Krooninen sairaus

tiivistelmä

eniten tappavan vaihe syövän etenemisen on metastaattinen muuntaminen. Epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on keskeinen prosessi, jolla syöpäsolut hankkia invasiivisia ja metastaattinen fenotyyppejä. Jotta kutemaan makroskooppinen etäpesäkkeitä, levitetään syöpäsolut näyttäisi edellyttävän itseuudistumisen ominaisuus. Kuitenkin taustalla olevaa mekanismia määritellään näiden prosessien hyvin huonosti. Yksi mahdollinen mekanismi oleva metastaasi on fuusio välillä myeloidisoluissa ja syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että spontaanisti muodostunut tuumorigeenisia hybridit luuytimestä peräisin mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) ja kolme erilaista ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat vaikuttivat erittäin pahanlaatuisten alapopulaatioiden sekä EMT ja kantasolujen kaltaisia ominaisuudet. Hybridit menettivät epiteelin morfologia ja oletettu fibroblasti-ulkonäkönsä. Up-regulation vimentiinista, α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA), ja fibronektiiniä ja alas-säätely E-kadheriinin ja pancytokeratin havaittiin kasvaimia synnyttäviä hybridit. Nämä solut oli myös lisääntyneen ekspression kantasolujen markkeri prominin-1 (CD133) ja yli-ilmentymisen transkription tekijöitä Oct4, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1 sekä Sox2, kaikki vastaavat geenit säädellään ja ylläpitää kantasolujen fenotyyppiä. Lisäksi spontaanisti muodostettu tuumorigeenisiä hybridit, lisääntynyt pneumosphere muodostavan kapasiteetin ja kasvaimen muodostavien kyky NOD /SCID-hiiriin oli havaittavissa. Siten solujen välisen fuusion keuhkosyövän solujen ja MSC tarjoaa nonmutational, joka voisi edistää poikkeavasta geeniekspressiomalleja ja aiheuttaa erittäin pahanlaatuisten alapopulaatioita molemmat kykenevät EMT ja ominaisuuksia syövän kantasoluja (CSCS).

Citation: Xu MH, Gao X, Luo D, Zhou XD, Xiong W, Liu GX (2014) EMT ja hankinta Stem Cell-Like Properties osallistuvat spontaani muodostuminen Kasvaimia synnyttävä väliset hybridit Keuhkosyöpä ja luuydinperäisiä mesenkyymikantasoluista . PLoS ONE 9 (2): e87893. doi: 10,1371 /journal.pone.0087893

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 elokuu 2013; Hyväksytty: 06 tammikuu 2014; Julkaistu: 06 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (81071728). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä, erityisesti ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), on edelleen suurin syy syöpään liittyvän kuolleisuuden maailmanlaajuisesti. Tavallisimpia ns NSCLC ovat adenokarsinooma, levyepiteelisyöpä ja suuri cell carcinoma [1], [2]. Tuumorimetastaasit on ensisijainen kuolinsyy johtuu NSCLC. Kuitenkin mekanismit tuumorimetastaasissa yhä puutteellisia.

Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on trans-eriyttäminen prosessi, jolla solut läpikäyvät morfologista siirtyminen epiteelin polarisoitunut fenotyypin mesenkymaaliset fibroblastit fenotyyppi, ja liittyy menetys solun polariteetin laski solu-soluadheesion ja lisääntynyt liikkuvuus ja kapasiteetti muuttoliike [3]. EMT on ehdotettu olevan olennainen askel syöpäsolun levittämiseen ja etäpesäke. Prosessin aikana tuumorimetastaasin, joka on usein käytössä EMT, levitetään syöpäsolut näyttäisi edellyttävän itseuudistumisen valmiudet, jotta kutemaan makroskooppinen etäpesäkkeitä. Viimeaikaiset työ osoitti, että prosessi EMT synnyttää solujen stemlike ominaisuuksia rintarauhasen solupopulaation [4]. Välinen yhteys EMT ja hankinta kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia syöpäsolut voivat selittää, miksi EMT indusoi syövän etenemiseen. Kuitenkin mekanismit, jotka aiheuttavat ja sitten ylläpitää tätä mesenkymaalisten /kantasolujen tilan edelleen epäselviä.

osto metastaattisen kyvyn kasvaimen solut pidetään myöhään tapahtuma kehityksessä pahanlaatuisia kasvaimia, joissa metastaattinen solu on katsotaan syntyvän asteittain ja asteittaista kerääntyä ylimääräisiä mutaatioita tarvitaan liikkuvuutta. Viime aikoina kuitenkin, tämä malli on kyseenalaistettu. Uudet todisteet viittaavat siihen, että pahanlaatuisia soluja voi levittää paljon aikaisemmassa vaiheessa kuin aiemmin kirjattu kasvainten synnyssä [5], [6]. Tämä viittaa siihen, että aikaisempi liipaisin on ajo kehitystä liikkuvia fenotyypin, joka mahdollistaa joitakin näistä soluista irrottautua primaarikasvaimen, hyökätä mikrovaskulaarisessa, matka- ja luoda pesäkkeitä kaukaisiin sivustoja. Muodostuminen hybridien välillä syöpäsolujen ja normaalien luuytimestä peräisin olevat solut kasvaimeen liittyvien strooman on kannattanut kuin nonmutational, joka voisi edistää poikkeavasta geeniekspressiomalleja liittyy erittäin pahanlaatuisten osapopulaatioiden [7] – [11].

solujen yhdistäminen on keskeinen prosessi, joka esiintyy sekä terveyden ja sairauden, jossa kaksi tai useampia soluja yhdeksi yhdistämällä niiden solukalvojen ja järjestämällä niiden ydin- sisältöä. Jälkeläiset solun fuusion kutsutaan hybridejä. Tällaiset fuusio hybridit jakavat geneettisiä ja toiminnalliset ominaisuudet sekä vanhemman solujen [7], [9], [12]. Genomiin syöpäsolujen voitaisiin edistää kasvainten muodostumiseen sen hybridit, kun taas ydinsoluissa voitaisiin edistää ilmentymistä mesenkymaalisten geenien ja lisääntynyt metastaattinen potentiaali.

Viime vuosikymmenen aikana, useita erillisiä alaryhmiä kasvaimen infiltroituneen ydinsoluissa on kuvattu [ ,,,0],13], joista mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) ovat kiinnittäneet huomiota, joilla on rooli syövän etenemisessä [14] – [16]. MSC: t ovat pieni populaatio solujen mesenkymaaliset stroomasolujen osastoihin, jotka on kyky itse uudistaa ja erilaistua useiksi solulinjoja. MSC: t tunkeutuminen on yleinen NSCLS [17]. Useimmissa tapauksissa kasvainta infiltroituneen MSC: t tarjoavat erilaisia ​​toiminnallisia aids edistää maligniteetin, jotka vaihtelevat rakenteellisen tuen luomista ennalta metastaattinen ympäristöön [18], [19].

Yhdessä nämä erilaiset linjat todisteet viittaavat siihen olettamukseen, että fusogeenistä myeloidisolun populaatiot, kuten MSC: t, voisi helpottaa kykyä syöpäsolujen hankkia mesenkymaalisten ja kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia siirtämällä erillistä dataominaisuudella aikana fyysinen fuusio tapahtuman syöpäsoluja. Siksi Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää hybridejä muodostuu fuusio välillä ihmisen keuhkosyövän solujen ja luuytimestä peräisin MSC: t voivat tulla voimavara mesenkymaaliset /syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja.

Tulokset

Spontaani muodostaminen MSC-keuhkosyövän hybridit

Viljellyt MSC: näytteillä fibroblastien kaltainen solumorfologiaan (kuvio S1A), tyypillinen fenotyypit ja olivat positiivisia CD44, CD105 ja negatiivinen CD34 (kuva S1B), ja on multipotenttisuus erilaistua osteoblastien rasvasolut ja kondrosyyttien jälkeen osteogeenisen adipogeeniset ja kondrogeeninen induktio erilaistumisen (Kuva S1C-E).

ensimmäinen arvio siitä, olisiko spontaanisti muodostunut heterotypic hybridien voisi löytyä rinnakkaisviljelmätilanteessa kokeilu. MSC: t olivat fluoresoivasti merkitty retroviruksen transduktion kanssa RFP-ilmentävillä vektoreilla, ja keuhkosyöpä solut tagged by EGFP-ilmentävillä vektoreilla. Olemme yhteistyössä viljellyissä ihmisen MSC: t ihmisen A549, H460 tai SK-MES-1 keuhkosyövän soluja. 72 tunnin jälkeen, solut, jotka ilmentävät sekä EGFP ja RFP havaittiin (kuvio 1A). Kuten solufuusio edetessä havaitsimme MSC: t vähitellen muuttua vihreäksi ja keuhkosyöpään solut vähitellen värjää, mikä dually fluoresoivia soluja, jossa erilliset strooman morfologia ja säteilevät keltainen fluoresenssi, syntynyt (kuvio 1 B). Läsnä on kaksi tai useampia tumia havaittiin useimmissa näissä soluissa. Heterotyyppisten hybridi väestö muodosti 2,91 ± 0,35%, 1,23 ± 0,13% tai 3,20 ± 0,48% kaikista soluista MSC-A549 co-kulttuuri, MSC-H460 yhdessä viljelemisen tai MSC-SK-MES-1 co-kulttuuri, vastaavasti arvioituna virtaussytometrialla (kuvio 1 C). Kuitenkin ohjaus kokeilu osoitti, että solufuusio oli suhteellisen ei-havaittavissa kun viljellään yhdessä ihmisen MSC: t, joissa BEAS-2B (normaali ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen linja) tai MRC-5 (normaali ihmisen keuhkojen fibroblastisolulinjan), tässä järjestyksessä.

(a) loisteputki micrographs rinnakkaisviljelmätilanteessa A549-EGFP (vihreä) ja MSC-RFP (punainen), joka osoittaa muodostumista kaksoisleimattua hybridi solun kaksi ydintä ja fibroblastisella muoto (nuolet). Mittakaava, 50 pm. (B) fluoresoiva micrographs, otettu 2 tunnin välein, on co-viljelmistä SK-MES-1-EGFP (vihreä) MSC-RFP (punainen), joka osoittaa ilmeistä osallistuminen solufuusio (nuolet) ja värimuutoksen vuorovaikutus keuhkosyövän solujen MSC: t. Asteikko bar, 10 mikrometriä. (C) kvantifiointi spontaanin välisen hybridisaation keuhkosyövän soluja (A549-EGFP, H460-EGFP tai SK-MES-1-EGFP), ja MSC-RFP korkean tiheyden co-kulttuuriin. Määrä hybridit arvioitiin virtaussytometrianalyysillä ja ilmaistiin prosentteina solujen kokonaismäärästä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta kokeesta. (D) FISH-analyysi HCC827 /MSC co-kulttuureissa. Mies MSC: t viljeltiin naaraspuoliset HCC827 keuhkosyövän soluja 8 päivän ja kiinteä. FISH (Spectrum red-Y-kromosomi ja Spectrum vihreä-X-kromosomi) suoritettiin ja tumat värjättiin DAPI (sininen). Vihreät nuolet osoittavat X-kromosomia ja punaiset nuolet, Y kromosomit. Mies MSC: t ilmaistaan ​​yksi Y-kromosomi ja yksi X-kromosomi että naisten HCC827 solujen ilmaista vain X-kromosomia. In HCC827 /MSC hybridit: esimerkiksi kahden solun, yksi kätkeminen kaksi ydintä ja muita ytimellä. Nämä kaksi solua on kullakin Y-kromosomi, joka osoittaa MSC peräisin oleva solu. Mittakaava, 25 pm.

Jotta voitaisiin vahvistaa roolia fuusio, sukupuoleen ristiriitaiset MSC: t ja HCC827 soluja viljeltiin yh- ja heterotypic hybridit arvioitiin FISH sukupuolen kromosomeja. Näitä kokeita varten, naispuolinen HCC827 solut sulatettu puromysiiniresistenttejä by lentiviral transduktion. HCC827 /MSC hybridit valittiin altistuksella 1 ug /ml puromysiiniä, mikä aiheutti täydellisen häviämisen uros MSC: eiden. Jälkeen 5 päivää valintaa, ulkonäkö uros-johdettu hybridejä strooman morfologia havaittiin. Jotkut hybridien sisälsi yhden ytimen yhden Y-kromosomi ja useita X-kromosomia, mikä osoittaa, että ydin mies MSC oli fuusioitunut ydin naisen HCC827 solu. Jotkut solut sisälsivät kaksi ydintä, joista yksi Y-kromosomi ja toinen ilman Y-kromosomi, joka osoittaa, että kalvo on mies MSC oli fuusioitunut kalvon naisen HCC827 solun ilman fuusion kaksi ydintä (kuvio 1 D). Muita soluja sisälsi yhden ytimen yhden Y-kromosomi ja yksi X-kromosomi, mikä viittaa siihen, mitoosin fuusioitunut monitumaisia ​​soluja, jotka aiheuttavat MSC-peräisen mononucleated tytärsolujen (kuvio S2A).

Jotta voitaisiin vahvistaa esiintyminen fuusio

in vivo

, sukupuoleen ristiriitaiset MSC: t ja HCC827 soluja tuoreeltaan sekoitettiin samassa suhteessa kuin mitä käytettiin

in vitro

määrityksissä sitten ksenosiirrettyjä ihonalaisena injektiona NOD /SCID immuunivajaisiin hiirillä. Solufuusio MSC: ja HCC827 solut arvioitiin FISH sukupuolen kromosomeja. Viisi viikkoa ksenografti, spontaanisti muodostetun uros johdettu tuumorigeenisia hybridit havaittiin (kuvio S2B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että spontaanisti muodostunut MSC-keuhkosyöpä hybridit voidaan havaita sekä

in vitro

ja

in vivo

.

Fusion välillä MSC: ja Lung Cancer Cells indusoi morfologiset muutokset ja Growth Inhibition

5-7 päivää päättymisen jälkeen puromysiinin hoidon, me eristetty puromysiiniresistenttiä fluoresoiva hybridit fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu. Fuusion jälkeen MSC-RFP, A549-EGFP solut menettivät epiteelin morfologia. Niistä tuli hajallaan ja oletettu fibroblasti ulkonäkönsä pitkänomaisen muodon omaavia ja etu-back päin. Sama vaikutus havaittiin H460-EGFP ja SK-MES-1-EGFP-soluissa (kuvio 2A). Nämä hybridit ilmaistaan ​​sekä EGFP ja RFP (kuvio 2B), ja kaksi tai useampia tumia havaittiin useimmissa näissä soluissa. Meidän havainnot viittaavat siihen, että siirtyminen epiteelin ja mesenkymaalisten kaltaisia ​​morfologiset ominaisuudet indusoitiin fuusio.

(A) Phase-kontrasti kuvia heterotypic hybridit ja vastaavat vanhempien keuhkosyövän soluja. Fuusion jälkeen MSC keuhkosyöpäsoluissa hajallaan, menetti epiteelin morfologia ja oletettu fibroblasti ulkonäkönsä pitkänomainen muoto ja etu-back päin. Mittakaava, 500 um. (B) konfokaali laser mikroskoopilla kuvantaminen. A549 /MSC hybridit oletettu fibroblasti-ulkonäkönsä ja ilmaisivat sekä EGFP ja RFP. Mitta-asteikko, 25 pm.

Seuraavaksi testasimme hypoteesia, että fuusio MSC: eiden kanssa saattaa vaikuttaa syöpäsolun proliferaatiota. Kaikissa testatuissa solulinjoissa (A549, H460 ja SK-MES-1), fuusio MSC: t aiheuttama kasvun esto. Hybridit alkoi kasvaa hitaammin kuin vastaavien vanhempien keuhkosyöpä solut päivä 2, ja ero kasvun nopeuden näiden kahden ryhmän välillä oli merkitsevä päivän 4 jälkeen (kuvio S3). Nämä havainnot osoittavat, että proliferaatiopotentiaali hybridien väheni merkittävästi verrattuna vastaaviin vanhempien keuhkosyöpäsoluissa kunakin ajankohtana jälkeen 2. päivä

Fusion MSC: eiden kanssa Edistää Siirtyminen epiteelikasvaimet ja mesenkyymikasvaimia Fenotyyppikuvaus Lung Cancer Cells

Kun otetaan huomioon morfologiset muutokset MSC-keuhkosyöpää hybridit, tutkimme seuraavaksi ne hankittu muutosta lausekkeen epiteelin on mesenkymaaliset ohjelmistoon. Käytimme immunofluoresenssi ja QRT-PCR ekspression tutkimiseksi ja jakelu E-kadheriinin, pancytokeratins, vimentiinistä, α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) ja fibronektiinin heterotypic hybridit ja omilla vanhempien keuhkosyöpään solut. Käytimme myös QRT-PCR ekspression tutkimiseksi EMT indusoivan transkription tekijöitä, kuten Snail, Slug, Zeb1, Zeb2, Foxc2 ja Twist geenejä.

immunofluoresenssi osoitti, että verrattuna vanhempien keuhko- syöpäsoluja, MSC -lung syöpä hybridit osoitti voimakasta vähentämistä proteiinin ilmentyminen E-kadheriinin ja pancytokeratins sekä merkittävästi lisääntyneen ilmentymisen vimentiinin, α-SMA: n ja fibronektiinin kaikissa kolmessa NSCLC solulinjoissa (kuviot 3A-E).

MSC: ien ja keuhkosyövän soluja fluoresoivasti merkitty retroviruksen transduktion kanssa RFP- ja EGFP-ilmentäviä vektoreita, vastaavasti. Spontaanisti muodostuneet heterotypic hybridit ilmaistaan ​​sekä EGFP ja RFP. Immunovärjäys suoritettiin ensisijaisen vasta-aineita (A) E-kadheriinin (E-Cad), (B) pancytokeratin (pCK), (C) vimentiinista (Vim), (D) α-SMA, ja (E) fibronektiini (Fibro) , ja paljastettiin käyttäen AlexaFluor 647-leimatut sekundääriset vasta-aineet (violetti); tumat värjättiin DAPI (sininen). Mittakaava, 25 pm. (F) ilmentyminen tasolla koodaavien mRNA-E-kadheriinin, vimentiinin, α-SMA, fibronektiini, Foxc2, Slug, Snail, Twist, Zeb1 ja Zeb2 spontaanisti muodostaa A549 /MSC, H460 /MSC, SK-MES-1 /MSC heterotypic hybridit suhteessa vastaaviin vanhempien keuhkosyöpäsoluissa määritettynä QRT-PCR. GAPDH mRNA käytettiin normalisoimaan vaihtelua mallin lastaus. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SEM.

QRT-PCR-analyysit paljastivat, että suhteessa ilmentyminen vanhempien keuhkosyövän soluja, taso E-kadheriinin mRNA: n hybridien oli vähentynyt huomattavasti, kun taas ekspressio mRNA: t koodaavat mesenkymaaliset markkereita lisääntyi merkittävästi (kuvio 3F). Myös lisääntynyt huomattavasti ilmentymisen EMT indusoivan transkriptiotekijöiden (kuvio 3F).

Jotta voitaisiin määritellä kyky keuhkosyöpään solujen hankkia mesenkymaaliset ominaisuuksia ilman fuusio tapahtumia, EGFP ilmentäviä keuhkosyöpäsoluissa ja RFP ilmentäviä MSC: t maljattiin ylä- ja alareunassa kuoppiin 0,4 um soluviljelyinsertissä. Epäsuoran yhteisviljelyn jälkeen viljelmässä 8 päivää, keuhkosyövän solut osoittivat vastaava ilmaisu E-kadheriinin, vimentiinin, α-SMA: n ja fibronektiinin kaikissa kolmessa NSCLC solulinjoissa verrattuna emo-keuhkosyövän soluista, jotka viljeltiin yksinään (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittivat, että MSC-keuhkosyöpää hybridit ilmaisi merkkiaineita, jotka liittyvät soluihin, jotka ovat läpikäyneet EMT.

Hybridit hankkia Lisääntynyt Liikkuvuus ja invasiivisuus

tutkimiseksi edelleen toisen funktionaalisen tunnusmerkki mesenkymaalisten /kantasolu tilassa, teimme

in vitro

motiliteetin määrityksiä. Siirtymätesteissä määrityksissä, A549 /MSC hybridit olivat useamman muuttavan (5,5-kertainen) verrattuna vanhempien A549-soluja, H460 /MSC hybridit olivat useamman muuttavan (5,9-kertainen) verrattuna vanhempien H460 soluihin, ja SK-MES-1 /MSC hybridit olivat useamman muuttavan (4,1-kertainen) verrattuna emo-SK-MES-1-soluissa (kuvio 4A). Vuonna invaasio määrityksissä, A549 /MSC hybridit olivat invasiivisia (3,8-kertainen) verrattuna vanhemman A549-soluja, H460 /MSC hybridit olivat invasiivisia (5,9-kertainen) verrattuna vanhemman H460 soluihin, ja SK-MES-1 /MSC hybridit olivat invasiivisia (5,8-kertainen) verrattuna vanhemman SK-MES-1-soluissa (kuvio 4B). Yhdessä havaintomme osoittavat, että spontaanisti muodostettu hybridit keuhkosyövän soluja ja MSC ovat alapopulaatio rikastettu liikkuvia soluja.

vaeltavia ja invasiivisia mahdollisten solujen määritettiin laskemalla solujen lukumäärä, jotka olivat vaeltaneet alapintaan suodattimen 12 satunnaisesti valitusta mikroskooppikentästä inserttiä kohti. (A) Migration määritykset: mikroskooppinen kuvia ja kvantifiointiin. (B) Invasion määritykset: mikroskopia kuvia ja kvantifiointiin. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tähdellä kuvaavat tilastollisesti merkitseviä eroja heterotyyppisten hybridit ja vastaavat vanhempien keuhkosyövän soluja (*

P

0,001). Mittakaava, 50 pm.

geeniekspressioprofilointi of Stemness Markers in hybridit

kantasolu markkeri prominin-1 (CD133), joka on pentaspan kalvo proteiini voi olla ainoa merkki, mutta se on yleisimmin raportoitu markkeri syövän kantasoluja (CSCS) keuhkosyöpään, ja on vahvistanut eri ryhmien [20] – [22]. Olemme edelleen arvioitu ilmaus CD133 MSC-keuhkosyöpä hybridit käyttävät virtaussytometria ja QRT-PCR. Virtaussytometria analyysit osoittivat, että vanhempien A549-soluja, ilmentävien prosenttiosuus, CD133 oli noin 0,94% koko solupopulaation. Fuusion jälkeen MSC: eiden kanssa, ilmentymisen CD133 kasvoi 30-kertaiseksi. Lisäksi CD133 ilmentyminen lisääntyi hybridit verrattuna niiden vanhempien H460- ja SK-MES-1 solulinjoissa (kuvio 5A). QRT-PCR-analyysit paljasti myös, että suhteessa ilmaisun vanhempien keuhkosyövän soluja, taso CD133 mRNA hybridien lisääntyi merkittävästi (kuvio 5B). Nämä tiedot tarjoavat lisää todisteita siitä, että spontaanisti muodostettu tuumorigeenisiä hybridit keuhkosyövän soluja ja MSC hankkia yli-ilmentyminen kantasolujen merkkiaineita mukana läpi EMT.

(A) Virtaussytometria-analyysi CD133 ilmentymisen heterotypic hybridit ja vastaavat vanhempien keuhkosyövän soluja. Prosenttiosuudet CD133

+ solut ilmoitettu kontrollivasta-aineella ja tiettyä vasta-aine-värjäytyneiden solujen. Harmaa ja musta viiva merkitty negatiivinen kontrolli ja näytteen vastaavasti. (B) ekspressio tasot koodaavien mRNA-CD133, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1, Sox2 ja Oct4 spontaanisti muodostettu A549 /MSC, H460 /MSC: n ja SK-MES-1 /MSC heterotypic hybridit suhteessa vastaaviin vanhempien keuhkosyöpä solut määritettynä QRT-PCR. GAPDH mRNA käytettiin normalisoimaan vaihtelua mallin lastaus. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SEM.

tutkimiseksi geenien vastuussa sääntelystä ja ylläpitää kantasolujen fenotyyppi A549 /MSC hybridit, suoritimme QRT-PCR Oct4, Nanog, BMI1, Notch1 , ALDH1 ja Sox2. Mielenkiintoista, transkriptiotekijöiden Oct4, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1 ja Sox2, tiedetään olevan riittävä ohjelmoida hiiren tai ihmisen somaattisten solujen eriytymättömiä, pluripotenttien kantasolujen, havaittiin merkittävästi lisääntynyt hybridit verrattuna vanhempien keuhko- syöpäsoluja, ilmoitetaan niiden stemness fenotyypin (kuvio 5B). Nämä havainnot osoittavat, että itseuudistumisen geenit yliekspressoitu spontaanisti muodostunut hybridit keuhkosyövän solujen ja MSC.

Kyky muodostaa Kasvaimen Kuulat lisääntyy Hybridit

Pehmeä agar määritys palvelee kuin

in vitro

korvike mitta kasvaimien [23], kun taas pneumosphere määrityksessä mitataan kiinnittymisestä riippumaton proliferaatioprosessi kloonitiheydessä

in vitro

ja on liittynyt läsnäolo kantasolukkoa [ ,,,0],24]. Siksi suoritettiin näiden solujen sekä pehmeän agarin ja pneumosphere määrityksissä. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että heterotyyppisten hybridejä muodostuu vähintään 7,5-kertaa enemmän pesäkkeitä pehmeässä agarissa suspensioviljelmässä kuin teki valvonta vanhempien keuhkosyövän soluja (kuvio 6A ja kuvio S4A). Yhtä tärkeää on, hybridi-solut osoittivat merkittävästi kasvanut kyky muodostaa pneumospheres verrattuna niiden vanhempien keuhkosyöpään solut, jotka muodostavat vähintään 7,3-kertaa enemmän pneumospheres kuin vanhemman soluja (kuvio 6B). Pneumosphere koko hybridisolujen oli myös merkitsevästi suurempi kuin vanhempien keuhkosyövän soluja. Dissosioimalla aluksi muodostettu mammospheres ja palauttamalla nämä solut uusio- mammosphere kulttuureissa, havaitsimme vaatimaton kasvu alalla muodostumista hybridit (kuvio S4b). Perustuen tässä kokeessa, voimme päätellä, että spontaanisti muodostunut tuumorigeenisia hybridit keuhkosyövän solujen ja MSC hankkia vielä toinen ominaisuus CSCS.

(A) Pehmeä agar määritykset: Single-solut (1 x 10

3 per kuoppa) maljattiin pehmeälle agarille 6-kuoppalevyille kolmena kappaleena. Mikroskooppinen kuvia ja kvantifiointiin heterotypic hybridit ja vastaavat vanhempien A549, H460 tai SK-MES-1-soluissa. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SEM. (B) Pneumosphere määritys: mikroskooppinen kuvia ja kvantifiointiin heterotypic hybridit ja vastaavat vanhempien A549, H460 tai SK-MES-1-solut; n = 12. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SEM. Tähdellä kuvaavat tilastollisesti merkitseviä eroja heterotyyppisten hybridit ja vastaavat vanhempien keuhkosyövän soluja (*

P

0,001). Mittakaava, 100 pm.

Heterotyyppisten Hybridit esiintyy suurempaa tuumorigeenisyyteen ja toisintaa ihmisen kasvain

in vivo

Sen testaamiseksi, onko fuusio MSC: eiden kanssa onnistuu muuttavaa kasvain-aloittavat taajuus keuhkosyöpään solujen injektoimme A549 /MSC hybridit, H460 /MSC hybridit sekä SK-MES-1 /MSC hybridit ja vastaavat vanhempien keuhkosyövän soluja NOD /SCID-hiiriin. Kuten on esitetty taulukossa 1, havaitsimme, että injektio niinkin vähän kuin 10

4 hybridit johdonmukaisesti johti kasvun tuumoriksenograftien kanssa morfologisia ominaisuuksia muistuttavat läheisesti kasvaimen aiheuttama kunkin vanhempien keuhkosyövän soluja, kuten on esitetty hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäytymistä (kuvio 7A). Kasvaimen tilavuus tuottaman hybridit oli merkittävästi suurempi kuin se, joka johtuu emosoluista (kuvio 7B). Nämä tulokset vahvistivat, että spontaanisti muodostunut tuumorigeenisia hybridit keuhkosyövän solujen ja MSC edustavat alapopulaatio rikastettu keuhkosyövän-aloittavat soluissa.

(A) MSC-keuhkosyöpä hybridit ovat tuumorigeenisemmiksi ja uusiutumaan samanlaisia ​​kasvaimia niiden vanhempien keuhkosyövän soluja NOD /SCID-hiiriin. Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H & E) värjäämällä suoritettiin kasvaimen näytteitä välittömästi näytteenoton vanhempien kasvain tai kasvaimia syntyy ihonalaisella MSC-keuhkosyövän hybridien NOD /SCID-hiirissä (ksenograftin). Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (B)

Ylähavas:

Tuumorigeenisuustutkimuksissa 1 x 10

3 A549 /MSC verrattuna 1 x 10

4 vanhempien A549-soluja. Solut samanaikaisesti ruiskutetaan oikea (A549 /MSC) ja vasen kylki (A549) saman hiiren ja hiiri valokuva otettiin 12 viikkoa injektion jälkeen.

Alahavas:

Gross patologia kasvaimen tuottaman ihon alle A549 /MSC hybridit ylemmässä paneelissa. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. Mittakaava, 100 pm.

Hybridit Solut hankkia uudelleen epiteelityyppinen Morfologiset ominaisuudet

in vitro

ja

in vivo

Upon erilaistuminen

3 kuukauden kuluttua viljelmässä, yleinen siirtyminen mesenkymaalisten epiteeli- kaltaisia ​​morfologiset ominaisuudet havaittiin MSC-keuhkosyöpä hybridit (kuvio 8A). Samanlainen elimellisen muutoksen havaittiin myös kasvun aikana tuumoriksenograftien. Solu muoto hybridi ksenograftien oli paljon enemmän kuin että vanhempien keuhkosyövän soluja näköisiä. Vahva kalvomainen ilmaus pancytokeratins ja E-kadheriinin hybridi ksenografteissa, verrattavissa ilmaisua vanhempien keuhkosyöpää ksenograftien, ja solujen morfologia olivat viittaavia epiteelin luonteesta kasvainten, kun taas tehostettu ilmentyminen vimentiinista, α-SMA ja fibronektiini ehdotti MSC panos hybridi fenotyypin (kuvio 8B). Nämä tiedot viittaavat siihen epävakaus hybridit. Kun aika kuluu, käänteinen sekoittaa fenotyypin ja käänteinen prosessi kutsutaan mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen (MET) tapahtuu.

(A) Kuvat, peräkkäisissä ajankohtina, jotka osoittavat palautumisen fibroblastiselle morfologiset ominaisuudet A549 /MSC hybridit epiteeliosaan, A549 ulkonäkönsä viljelmässä. Mittaviivat: 500 um. (B) immunohistokemiallinen värjäys osoitetulle antigeenien suoritetaan Tuumorinäytteet peräisin vanhempien A549 kasvaimen tai kasvaimista syntyy ihonalaisella A549 /MSC hybridit NOD /SCID-hiiriin. Eksplanttien tuumoriksenograftien A549 /MSC hybridit ja vanhempien A549 soluilla samanlaisia ​​keuhkosyöpä kaltaisia ​​morfologisia ominaisuuksia. Mittakaava, 100 pm.

Keskustelu

Tulokset esitetään tässä kuvata odottamaton lähentyminen EMT ja kantasolujen ominaisuuksia spontaanisti muodostunut tuumorigeenisia hybridit keuhkosyövän solujen ja luun marrow- johdettu MSC:. Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on kuvattu viime vuosikymmenen aikana kriittiseksi normaalin kehittämisen aikana ja haavan paranemisen, mutta viime aikoina ominaisuuksia EMT ovat sekaantuneet ihmispatologiaa, mukaan lukien syövän etäpesäkkeiden [25]. Riippumaton Näiden havaintojen tutkimuksissa on kuvattu näyttöä kantasolujen eri syöpiä. Mani

et al.

Ensimmäinen löydetty yhteys näiden kahden ilmiöitä rintasyöpäsoluja vuonna 2008 [4]. Kuitenkaan ole tutkimus on vielä paljastanut mekanismeja niiden takana tai tunnistettu lähde solujen sekä EMT ja kantasolujen ominaisuuksia. Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa, että keuhkosyöpään solut voivat hankkia mesenkymaaliset ominaisuudet ja kantasolujen ominaisuuksia läpi fuusion avulla MSC: eiden kanssa. Löytö spontaanisti muodostetun tuumorigeenisia hybridit keuhkosyövän solujen ja luuytimestä peräisin MSC: monien ominaisuuksia sekä EMT ja uudistuva kantasolujen pitää lupauksen ratkaista suuri ongelma syövän biologian. Prosessin aikana kasvaimen etäpesäke, EMT ominaisuudet voivat sallia levittäminen kasvainsolujen primaarikasvaimen ympäröivään stroomaan ja siten kaukaisiin kohtiin [26]. Kuitenkin, jos suurin osa soluista, jotka ovat levinneet puuttuu itseuudistumisen ominaisuus, kyky havaittu makroskooppista etäpesäkkeitä vaarantuu alusta alkaen, koska niiden rajoitettu proliferatiivinen potentiaali. Tämä arvoitus voidaan ratkaista ainakin osittain esillä havainnot, koska spontaanisti muodostetun hybridit syöpäsoluja ja MSC saada sekä EMT ja kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia, joiden kehittämiseen mahdollistaa syöpäsolujen levittää ensisijaisesta kasvain ja muodostamaan pesäkkeitä etäältä.

Äskettäin välinen yhteys syövän etenemistä ja tunkeutuminen myelooisessa solujen on tunnustettu erilaisia ​​syöpiä [13]. Infiltraatiota ydinsoluissa liittyy yleensä epäedullisempia kliinisiä tuloksia [27] – [29]. Tulehdus on tärkeä osatekijä paikallisen ympäristön kasvainten [30]. Kemokiinit ja sytokiinit ovat ratkaisevia tekijöitä, jotka edistävät syöpään liittyvien tulehdus [31], [32]. Houkuttelee kemokiinit, erilaisia ​​MSC: luuytimestä rekrytoidaan kasvaimen sivustoja, ja olla tärkeä rooli helpottaa keuhkosyövän etenemistä [17]. Viimeaikaisten toimien krooninen tulehdus voi edistää solujen fuusio [33] – [35]. Tämä tutkimus osoittaa ensimmäistä kertaa, että MSC: t voivat edistää EMT ja levittämistä avulla fuusio keuhkosyöpään solujen. Se tarjoaa myös mekanistinen selitys pitkään tunnustettu yhteys tulehduksen ja syövän etenemistä.

Tämä tutkimus osoittaa, että solu fuusio välillä MSC: ja keuhkosyövän solujen johtaa alaryhmässä näytteille mesenkymaalisten morfologisia ominaisuuksia ja sytogeneettinen poikkeavuudet sekä invasiivisia ominaisuuksia ja itseuudistumisen ominaisuus. On selvää, että genomi keuhkosyövän solut osaltaan kasvainten muodostumiseen sen hybridit, kun taas MSC: t vaikuttivat ilmentymisen mesenkymaalisten geenien ja lisääntynyt metastaattinen potentiaali. Jotkut hybridien voi myös saada kyky itse uudistaa ja erilaistua useiksi solulinjasta peräisin luuytimestä peräisin MSC:. Mielenkiintoista on, aikaisemmassa tutkimuksessa, spontaanisti muodostunut tuumorigeenisia hybridit MSC: ja rintasyövän soluja oli mesenkymaaliset ulkonäön ja sekoitetaan ilmaus mesenkymaalisten ja rintasyöpä geenit [9]. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien että spontaanisti fuusioituneet tuumorigeenisia hybridit MSC: ja syöpäsolut voivat toteuttaa sitten fenotyyppi vastaanottajan solujen [9], [12].

in vivo

tuumorigeenisia määritys vahvistivat tuumorigeenisia ominaisuuksia, kun taas lisääntynyt ilmentymä vimentiinista, α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) ja fibronektiinin, ja yli-ilmentyminen transkriptio säätelevä geenejä, kuten Slug, Snail, Zeb1 , Zeb2, Foxc2 ja Twist, mukaan hybridiautot voi hankkia mesenkymaalisten ominaisuuksia MSC:. Lisäksi yli-ilmentyminen itseuudistumisen geenejä, kuten Bmi1, ALDH1 ja Oct-4 osoittaa, että keuhkosyövän solut voivat hankkia kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia MSC: sulattamalla.

Cogle

et al.

osoittanut mitään todisteita fuusion karyotyyppi välillä epiteelisolujen ja luuytimen solut käyttävät konfokaalimikroskopia ja XY luettelointi koska luovuttajalta peräisin (Y-kromosomi positiivinen) soluja havaitaan FISH sisälsi vain yksi X-kromosomia [36]. Paradoksaalinen Edellä mainittujen tulosten saattaa johtua epävakaus hybridit. 3 kuukauden kuluessa, molemmat

in vitro

ja

in vivo

, morfologisiin ominaisuuksiin hybridisoluille muuttunut. Tämä osoittaa, että hybridit ovat epävakaita. Solut, jotka syntyvät kun fuusio- tuotteita saattaa tapahtua ”vähentäminen jako”, ja DNA ploidia väheni 60 päivän kuluessa [9].