Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen eturauhasen kasvain rokote ja geeniterapiakokeita käyttämällä

ex vivo

menetelmiä prime dendriittisolut (DC) ja eturauhasen kalvoantigeeni (PSMA) ovat olleet jokseenkin onnistunut, vaan päivämäärä pitkällinen

ex vivo

manipulointi DC on rajoittanut laajaa kliinistä tämän menettelyn hyödyllisyyden. Tavoitteenamme oli parannella syövän rokotus kasvaimen antigeenejä toimittamalla PSMA

kautta

CD40 kohdistetun adenovirusvektori suoraan DC tehokkaana keinona aktivointia ja antigeenin esittelyä T-soluille. Testata tätä lähestymistapaa, kehitimme hiirimallissa eturauhassyövän tuottamalla klonaalisen johdannaisia ​​hiiren RM-1 eturauhassyöpäsolulinja ilmentävät ihmisen PSMA (RM-1-PSMA-soluissa). Maksimoida antigeenin esittelyä kohdesoluissa, sekä MHC-luokan I ja TAP-proteiinin ekspressio indusoitiin RM-1-solujen transduktiolla ilmoitus vektori ekspressoi interferoni-gamma (

Ad5-IFNy

). Annetaan infektoitujen DC:

ex vivo

CD40-kohdennettuja

Ad5-huPSMA

, sekä suora intraperitoneaalinen injektio vektorin, johti korkeisiin kasvain-spesifisen CTL-vasteita RM-1- PSMA solut esikäsitellään

Ad5-IFNy

kohdesoluina. CD40 kohdistaminen paransi huomattavasti terapeuttisen tuumorin vastaista tehoa

Ad5-huPSMA

koodauksen PSMA yhdistettynä

Ad5-IFNy

RM-1-PSMA malli. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CD-kohdennettu adenovirus tuottaa PSMA voi olla tehokas kliinisesti eturauhassyövän immunoterapiaa.

Citation: Williams BJ, Bhatia S, Adams LK, Boling S, Carroll JL, Li X-L, et al. (2012) dendriittisolujen Perustuu PSMA immunoterapia eturauhassyövän käyttäminen CD40-Kohdennettu adenovirusvektori. PLoS ONE 7 (10): e46981. doi: 10,1371 /journal.pone.0046981

Editor: Michael P. Bachmann, Carl-Gustav Carus tekninen yliopisto-Dresden, Saksa

vastaanotettu: 24 tammikuu 2012; Hyväksytty: 11 syyskuu 2012; Julkaistu: 08 lokakuu 2012

Copyright: © Williams et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain jota Feist-WEILLER Cancer Center, Louisiana Gene Therapy Research Consortium, ja myöntää National Institutes of Health-National Cancer Institute (2R42-CA114921) ja National Institutes of Health-National Institute of Allergy ja Infectious Diseases (5R33-AI076096). Nämä rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Imre Kovesdi on puheenjohtaja hallituksen ja toimitusjohtajan toimisto VectorLogics, Inc., David T. Curiel on tieteellinen johtaja ja perustaja VectorLogics, Inc., ja Nikolay Korokhov työskenteli Senior Scientist at VectorLogics, Inc. suorituksen aikana työn. Tämä työ käyttää teknologiaa, joka perustuu US-patentti 6.841.540 otsikolla ”Immuunimodulaatio geneettisesti muuntamalla dendriittisolujen ja B-solut”, johon liittyy CD40-kohdennettu rekombinantti adenovirusvektori geenimanipulaatioon dendriittisolujen ja B-solut. Ei tuotteita kehitteillä, tai kaupan tuotteita mukana tässä työssä. Tämä kilpaileva kiinnostus ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä toisella sijalla johtavia syöpään liittyvistä kuolemantapauksista Yhdysvalloissa miehillä , ja arviolta 240890 uutta tapausta ja 33720 kuolemista on tapahtunut vuonna 2011 [1]. Vaikka hoidot ovat saatavilla elimeen rajoittunut karsinooma eturauhasen, ei ole tehokas lähestymistapa hoitaa uusiutuva sairaus jälkeen androgeenien puute hoidon epäonnistuu. Tämä vaatii kehittämään uusia strategioita kyseisen taudin torjumiseksi. Viimeaikaiset raportit viittaavat tukahduttaminen eturauhasen kasvain kasvu on mahdollista seuraava immunisaatiostrategioista rokotteiden koodaavat kasvaimen antigeenejä [2], [3]. Eturauhasspesifinen kalvo (PSMA) on tyypin II membraaniproteiini, jossa folaatin hydrolaasiaktiivisuutta ilmentyy pääasiallisesti eturauhasen epiteelissä ja rajallinen määrä muita solutyyppejä. Tämä hyvin määritelty eturauhasen ilmentymistä merkittävästi kohonnut eturauhassyövän, erityisesti vaiheissa [4]. Siten PSMA on suotuisa potentiaalisimmaksi eturauhassyövän immunoterapiaa. Useita PSMA-pohjainen rokotteita oli kehitetty ja kliiniset tutkimukset osoittavat, että nämä -immunoterapialähestymistavat voidaan antaa turvallisesti ja voi aiheuttaa immuunivasteita potilailla, joilla on pitkälle edennyt syöpä eturauhasen [5], [6]. Kuitenkin rajallinen kliininen vaste havaittiin toistaiseksi takaa vaihtoehtoisen rokotuksen paradigma.

Dendriittisolut (DC) ovat ammatillinen APC: t, joilla on tärkeä voimakas rooli aloittamisen immuunivasteen aktivoimalla T-soluja. On tunnettua, että vuorovaikutus DC CD40: n kautta, jossa auttaja-T-solut, jotka ilmentävät CD40-ligandi (CD40L) voi tukea niiden kypsymiseen, joka puolestaan ​​laukaisee CTL-vasteen. Edellinen raportit ovat osoittaneet, että

ex vivo

DC-rokotteiden voi aiheuttaa spesifistä anti-kasvain T-soluvasteita potilailla, [7], [8], [9]. Huolimatta näiden kliinisten menestyksestä, tämä lähestymistapa rajoittuu yleisesti esiintyvää kliinisissä sovelluksissa, koska manipuloimalla DC läpi

ex vivo

kulttuurin ja antigeeni lastaus on työlästä, kallista ja aikaa vievää. Samoin

ex vivo

valmis DC näyttää rajoitettu muutto imusolmukkeisiin myöhempää aktivointia T-solujen [10]. Tämä ongelma on ratkaistu

in situ

DC: iden lataamiseksi kasvaimeen liittyviä antigeenejä käyttäen virus- ja ei-virusvektoreita [11]. Niistä virusvektoreita, adenovirusyhdistelmävektoreita (mainokset) ovat saaneet paljon huomiota syövän hoidossa, koska niiden suuren kapasiteetin ja kestävä geeniekspression [12]. Siitä huolimatta, Ad-vektorit huonosti infektoida DC puutteen vuoksi on ilmaus Coxsackie ja adenovirus reseptorin välittävä tarttuva käyttöönottoa [13]. Tämä rajoitus voidaan voittaa käyttämällä bispesifinen sovittimen molekyyli, joka käsittää fuusio solunulkoisen domeenin natiivi Coxsackie ja adenovirus-reseptori-reseptorin ja hiiren CD40-ligandi yhdistää trimerisaatiodomeeni motiivi T4-bakteriofagin fibritin proteiinin 14,15. Viime aikoina tämä sovitin on käytetty menestyksekkäästi DC-pohjainen immunoterapia hiirimallissa melanooma [16], [17]. Kuitenkin muut kasvain /antigeeni yhdistelmät ei ole testattu.

Tässä tutkimuksessa, arvioimme dendriittisolun kohdistetun Ad rokote ilmentävät ihmisen PSMA

in vivo

hiirimallissa eturauhassyöpää . Me tuotti immunokompetenteilla mallia käyttäen RM-1 hiiren eturauhassyöpäsolulinja jotka muodostavat kasvaimia syngeenisissä C57BL6 hiirillä [18], jonka konstitutiivisesti ilmentävät ihmisen PSMA antigeeni. Tässä osoitamme, että

in vivo

toimituksen CD40 kohdistetun Ad5 vektori lisäävästi sytotoksisten T-solujen reagointikykyä ja parantaa terapeuttista tehoa tässä mallissa. Osoitamme myös, että IFNy kuin immunologinen adjuvantti meidän rokotteen hallinnon lisääntynyt antigeenin esittelyä kohdesoluissa ja maksimoida tätä vaikutusta.

Näkyy on edustava kasvukäyrä lukumäärän RM-1-solut (•) viljelmässä aikaa verrattuna määrä RM-1-PSMA-kloonin 1-soluja (▾), RM-1-PSMA-kloonin 3-soluja (⧫), ja RM-1-GFP-kloonin 2-soluja (▪). Kukin tietopiste on keskiarvo ± keskivirhe kolmen erillisen kokeen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläimet Tässä tutkimuksessa käytettiin saivat inhimillinen hoito perustuu hyväksymien suuntaviivojen mukaan American Veterinary Association sekä mukaisesti

opas hoito ja käyttö Laboratory Animals

(Institute for Laboratory Animal Research, Washington, DC). Kokeellinen protokollat, joihin liittyy elävien eläinten tarkistettiin ja hyväksyttiin Institutional Animal Care ja käyttö komitean LSU Health Sciences Center Shreveport (protokolla P-10-040). Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimyksiä, vähentää käytettyjen eläinten määrää ja hyödyntää vaihtoehtoja

in vivo

tekniikoilla, jos käytettävissä.

Proteiiniekstraktit (20 ug) valmistettiin kustakin solulinja ja laimennettiin RIPA-näytepuskuria. Uutteet erotettiin SDS-PAGE: lla, elektroblotattiin nitroselluloosalle ja tutkittiin anti-ihmis-PSMA-vasta-aine on suunnattu C-terminaalisen proteiinisekvenssin (A) tai anti-ihmis-PSMA-vasta-aine on suunnattu N-terminaalisen proteiinisekvenssin (B) , jota seuraa käsittely vastaavalla anti-lajien IgG HRP-konjugaatteja. Esitetyt tulokset edustavat blotteja jälkeen visualisoinnin autoradiografialla.

Solulinjat

RM-1, androgeenista tunteeton MHC-luokan I-puutosta hiiren eturauhassyöpäsolulinja, joka on syngeeninen C57BL /6 hiirissä [18], saatiin tri Timothy C. Thompson (Baylor College of Medicine, Scott Department of Urology, Houston, TX). Ihmisen transformoitu sikiön munuaisen HEK-293-solulinja saatiin laitoksesta American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% kostutetussa CO

2 ilmakehässä Dulbeccon Minimum Essential Medium (DMEM, Mediatech Inc .; Manassas, VA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gemini Bioproducts, Woodland, CA) ja 1% antibioottista-antimykoottista liuosta (Mediatech Inc .; Manassas, VA).

(A) proteiiniuutteet (20 gg) valmistettiin viljellyistä hiiren dendriittisoluja infektion jälkeen 24 h, CD40- kohdennettuja

Ad5-luc1

tai CD40 kohdistaminen

Ad5-mPSMA

ilmentävät hiiren PSMA tai

Ad5-huPSMA

ilmentävät ihmisen PSMA. (B) Proteiiniekstraktit (20 ug) valmistettiin viljellyistä hiiren dendriittisoluja tartunnan jälkeen 0, 24 tai 48 h kanssa CD40-

Ad5-huPSMA

ilmentävät ihmisen PSMA. Kukin solu-uute valmistettiin käyttäen RIPA-näytepuskuria. Uutteet erotettiin SDS-PAGE: lla, elektroblotattiin nitroselluloosakalvoille ja tutkittiin anti-ihmis-PSMA-vasta-ainetta ja sen jälkeen käsittelemällä vastaava anti-hiiri-IgG HRP-konjugaatteja. Esitetyt tulokset edustavat blotteja jälkeen visualisoinnin autoradiografialla. Latauskontrollina käytti yhdessä käsittelemällä kalvojen anti-hiiri α-tubuliinin vasta-aine.

Eläimet

Male C57BL /6-hiirten 4-6 viikon iässä saatiin Charles River Laboratories (Wilmington, MA).

Arviointi sitoutumisen anti-MHC-luokan I (H-2Db ja H-2Kb) vasta-aineet (A) RM-1 emosoluista, (B) RM-1-GFP-kloonin 2-solut, (C) RM-1-PSMA-klooni 1-soluissa, ja (D) RM-1-PSMA-kloonin 3-soluja. On esitetty histogrammi vastaa käsittelemätöntä (varjostettu) ja solut infektoitiin

Ad5-IFNy

(varjostamattoman).

Generating RM-1 ilmentävien kasvainsolujen Rekombinantti humaani PSMA ja GFP

Ihmisen elongaatiotekijä 1α-alayksikön promoottorin (EF-1α) valittiin siirtogeenin promoottorista. Ihmisen PSMA ja GFP koodaussekvenssit kloonattiin pEF1 /Myc-His-vektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Konstruktit oikea restriktiokuvio valittiin ja sekvensoitiin, ja niitä käytettiin transfektoimaan RM-1-soluja. Sitten solut valitaan 0,8 mg /ml G418: aa (Alexis) ja 2 viikkoa, jolloin saatiin yhden kloonin. Rekombinantin ihmisen PSMA-ilmentyminen antibiooteille resistenttien kloonien määritettiin Western blot -analyysillä (käyttäen jäljempänä kuvattua menetelmää), anti-PSMA monoklonaalista vasta-ainetta tunnustaa N-pään (7E11C5; aiemmin puhdistettu hybridoomasta saatu ATCC) tai C -pään (YPSMA-1, Abcam, Cambridge, MA). Kaksi kloonia ilmaisi havaittavissa oleva määrä PSMA (RM-1-PSMA klooni 1 ja RM-1-PSMA klooni 3). Ne kasvatettiin ja jäädytettiin tarkempaa analysointia. RM-1 ilmentävien kloonien GFP tunnistettiin fluoresenssimikroskopialla. Yksi positiivinen klooni (RM-1-GFP-klooni 2) laajennettiin ja pakastettiin tarkempaa analysointia.

Proteiiniekstraktit (20 ug) valmistettiin kustakin solulinjasta ja laimennettiin RIPA-näytepuskuria. Uutteet erotettiin SDS-PAGE: lla, elektroblotattiin nitroselluloosalle ja koetettiin (A) anti-hiiri-TAP1-vasta-aineen tai (B) anti-hiiri-TAP2-vasta-ainetta, minkä jälkeen käsittelemällä vastaavaa anti-hiiri-IgG HRP-konjugaatteja. Esitetyt tulokset edustavat blotteja jälkeen visualisoinnin autoradiografialla. Latauskontrollina käytti yhdessä käsittelemällä kalvojen anti-hiiren GAPDH-vasta-ainetta.

Kuvassa on edustava käyrä solujen elinkelpoisuuden (A) RM-1-soluja tai (B) RM-1-PSMA-kloonin 3 infektoitujen solujen viljelmässä kasvavien pitoisuuksien kanssa

Ad5-IFNy

verrattuna infektoitumattomiin soluihin. Vaikutus solujen elinkyky määritettiin päivänä 1 (•), päivänä 2 (▾), päivänä 3 (⧫) ja päivänä 4 (▪) aloittamisen jälkeen infektion

Ad5-IFNy

. Kukin tietopiste on keskiarvo ± keskivirhe kolmesta itsenäisestä kokeesta.

adenovirusvektorit

Ad5-huPSMA

rakennettiin subkloonaamalla ihmisen PSMA: tä koodaavan cDNA-sekvenssin osaksi MfeI – BstXI-kohtiin pAdenoVatorCMV5 shuttle-vektoriin (QBiogene, Carlsbad, CA). Saatu pAdenoVatorCMV5-hu-PSMA sukkulavektoriin käytettiin rakentaa adenoviruksen homologisella rekombinaatiolla pAdEasy1 (joka sisältää E1- ja E3 poistetaan Ad5 selkäranka) on

E. coli

aikaisemmin kuvattuja menetelmiä käyttäen [19]. Saatu yhdistelmä-DNA-plasmidi linearisoitiin Pac I ja transfektoitiin HEK-293-soluista, tuottaa

Ad5-huPSMA

virus.

Ad5-luc1

, ihmisen Ad serotyyppi 5 vektori sisältää tulikärpäsen lusiferaasi ekspressiokasetin sisällä E1 poistettua aluetta saatiin tohtori Igor Dmitriev (Washington University School of Medicine, St. Louis, MO).

Ad5-IFNy

, ihmisen Ad serotyyppi 5 vektori, joka koostuu E1-poistettu ihmisen serotyyppi 5 Ad kanan β-aktiini ajava promoottori ilmentymisen hiiren IFNy cDNA saatiin tri Hirofumi Hamada (Department of Molecular Medicine, Sapporo Medical University, Sapporo, Japani). Adenoviruksen varastoja kasvatettiin ja monistettiin ihmisen muuttaneet sikiön munuaisen HEK-293-solulinja. Korkean tiitterin adenovirusvarasto- puhdistettiin käyttäen Adenopure puhdistuspakkausta (Puresyn, Inc, Malvern, PA). Puhdistuksen jälkeen virukset kvantifioitiin käyttäen Adeno-X Rapid Titer Kit (BD Biosciences, Palo Alto, CA). Virukset dialysoitiin yön yli dialyysipuskuria (kalium fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, joka sisälsi 1 M sakkaroosia ja 0,5% β-syklodekstriini), 4 ° C: ssa ennen varastointia -80 ° C: ssa.

Hiiret immunisoitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmiä infektoituja dendriittisoluja CD40 kohdistaminen

Ad5-luc1

tai CD40 kohdistaminen

Ad5-huPSMA

. Päivänä 24 sen jälkeen, kun kokeen aloittamista, eläimet lopetettiin, ja CTL-aktiivisuus mitattiin solujen kerättiin pernat. Kohdesoluja käytettiin RM-1 vanhempien (•), RM-1-PSMA klooni 1-solut (▾), RM-1-PSMA klooni 3-solut (⧫), ja RM-1-GFP kloonin 2-solut (▪). Kohdesoluja olivat joko käsittelemättömiä (A ja C) tai esikäsitelty infektion

Ad5-IFNy

(B ja D). Kukin tietopiste on keskiarvo ± keskivirhe neljää rinnakkaista kuoppiin.

CD40-ligandeja,

Rekombinantti molekyylipainon sovitin proteiinia, joka koostuu liukoisen ekstrasellulaarisen domeenin Coxsackie ja adenovirus-reseptori liittyy hiiren CD40-ligandin kautta trimerzation motiivi (CFm40L) rakennettiin, tuotettiin ja puhdistettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [14], ja sitä käytetään kohdistusluetteloita adenovirusvektorit hiiren DC.

Hiiret immunisoitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät CD40 kohdistaminen

Ad5-luc1

tai CD40 kohdistaminen

Ad5-huPSMA

. Päivänä 24 sen jälkeen, kun kokeen aloittamista, eläimet lopetettiin, ja CTL-aktiivisuus mitattiin solujen kerättiin pernat. Kontrollina, CTL-aktiivisuus mitattiin kerättyjä soluja pernat infektoitunut (käsittelemättömän) hiirillä. Kohdesoluja käytettiin RM-1 vanhempien (•), RM-1-PSMA klooni 1-solut (▾), RM-1-PSMA klooni 3-solut (⧫), ja RM-1-GFP kloonin 2-solut (▪). Kohdesoluja olivat joko käsittelemättömiä (A, C, ja E) tai esikäsitelty infektion

Ad5-IFNy

(B, D ja F). Kukin tietopiste on keskiarvo ± keskivirhe neljä jäljitellä kaivojen.

Western Blot analyysi TAP Expression

Ohjaus RM-1-soluissa ja RM-1 soluja inkuboitiin 24 h

Ad5-IFNy

on infektiokertoimella (MOI) 100 IFU /solu kerättiin ja lysaatit valmistettiin RIPA näytepuskuriin. Proteiinikonsentraatiot näytteet normalisoitiin Bradford-määrityksellä. Näytteet ajettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) geelit ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) ja pestiin TTBS (1% Tween-20: Tris-puskuroitu suolaliuos). Sen jälkeen kalvoja inkuboitiin anti-hiiri-TAP1, anti-hiiri-TAP2, tai anti-hiiri-GAPDH-vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 1 tunnin ajan. Kolmen peräkkäisen pesun TTBS: llä, kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta 1 tunnin ajan, ja pestiin kolme kertaa kulloinkin 30 min TTBS: llä. Lopuksi kalvot kehitettiin käyttämällä ECL-substraatilla (Amersham, Piscataway, NJ), ja altistettiin röntgenfilmille.

(A) Sytotoksinen aktiivisuus NK-efektorisolujen on YAC-1 ja RM-1 kohdesoluja määritettiin

51Cr-release assay ilmoitetuilla E: T-suhteet. Kohdesoluja käytettiin YAC-1 (•), RM-1 vanhempien (▾), RM-1 emosoluilta esikäsitelty infektion

Ad5-IFNy

(▪), RM-1-PSMA-kloonin 3 solut (⧫), tai RM-1-PSMA-kloonin 3-soluja esikäsitellään infektion

Ad5-IFNy

(▴). Kukin tietopiste on keskiarvo ± keskivirhe neljä rinnakkaisten kaivojen. (B) Virtaussytometrianalyysi YAC-1 ja RM-1-solut värjättiin PE leimatun anti-H60, anti-MULT-1 tai anti-Rae-1-vasta-aineiden kanssa tai isotyypin kontrollivasta-ainetta. Numeroita histogrammit vastaavat fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo jokaisen piikin.

antituumorivaikutus on CD40-kohdennettu

Ad5-huPSMA

rokote määritettiin käyttämällä RM-1-PSMA-hiirimallissa . Hiiret immunisoitiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät CD40 kohdistaminen

Ad5-luc1

tai CD40 kohdistaminen

Ad5-huPSMA

. Päivänä 24 aloittamisen jälkeen kokeen, kukin hiiri sai 4 × 10

6 RM-1 vanhempien soluja tai 4 x 10

6 RM-1-PSMA klooni 1 soluja ihon alle. Kolme päivää myöhemmin, hoitoryhmien injektoitiin paikassa, tuumorisolujen injektion 1 x 10

8 IFU on

Ad5-IFNy

tai normaalia suolaliuosta. Alku ajankohtana kasvainsolualtistuksen (päivä 0), kasvaimet mitattiin ja tilavuudet lasketaan kaavalla:

kasvaimen tilavuus =

½ × (

pituus

×

leveys

2), jossa pituus on pisin etäisyys kasvain. Kukin datapiste edustaa keskimääräinen tilavuus 15 kasvainten ± keskivirhe.

virtaussytometria analyysi MHC-luokan I ilmentyminen

RM-1-soluja (vanhempien sekä RM-1- PSMA-kloonit, jotka ilmentävät ihmisen PSMA) analysoitiin solun pinnalla MHC-luokan I (Db ja Kb). Lyhyesti, RM-1-soluja infektoitiin 24 tunnin ajan

Ad5-IFNy

MOI 100. 24 h post-inkuboinnin jälkeen solut otettiin talteen ja immunovärjättiin käyttäen fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) leimattu anti-hiiri-H- -2Kb /H-2Db- vasta-ainetta (BD Biosciences, San Jose, CA). Tämä vasta-aine reagoi hiiren H-2Kb MHC-luokan I alloantigeeniselle haplotyypin ja rajat reagoi H-2Db-, mutta ei reagoi muiden haplotypes. Soluja inkuboitiin vasta-aineen kanssa (1:1000 laimennus) 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja pestiin 3 kertaa jääkylmällä PBS: llä. Isotyyppiä vasta-ainetta (hiiren IgG2a, κ) käytettiin myös immunostain solujen negatiivisena kontrollina. Tämän jälkeen solut kiinnitettiin 1% paraformaldehydi 5 min pimeässä, pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 200 ui PBS-puskurissa voidaan analysoitiin virtaussytometrialla (FACSCalibur; BD Biosciences).

valmistelu luuytimestä peräisin DC

Bone luuytimestä johdettujen DC: itä syntyy 4-6 viikkoa vanhoja C57BL /6-uroshiirissä. DC viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [20] kanssa joitakin muutoksia. DC viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää (Atlanta Biosciences), 10 ng /ml: n rekombinantti-granulosyytti-makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF) ja interleukiini-4 (IL-4) PeproTech Inc (Rock Hill, NJ). Päivänä 3 kulttuurin, tuoretta väliainetta lisättiin DC kulttuureissa. Päivänä 6 viljelyn, DC altistettiin 4 tunnin ajan CD40-suunnataan uudelleen

Ad5-huPSMA

MOI 100. Tämän jälkeen DC: t kypsytetään inkuboimalla 100 ng /ml lipopolysakkaridia (LPS, Sigma, St. Louis, MO) yön yli. Erääntynyt DC pestiin kahdesti PBS: llä ja annettiin vatsaonteloon (ip) injektiona C57BL /6-hiiristä.

Immuunivasteen rokotuksen jälkeen käyttäen DC stimuloidun

ex vivo

Ad5-huPSMA

hiiret rokotettiin Ad-infektoitujen DC (1 x 10

6 solua /hiiri) suspendoitiin steriiliin PBS kokonaistilavuudessa 50 ui ip injektio päivänä 0 ja 14. Päivänä 24 hiiret lopetettiin ja pernat kerättiin. Yhden solun suspensiot valmistettiin hienontamalla pernat seerumivapaassa RPMI saksilla ja lempeä toistuva pipetointi, minkä jälkeen viemällä suspensioiden läpi 100 uM nailonverkon. Punasolut lyysattiin lyysipuskurilla, ja puhdistettu T-solut pestiin kaksi kertaa seerumittomassa väliaineessa, laskettiin ja ympättiin tiheydellä 1 x 10

6 solua per kuoppa 24-kuoppalevyille 500 ui seerumia.

Immuunivasteen jälkeen suora rokottaminen

in vivo

Ad5-huPSMA

C57BL /6-hiiret immunisoitiin suoraan ip injektiota

Ad5-huPSMA

. Jokainen hiiri injektoitiin 1 x 10

9 IFU on

Ad5-huPSMA

yksin tai 1 x 10

9 IFU on

Ad5-huPSMA

kompleksoituna 1200 ng CFm40L on päivänä 0. toinen annos annettiin 14 päivää myöhemmin. Tällä 24 päivää ensimmäisen immunisoinnin jälkeen, hiiret lopetettiin ja pernat otettiin talteen ja T-soluja viljeltiin, kuten edellä on kuvattu.

tuottaa CTL: ien ja esittävät Sytotoksisuus Testit

Viljellyt T-solut hiiren pernat uudelleen stimuloitiin 6 päivää lisäämällä säteilytettyä HEK-293-solut infektoitiin

Ad5-huPSMA

yli ilmaista PSMA-antigeenin. Seuraavat uudelleen stimulaatiota, T-solut kerättiin ja erotettiin kuolleita soluja. Sytotoksisuus määritettiin standardin 4 h kromin vapautumisen määrityksellä käyttäen stimuloitujen T-solujen efektorisolujen (E) ja RM-1-solulinjoja erityisiä tavoitteita (T) osoitetussa E: T-suhteet. RM-1-solulinjoja (RM-1-PSMA-klooni 1, RM-1-PSMA-kloonin 3 ja RM-1-GFP-klooni 2) käytettiin suoraan kohdesoluja tai aiemmin inkuboitiin 24 h

Ad5 -IFNγ

(MOI 100). Solut leimattiin 100 uCi Na

2

51CrO

4 1,5 tuntia 37 ° C: ssa. Sen jälkeen, 1 x 10

3 leimattuja kohdesoluja oli viljeltiin yhdessä eri määrä efektorisolujen 96-kuoppaisille (v-pohjalevyt) 4 h 37 ° C: ssa. Lopussa viljelyn, 100 ui supernatantit kerättiin ja radioaktiivisuus mitattiin gamma-laskurilla. Maksimi ja spontaani vapautuminen

51Cr saatiin supernatanteista kohdesolujen 1% Nonidet P-40 ja pelkästään väliainetta vastaavasti. Kaikki kokeet suoritettiin neljänä rinnakkaisena kuoppiin. Tunniste

51Cr-vapautuminen mitattiin gammalaskurilla (LKB Instruments, Gaithersburg, MD) ja prosentuaalinen spesifinen lyysi laskettiin seuraavalla kaavalla:

% spesifistä liukenemista = [(kokeellinen cpm – spontaani cpm) /(maksimaalinen cpm – spontaani cpm)]

x

100.

virtaussytometria analyysi NKG2D Ligandin Expression

RM-1-PSMA klooni 3-soluissa ja YAC-1-solut maljattiin 100000 solua /kuoppa 24-kuoppaisiin kudosviljelymaljoihin. Solujen annettiin kiinnittyä yön yli inkubointi 37 ° C: ssa. Seuraavana päivänä soluja inkuboitiin puuttuessa tai läsnä ollessa

Ad5-IFNy

on 100:1 MOI 37 ​​° C: ssa seerumittomassa alustassa. 2 h infektion jälkeen, virus sisältävä elatusaine korvattiin täydellisen kasvun elatusainetta, joka sisälsi 10% FBS: ää. 48 tunnin kuluttua, käsittelemättömien tai

Ad5-IFNy

käsitellyt solut kerättiin ja pestiin kahdesti PBS: llä. Soluja inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa fykoerytriini (PE) leimattua rotan IgG

2A isotyyppikontrollivasta-ainetta (R La Jolla, CA). Data katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun P 0,05.

Tulokset

RM-1 Mouse Prostate Cancer Cell Lines, jotka ilmentävät ihmisen PSMA

täysimittaista ihmisen PSMA cDNA-sekvenssi kloonattiin nisäkkään ekspressioplasmidivektoriin pEF1 /V5-His alavirtaan tehostaja /promoottorielementit ihmisen elongaatiotekijä 1α alayksikön (HEF-1α) korkean tason ilmentymistä nisäkässoluissa. Negatiivisena kontrollina, vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) cDNA kloonattiin myös pEF1 /V5-His-ekspressiovektoriin. Hiiren eturauhasen syöpä solulinja RM-1 transfektoitiin ekspressiovektoreilla, ja yksittäiset kloonit eristettiin G418-valinnan ja sen jälkeen rajoittavalla laimennuksella. Kolme yksittäistä kloonia eristettiin: RM-1-PSMA klooni 1 ja RM-1-PSMA klooni 3 ilmentävät ihmisen PSMA cDNA ja RM-1-GFP-kloonin 2 ilmentää GFP cDNA.