Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

guaniini-rikas lohkon sisällä promoottori

KRAS

geeni voidaan taittaa osaksi molekyylin sisäisiä G-Nelivaiheinen rakenne (G4), joka on tärkeä rooli säätelyssä

KRAS

transkriptio. Olemme aikaisemmin tunnistettu indolo [3,2

b

] kinoliinien 7-karboksylaatti ja sen kolmessa alkyyliamiini sivuketjut (IQ3A) tehokkaina G4 stabilointi ja lupaavia selektiivinen syövän vastaista johtaa. Tässä tutkimme syövän vastaisen vaikutusmekanismi näiden yhdisteiden, jota arveltu vuoksi vakauttamiseen G4 sekvenssin

KRAS

promoottori ja myöhemmin alas-geenin ilmentymisen säätelyyn.

Menetelmät /Principal havainnot

IQ3A yhdisteet osoittivat suurempaa vakauttaminen G4 verrattuna duplex DNA rakenteet ja pienentää

KRAS

promoottorin aktiivisuutta dual lusiferaasireport- määritys. Lisäksi IQ3A yhdisteet osoittivat korkeaa antiproliferatiivista aktiivisuutta HCT116 ja SW620 paksusuolen syövän soluja (IC

50 2,69 uM), ilman aikaansaamaan solukuoleman hyvänlaatuisen HEK293T- ihmisen alkion munuainen ja ihmisen koolonin fibroblasteissa CCD18co. IQ3A yhdisteet vähensi

KRAS

mRNA ja proteiini vakaan tason IC

50 pitoisuuksia, ja lisääntynyt p53-proteiinin vakaan tason ja solukuolema in HCT116-soluissa (mut

KRAS

, paino

p53

). Lisäksi KRAS hiljentäminen in HCT116 p53 villityypin (p53 (+ /+)) ja nolla (p53 (- /-)) isogeenisiin solulinjat indusoi korkeamman solukuoleman, ja korkeampi IQ3A-indusoituvaa solukuolemaa HCT116 p53 (+ /+) verrattuna HCT116 p53 (- /-).

Johtopäätökset

Tässä tarjoamme todisteita siitä, että G4 ligandit kuten IQ3A yhdisteet voivat kohdistaa G4 motiiveja esittää

KRAS

promoottori, alas-säätelemään mutantti

KRAS

geeni estämällä transkription ja translaation, ja aiheuttavat solujen kuoleman apoptoosin koolonsyöpäsolulinjaa. Näin ollen, KRAS on genomitasolla G4 ligandit voivat olla uusi syöpähoidolla strategian paksusuolensyöpä.

Citation: Brito H, Martins AC, Lavrado J, Mendes E, Francisco AP, Santos SA, et al . (2015) kohdistaminen

KRAS

Oncogene in koolonkarsinoomasoluissa 7-karboksylaatti indolo [3,2

b

] kinoliini Tri-alkyyliamiinijohdannaisia. PLoS ONE 10 (5): e0126891. doi: 10,1371 /journal.pone.0126891

Academic Editor A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 06 tammikuu 2015; Hyväksytty: 08 huhtikuu 2015; Julkaistu: toukokuu 29, 2015

Copyright: © 2015 Brito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tekijät alkaen IMED-ULisboa tunnustaa Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugali, taloudellisen tuen kautta hankeavustuksista EXPL /QEQ-MED /0502 /2012 HMSP-ICT /0018/2011, ja tuhoeläinten OE /SAU /UI4013 /2014. HB, CMPR ja PMB kiittää myös Sociedade Portuguesa de Gastroenterologia ja Korea Human Gene Bank (KHGB), Medical Genomics Research Center, KRIBB, Korean tasavalta. JL tunnustaa FCT varten Post-Doctoral myöntävät SFRH /BPD /72903/2010: n ja SAS PhD apurahan SFRH /BD /80162/2011. Neidle laboratorio myöntää tukea Haimasyöpä Research Fund ja Medical Research Council. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

KRAS

geeni koodaa G-proteiini, joka toimii molekyylipainon vaihtaa endoteelin kasvutekijän reseptori ja ytimen, joka ohjaa useita signalointireittejä tärkeä solujen kasvua ja selviytymistä. KRAS GTPaasina olemassa kaksi valtiota, GTP: hen sitoutuneen aktiivitilan ja BKT-sidottu aktiivinen tila. Edelleen,

KRAS

mutaatiot lisäävät KRAS affiniteetti GTP johtaa konstitutiiviseen aktivoitumiseen proteiinin. Tärkeää on, poistaminen mutantti

KRAS

alleeli koolonsyöpäsolulinjaa vähentää dramaattisesti solujen lisääntymistä [1], korostetaan, että monet kasvaimet kätkeminen mutantti

KRAS

ovat KRAS riippuvia.

KRAS

mutaatiot ovat enimmäkseen yleisiä haiman (90-60%), peräsuolen (30-50%) ja keuhkojen (20-30%) karsinoomien [2]. Johtuen yleisyydestä näiden syöpien maailmanlaajuisesti [3] sekä lisääntyneen resistenssin tavanomaiseen kemoterapiaan [4], löytää uusia kohteita on tehostettu viime viime vuosina.

tärkeys terapeuttinen modulaation KRAS signaloinnin on laajalti tunnustettu ja useita lähestymistapoja on raportoitu aikaisemmin, mutta kukaan ei ole säädetty hyväksytty uusi syöpälääkkeen mennessä [5]. Innovatiivinen terapeuttinen lähestymistapa tutkitaan on käyttää miRNA, koska niillä on tärkeä rooli kemiallis-herkistymistä [6]. Olemme aiemmin osoittaneet, että miRNA-143, joka myös vähentää

KRAS

ilmaisu, chemosensitizes koolonkarsinoomasoluissa 5-fluorourasiilin [7], ja vähentää kasvaimen kasvu

in vivo

, voimistunutta apoptoosia ja pienentää leviämisen [8].

Jatkuva tutkimuksissamme, joilla pyritään löytämään uusia ja selektiivisiä syöpälääkkeet, pyritään kehittämällä useita kemiallisia järjestelmiä käytetään erilaisissa hoitostrategioita [9], [10], [11 ], raportoimme täällä lähestymistavasta kohdistaminen KRAS signalointi syöpäsoluissa suoraan moduloimalla

KRAS

ilmentymisen geenin tasolla. Se on hiljattain osoitettu, että guaniini-rikas lohkon sisällä promoottori

KRAS

voidaan taittaa osaksi molekyylin sisäisiä G-Nelivaiheinen rakenne (G4), joka on tärkeä rooli säätelyssä

KRAS

transkriptio [12], [13]. G4 järjestelyt ovat nukleiinihappo korkeamman asteen rakenteita, muodostetaan sekvenssejä, jotka sisältävät toistuvia guaniini (G) rikas kirjoitusten [14]. Useat tutkimukset ovat tarjonneet todisteita olemassaolosta G4 eukaryootti- telomeres ja onkogeeni promoottorit, mukaan lukien

KRAS

,

HRAS

,

HSP90

,

c-MYC

,

c-KIT

,

BCL-2

ja

VEGF

geenejä, ja että pienet molekyylit vakauttava G4 rakenteet pystyvät alas-säädellä onkogeeni transkription kasvain solulinjat, estävät telomeraasiaktiivisuutta ja aiheuttaa syöpäsolujen kasvua pidätys [15], [16], [17]. G4 rakenteita on löydetty myös RNA-sekvenssit, kuten 5’transloimaton alue (UTR) on

KRAS

mRNA, ja osoitettu olevan käännös säätelytoimintoja [18], [19], [20].

Indoloquinolines ovat luonnollisia alkaloideja voidaan kohdentaa DNA rakenteita, joista osa on potentiaalia kehityksen syöpälääkkeiden [21], [22]. Indolo [3,2

b

] kinoliini johdannaiset on osoitettu olevan voimakkaita G4 ligandeja, ja estävät solujen proliferaatiota ja onkogeenin (

c-MYC

) transkription [21], [23 ], [24]. Lisäksi olemme viime aikoina havainneet, että indolo [3,2

b

] kinoliinien 7-karboksylaatti ja sen kolmessa alkyyliamiini sivuketjut (1a ja 2a kuvassa 1) ovat lupaavia selektiivinen syövänvastainen johtaa [25]. Nämä yhdisteet inhiboivat selektiivisesti (100-kertainen) kasvu

KRAS

mutantti HCT116 koolonkarsinoomasoluissa verrattuna ensisijaisen rotan maksasoluilla, ja vähentävät KRAS-proteiinin tasoja. Jotta hyödyntää tätä telineen kohti löytö uusi ja parannettu syöpälääkkeet, olemme laajentaneet kemiallinen erilaisuus näiden indoloquinolines ja tutkittu niiden mahdollisia syövän vastaisen vaikutusmekanismi. Edellinen rakenne-aktiivisuus tutkimuksissa mono-alkyyliamiinin indolo [3,2

b

] kinoliinien ovat osoittaneet, että optimaalinen G4 vakauttaminen aiheutettiin yhdisteitä propyyli sivuketjuja ja perus amiiniryhmien (p

Ka

≥ 8) [25]. Siten yhdisteet 1a-d ja 2 a-d (kuvio 1) on suunniteltu, syntetisoitiin ja arvioitiin selektiivinen G4 lämpöstabiloimiseen verrataan duplex DNA yhdessä inhibitio syöpäsolujen proliferaation, apoptoosin induktio ja alas-säätely

KRAS

ja

HSP90

transkriptio ja proteiinin ilmentymiseen. Parantaakseen syövän vastaista aktiivisuutta profiilin ja

KRAS

onkogeeni alassäätöä kapasiteetti tavoitteemme indoloquinolines, olemme käyttäneet neljä solulinjoissa erilaiset

KRAS

ja

TP53

genotyypit , sekä kaksi positiivisia kontrolleja, syöpälääke 5-fluorourasiilin (5-FU) ja G4 ligandin TMPyP4 (kuvio 1).

7-karboksylaatti indolo [3,2

b

] kinoliini tri-alkyyliamiini johdannaisia ​​(IQ3A) 1a-d ja 2a-d; G4 ligandi porfyriinijohdannaista TMPyP4 ja 5-fluorourasiilin (5-FU) syöpälääkkeen.

Tulokset ja keskustelu

Yhdisteet 1a-d ja 2a-d syntetisoitiin neljässä vaiheessa jälkeen menetellen aikaisemmin kuvatulla tavalla [25] muutamin muutoksin (S1 Text). Rakenteet 1a-d ja 2a-d olivat täysin valaistaan ​​kaksiulotteisesta

1H (COSY ja NOESY) ja

13C heterocorrelation NMR-kokeet (HMQC ja HMBC) ja puhtaus ( 95%) vahvistettiin HPLC- ELSD- MS (S1 Kuva).

kapasiteetti yhdisteiden 1a-d, 2a-d ja tavallinen G4 ligandia TMPyP4 (kuvio 1) [16] sitoa ja vakauttaa

KRAS

[26] ja

HSP90A

[27] G4 DNA rakenteita sekä duplex DNA (T-loop) arvioitiin jonka Fluoresenssiresonanssienergiasiirtoa (FRET) sulaminen määrityksessä. Kasvu sulamisen aiheuttama eri konsentraatioita yhdisteitä, on esitetty taulukossa 1 ja S2 kuvion. Tuloksemme osoittavat, että tri-alkyyliamiini indolo [3,2

b

] kinoliinien (IQ3A) ovat tehokkaita ja selektiivisiä ligandeja

KRAS

ja

HSP90A

G4 rakenteita. Kuten aikaisemmin havaittu mono- ja di-alkyyliamiini analogit [25] ja muiden polyaromaattisten fuusioituneet G4 ligandien [28], [29], yhdisteet, propyyliamiinin sivuketjut (1d ja 2d) ovat parempia G4 stabilisaattorit (Δ

T

m välillä 18 ja 23 ° C: ssa 2 uM ligandi) kuin yhdisteet, joilla on lyhyt alkyyliamiinin sivuketjut (1a-b ja 2a-b, Δ

T

m arvojen 7 ja 17 ° C 2 uM ligandikonsentraatioon). Havaittiin, että emäksisyys sivuketjujen korreloi positiivisesti termisen G4 vakauttamiseen kaikki DNA-sekvenssit jopa optimaalinen pKa ~ 8,0-9,0 (kuvio 2). Heterosykliset amiinit lopussa alkyyli- sivuketjun (1b ja 2b) näyttää parantaa sitoutumista G4 ja monimutkaisia ​​stabilointi verrattuna di-etyyliamiini ryhmä (1a ja 2a), jota ei voida selittää eroilla emäksisyyden välillä pääteryhmiä. Lisäksi ja sen mukaisesti, mitä on aiemmin havaittu di-alkyyliamiini indoloquinolines [25], tämä tutkimus osoittaa, että N5, N10, COO tri-korvautuminen heterosykliset amiiniryhmiä at alkyylisivuketju päät kasvu Ligandiaffiniteetin G4, kuten 2b, d -G4 DNA-kompleksit on korkeampi sulamis- lämpötilat kuin kompleksit kirjeenvaihtaja isomeerien 1b, d. Kuitenkin, tämä ei havaittu isomeeriselle pari 1a /2a. Huolimatta lisääntyneestä G4 stabilointikykyä ligandit 2b ja 2d eivät pystyneet merkittävästi syrjiä kahden DNA G4 rakenteet (taulukko 1).

. Laskettu p

K

arvoihin sivuketjumetabolian amiiniryhmien by SPARC (v. 4.6). B. Tontit vaihtelun G4 lämpöstabiloimiseen yhdisteillä (Δ

T

m) emäksisyys (p

K

a) sivuketjuja ryhmiä.

vaikutuksen tutkimiseksi IQ3A yhdisteiden syövän ja ei-syöpäsolujen, valitsimme yhdiste 2d kiinnitettävää G4 stabilointikykyä

in vitro

ja pari 1a ja 2a, jotka huolimatta näkyy alhaisempia Δ

T

m arvot kunkin komplekseja G4 DNA, voivat vähentää

KRAS

ilmaisun inkuboitaessa HCT116 peräsuolen syövän soluja, kuten olemme aiemmin osoittaneet [25].

lyhytaikainen vaikutus yhdisteiden 72 tunnin solujen kasvuun tutkittiin kolorektaalikarsinoomasolulinjaa linjoihin eri

KRAS

ja

TP53

genotyypit: paksu- ja HCT116 (mut

Kras

, villityypin (wt)

p53

), ja ihmisen metastasoituneen kolorektaalisyövän adenokarsinooman SW620 (mut

Kras

, mut

p53

). Samanaikaisesti olemme myös käyttäneet kuolemattomaksi ihmisalkion munuais- solulinja HEK293T- (paino

Kras

, paino

p53

) ja normaalin ihmisen paksusuolen fibroblastisoluja CCD18co (paino

Kras

, p-

p53

). IC

50 ja IC

65 Taulukon 2 arvot osoittavat, että yhdisteet 2a ja 2d näyttö superior antiproliferatiivista aktiivisuutta verrattuna 1a ja 5-FU, etenkin metastaattisen SW620-soluissa, jossa 2d antoi IC

50-arvo (0,28 uM), lähes 20 kertaa pienempi kuin standardin syöpälääke 5-FU (IC

50 = 5.39 uM). Mielenkiintoista on, että paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja, HCT116 ja SW620, jotka ilmentävät KRAS, olivat erityisen epäherkkiä porfyriinijohdannaista TMPyP4, toisin kuin pahanlaatuiset HEK293T solut, jotka ilmentävät villityyppistä KRAS. Lisäksi, IQ3A yhdisteet ja 5-FU eivät olleet selektiivisiä syöpäsolut ilmentävät KRAS, koska ne olivat yhtä aktiivisia HCT116, SW620 ja HEK293T-soluissa. Olemme kuitenkin havaittu joitakin selektiivisyys (SI 2,4; taulukko 2) kohti koolonisyöpäsolulinja HCT116 verrattuna normaaliin koolonin fibroblasteissa (CCD18co).

Seuraavaksi guava ViaCount määritystä käytettiin arvioimaan vaikutukset IQ3A yhdisteiden solukuoleman induktioon syövän (HCT116 ja SW620) ja ei-pahanlaatuiset (HEK293T- ja CCD18co) soluja, verrattuna 5-FU ja TMPyP4 klo equitoxic pitoisuuksina (IC

50 ja IC

65) . Down-regulation mutantti

KRAS

ilmentymisen antisense-oligonukleotideja kolorektaalisyövässä soluissa [7], [8], [30] ja jonka MAZ sitova oligonukleotidi-syötti haiman syöpäsoluissa [31] on liittynyt lisääntynyttä apoptoosia ja solujen kasvun pysähtymistä. Lisäksi, syöpälääkkeet, kuten 5-FU ja G4 stabilointiaineet telomeerinen ja onkogeenin promoottorisekvenssit, kuten TMPyP4, tiedetään indusoivan yleisen soluvaste, joka johtaa solujen kasvun pysähtymisen ja apoptoosin aiheuttaman solukuoleman (DNA-vaurioita vaste) [15], [32], joka käsittää aktivoinnin pro-apoptoottisen transkriptiotekijä p53 muun reittejä tapauksessa 5-FU: [34]. Kuvio 3 osoittaa, että testi yhdisteillä on selvä vaikutus solujen, riippuen yhdisteen rakenteesta ja luultavasti myös geneettisen taustan yksittäisen solulinjan. Vuonna HCT116-soluissa, kaikki yhdisteet aiheuttama solukuolema, mutta IQ3A yhdisteet osoittivat merkittävin apoptoottinen vaikutus, suuntaus 1 a 2a 2d, ja aiheuttavat 30-70% solukuoleman pitoisuuksina 0,58-3,42 uM (IC

65) (kuvio 3B, ylempi vasen paneeli). Toisaalta, kaikki yhdisteet eivät pystyneet indusoimaan merkittäviä solukuolemaa HEK293T ja CCD18co-soluissa (kuvio 3A ja 3B, alempi paneeli), kun taas SW620-soluissa vain 5-FU kykeni indusoimaan apoptoosin annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3A ja 3B , ylhäällä oikealla paneeli). Vaikutus TMPyP4 on SW620 ei ole tutkittu, koska tämä solulinja ei ollut herkkä tätä yhdistettä jopa 20 uM.

Solupopulaatiot saatiin guava ViaCount virtaussytometrialla seuraavasti 72 h inkubaation HCT116 paksusuolensyöpä , SW620 metastaattinen paksusuolen syövän, CCD18co ihmisen koolonin fibroblasteissa ja HEK293T- alkion munuaissolulinjoissa 5-FU, TMPyP4 ja IQ3A klo equitoxic (IC

50 ja IC

65) pitoisuudet tai DMSO (ajoneuvon hallinnan). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona prosentteina (%) elinkelpoisia, mid-apoptoottiset ja kuolleet solut ± SEM, vähintään kolmen eri kokeessa, A. IC

50, ja B. IC

65 yhdisteen pitoisuuksia. a, p 0,05; b, p 0.01 DMSO (ajoneuvon valvonta); c, p 0,05; ja d, p 0,01 5-FU.

edelleen vahvistaa vaikutuksen IQ3A yhdisteiden vaikutusta apoptoosin induktio HCT116-soluissa, apoptoosin varmistettiin arvioimalla muutoksia ydin- morfologia Hoechst-värjäys, ja myös neksiini määritys, seuraavat 72 h inkubaation IQ3A yhdisteitä IC

50 pitoisuuksia. CCD18co soluja käytettiin rinnakkain vahvistaa, että IQ3A eivät aikaan solukuolemaa normaaleissa soluissa. Nämä tulokset osoittivat, että IQ3A merkittävästi indusoi apoptoosia HCT116-soluissa, yhdisteellä 1 a tuottaa huomattavasti enemmän apoptoosin verrattuna vehikkeliin (kuvio 4A ja 4B). Lisäksi meillä on myös vahvistanut, että IQ3A yhdisteet eivät indusoi apoptoosia normaaleissa koolonin fibroblasteissa CCD18co. P53-proteiini on keskeinen ja ratkaiseva rooli ihmisen syövissä [33], jolla on voimakas kasvaimen tukahduttava aktiivisuus kautta pleiotrooppista mekanismeja. Siksi vakaan tason p53-proteiinin arvioitiin immunoblottauksella, seuraavien 72 tunnin inkubaation IQ3A yhdisteitä IC

50 pitoisuuksia, selvittämään niiden osallistuminen mekanismista apoptoosin aikaansaama IQ3A. Tuloksemme (kuvio 5A) osoittavat selvästi, että IQ3A lisääntynyt p53-proteiinin vakaan tilan pitoisuudet HCT116 4-7 kertaiseksi (

p

0,01) (kuvio 5A, vasen paneeli), mikä saattaa olla yhteydessä korkeamman solukuoleman varmistettiin Guava ViaCount määrityksessä. Vuonna SW620-soluissa, ei suurentunut merkitsevästi p53 vakaan tilan ekspressiota havaittiin, johtuen mahdollisesti mutantin asemaa p53 (kuvio 5A, keskimmäinen paneeli). Lopuksi HEK293T- soluissa, IQ3A osoitti mitään vaikutusta p53-proteiinin ilmentymisen, sopusoinnussa ilman solukuolemaa elinkelpoisuuden määrityksessä (kuvio 5A, oikea paneeli). Lisäksi olemme edelleen tutkitaan merkitystä p53 mekanismiin apoptoosin aikaansaama IQ3A, hiljentämällä KRAS vuonna HCT116 p53 villikannan (p53 (+ /+)) ja nolla (p53 (- /-)) isogeenisiin solulinjat, ja arvioimalla sen vaikutus solukuolemaa, ja IQ3A aiheuttama solukuolema (kuvio 5B). Tuloksemme osoittavat selvästi, että KRAS hiljentäminen indusoi korkeamman solukuoleman verrattuna siRNA-ohjaus (

p

0,05), ja korkeampi IQ3A-indusoituvaa solukuolemaa HCT116 p53 (+ /+) verrattuna HCT116 p53 (- /-) (

p

0,05 2a ja 1a). Edelleen, siRNA ohjaus transfektoiduissa soluissa, kaikki IQ3A indusoituu merkittävästi korkeampi solukuoleman HCT116 p53 (+ /+) verrattuna HCT116 p53 (- /-) (

p

0,05). Kuitenkin p53 mutantti SW620-soluissa, IQ3A yhdisteet eivät merkitsevästi saada solukuolemaa (kuvio 3), eivätkä ne lisäävät p53-proteiinin vakaan tilan ilmaisu (kuvio 5). Yhteisymmärryksessä, KRAS ja /tai HSP90 hiljentäminen voineet aiheuttaa solukuoleman tässä solulinjassa, kun taas KRAS Äänenvaimennusjärjestelmä indusoi annoksesta riippuvan vaikutuksen vähentämisessä SW620 soluproliferaation (S3 kuvassa). Yhdessä nämä tiedot vahvistavat edelleen, että on tärkeää p53 IQ3A apoptoosin induktion.

. Nuclear morfologia ja edustavat kuvat HCT116 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa ja CCD18co ihmisen koolonin fibroblasteissa jälkeen Hoechst värjäyksen arvioituna fluoresenssimikroskopialla 72 tunnin kuluttua altistuksen equitoxic (IC

50) pitoisuuksia 5-FU, TMPyP4 ja IQ3A tai DMSO: ssa (ajoneuvon ohjaus) klo 400x suurennuksella. Valkoinen Nuolet ilmaisevat ydin- pirstoutuminen ja kromatiinin tiivistyminen, ja B. Apoptotic solupopulaatioiden saatu Guava neksiini virtaussytometrialla seuraavat 72 h inkubaation HCT116 ja CCD18co solujen 5-FU, TMPyP4 ja IQ3A klo equitoxic (IC

50) pitoisuudet tai DMSO (ajoneuvon kontrolli). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona prosentteina (%) varhaisen (LR neljännesympyrä) ja myöhäinen (UR neljänneksessä) apoptoottisia soluja. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM vähintään kolmen riippumattoman kokeen; * P 0,05 ja §p 0.01 DMSO (ajoneuvon valvonta); ja † p 0,05 ja ‡ p 0.01 5-FU.

. p53-proteiini vakaan tilan ilmentymisen arvioitiin immunoblot verrattuna DMSO: hon (ajoneuvon ohjaus), 72 tunnin kuluttua altistuksen equitoxic (IC

50) pitoisuuksia 5-FU, TMPyP4 ja IQ3A. B. Solupopulaatiot saatu guava ViaCount virtaussytometrialla seuraavasti 72 tunnin inkuboinnin 5-FU, TMPyP4 ja IQ3A on equitoxic (IC

50) pitoisuudet, tai DMSO: ta (ajoneuvon hallinnan) ja HCT116 p53 (+ /+) ja p53 (- /-) isogeenisiin solulinjat transfektoidaan 40 nM siRNA KRAS tai siRNA ohjaus. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. A. §p 0.01 DMSO (ajoneuvon valvonta); ja ‡ p 0.01 5-FU. B. * p 0,05 siRNA valvonta P53 (+ /+) solujen kanssa; §p 0,05 siRNA valvonnan p53 (- /-) solut; ja † p 0,05 siRNA KRAS p53 (- /-) soluja.

Lopuksi kapasiteetti IQ3A yhdisteiden tukahduttamiseksi

KRAS

ilmentyminen arvioitiin määrällisesti KRAS proteiini syöpäsolulinjoissa. Koska IQ3As on myös osoitettu olevan tehokkaita stabilisaattoreita G4 sekvenssien HSP90 onkogeenin promoottorialue (taulukko 1) tämän proteiinin ilmentymisen arvioitiin myös. Kuvio 6A esittää, että G4 ligandit 1a, 2a, 2d ja TMPyP4 alassäädetty ilmentymistä KRAS mukaan 35-60% vuonna HCT116 ja SW620-soluissa, lukuun ottamatta 2a (

p

0,01). Lisäksi, IQ3A vähensi myös HSP90-proteiinin vakaata tasoa, mutta vähemmässä määrin kuin KRAS. Siksi tutkimme seuraavaksi kykyä IQ3A yhdisteiden alas-säädellä

KRAS

transkription paksusuolen syöpäsoluja.

KRAS

mRNA vakaan tilan tasot arvioitiin RT-PCR jälkeen 72 tunnin inkuboinnin soluja yhdisteiden kanssa niiden IC

50 pitoisuuksia ja verrattiin vaikutus TMPyP4 klo equitoxic pitoisuuksina. G4 ligandeja kuten TMPyP4 on osoitettu sitoutuvan G4 rakenteita

KRAS

promoottorialue ja 5′-UTR

KRAS

mRNA, ja myös tukahduttaa sekä geenin transkriptio ja translaatio [ ,,,0],13,19]. Kuvio 6B osoittaa, että 1a, 2a ja 2d pystyivät alas-säädellä KRAS transkriptiota noin 40% HCT116-soluissa, mutta ei merkittävästi niin SW620-soluissa. Mahdollinen selitys on ajankohta, jolloin arvioimme

KRAS

mRNA ja proteiini vakaan tilan tasot. Sen jälkeen 72 h IQ3A altistuminen ei voi enää olla merkittäviä tukahduttamisesta

KRAS

promoottorin aktiivisuutta SW620 solulinjassa, kun taas proteiinin tasot pysyvät pienenee seurauksena kertynyt IQ3A vaikutuksia. Myös TMPyP4 pystynyt vähentämään

KRAS

mRNA vakaan tilan tasot HCT116 solulinjassa, toisin kuin laskua noin 80% proteiinista vakaan tason (kuvio 6A ja 6B). Nämä tulokset ovat yhtä mieltä raportoitu kyky TMPyP4 on ensisijaisesti kerääntyä solujen sytoplasmassa [19], jossa se voi estää

KRAS

mRNA käännös.

. KRAS ja HSP90 proteiini vakaan tilan ilmaisu arvioitiin immunoblot suhteessa DMSO (ajoneuvon hallintaan), 72 tunnin kuluttua altistumisesta equitoxic (IC

50) pitoisuuksia 5-FU, TMPyP4 ja IQ3A hoito; B.

KRAS

mRNA vakaan tilan ilmentyminen arvioitiin Taqman Reaaliaikainen RT-PCR käyttäen spesifisiä Taqman KRAS ja β-Actin normalisointia.

KRAS

mRNA vakaan tilan ilmentymisen tasot laskettiin ΔΔCt menetelmällä käyttäen DMSO: ta (ajoneuvon hallinnan) kalibrointiin; ja C. HEK293T-solut ko-transfektoitiin pGL3-perusvektoriin (tyhjä vektori kontrolli), tai

KRAS

promoottorin lusiferaasireportteri- rakentaa PGL-Ras0.5 tai PGL-Ras2.0 yhdessä pRL- TK. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut maljattiin uudelleen 96-kuoppaisille levyille, on 5,000 solua kuoppaa kohti. Sen jälkeen, 24 tunnin kuluttua jatkomaljausta, solut altistettiin IC

50 equitoxic testiyhdisteen pitoisuutta IQ3A, TMPyP4 ja ajoneuvon (DMSO); D. HCT116, SW620 ja HEK293T solut kotransfektoitiin pGL3-basic vektori (tyhjä vektorisäätö) tai KRAS promoottori lusiferaasireportterista rakentaa PGL-Ras0.5 yhdessä PRL-TK. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin solut maljattiin uudelleen 96-kuoppaisille levyille, 5000 solua kuoppaa kohti ja altistettiin IC

50 equitoxic testiyhdisteen pitoisuutta IQ3A, TMPyP4 ja ajoneuvon (DMSO).

KRAS

promoottorin aktiivisuuden tasot arvioitiin Dual-lusiferaasianalyysissä 72 h (C) tai 24 h (D.) jälkeen yhdistettä altistuksen. Tulokset ilmaistaan ​​Lusiferaasisignaali suhde pGL-Ras2.0 tai pGL-Ras0.5 ja pGL3-perusvektoriin transfektoituja soluja, normalisoinnin jälkeen kanssa Renilla Luciferase. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM vähintään kolmen riippumattoman kokeen; * P 0,05 ja §p 0.01 DMSO (ajoneuvon valvonta); ja † p 0,05 ja ‡ p 0.01 5-FU.

vahvistaa, että mekanismi antiproliferatiivisia aktiivisuutta ja apoptoottisten indusoituminen IQ3A yhdisteillä liittyy tukahduttaminen

KRAS

geeniekspressiota seurauksena vakauttamista G4 muodostavan sekvenssien läsnä promoottori, vaikutukset yhdisteiden

KRAS

geenin promoottorin suoraan arvioitiin lusiferaasireport- määrityksessä. Tätä tarkoitusta varten käytimme kahta eri kokoa promoottorin konstrukteja, jotka sisältävät G4 alueella

KRAS

-geenin promoottori, kloonattiin pGL3 Basic selkäranka: pGL-Ras0.5, pGL-Ras2.0, ja pGL3 Basic tyhjä (Firefly Luciferase negatiivinen ohjaus /ei-promoottori), kotransfektoitiin yhdessä PRL-TK (transfektiotehokkuutta normalisointi) osaksi HEK293T- soluihin, kuten G4 negatiivinen kontrolli. Tämä rakenne ei satama G4 sekvenssit ja on herkkä G4 liittyviä vaikutuksia /sääntelyä. Tuloksemme osoittavat selvästi, että IQ3A yhdisteitä, samoin kuin TMPyP4, pystyivät merkittävästi vähentämään

KRAS

transkriptio, suosittelemme olemalla vuorovaikutuksessa G4 alueen

KRAS

geenin promoottori, tukahduttaa alavirtaan coding- alue ilmaus 40-60% vs. DMSO ohjaus (

p

0,01) (kuvio 6C). Käyttämällä molemmat plasmidit, 500 ja 2000 bp ylävirtaan transkription aloituskohdasta, me osoittavat myös, että kohdealueella IQ3A yhdisteistä on tällä alueella, mikä jolloin myös polypuriini G-rikas lohkon vastuussa G-Nelivaiheinen rakenne kokoonpano [12 ]. Mikä tärkeintä, me pystyimme myös osoittamaan, että IQ3A yhdisteitä, samoin kuin TMPyP4, pystyivät merkittävästi vähentämään

KRAS

promoottorin aktiivisuutta HCT116 ja SW620-soluissa (kuvio 6D).

Johtopäätökset

Olemme tutkineet tässä tutkimuksessa kyky ryhmä 7-karboksylaatin indolo [3,2

b

] kinoliini tri-alkyyliamiini johdannaisia ​​(IQ3A), jotka ovat tehokkaita stabilisaattorit DNA G4 rakenteiden läsnä

KRAS

promoottori, alas-säädellä

KRAS

ilmaisun ja aiheuttaa solukuolema, erityisesti KRAS riippuvaista koolonsyöpäsolulinjaa. IQ3A yhdisteet selvästi osoitti antiproliferatiivista aktiivisuutta IC

50 on alempi kuin 2,69 uM HCT116 ja SW620-soluissa. Erityisesti vuonna HCT116-soluissa, IQ3A yhdisteiden IC

65 pitoisuus kasvoi solukuolemaa enintään 4,7-kertainen (

p

0,01) ja 2,4-kertainen (

p

0,01) verrattuna DMSO: ssa tai 5-FU, vastaavasti. Lisäksi, ei-pahanlaatuisten solujen linjat IQ3A yhdisteet eivät aiheuta merkittävää solukuolemaa. Lisäksi he pieneni huomattavasti

KRAS

mRNA ilmaisun ja proteiinin tasot koolonkarsinoomasoluissa mahdollisesti suoraan transkription tukahduttamisen

KRAS

promoottori. Tuloksemme mennessä osoittaa kiinnekohta suhde transkription repression ja sitoutumaan G4 alueelle tämän promoottori, vaikka lisätutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan osoittaa suora yhteys näiden kahden välillä. Tukahduttaminen vaikutus liittyy lisääntynyt p53-proteiinin vakaan tilan tasot HCT116, ja vain lievää laskua HSP90 tasot kolmessa testatuissa solulinjoissa, mikä osoittaa, että nämä yhdisteet eivät ole myös vaikuttavan muita mahdollisia G4 kohteita kuten HSP90 promoottori [27]. Pikemminkin IQ3A yhdisteet selektiivisesti kohdistettu

KRAS

kuljettajan geenejä koolonsyöpäsolulinjoissa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että G4-sitojaligandit, kuten nämä indoloquinoline johdannaiset, näyttö mahdollisuudet käyttää uutena syövän vastaisia ​​terapeuttisia aineita, erityisesti ihmisen syöpien hoidossa ohjaavat KRAS mutaatioita, jotka ovat edelleen suurelta osin syövät hoitomuotoa kliinisen tarvitsevat.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

7-karboksylaattia indolo [3,2

b

] kinoliini tri-alkyyliamiinijohdannaisia ​​1a-d ja 2a-d (IQ3A) syntetisoitiin, kuten on kuvattu S1 teksti. 5-fluorourasiili (5-FU) ja TMPyP4 ostettiin Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA.

Oligonukleotidit sekvenssit

Kaikki oligonukleotidit hankittiin Eurofinsille MWG Synthesis GmbH, Saksa. Leimattu oligonukleotidit käytetään FRET määrityksissä oli kiinnitetty donorifluoroforin FAM (6-karboksifluoreseiini) ja akseptorifluoroforin TAMRA (6-karboksitetrametyylirodamiini): KRAS21R (5′-FAM-AGGGCGGTGTGGGAAGAGGGA-TAMRA-3 ’); HSP90A (5′[FAM] -GGGCCAAAGGGAAGGGGTGGG- [TAMRA] -3 ’); T-Loop (5’-FAM-TATAGCTATATTTTTTTATAGCTATA-TAMRA-3 ’). Kukin oligonukleotidi alun perin laimennettiin varastointi ratkaisu 100 uM nukleaasia vapaata vettä (ei DEPC-käsitelty), ostettu Ambion Applied Biosystems UK.

FRET sulaa määritys

Kyky IQ3A ja TMPyP4 vakauttaa G-Nelivaiheinen ja duplex-DNA-sekvenssit selvitettiin käyttäen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) määritys. Kantaliuosta oligonukleotidisekvenssit 20 uM ja jälkeen laimennukset saatiin säilytykseen laimentamalla K-kakodylaattipuskurissa pH = 7,4, joka sisälsi 60 mM K

+ (10 mM kaliumfosfaattipuskuria dylaatissa, 50 mM KCI). FRET-koettimen sekvenssit laimennettiin varastosta oikea pitoisuus (0,4 pM), ja sitten hehkutetaan kuumentamalla 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen se jäähdytettiin RT. Testiyhdisteet valmistettiin 1 mM 10% DMSO: ta ja 10% 1 mM HCI: HPLC-laatuista vettä. Loput laimennoksia tehtiin käyttämällä FRET-puskuria. Hehkutettu DNA: ta (50 ui) ja yhdiste (50 ui) jakautuvat 96-RT-PCR-levyt (BioRad, MJ Research, Waltham, MA, USA). Asiaankuuluvat tarkastukset suoritettiin myös tarkistaa häiriöitä määrityksessä. Fluoresenssilukemat tehtiin DNA Engine Opticon (MJ Research) eksitaatiolla 450-495 nm ja toteaminen 515-545 nm, otetaan välein 0,5 ° C välillä 30-100 ° C, jossa on vakio lämpötila pidetään 30 s ennen jokaista lukeminen varmistaa vakaa arvo. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Lopullinen analyysi tiedoista suoritettiin GraphPad Prism 5.0 ohjelmisto (GraphPad Software, Inc.). Kehittynyt käyrä istuva toiminto GraphPad Prism käytettiin laskettaessa Δ

T

m

arvot ja niihin liittyvät standardipoikkeamat.

Soluviljely

SW620 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen adenokarsinooma soluja (European Collection of Cell Cultures, ECACC, Porton Down, Wiltshire, UK), HEK293T ihmisen alkion munuaisen solut (ATCC, LGC Standards, UK) HCT116 ihmisen paksusuolen karsinoomasoluja (ECACC), HCT116 p53 (+ /+) ja p53 (- /-) isogeenisiin ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa (GRCF Cell Center ja Biorepository, Johns Hopkins University, School of Medicine, Baltimore, MD, USA), kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), johon oli 10% naudan sikiön seerumia ja 1% antibioottia /antimykoottia (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), CCD18co ihmisen koolonin fibroblasteissa (ATCC, CRL-1459) kasvatettiin Minimum Essential Medium (MEM), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia , 1% antibioottia /antimykoottia, 2 mM GlutaMAX, 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA) (Invitrogen), ja 0,57 mM Rekombinantti ihmisen TNF-α (Peprotech, USA) ja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä,