Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Natriumbutyraattia, histonideasetylaasi estäjä , on noussut lupaavaksi syöpälääkettä useita syöpiä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että natriumbutyraatti voi estää etenemisen eturauhasen syöpä; kuitenkin, tarkka mekanismi on vielä epäselvä. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia mekanismi natriumbutyraatin toiminnan eturauhassyövän DU145 soluja.

Methods

estäviä vaikutuksia Nab solujen kasvuun havaittiin 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-diphenyltetrrazolium bromidi määrityksessä. Apoptoosia määritettiin virtaussytometria-analyysi DU145-solujen värjättiin anneksiini-V: n ja PI. Hoechst 33258 ja fluoresenssia mikroskooppeja käytettiin tarkkailla ydin- morfologian DU145 solujen hoidon jälkeen NaB. ANXA1 pudotus solut lävitse transfektion ANXA1 siRNA. ANXA1 mRNA-tasot mitattiin qRT-PCR. Bcl-2, Bax, ANXA1, ERK1 /2 ja pERK1 /2 havaittiin Western blot.

Tulokset

NaB inhiboi merkittävästi kasvua ja induktion apoptoosin DU145 ja PC3-solujen annoksesta -riippuvaisella tavalla. Expression of anti-apoptoosin geenin Bcl-x L- ja Bcl-2: DU145-soluissa pienenevät ja ilmentyminen pro-apoptoosi-geenin Bax ja Bak lisääntynyt jälkeen NaB hoidon. Lisätutkimukset ovat osoittaneet, että NaB sääteli ilmaus ANXA1 ja että kasvain esto toiminta Nab vähennettiin merkittävästi läpi Knockdown n ANXA1 geenin DU145 soluissa. Lisäksi siANXA1 solut osoittivat, että solujen lisääntymistä lisääntynyt ja solujen apoptoosia indusoitiin inaktivoimiseksi solunulkoisen säänneltyjen kinaasin (ERK).

Johtopäätös

tulokset tukevat merkittävä korrelaatio NaB toimintoja ja ANXA1 ilmentyminen eturauhassyövässä, ja tasoittaa tietä edelleen tutkitaan molekyylitason mekanismi NaB toimien syövissä.

Citation: Mu D, Gao Z, Guo H, Zhou G, Sun B (2013) natriumbutyraatilla indusoi Growth esto ja apoptoosi ihmisen eturauhassyöpä DU145 Cells by Up-ilmentymisen säätely anneksiini A1. PLoS ONE 8 (9): e74922. doi: 10,1371 /journal.pone.0074922

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 06 elokuu 2013; Julkaistu 23 syyskuuta 2013

Copyright: © 2013 Mu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on suhteellisen yleinen pahanlaatuinen syöpä ja toiseksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä [1]. Viime aikoina useita tehokkaita hoitoja voidaan tarjota kliinisen eturauhassyövän hoitoon; kuten leikkaus (radikaali prostatektomia) ja sädehoidon (ulkoinen-palkki sädehoidon, brakyhoito, tai molemmat) potilaille, joilla on aikaisen vaiheen taudin ja adjuvanttia systeemisen hoitoja (kemoterapia), jotka ovat tehokkaita myöhäisvaiheen tauti [2]; Kuitenkin hoitoja kaikilla on erilaiset sivuvaikutusprofiilit. Natriumbutyraatilla, joka on yksi laajimmin tutkittu histonideasetylaasi-inhibiittorit, on noussut lupaavaksi syöpälääkettä muuttamalla geeniekspression kromatiinin muutoksia [3].

natriumbutyraatti, natriumsuola voihappoa, on raportoitu on monenlaisia ​​vaikutuksia viljellyissä nisäkässoluissa, kuten erilaistumisen induktioon ja soluproliferaation inhibointi, suhteellisen pieninä pitoisuuksina [4], [5]. Lisäksi on olemassa näyttöä siitä, että osoittaa, että natriumbutyraatti voivat aiheuttaa apoptoosin lukuisissa syöpäsoluissa [6], [7]. Koska sen kasvua inhiboivaa ja apoptoosia indusoivaa aktiivisuutta, natriumbutyraatti, yksin tai yhdessä muiden syövän vastaisten lääkkeiden, voidaan käyttää hoitamaan useita pahanlaatuisia kasvaimia [8], [9]. Äskettäin Degui Wang ja työtovereiden osoitti, että natrium butyraatti voi estää leviämisen ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja on synergistinen vaikutus syöpälääkkeiden hoidettaessa eturauhassyöpää sekä

in vitro

ja

in vivo

[10]. Kliininen hyöty natriumbutyraatin rajoittaa sen vaikutusmekanismi, joka on vielä epäselvä. Tärkeä viimeaikainen edistysaskel on ollut, että natriumbutyraatin on todettu ajan säätelemään anneksiini A1 (ANXA1) ihmisen paksusuolen adenokarsinooma soluihin [11].

Annexins ovat perheen fosfolipidin ja kalsiumin sitovia proteiineja, jotka koostuvat 12 jäsentä nisäkkäillä. Annexins ovat kaikkialla läsnä ja ilmaistaan ​​erilaisissa organismien [12]. On olemassa jonkin verran näyttöä siitä, että anneksiini perheenjäsenillä on tärkeitä rooleja tuumorien kehittymisessä ja etenemisessä, koska nämä proteiinit voivat vaikuttaa invasiivisuus ja leviämisen syöpäsolujen ja näyttää säätelyhäiriö lukuisissa syövissä [13]. ANXA1, ensimmäinen perheenjäsen on annexins, on solunsisäinen proteiini, joka näyttelee tärkeä rooli apoptoosin, leviämisen, ja syöpä [14], [15]. Paljon kiistaa edelleen olemassa koskien ilmaus ANXA1 eri syöpiä. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmaus ANXA1 säätyy alas kohdunkaulan, rinta-, pään ja kaulan, tai kilpirauhassyövän [16], [17], [18], [19], [20]. Toisaalta, on olemassa myös jonkin verran todisteita siitä, että lisäys ANXA1 ilmentymisen on esiintynyt muiden syöpien, kuten haimasyövän, ruokatorven ja mahalaukun karsinoomien [21], [22], [23]. On riittämätön toiminnallisten kokeellista näyttöä määritellään selkeästi rooli annexins eturauhassyövässä. Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että anneksiini II vähennettiin eturauhasen syöpien ja annexins A1 ja A2 on jo liittynyt tuumorisuppressiogeeneksi eturauhassyövässä [24]. Lecona ja kollegat osoittivat, että butyraatti voi ajan säätelemään ANXA1 ihmisen paksusuolen adenokarsinoomasolua [11]. Nämä tutkimukset osoittavat mahdollista roolia natriumbutyraatin kuin ANXA1 säädin estää etenemisen eturauhasen syöpä. Tutkimus tarjoaa ensimmäisen suoria todisteita eturauhasen syövän solut, jotka natriumbutyraattia voidaan säätää ylös ilmentymistä ANXA1 johtaa solun apoptoosin. Osoitamme, että natriumbutyraatin estää solujen kasvua ja indusoi apoptoosia eturauhassyöpäsoluissa jopa-ekspressiota sääteleviä ANXA1 kautta ERK signalointireitin.

Materiaalit ja menetelmät

Antibodies

hiiren anti-Bcl-2-monoklonaalisella vasta-aineella, hiiren anti-Bax monoklonaalinen vasta-aine, hiiren anti-Bcl-xl monoklonaalinen vasta-aine, hiiren anti-Bak monoklonaalinen vasta-aine, hiiren anti-ANXA1 monoklonaalinen vasta-aine ja hiiren anti-β-aktiini-monoklonaalinen vasta-aine oli saatu Abcam (Cambridge, MA). Anti-fosfo-ERK (Perk) monoklonaalinen vasta-aine, anti-ERK polyklonaalista vasta-ainetta ja HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Cell Culture

ihmisen eturauhasen syöpä solujen linja DU145-solut (HTB-4, ATCC, Rockville, MD), ja PC3-solut (ATCC, Rockville, MD) viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2 ja 95% ilmaa ja kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 1% penisilliini-streptomysiiniä ja 1% glutamiinia.

solunelinkykyisyysmääritys

solujen elinkelpoisuus määritettiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu vähäisin muutoksin [25]. Lyhyesti, DU145 ja PC3-solut maljattiin erikseen 24-kuoppalevyille 2 x 10

5 solua per kuoppa, kasvatettiin RPMI 1640 väliaineessa 24 h ja sitten lisättiin eri pitoisuuksia NaB lopulliseen konsentraatioon 0, 1 , 5, ja 10 mmol. Vain dimetyylisulfoksidi (DMSO) lisättiin kontrolliryhmään. Soluja kasvatettiin inkubaattorissa eri ajanjaksoina. Solususpensiot (10 ui) PBS: ää sekoitettiin 40 ul: Trypan Blue (Sigma, St. Louis, MO). Solut pestiin tämän jälkeen kolme kertaa DMSO: lla ennen laskemista valomikroskoopilla. Solut, jotka osoittavat värin sisäänottoa luokiteltiin käyttökelvottomaksi.

MTT proliferaatiotestillä

DU145 ja PC3-solujen lisääntymisen mitattiin käyttäen aikaisemmin kuvattua 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2 , 5-diphenyltetrrazolium bromidia (MTT) [26]. Lyhyesti, DU145 ja PC3-solut (noin 2 x 10

5) maljattiin erikseen 24-kuoppalevyillä 48 tuntia. MTT: n (20 ui, 5 mg /ml) lisättiin sitten osaksi DU145 ja PC3-syöpäsolujen 4 h 37 ° C: ssa. DMSO: ta (200 ui) lisättiin liuottamaan kiteet 25 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Optinen tiheys (OD) arvo mitattiin aallonpituudella 490 nm spektrofotometrillä (Multiskan MK3, Thermo, Waltham, MA). Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa ja laskettiin käyttäen keskimääräiset tulokset.

Detection apoptoottisten solujen virtaussytometrialla

solujen apoptoottisen suhde mitattiin anneksiini V-FITC: llä ja PI-värjäyksessä, mitä seurasi analyysi virtaussytometrillä (Beckman-Coulter, Brea, CA). Lyhyesti, 2 x 10

5 solua per kuoppa maljattiin 24-kuoppalevyille ja sitten eri pitoisuuksia NaB lisättiin. Solut trypsinoitiin ja kerättiin sentrifugoimalla ja inkuboitiin sitten anneksiini V: n ja PI-15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Apoptoosi tutkittiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V-FITC /PI-kittiä (BD PharMingen, San Diego, CA). 30 minuutin kuluttua 37 ° C: ssa solut olivat valmiita analysoitaessa virtaussytometrialla ja solun apoptoottisten suhde määritettiin.

Nuclear morfologinen havainnointi NaB Käsitelty DU145 Syöpäsolut

Solut 24-kuoppalevyille 2 x 10

4 solua kuoppaa kohti ja käsitellään NaB eri pitoisuuksina. Solut kiinnitettiin käyttämällä 10% puskuroituun formaliiniin /4% formaldehydiä, ja pestiin sitten kahdesti PBS: llä ja värjättiin Hoechst 33258 värjäys ratkaisu. Ydin- morfologia DU145 solujen havaittiin heijastui fluoresenssimikroskooppia (Nikon MF30 LED, Japani). Kvantifiointi apoptoottisten solujen tehtiin laskemalla 500 DU145 soluja, ja sitten määrittämällä prosenttiosuus apoptoottisten solujen vähintään viisi poikkileikkauksissa per slide. Koe toistettiin vähintään kolme kertaa.

Quantitative Reaaliaikainen -PCR (qRT-PCR) määritys

ANXA1

mRNA-tasot mitattiin eturauhassyövän solulinjoissa DU145 käyttämällä qRT-PCR-menetelmällä. Solun kokonais-RNA eristettiin DU145-soluissa käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. 2 ug kokonais-RNA: ta tehtiin käänteistranskriptio käyttäen High-Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. QRT-PCR suoritettiin BioRad MyIQ yksivärinen reaaliaikainen PCR tunnistusjärjestelmä käyttämällä SYBR Green Supermix (BioRad, Carlsbad, CA). Aluke sekvenssejä käytetään qRT-PCR olivat seuraavat:

ANXA1

eteenpäin, GAGCCCCTATCCTACCT TCA;

ANXA1

kääntää, GGTTGCTTCATCCACACCT;

ACTIN

eteenpäin, TCCCTGGAGAAGAGCTACGA;

ACTIN

kääntää, AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG. Nämä alukkeet olivat kaikki syntetisoitiin Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kiina). Sykliolosuhteet olivat seuraavat: esi-inkubaatio: 95 ° C, 10 min; PCR: 94 ° C, 10 s ja 60 ° C, 30 s, 45 sykliä; lopullinen venymä: 72 ° C, 10 min. Ekspressiotasot suhteellinen geenien laskettiin käyttämällä 2

-ΔΔCT menetelmän [27] kanssa ja β-aktiini-mRNA: n sisäisenä kontrollina.

Western blot -määritys

kokonaisproteiinista of DU145 soluja uutettiin käyttäen RIPA lyysipuskuria (Beyotime, Nantong, Kiina) mukaan toiminta-protokollia. Proteiinipitoisuus lysaateissa määritettiin BCA-proteiinimäärityksellä Kit (Beyotime, Nantong, Kiina). Proteiinit (40 ug /kaista), tehtiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin elektroforeettisesti Immobilon P Millipore (Bedford, MA, USA). Hiiren monoklonaaliset ja polyklonaaliset vasta-aineet käytettiin primaarisena vasta-aineena ja HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-lgG: tä käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. Sitoutuneet vasta-aineet visualisoitiin käyttäen LumiGLO reagenssia (Pierce, Rockford, IL) ja tasot proteiinien suhteessa p-aktiini määritettiin. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Sirna transfektio

eturauhassyövän DU145-solujen kanssa ANXA1 proteiinin transfektoitiin ANXA1 siRNA (siANXA10) tai kontrolli-siRNA: (siMock) ( Takara, Dalian, Kiina) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), menetelmän mukaisesti Maxime [28], vähäisin muutoksin. Lyhyesti, päivää ennen transfektiota 2 x 10

5 eturauhassyövän solut ympättiin 60 mm: n levyillä RPMI 1640, joka sisälsi 5% FCS: ää. Kaikkiaan 1,5 ug plasmidi-DNA transfektoitiin DU145 solujen RNA ja proteiini uuttamalla. Stabiilit transfektantit ja DU145-soluja valittiin elatusaineella, joka sisälsi puromysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA). Elinkelpoiset pesäkkeet poimittiin ja siirrettiin uusia ruokalajeja jälkeen 2-3 viikkoa transfektion jälkeen. SiANXA1 kohdesekvenssejä olivat: 5′-ATGCCTCACAG- CTATCGTGAA-3 ’(sense), ja 5′-TTCACGATAGCTGTGAGGCAT-3’ (anti-sense). SiANXA1-transfektoiduissa ja siMock-transfektoituja soluja käytettiin lisäkokeisiin.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Erot ohjaus ja NaB käsitellyissä ryhmissä verrattiin Dunnettin testi jälkeen ANOVA. Arvo P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Tulokset

NaB Estää leviämisen ja Cell Survival in DU145 Solut

sytotoksinen vaikutus NaB ihmisen eturauhassyövän DU145 ja PC3-solut tutkittiin vaihtelevilla NaB ja ajat trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä (Fig. 1 A ja C). Tulokset osoittivat, että elinkelpoisuus DU145 ja PC3-solut olivat kaikki vähennettiin NaB annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. NAB aiheuttama ilmeinen väheneminen elinkykyisten isäntäsolujen annosriippuvaisesti kanssa IC

50 7,07 mmol /l 48 h DU145 soluissa ja IC

50 8,71 mmol /l 48 h PC3-soluissa . Annosvälillä 0-10 mmol NaB eturauhassyövän hoitamiseksi DU145 solujen ja PC3 48 tuntia ovat meidän odotettu keskittymistä ja aikaa.

(A) NaB estää solujen elinkelpoisuuden aika- ja annosriippuvaisia ​​tavalla DU145 solut. Syövän soluja käsiteltiin pelkällä väliaineella tai erilaisia ​​pitoisuuksia NaB (1, 5, 10 mmol) ja eri ajankohtina (12, 24, 48, 72, 96 ja 120 h). (B) vaikutus NaB on DU145 soluproliferaatioon. Syövän soluja käsiteltiin pelkällä väliaineella tai erilaisia ​​pitoisuuksia NaB (1, 5, 10 mmol) 48 tuntia. (C) NaB estää solujen elinkelpoisuuden PC3-soluissa. Syövän soluja käsiteltiin pelkällä väliaineella tai erilaisia ​​pitoisuuksia NaB (1, 5, 10 mmol) ja eri ajankohtina (12, 24, 48, 72, 96 ja 120 h). (D) vaikutus NaB on PC3 soluproliferaatioon. Syövän soluja käsiteltiin pelkällä väliaineella tai erilaisia ​​pitoisuuksia NaB (1, 5, 10 mmol) 48 tuntia. (E) Vaikutus Nab yhdistettynä DOC solun elinkelpoisuuden DU145 ja PC3-soluissa. Syövän soluja käsiteltiin pelkällä väliaineella tai NaB (5 mmol) yhdessä DOC (1 umol) 48 tuntia. (F) vaikutus NaB yhdistettynä DOC DU145 ja PC3-solujen lisääntymisen. Syövän soluja käsiteltiin pelkällä väliaineella tai NaB (5 mmol) yhdessä DOC (1 umol) 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. Soluproliferaatiota havaittiin MTT-määrityksellä. NaB estivät merkittävästi kasvua DU145 ja PC3-soluissa. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM. (N = 3) (Dunnettin testillä, * P 0,05

vs.

Kontrolli).

mitattiin myös vaikutus NaB on DU145 ja PC3-solujen lisääntymisen MTT: llä. Kuten on esitetty kuviossa. 1B ja D, oli jyrkkä väheneminen solujen lisääntymisen kasvavia annoksia NaB (0-10 mmol). NAB esti solujen lisääntymistä annoksesta riippuvalla tavalla sekä DU145 ja PC3-solut (Fig. 1 B ja D). Nämä havainnot osoittavat, että NaB voi estää proliferaatiota ja eloonjäämistä DU145 ja PC3-solut kuitenkin DU145 on herkempi NaB hoitoon.

on jonkin verran näyttöä siitä, että NaB yhdessä muiden syöpälääkkeiden voi olla erittäin hyödyllistä virtsarakon syövistä [10]. Siten tutkimme vaikutus NaB yhdistettynä doketakseliin (DOC) eturauhasen syöpäsoluja. Tulokset osoittivat, että on olemassa synergistinen inhibitio ihmisen eturauhasen syöpäsolujen kasvua NaB ja DOC (Fig. 1 E). Edelleen vahvistaa synergistisen kasvun inhibition vaikutus NaB, soluproliferaatioon havaittiin MTT-määrityksellä. Kuten on esitetty kuviossa. 1F, NaB yhdistettynä DOC voisi merkittävästi estävät solujen lisääntymistä.

NaB indusoi apoptoosia DU145 Cell Lines

apoptoosin induktio NaB ensin tutkittiin virtaussytometrianalyysin DU145 soluja värjättiin anneksiini V ja PI (Fig. 2A). Tulokset osoittivat, että NaB aiheutti annoksesta riippuvan lisäys solujen apoptoosin, ja apoptoosin nousi 30%, kun pitoisuus on NaB oli yli 5 mmol /l.

(A) Virtaussytometria-analyysi NaB käsiteltyjen DU145 solut värjättiin anneksiini V: ja PI. (B) Nuclear morfologiset havainto Nab käsiteltyjen DU145 syöpäsoluja. Hoechst 33258 ja fluoresenssimikroskoopilla käytettiin tarkkailla ydin- morfologian DU145 solujen käsittelyn jälkeen NaB (400 x). (C) kvantitatiivinen analyysit määrä apoptoosin solussa. (D) NaB moduloi ilmentymistä Bcl-xl ja Bak DU145 soluissa. (E) NaB moduloi Bcl-2: n ja Bax on DU145-soluissa. Ilmaus Bcl-xl, Bcl-2, Bax ja Bak määritettiin Western blot -analyysillä. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM. (N = 3) (Dunnettin testi, * P 0,05

vs.

Kontrolli).

vieressä määrällisesti muutoksia solujen tuman morfologiaa Hoechst värjäys alle fluoresenssimikroskopiaan. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, syöpäsolut osoittivat kirkkaasti fluoresoivia ytimiä kupliminen ja DNA pirstoutuminen, verrattuna kontrolliryhmään DU145 solujen hoidon jälkeen NaB 48 tuntia. Lisäksi apoptoottisten solujen määrässä suureni NaB annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2C). Samalla, solutiheys väheni annoksesta riippuvalla tavalla. Nämä muutokset ovat mukaisia ​​ominaisuuksia apoptoosin.

Solun apoptoosin näyttää ohjata useita geenejä;

Bcl-xl, Bcl-2

,

Bax ja Bak

ovat tärkeimmät apoptoosiin liittyvien geenien joukossa. Bcl-xl ja Bcl-2-proteiinin kaksi solukuoleman estäjät, kun taas Bax ja Bak on ratkaiseva rooli, kun helpotetaan apoptoosin. Näin ollen mittasimme Bcl-xl, Bcl-2, Bax ja Bak proteiinien DU145-soluissa Western blot-hoidon jälkeen NaB (Fig. 2D ja E). Tulokset osoittivat, että Bcl-xL: n ja Bcl-2: ta väheni ja ilmentymistä Bax ja Bak ovat samanaikaisesti ylös- säätää. Apoptoosi oli merkittävästi lisääntynyt, koska säätely ylöspäin pro-apoptoosin geenejä.

NaB Up-säätelee ilmentäminen ANXA1 in Eturauhassyöpä DU145 Cell Line

Edellä esitetyt tulokset osoittivat, että NaB voi estää proliferaatiota ja indusoi apoptoosin eturauhassyövän soluissa; kuitenkin, mekanismi NaB toiminta on edelleen epäselvä. Lecona ja kollegat ehdotti, että butyraatti voi ajan säätelemään anneksiini A1 ihmisen paksusuolen adenokarsinooma soluissa. Niinpä kyseenalaiseksi oliko joitakin yhteys NaB ja ANXA1. Ilmentyminen ANXA1 ja säätely ylöspäin ANXA1 mukaan NaB vuonna DU145 solut määritettiin RT-PCR ja western blot, vastaavasti (Fig. 3). Kuten on esitetty kuviossa. 3, lisääntynyt ANXA1 mRNA-tasoja ja proteiinin ilmentyminen havaittiin DU145 käsitellyissä soluissa NaB. Tulokset osoittivat, että NaB voisi ajan säätelemään ANXA1 on DU145-soluissa.

(A) ANXA1 mRNA: n ekspressio havaitaan qRT-PCR: llä. NaB hoitoryhmissä huomattavasti korkeampi kuin kontrolliryhmä (käsittely vain väliaine). (B) Western blot-analyysi ANXA1 ilmentymisen DU145 soluissa jälkeen NaB hoidon. Tiedot on normalisoitu β-aktiini-arvot, ja ne ilmaistaan ​​kertainen muutokset β-aktiini on NaB käsitellyssä ryhmässä suhteessa kontrolliin. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM. (N = 3) (Dunnettin testi, * P 0,05

vs.

Kontrolli).

perustaminen ja toiminnalliset analyysit ANXA1 Knockdown Cells

Koska ANXA1 ilme oli ajan säännelty DU145 soluissa käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla NaB, oletimme, että ANXA1 voisi olla merkittävä rooli aktiivisuuden Nab. Mitata ANXA1 toiminnot

in vitro,

siRNA Koe suoritettiin DU145 soluissa. MRNA tasolla ja proteiinin ANXA1 että siANXA1-transfektoituja ryhmä oli merkittävästi pienempi kuin siMock transfektoitu ryhmä (Fig. 4A). Me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus ANXA1 pudotus aktiivisuuteen NaB, mukaan lukien solun kasvun estämistä (MTT-määritys) ja induktio solujen apoptoosin (Western blot-määritys). Tulokset osoittivat, että oli olemassa nousu solujen kasvua siANXA1 transfektoitujen ryhmä verrattuna siMock-transfektoiduissa ryhmä (Fig. 4B). Lisäksi apoptoosin oli pienentynyt vuonna siANXA1-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 4C). Tulokset osoittivat, että NAB aktiivisuus kasvun hidastumisen ja pro-apoptoosin DU145 syöpäsoluissa liittyi yli-ilmentyminen ANXA1.

(A) Western blot-analyysi ANXA1 ilmaisun siANXA1 ja siMock solujen jälkeen NaB hoitoon. Data normalisoitiin kanssa β-aktiini-arvot, ja ne ilmaistaan ​​kertainen muutokset β-aktiini on NaB käsitellyssä ryhmässä suhteessa kontrolliin. (B) lisääntyminen siANXA1 ja siMock solujen jälkeen NaB hoidon. (C) Western blot -analyysi ilmentymisen Bax ja Bcl-2: siANXA1 ja siMock soluja. Bcl-2: n ja Bax ekspressiotasoja normalisoitiin p-aktiini ja ne on esitetty Bax /Bcl-2 -suhde. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM. (N = 3) (Dunnettin testi, * P 0,05

vs.

Kontrolli).

Yli-ilmentyminen ANXA1 on suoraan verrannollinen aktivointi ERK

ERK koulutusjakso on usein säädelty eri syövistä [29], [30], ja on jonkin verran näyttöä osoitti ANXA1 moduloi ERK koulutusjakso proksimaalisessa sivustolla [31]. Tutkimiseksi edelleen mahdollinen, joka voisi olla mukana kasvun estäminen ja pro-apoptoosin syöpäsoluissa, ilmaus ERK ja fosforyloidun ERK (lisäansiot) havaittiin. Perk oli merkittävästi vähentynyt siANXA1-transfektoiduissa soluissa verrattuna siMock ryhmään. Tulokset osoittivat, että ERK-reitin on heikennetty siANXA1-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 5).

ilmentyminen p-ERK ja ERK havaitaan Western blot -analyysillä. Ilmaisu p-ERK pienenee merkittävästi ANXA1 pudotus soluissa verrattuna siMock solujen, kun taas ERK taso on lähes ennallaan. Tiedot on normalisoitu β-aktiini-arvot, ja ne ilmaistaan ​​kertainen muutokset β-aktiini. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Tiedot ovat keskiarvoja ± SEM. (N = 3) (Dunnettin testi, * P 0,05

vs.

Kontrolli).

Keskustelu

Eturauhassyöpä on toiseksi yleisin diagnosoitu syöpä ja toinen johtava syy syöpäkuolemista miehillä. Tällä hetkellä useat tehosäteily ja kirurgiset hoitoja voidaan tarjota kliinisen eturauhassyövän hoitoon; kuitenkin hoitomuotoja eturauhasen syöpä ovat kaukana tyydyttävästä ja edenneen eturauhassyövän edelleen parantumaton [9]. On kiireesti löydettävä aineita tai lääkkeitä, jotka soveltuvat ehkäisyä ja parempaa valvontaa eturauhassyöpää. NaB, joka on ryhmän jäsen, histonideasetylaasi-inhibiittorit (HDAC: t), on luonnossa esiintyvä lyhytketjuinen rasvahappo, joka kykenee aloittamaan erilaistumisen monissa solutyypeissä, kuten HT29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluja ja mahalaukun syövän soluihin [32], [33]. NaB voi lisätä antituumorivaikutus vähemmän myrkyllisyyttä, ja siellä on useita rivejä todisteita, jotka ovat osoittaneet, että NaB voi aiheuttaa kasvun hidastumisen ja apoptoosin lukuisissa syövissä, mukaan lukien eturauhassyöpä [5], [6], [9]. Kuitenkin tarkka mekanismi Nab kasvainten synnyssä ymmärretään huonosti.

Nyt on todettu, että NaB voi ajan säätelemään ANXA1. Lisäksi annexins usein väärin säädellystä eri syöpätyyppeihin ja niiden ilmaisun on ilmoittanut tuumorisuppressorina tai mahdollista homeostatic rooli [34], [35]. Niinpä oletetaan, että NaB esti solujen lisääntymistä ja indusoi apoptoosin kautta sääteli ilmentymä ANXA1.

Nykyisessä tutkimuksessa arvioimme leviämisen estäminen ja apoptoosin edistämistä vaikutusten NaB ihmisen eturauhassyövän DU145 solujen sekä sen vaikutusmekanismi. Tutkimuksemme osoittivat, että NaB 1-10 mmol voivat molemmat estävät DU145 soluproliferaatiota ja aiheuttaa apoptoosia. Apoptoosi, joka tunnetaan myös nimellä ohjelmoitu solukuolema, on fysiologinen prosessi, joka säätelee useita hyvin tunnettu geenejä ja on tärkeää kehitystä ja homeostaasia monia organismeja. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että NaB voivat alas-säädellä Bcl-2: n ilmentymisen ja ajan säädellä Bax ilme. On todennäköistä, että NaB indusoi eturauhassyövän DU145 apoptoosia estämällä Bcl-2: n ilmentymisen ja aktivoimalla Bax.

Samalla havaitsimme, että NaB sääteli ilmentymistä ANXA1 in DU145 soluissa. Voit selvittää ANXA1 toiminto on merkitystä NaB toiminta, teimme toiminnallinen tutkimukset käyttämällä siRNA. Tulokset osoittivat, että esto ilmentymisen ANXA1 vähensi NaB toiminta estää solujen kasvua ja pro-apoptoosi. Lisäksi meidän tulokset viittaavat siihen, että mekanismi Nab vastaan ​​apoptoosin kautta lisäävä säätely ANXA1 liittyi ERK signaalireitin. Ekspression inhiboimiseksi ANXA1 voi estää fosforylaatiota ERK1 /2, mikä osoittaa, että ilmentymisen ANXA1 voisi aktivoida ERK signaalireitin. Tähän mennessä ilmaus ANXA1 olevan jopa valvoman NaB eturauhassyövässä ei ole vahvistettu. Tutkimuksessamme olemme edellyttäen jonkin verran näyttöä siitä, että NaB ajan säätelee ilmentymistä ANXA1 ja korreloi etenemistä eturauhassyöpää. Nämä seikat voimakkaasti sitä, että ANXA1 on tärkeä rooli eturauhassyövän etenemiseen.

Lopuksi, NaB on anti-proliferatiivisia ja pro-apoptoottista aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. Lisäksi NaB voi lisätä ilmentymistä ANXA1, ja ANXA1 voi lisätä toiminnan ERK signalointireitin. Lisätutkimuksia tarvitaan paljastaa selvän vuorovaikutukset ANXA1 ja ERK signalointireitin. Esillä olevat havainnot viittaavat siihen, että NaB on erityisen tehokas etenemisen estämiseksi eturauhassyövän kautta ylös-säätely ilmentymisen ANXA1.