Krooninen sairaus

tiivistelmä

Luun morfogeneettisen proteiinien (BMP: t) ovat erittäin konservoituneita morfogeeneille, jotka ovat välttämättömiä normaalia kehitystä. BMP-2 ilmentyy voimakkaasti suurimmassa osassa ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC), mutta ei normaalissa keuhkokudoksessa tai hyvänlaatuinen keuhkokasvaimia. Vaikutukset BMP signalointikaskadissa kasvua ja selviytymistä syöpäsolujen on huonosti ymmärretty. Osoitamme, että BMP signalointi on basaalisesti aktiivinen keuhkosyövän solulinjoja, jotka voidaan tehokkaasti inhiboida selektiivisiä BMP tyypin I reseptorit. Keuhkosyöpä solulinjat ilmentävät Alk2, Alk3 ja alk6 estymisestä yhden BMP-reseptoriin ei riittävä alentamaan signalointi. Esto useamman kuin yhden tyypin I reseptori tarvitaan laskevan BMP signalointia keuhkosyövän solulinjat. BMP reseptoriantagonistit ja vaiennettu BMP tyypin I reseptorien kanssa siRNA solukuolema, esti solujen kasvua, ja aiheutti merkittävän laskun ilmaus estäjän erilaistumisen (ID1, Id2, ja id3) perheenjäseniä, joiden tiedetään säätelevän solujen kasvua ja eloonjäämisen monenlaisia ​​syöpiä. BMP reseptoriantagonistit myös vähentynyt klonogeeniset solujen kasvua. Knockdovvn id3 vähentynyt merkittävästi solujen kasvuun ja solukuolema keuhkosyövän soluja. H1299-solut stabiilisti yli-ilmentävät id3 olivat resistenttejä kasvun hidastuminen ja solukuoleman induktioon aiheuttama BMP antagonisti DMH2. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että BMP signalointi edistää solujen kasvua ja selviytymistä keuhkosyöpään solujen, mikä välittyy kautta sääntelyn Id perheenjäseniä. Selektiivisiä BMP tyypin I reseptorit on potentiaalinen keino farmakologisesti hoitoon NSCLC ja muut syövät aktivoitu BMP signalointiryöpyn.

Citation: Langenfeld E, Hong CC, Lanke G, Langenfeld J (2013) luun morfogeneettinen proteiini tyyppi I -reseptorin vähennys kasvu ja aiheuttavat solukuoleman keuhkosyöpään Cell Lines. PLoS ONE 8 (4): e61256. doi: 10,1371 /journal.pone.0061256

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 tammikuu 2012; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2013; Julkaistu: 12 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Langenfeld et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat seuraavat kiinnostusta. Pieni molekyylejä käytettiin kokeessa edustavat mahdollisia lääkkeitä hoitoon syöpäpotilailla. Previsionary patenttihakemus on jätetty mahdollisesta käytöstä näiden molekyylien syövän. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

luun morfogeneettinen proteiinit (BMP: t) ovat jäsenten Transforming Growth Factor-superperheen (TGF). BMP: t ovat phytogenetically konservoituneita proteiineja tarvitaan alkionkehityksen hyönteisistä ihmiseen. Noin 20 BMP ligandeja on tunnistettu ja luokiteltu useisiin alaluokkiin. BMP-2 ja BMP-4 osuus 92% homologia ja ovat vaihdettavissa biologinen aktiivisuus. BMP: t ovat erittyviä proteiineja, jotka signaloivat transmembraani- seriini /treoniini-kinaasien kutsutaan tyypin I ja tyypin II reseptorit [1]. Tyypin I reseptorit ovat Alk 1, Alk2 (ActR-1), Alk3 (BMPR-IA), ja alk6 (BMPR-IB) [1]. Tyypin II reseptorit ovat BMPR-II: n ja aktiviinin tyypin II reseptorien ActR-II ja ACR-IIB [1]. BMP-reseptorit ovat irrallisia, ja se voidaan aktivoida usealla BMP ligandien [1], [2]. Jokainen BMP-ligandin on myös pystyvät aktivoimaan eri reseptoreihin [1], [2]. Sidonta BMP ligandien tyypin I reseptori johtaa fosforylaation konstitutiivisesti aktiivista tyypin II reseptoriin. Reseptorikompleksissa fosforyloi Smad-1/5, joka sitten aktivoi transkription alavirtaan kohdegeenien [3].

alkionkehityksen aikana, BMP: t säätelee solun kohtaloa päätöksiä, solujen selviytymisen, ja vaskulogeneesiä [4], [5 ], [6], [7], prosesseja, jotka ovat yleisiä myös syövän synnyn. Itse asiassa, BMP-2 on yli-ilmentynyt 98% NSCLC ja muut syövät [8], [9]. BMP ilme kääntäen korreloi selviytymisen [10] ja korkea ilmentyminen liittyy metastaaseja [11], [12]. BMP-2 tehostaa tuumoriangiogeneesissa [13], [14], [15] ja stimuloi kasvaimen invaasio [8]. Ektooppinen ilmentyminen BMP-2 A549 keuhkosyövän soluja suuresti parannettu metastaattista kasvua hiirimallissa keuhkosyövän jälkeen, häntälaskimoinjektio [16]. Tutkimukset käyttäen yhdistelmä-DNA-BMP-proteiinia tai pudotus yhden BMP-reseptoriin ovat ehdottaneet, että BMP-signalointia syöpäsoluissa ei edistää solujen kasvua, ja se voi toimia jopa tuumorisuppressori (16-19). Vaikutukset estämällä useita BMP reseptorien solujen kasvua ja selviytymistä syöpäsoluissa ei ole tutkittu. Näin ollen biologinen merkitys on basaalisesti aktiivisen BMP signalointiryöpyn syöpäsoluissa ei ole tiedossa.

kehittämisen aikana inhibiittorit DNA: ta sitovan /erilaistumiseen (Id) ovat suoria välittäjiä BMP-signalointia. On 4 Id perheenjäseniä (ID1, Id2, id3, ja ID4). BMP-elementteihin (BRE) on ID1, Id2, ja id3 promoottorit aktivoituvat Smad 1/5/8 (20-23). Id proteiinit estävät linjaa sitoutuminen sitomalla ja metalleja sitovia perus HLH transkriptiotekijöiden [17]. Id perheenjäsenet ovat sekaantuneet onkogeenisen muutoksen useita syöpiä [18] [19], [20]. ID1 on raportoitu säätelemään invaasio, proliferaatio, selviytyminen, ja metastaattisen leviämisen syöpäsolujen [18], [21], [22]. Id perheenjäsenet usein ilmaistaan ​​ei-pienisoluisen keuhkosyövän [23], [24] ja yli-ilmentyminen liittyy lyhyempi taudista vapaa eloonjääminen [25]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että kohdistaminen signalointireittejä, jotka säätelevät ilmentymistä Id perheenjäsenet voivat olla tärkeitä terapeuttisia vaikutuksia. Vaikka yhdistelmä-BMP2 proteiinien aiheuttaa ohimenevää ilmentymistä ID1 keuhkoissa syöpäsoluissa [8], rooli BMP signalointiryöpyn säätelyssä perusekspression tasot Id perheenjäsenten syöpäsoluissa ei ole selvitetty.

tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää keuhkosyövän solulinjoja, joita ei ole stimuloitu rekombinantti BMP-proteiinia, onko solut ovat basaalisesti aktiivinen BMP signalointi ja määrittää sen vaikutus solujen kasvuun, selviytyminen, ja ilmaus Id perheenjäsenet. Valikoiva BMP tyypin I reseptoriantagonisteja ja siRNA kohdistaminen BMP tyypin I reseptorien paljastaa, että basaalisesti aktiivisia BMP signalointia keuhkosyövän solulinjoissa on kasvua edistävää ja tärkeä säätelijä ilmentymisen Id perheenjäseniä. BMP signalointi välittyy useamman kuin yhden tyypin I BMP-reseptoriin. DMH2 aiheutti suurimmat eston BMP signaloinnin ja aiheuttama suurin vähennys solujen kasvun ja ilmentymisen Id perheenjäseniä.

Tulokset

BMP tyypin I -reseptorin Vähennä Smad 1/5/8 signalointi

Käyttämällä BMP-reagoiva lusiferaasireportteri (BRE-Luc), selvitimme vaikutuksia eri BMP tyyppiä reseptoriantagonistien on Smad 1/5/8 aktiivisuutta H1299 soluissa. Dorsomorphin, DMH1, DMH2, ja LDN kaikki aiheutti merkittävän vähenemisen ekspression BRE-Luc reportteri H1299-soluissa, mikä osoittaa laskua Smad 1/5/8 aktiivisuuden (kuvio 1A). Immunoblot-analyysi paljasti, että valikoiva BMP tyypin I reseptoriantagonistit vähentävät fosforylaatiota Smad 1/5/8 vuonna H1299 ja A549-soluja (kuva 1 B ja kuva S1). Fosforylaatiota Smad 1/5/8 aleni 24 tunnin kuluessa hoidon ja kesti vähintään 48 tuntia sen jälkeen.

(A) H1299-solut transfektoitiin BRE-luciferace toimittaja. 48 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin DMSO: ssa, 10 uM Dorsomorphin, tai 1 uM DMH1, 1 uM DMH2, tai 1 uM LDN 48 tuntia. BRE-luciferace aktiivisuus raportoidaan prosenttia DMSO-kontrollin käsiteltyjen solujen. Data edustaa keskiarvoa 3 kokeen kolmena kappaleena. Keskiarvo kontrolli solujen keskimääräiseen verrattuna käsitellyn soluja. * P 0,05. (B) immunoblot-analyysi fosforyloidun Smad 1/5/8 ja H1299-solujen käsiteltiin 1 uM DMSO, DMH1 tai DMH2 12, 24, ja 48 tuntia.

BMP tyypin I -reseptorin vähennys Expression of Id perheenjäsenet

kvantitatiivinen RT-PCR: ää käytettiin sen määrittämiseksi, BMP signalointikaskadissa säätelee ilmentymistä Id perheenjäsenten keuhkosyövän solulinjoissa. Dorsomorphin, DMH1, ja DMH2 laski merkittävästi ID1, Id2, ja id3 ilmentymistä A549- ja H1299 solulinjoissa (kuvio 2A-B). BMP antagonistit aiheuttivat pieneni enemmän Id perheenjäsenten H1299 soluissa verrattuna A549-soluja. Western blot-analyysi, Dorsomorphin, DMH1, DMH2, ja LDN vähentänyt proteiinin tasot ID1 ja id3 A549 ja H1299-soluja (kuvio 2C-D ja kuva S2). BMP antagonistit vähentynyt ilmentyminen Id perheenjäsenten 12 24 tuntia, joka kesti vähintään 48 tuntia. DMH1 ja DMH2 aiheutti suuremman vähentäminen ID1 vuonna H1299 soluissa verrattuna A549-soluja. DMH2 johdonmukaisesti aiheutti suuremman väheneminen ID1 proteiinin ilmentymisen kuin DMH1.

(A-B) Kvantitatiivinen RT-PCR ID1, Id2, ja id3 päällä (A) A549 ja (B) H1299 käsiteltyjä soluja DMSO, 10 uM Dorsomorphin, 1 uM DMH1, tai 1 uM DMH2 48 tuntia. Data edustaa keskiarvoa vähintään 3 kokeet suoritettiin kahtena rinnakkaisena, ja esitetty prosentuaalinen valvonnan käsiteltyjen solujen. Keskiarvo kontrolli solujen keskimääräiseen verrattuna käsitellyn soluja. * P 0,05. (C-D) Western blot analyysi ID1 ja id3 on (C) A549 ja (D) H1299-soluja käsiteltiin 1 uM DMSO: ssa tai 1 uM valikoiva BMP tyypin I reseptori antagonisti 12, 24, ja 48 tuntia. Nämä tutkimukset tehtiin vähintään 3 kertaa.

Multiple BMP tyypin I reseptorit välittävät Signaling

Seuraavaksi arvioimme onko tietty BMP tyypin I reseptori välittää basaalisesti aktiivisia BMP signalointia keuhkosyövän solulinjat. Kvantitatiivisella RT-PCR: n ilmentyminen BMP tyypin I reseptorien tutkittiin. Alk 1 ei ilmoitetaan joko A549- tai H1299 soluja (kuvio 3A). Kuten odotettua, Alk 1 on ilmaistu ihmisen endoteelisoluissa (aineistoa ei esitetty). Alk2, Alk3, ja alk6 mRNA ilmaistaan ​​A549 ja H1299 solulinjoissa (kuvio 3A). Käyttämällä siRNA: n ilmentyminen kunkin tyypin I reseptorin väheni noin 40% tai suurempi (kuvio 3B). Voit testata spesifisyys siRNA, knockdown kunkin tyypin I reseptoriin suoritettiin ja RT-PCR suoritettiin Alk2, Alk3, ja alk6. Knockdovvn Alk2 aiheutti merkittävän kasvun ilmentymisen alk6 (kuvio 3C). Knockdovvn Alk3 ja alk6 aiheutti pienen laskun ilmaus muiden tyypin I reseptorit (kuvio 3C). Kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että hiljentäminen Alk2 tai Alk3 että H1299 soluissa aiheutti noin 20-25%: n lasku ilmaus ID1 mRNA (kuva 3D), kun taas hiljentäminen on alk6 pyrkivät aiheuttamaan kasvua ID1 ilme. Vaimentaminen sekä Alk2 ja Alk3 aiheutti huomattavasti suurempi lasku ID1 ilmaus kuin knockdovvn joko reseptorin yksinään (kuvio 3D). Western blot-analyysi osoitti, että knockdown yhden tyypin IA reseptorin yksinään ei laskenut ID1 ilmaisu (kuvio 3E). Hiljentäminen Sekä Alk2 ja Alk3 tai vaiennettu Alk2, Alk3, ja alk6 ei alentavan ID1 proteiinin ilmentymisen (kuvio 3E). Kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että pudotus useiden reseptorien johti vähenemiseen kaikentyyppisiä BMP-reseptoreja, joka oli suurempi kuin nähdään yhden reseptorin knockdowns (kuvio 3F).

(A) kvantitatiivinen RT-PCR-A549- ja H1299-solut osoittavat ilmentymisen Alk2, Alk3, ja alk6 mutta ei Alk 1 (n = 3). (B) H1299-solut transfektoitiin siRNA: lla kohdistamisen kunkin tyypin I BMP-reseptoriin ja kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin, että BMP-reseptoriin. (C) Knockdown kunkin BMP tyypin I reseptorin H1299-soluissa tehtiin ja kvantitatiivinen RT-PCR suoritetaan kaikille 3 tyypin I reseptorien. (B-C) Data edustaa keskiarvoa 2 kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. (D) Knockdown in H1299 soluissa yhden BMP tyypin I reseptori tai molemmat Alk2 ja Alk3. 48 tunnin jälkeen ilmentyminen ID1 tutkittiin kvantitatiivisen RT-PCR: llä. Data edustaa keskiarvoa 3 kokeen suoritettiin kaksinkertaisina. (E) Western blot analyysi ID1 in H1299 solujen knockdown yhden tyypin I BMP-reseptoriin tai yhdistelmä knockdovvn Alk2 ja Alk3, tai kaikki 3 BMP tyypin I reseptorien. Tutkimukset tehtiin vähintään 2 kertaa. Tutkimukset osoittavat hiljentäminen useampia reseptoria tarvitaan laskevan ID1 ilme. (F) Kvantitatiivinen RT-PCR tyypin I BMP reseptorien jälkeen knockdovvn Alk2 ja Alk3, tai kaikki 3 BMP tyypin I reseptorien. Tutkimukset tehdään 3 kertaa kahtena ilmoitetaan prosentteina vertailusta. (G) H1299-solut kotransfektoitiin insertless vektori, konstitutiivisesti aktiivinen Alk3 (ca-Alk3), tai konstitutiivisesti aktiivinen alk6 (ca-alk6) ekspressiovektorit ja BRE-lusiferaasireportteri-. Sitten solut käsiteltiin 1 uM DMSO: ssa tai 1 uM BMP-reseptoriantagonistin 24 tuntia ja luciferace aktiivisuus mitattiin. Data osoittaa, että keskiarvo on vähintään 3 itsenäisen kokeen esitetty prosentuaalinen valvonnan.

Toinen sarja siRNA kohdistamisen kunkin BMP tyypin I reseptoria käytettiin arvioimaan edelleen BMP-signalointia. Nämä siRNA aiheutti myös merkittävän vähenemisen ilmentymisen kohteena reseptorin A549 ja H1299-soluja (kuva S3). Tarkastellaan spesifisyys näiden siRNA osoittivat myös, että knockdown yhden reseptorin aiheutti downregulation toisen tyypin I BMP-reseptorit (kuvio S3). Nämä tiedot viittaavat siihen, että on olemassa rajat sääntelyä eri tyypin I BMP reseptoreita. Jälleen knockdown yhden tyypin I BMP-reseptoriin ollut riittävä alentamaan ID1 ilmentymistä joko A549- ja H1299-solut (kuva S3). Tutkimaan edelleen BMP-reseptoriin signalointi, kukin reseptori hiljennettiin ja Smad 1/5/8 aktiivisuus määritetään käyttämällä BRE-lusiferaasianalyysissä. Hiljentäminen vain yksi BMP tyypin I reseptoriin ei aiheuttanut vähenemistä Smad-1 /5/8 aktiivisuutta (kuva S3). By qRT-PCR, knockdown kaikista 3 tyypin I BMP reseptoreihin A549 aiheutti merkittävän ilmentyminen vähenee ID1 (kuva S3). Knockdown kaikentyyppisiä I BMP reseptorien (Alk2, Alk3, ja alk6) vahvistettiin qRT-PCR (kuva S3). Western blot-analyysi osoitti jälleen, että pudotus yhden reseptorin H1299-soluissa ei ollut riittävä alentamaan ilmentymisen ID1 (kuva S3). Vastaa meidän muiden joukko siRNA, knockdovvn Alk2 + Alk3 tai Alk2, Alk3 ja alk6 alensi proteiinin ilmentymistä ID1 (kuva S3). Nämä tulokset tukevat että BMP signalointi välittyy useamman kuin yhden tyypin I BMP-reseptoriin keuhkosyövän solulinjoissa.

C2C12 hiiren myoblastisolun solulinja, DMH1 esti Alk2 ja Alk3 toimintaa vaan ilmoitettiin olevan mitätön estäviä vaikutuksia on alk6 [26]. DMH2 tiedetään estävän Alk2 ja LDN estää tehokkaasti Alk2, Alk3, ja alk6 [26]. Testata reseptorin selektiivisyyttä DMH1, DMH2, ja LDN keuhko- syöpäsoluja, konstitutiivisesti aktiivinen Alk3 (ca-Alk3) tai alk6 (ca-alk6) on ko-transfektoitiin BRE-luciferace reportteri osaksi H1299-soluja (kuvio 3G). DMH2 aiheutti suuremman vähentämiseen Alk3 aktiivisuuden kuin DMH1 ja LDN että H1299 soluissa. BMP antagonistit aiheutti eston alk6, mutta pienempi kuin nähty Alk3 (kuvio 3G).

esto BMP tyypin I reseptorit Vähentää Cell Growth

Seuraavaksi vaikutukset estämällä BMP tyypin I reseptoreihin solujen kasvua tutkittiin suorittamalla solujen määrää. BMP tyypin I reseptoriantagonistien aiheutti merkittävän lukumäärän vähentäminen solujen jälkeen 7 päivää sekä A549 ja H1299 solulinjoissa (kuvio 4A). Selektiivinen BMP reseptoriantagonisteja aiheutti suuremman vähennys solujen kasvun H1299 soluissa verrattuna A549-soluja. DMH2 aiheutti merkittävästi enemmän kasvun inhibitiota kuin DMH1 molemmissa solulinjoissa (kuvio 4A). Poistaa mahdolliset BMP ligandien soluviljelmässä tietovälineellä, H1299-soluja viljeltiin seerumivapaassa väliaineessa ja käsiteltiin DMH2. DMH2 myös aiheutti merkittävää solujen kasvun esto on H1299 soluja viljeltiin seerumivapaassa väliaineessa (SFM) (kuva 4B), mikä viittaa siihen, että BMP signalointi voi tapahtuu itse itsenäisesti. Proliferaatio tutkittiin määrittämällä bromideoksiuridiinia (BrdU) sisällyttäminen. DMH2 aiheutti annoksesta riippuvaisen laskun proliferaatiossa että H1299 solujen 24 tunnin kuluessa (kuvio 4C) ja syvempi vaikutus havaittiin 48 tuntia (kuvio 4C). Knockdown kaikista 3 tyypin I BMP reseptorien (Alk2, Alk3, ja alk6) kun H1299 soluissa aiheuttivat myös merkittävä lasku BrdU (kuvio 4D). Knockdovvn Alk2, Alk3 ja alk6 avulla toinen joukko siRNA aiheutti myös merkittävä väheneminen proliferaatio H1299 soluissa (kuva S3). Kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että tämän toisen sarjan siRNA suunnattu kaikille 3 tyypin I BMP reseptoreihin H1299 soluissa aiheutti downregulation Alk2 ja alk6 muttei Alk3 (kuva S3). Tämä viittaa siihen, että esto Alk2 ja alk6 on riittävä alentamaan BMP signalointia H1299 soluissa.

(A) A549 ja H1299 soluja viljeltiin DMEM 5% FCS hoidettiin DMSO, 10 uM Dorsomorphin, 1 uM DMH1, 1 uM DMH2, tai 1 uM LDN ja 7 päivää ja solujen määrä suorittaa. (B) H1299-soluja viljeltiin SFM käsiteltiin 1 uM DMSO: ssa tai 1 uM DMH2 ja 7 päivää ja solujen määrä suorittaa. (C) BrdU ja H1299: lla käsiteltyjen solujen DMSO: ssa tai 1 uM tai 5 uM DMH2 24 ja 48 tuntia. (D) BrdU sisällyttämisen H1299 transfektoitujen solujen siRNA kohdistaminen kaikentyyppisiä I BMP reseptorien tai siRNA ohjaus. (C-D) Data on keskiarvo 3 kokeen kolmena kappaleena raportoidaan prosenttia ohjaus käsiteltyjen solujen. (E-G) Colony kasvu A549 ja H1299 solut käsiteltiin 1 uM DMSO tai 1 uM selektiivinen BMP-reseptorin antagonisti. (E) valokuva edustavan kokeen. (F-G) Tiedot on esitetty keskimääräisen vähintään 3 itsenäisen kokeen raportoidaan prosenttia valvontaa. (G) DMH1 pienenee ankkurointi riippumatonta kasvua keuhkosyövän solulinjat. A549 ja H1299-solujen pehmeässä agarissa käsiteltiin 1 uM DMS0 tai 1 uM DMH1 varten 2 viikkoa ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin. Tiedot näytetään on keskiarvo 3 itsenäisen kokeen raportoidaan prosenttia valvontaa.

BMP tyypin I -reseptorin Vähennä klonogeeninen Growth

vaikutus BMP-reseptoriantagonistien on klonogeeniset solujen kasvuun tutkittiin. DMH1, DMH2, ja LDN kaikki aiheutti merkittävän vähentämisen klonogeeniset kasvua sekä A549 ja H1299 solulinjoissa (kuvio 4E-G). Klonogeeniset kasvu estyi enemmän DMH2 ja LDN kuin DMH1 (kuva 4E-G). Edelleen vaikutusten arvioimiseksi DMH1 on klonogeeniset kasvuun, ankkurointi riippumattomaan kasvuun tutkittiin. DMH1 vähensi ankkurointi riippumatonta kasvua sekä A549 ja H1299-solut (kuvio 4H). Nämä tiedot osoittavat, että basaalisesti aktiivinen BMP signalointi stimuloi proliferaatiota ja edistää klonogeeniset kasvua keuhkosyöpään solujen.

esto BMP tyypin I reseptoreihin saa Cell Death

Vaikutus BMP signaloinnin solun eloonjäämistä tutkittiin . Solukuolemaa kvantitoitiin käyttäen etidiumbromidia oton määritystä. Etidiumbromidia vain siirtyy solujen, jotka ovat menettäneet kalvo eheys, joka syntyy, kun solut kuolevat nekroosin tai apoptoosin [27]. BMH2 indusoimaa solukuolemaa H1299-soluissa 12 tunnin kuluessa, ja 48 tunnin kaikki antagonistien aiheutti merkittävän osuuden kasvu kuolleita soluja (kuvio 5A). 48 tunnin kuluessa, Dorsomorphin, DMH1, ja DMH2 aiheutti merkittävän kasvun solukuolemaa A549-soluja (kuvio 5B). Arvioidaan tarkemmin solukuoleman, H1299 soluja viljeltiin DMEM 5% FCS käsiteltiin DMH2 4 päivää ja prosenttiosuus kuolleet solut määritetään trypaanisineä värjäystä. DMH2 aiheutti merkittävän kasvun solukuoleman, joka oli annoksesta riippuvainen (kuvio 5C). Prosenttiosuus kuolleita soluja oli vielä korkeampi H1299 soluissa viljeltiin SFM (kuvio 5D). Amiini-reaktiivista fluoresoivaa väriainetta käytettiin havaitsemaan solukuoleman, joka osoitti myös, että DMH2 indusoi solukuolemaa H1299-soluja (kuvio 5E). Edelleen varmistamiseksi, että BMP-antagonistit indusoivat solukuoleman estämällä BMP signalointi, kolminkertainen knockdovvn Alk2, Alk3, ja alk6 reseptoreihin suoritettiin. Knockdovvn Alk2, Alk3, ja alk6 reseptorit aiheutti merkittävän osuuden kasvu kuolleita soluja verrattuna siRNA kontrolli käsitellyissä soluissa (kuvio 5F). Toinen sarja siRNA kohdistaminen Alk2, Alk3 ja alk6 myös aiheutti merkittävän prosenttiosuuden kasvattaminen kuoleman solujen (kuva S3). Nämä tutkimukset osoittavat, että antagonisoimalla aktiivisuus BMP tyypin I reseptorien indusoi solukuoleman keuhkosyövän soluja.

(A-B) H1299 ja A549 viljeltiin DMEM 5% FCS käsiteltiin DMSO: ssa tai BMP-reseptoriantagonistin (10 uM Dorsomorphin tai 1 uM-valikoiva antagonisti). Prosenttiosuus soluista, jotka vievät etidiumbromidilla määritettiin sitten. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. (C) H1299-soluja viljeltiin DMEM: ssä, 5% FCS: ää, käsiteltiin DMSO: ta, 1 uM ja μ5 M DMH2 ja 7 päivää, värjättiin Typan Blue, ja solujen määrä suorittaa. Data edustaa keskiarvoa 4 kokeita raportoidaan prosenttia kuolleita soluja. (D) H1299-soluja viljeltiin SFM käsiteltiin DMSO: ssa tai 1 uM DMH2 ja 7 päivää, värjättiin Typan Blue, ja solujen määrä suorittaa. Data edustaa keskiarvoa 5 kokeilut raportoitu prosenttia kuolleita soluja. (E) Solukuolema määritettiin käyttämällä virtaussytometria havaitsemiseksi ottoa amiinin kanssa reagoiva fluoresoiva väriaine H1299: lla käsiteltyjen solujen DMS0 tai DMH2 varten 4 päivää. Data edustaa keskiarvoa 3 riippumattoman kokeen. (F) H1299-solut transfektoitiin ohjaus siRNA ja siRNA kohdistaminen Alk2, Alk3, ja alk6. 2 päivän kuluttua solujen prosenttiosuus värjäyksiä etidiumbromidilla määritettiin. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona 6 itsenäisen kokeen.

BMP Merkinanto on säännelty Self-itsenäisesti

solukuoleman induktioon ja kasvun hidastuminen aiheuttama BMP reseptoriantagonistit keuhkosyövän solulinjoja kasvaa SFM ehdotti, että BMP signalointi tapahtuu itse itsenäisesti. Ennen tutkimukset ovat osoittaneet, että keuhkosyövän solulinjat tuottavat kypsän BMP2 proteiini, joka on aktiivinen muoto [8]. Sen varmistamiseksi, että keuhkosyövän solut erittävät BMP2, ELISA solun elatusaineet suoritettiin. BMP2-proteiinia ei havaittu DMEM, jossa oli 5% vasikan (FCS) tai seerumivapaassa väliaineessa (SFM) (kuvio 6A). BMP2 havaittiin väliaineessa, kun keuhkosyövän solulinjoja viljeltiin joko SFM tai DMEM, jossa 5% FCS: ää (kuvio 6A). Koska muut BMP: t voisivat olla FCS, vaikutukset BMP reseptoriantagonistien sääntelystä BMP signalointi tutkittiin SFM. Fosforyloidun Smad 1/5 ja ID1 ekspressiota havaittiin H1299-soluissa viljellä seerumivapaassa väliaineessa (kuva 6B). BMP tyypin I reseptori-antagonistit laski pSmad 1/5 ja ID1 ilmentyminen H1299-soluja viljeltiin SFM (kuvio 6B).

(A) BMP2 Elisa suoritettiin DMEM 5% FCS ja SFM ilman solut (medium). BMP2 Elisa suoritettiin DMEM 5% FCS ja SFM soluviljelyalustaa, joka sisälsi A549 ja H1299-soluja 48 tunnin ajan. Kokeet edustavat keskiarvoa vähintään 5 kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (B) BMP-antagonistit vähentävät BMP signalointi keuhkosyövän soluja viljeltiin SFM. H1299-soluja viljeltiin SFM käsiteltiin 1 uM DMSO: ta, 1 uM DMH2 tai 1 uM LDN 48 tuntia ja Western blot-analyysi suoritettiin. (C) Kvantitatiivinen RT-PCR BMP2 ilmaisun 48 tunnin kuluttua transfektoimalla H1299 solujen ohjaus siRNA tai siRNA kohdistaminen BMP2. Data edustaa prosenttia valvonnan keskimäärin 4 erillisen kokeen. (D) Western blot-analyysi H1299 solujen SFM 48 tunnin jälkeen transfektoitu ohjaus siRNA tai siRNA kohdistaminen BMP2. BMP2 Knockdown aiheuttaa lasku ilmaus pSmad 1/5 ja ID1. (E) knockdovvn BMP2 indusoi solukuoleman. H1299 solut SFM transfektoitiin ohjaus siRNA tai siRNA kohdistaminen BMP2. 48 tunnin jälkeen prosenttiosuus kuolleet solut määritettiin etidiumbromidivärjäyksellä. Aineisto edustaa keskiarvoja 4 erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena.

tarkastella edelleen itsensä autonominen signalointi BMP signalointiryöpyn, BMP2 ilmaisu, joka pudotettiin käyttämällä siRNA. Kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että siRNA kohdistaminen BMP2 aiheutti suuremman kuin 60%: n vähennys ilmentymisen BMP2 (kuvio 6C). Knockdovvn BMP2 of H1299 soluja viljeltiin SFM vähentänyt proteiinin ilmentymistä fosforyloidun Smad 1/5 ja ID1 (kuva 6D). BMP2 Knockdown aiheutti merkittävän osuuden kasvu kuolleiden keuhkosyöpään solut kasvavat SFM (kuvio 6E). Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että pohjapinta BMP aktiivisuus keuhkosyövän solulinjoja stimuloidaan itsenäisenä itsenäisesti, mikä voidaan estää vastavaikuttamalla BMP tyypin I reseptorien.

knockdovvn ID1 ja id3 Vähentää solujen kasvua ja edistää solujen Death

Seuraavaksi tutkittiin, ID1 ja /tai id3 säätelee solujen eloonjäämistä ja kasvua keuhkosyöpään solujen. Pudotus ID1 käyttäen siRNA vähensi proteiinin taso ID1, mutta ei id3 (kuvio 7A). Knockdovvn id3 aiheutti vähentäminen id3 proteiinin tasot vaikuttamatta ilmentymisen ID1 (kuva 7A). Kvantitatiivinen RT-PCR osoitti myös vähenemistä ID1 ja id3 vastaavasti (kuvio 7B). Knockdown ID1 tai id3 in H1299 soluissa aiheutti merkittävän osuuden kasvu kuolleita soluja määritettynä etidiumbromidivärjäyksellä (kuvio 7C). Solulaskennat trypaanisineä käyttämällä värjäys osoitti, että knockdovvn ID1 laski solujen kasvuun ja solukuolema mutta ei saavuttanut tilastollista merkittävyyttä (kuvio 7D, F). Knockdovvn id3 ei aiheuttaa erittäin merkittävä kuoleman solun kasvun ja solukuoleman induktio verrattuna kontrolleihin (kuvio 7D, F). Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että vähentäminen Id ilmaisu on ainakin osittain mekanismi, jonka BMP-reseptorin antagonistit indusoivat solukuoleman ja vähentää solujen kasvua. Vuonna H1299 soluissa, id3 voi olla suurempi rooli säätelyssä BMP signalointi kuin ID1.

(A) Western blot analyysi ID1 ja id3 48 tunnin kuluttua H1299-soluja transfektoitiin ohjaus siRNA ja siRNA kohdistaminen ID1 tai id3. (B) Kvantitatiivinen RT-PCR ID1 ja id3 jälkeen H1299-soluja transfektoitiin ohjaus siRNA ja siRNA kohdistaminen ID1 tai id3. Data edustaa prosenttia valvonta keskiarvon 2 kokeissa. (C) H1299-solut transfektoitiin kontrolli-siRNA tai siRNA kohdistaminen ID1 tai id3. 48 tunnin jälkeen solujen prosenttiosuus värjäyksiä etidiumbromidilla määritettiin. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona 4 riippumattomassa kokeessa. (D-F) H1299-solut transfektoitiin ohjaus siRNA ja siRNA kohdistaminen ID1 tai id3. 7 päivän jälkeen solut värjättiin Trypan Blue, ja määrä elossa ja kuolleet solut määritettiin. Aineisto edustaa prosentuaalinen muutos siRNA valvonta (D) elossa tai (F) kuolleita soluja. (E) Esittää solujen prosenttiosuus, jotka olivat kuolleet. Aineisto edustaa keskiarvoja 4 itsenäisen kokeen.

yli-ilmentäviä soluja id3 ovat Kestää DMH2

edelleen määrittää, ID1 ja id3 välittävät BMP signalointi, ID1 ja id3 ekspressiovektorit olivat vakaasti transfektoidaan H1299 soluihin. Pakko ilmentymisen ID1 aiheutti lisääntymisen proteiinin ekspression ID1, mutta ei id3 (kuvio 8A). Pakko ilmentymisen id3 aikaansai ilmaus id3 muttei ID1 (kuva 8B). Siellä oli pieni nousu aktiinin ilmentymistä H1299 /id3 soluja. Koska aktiini voi jopa säädellä id3 yli-ilmentyminen, ilmentyminen GAPDH tutkittiin. Western blot-analyysi osoitti, että GAPDH-ilmentyminen oli samalla välillä vektorisäädön solujen ja H1299 /id3 soluja. DMH2 aiheutti samanlaisen väheneminen solujen kasvua H1299 /ID1 soluja verrattuna vektorin kontrollisoluihin (kuvio 8C). DMH2 ei aiheuttanut kasvun estäminen (kuvio 8C) tai aiheuttaa solukuoleman (kuva 8D) ja H1299 /id3 soluja. Nämä tiedot tukevat edelleen, että biologiset vaikutukset välittyvät BMP-reseptoriantagonistit liittyy Id proteiineja.

H1299-solut transfektoitiin stabiilisti ID1 ja id3 ekspressiovektorit tai insertless vektorin. (A-B) Western blot-analyysi osoittaa lisääntyneen ilmentymisen (A) ID1 tai (B) id3 on transfektoitu solulinja. (C-D) H1299 /ID1 ja H1299 /id3 soluja käsiteltiin 1 uM DMSO: ssa tai 1 uM DMH2 ja 7 päivää ja prosentuaalinen elossa ja kuolleet solut määritetään. (C) DMH2 aiheutti kasvun hidastuminen Vektorisäätö ja H1299 /ID1 soluja mutta ei H1299 /id3 soluja. (D) DMH2 indusoi solukuolemaa vektorisäätö soluja (H /con), mutta ei H1299 /id3-soluja (H /id3). Data edustaa keskiarvoa vähintään 3 raportoiduissa kokeissa kuin prosenttia ohjaus käsiteltyjen solujen. (E) DMH2 deceases solujen kasvua kuolemattomiksi normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBEC), mutta ei ihmisen aortan endoteelisoluissa (HAEC). Solulinjat kasvavat SFM hoidettiin 1 uM DMSO tai 1 uM DMH2 7 päivää ja solumäärät suoritettu. Data edustaa keskiarvoa vähintään 3 raportoiduissa kokeissa kuin prosenttia ohjaus käsiteltyjen solujen. (F) Western blot-analyysi osoittaa korkeampi ilmaus pSmad 1/5 ja ID1 sisään HBEC verrattuna HAEC: hen. 1 uM DMH2 48 tuntia vähentynyt ilmentyminen pSmad 1/5 ja ID1 in HBEC muttei HAEC.

DMH2 vaimentaa kasvu Normaali keuhkoputken epiteelisolujen mutta ei endoteelisoluissa

BMP2 signalointiryöpyn on välttämätöntä varhaista keuhkojen kehityksen voimakasta ilmentymistä epiteelin ja verisuonten esiasteita [28]. Vuoden loppuun keuhkojen morphogenesis BMP signalointi hylkäämisestä tuskin havaittava ilmentyminen aikuisen normaalissa keuhkokudoksessa [9], [28], [29]. BMP signalointi aktivoituu uudelleen normaaleissa aikuisen keuhkoputken epiteelisolujen tulehdus ja kudosvaurio [28], [29]. Määritellä tarkemmin spesifisyyden BMP reseptoriantagonistien, me tutki normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBEC) ikuisti ilman virus- onkoproteiineja [30] ja normaalin ihmisen aortan endoteelisoluja (HAEC) reagoivat DMH2. Odotetusti DMH2 aiheutti merkittävä väheneminen kasvun H1299 soluja (57%) ja samanlainen väheneminen HBEC (42%) (kuvio 8E). DMH2 aiheutti vain 15% vähennys solujen kasvua HAEC (kuvio 8E). HBEC oli suurempi ekspressiotaso pSmad 1/5 ja ID1 kuin HAEC (kuvio 8F). DMH2 vähensi ilmaus pSmad 1/5 ja ID1 in HBEC mutta ei HAEC. BMP-antagonistit myös vähentynyt ID1 ilmaisun ja indusoi kasvun inhibitio ihmisen normaaleissa keuhkoputken epiteelisoluissa kuolemattomiksi SV40: n suuren T-antigeenin geenin (BEAS-2B-soluja) [31] (kuva S4 ja tietoja ei näytetä).