Krooninen sairaus

tiivistelmä

verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) on angiogeeninen mitogeeni, jotka edistävät kasvaimen angiogeneesin kehossa. VEGF on keskeinen proteiini tarvitaan etenemisen kasvaimen hyvänlaatuisesta pahanlaatuiseen fenotyyppiin. Tässä tutkimuksessa tutkimme sitoutumisaffiniteetti aiemmin valitun 26-mer DNA aptameeriin sekvenssi (SL

2-B) vastaan ​​hepariinia sitovan domeenin (HBD) VEGF

165 proteiinia. SL

2-B ensin modifioitu ottamalla käyttöön fosforotioaattisidoksia (PS-sidoksia). Sen jälkeen, pintaplasmoniresonanssi (SPR) spektroskopiaa ja ympyrädikroismilla (CD) käytettiin määrittämään sitoutumisaffiniteettia, spesifisyys ja päätellä konformaatiota PS-modifioitua SL

2-B-sekvenssi. Lopuksi, antiproliferatiivinen aktiivisuus modifioidun SL

2-B-sekvenssi on Hep G2 syöpäsolujen tutkittiin. Tuloksemme osoittavat selvästi parannusta biostabiliteetin SL

2-B-sekvenssin jälkeen PS muutoksen. Modifioitu SL

2-B-sekvenssin lisäksi on parannettu antiproliferatiivista aktiivisuutta vastaan ​​Hep G2 syöpäsoluja hypoksiaolosuhteisiin. Lisäksi modifioitu SL

2-B-sekvenssin estää ilmentymisen Jagged-1-proteiinin, joka on yksi ligandien VEGF liittyy delta /rosoinen-lovi signalointireitin.

Citation: Kaur H, Li JJ, Bay BH, Yung L-YL (2013) tutkitaan antiproliferatiivinen High Affinity DNA aptameeriin syöpäsoluihin. PLoS ONE 8 (1): e50964. doi: 10,1371 /journal.pone.0050964

Editor: Antonio Facchiano, IDI, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italia

vastaanotettu: 02 toukokuu 2012; Hyväksytty: 29 lokakuu 2012; Julkaistu: 16 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Kaur et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusrahoitusta Singapore opetus- Academic Research Fund Tier 2 apurahan MOE2008-T2-1-046 ja Taso 1 apurahan R279000282112. Kirjoittajat arvosti myös jatko stipendi (for H. K.) peräisin NUS. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on yksi yleisimmistä kuolinsyistä maailmanlaajuisesti ja osuus 7,6 miljoonaa kuolemantapausta vuonna 2008 [1], [2]. Yhdysvalloissa yksin, noin 1: 4 ihmistä kuolee syöpään [3]. Tällä hetkellä, monoklonaaliset vasta-aineet ovat yksi pisimmällä terapeuttisia aineita syövän hoitoon markkinoilla. Useat FDA hyväksyi monoklonaalinen vasta lääkkeet, kuten bevasitsumabi (kauppanimi: Avastin) vastaan ​​endoteelikasvutekijä (VEGF) ja peräsuolen, keuhko-, ja munuaissyövän hoitoon trastutsumabi (kauppanimi: Herceptin) HER2 /neu-reseptoria rintasyövän hoidossa ja setuksimabi (kauppanimi: Erbitux) vastaan ​​epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) metastaattisessa peräsuolen, pään ja kaulan alueen syövät, on kehitetty ja niitä käytetään joko yksin tai yhdessä muiden lääkkeiden ja säteily syövän hoidossa [4 ] – [12].

vuonna 1990, joka on

in vitro

valintaprosessissa kutsutaan järjestelmällistä kehitystä ligandien eksponentiaalinen rikastus (SELEX) kehitettiin seulomiseksi yksijuosteinen nukleiinihappomolekyylien satunnaisesta allas kirjasto kohdeligandia vastaan ​​[13], [14]. Nämä luokat yksijuosteisen molekyylejä kutsutaan nimellä ”Aptameerien”. Niillä on suuri sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys, jotka ovat verrattavissa monoklonaalisia vasta-aineita. Lisäksi, pieni koko, ei-immunogeenisuutta ja helppous muutos verrattuna perinteisiin monoklonaalinen vasta-aine tekee aptameerit houkutteleva on tarkoitettu terapeuttiseen sovellukseen [15]. Perustuen lupaavia tuloksia prekliinisissä tutkimuksissa, kaksi syöpä kohdistaminen aptameerejä, ACT-GRO-777 (tai AS1411) – G-rikas DNA aptameeriin kohdistaminen nukleoliinin akuutin myelooisen leukemian (AML) ja NOX-A12 L-RNA aptameeriin kohdistaminen CXCL12 hoitoon useita myelooma ja lymfooma ovat jo kliinisissä tutkimuksissa [16], [17].

Yksi tärkein ongelma, joka syntyy terapeuttista käyttöä aptameerien on epästabiilisuutensa alle

in vitro

ja

in vivo

olosuhteissa [18]. Ne ovat alttiita entsymaattisia nukleaasihyökkäystä solu ja seerumin nesteitä. Tämän ongelman kiertämiseksi, useat kemialliset muutos strategioita on käytetty tehostamaan vastustuskykyä nukleaasien ja pysymisessä liikkeeseen puoliintumisaika biologisissa nesteissä. Tällaisia ​​kemiallisia modifikaatioita sisällyttämällä fosforotioaattisidoksia (PS-sidoksia) tai lukitussa nukleiinihapot (LNA), lisäksi funktionaalisia ryhmiä, kuten amino (-NH

2), fluori (-F),

O

metyyli (-OCH

3) 2′-asemaan riboosi sokeria, ja konjugointi korkean molekyylimassan polyetyleeniglykoli (PEG) tai kolesterolin [19] – [25]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että verrattuna modifioimattomaan versioon, kemiallisesti muunnettuja Aptameerien näytteille paitsi pidempi käyttöikä biologisessa miljöössä, mutta joskus myös parempaa sitoutumisaffiniteettia ja spesifisyyttä kohteisiinsa [21], [26].

VEGF on ratkaiseva angiogeenisten mitogeeni yli-ilmennetään kasvainsolut ja indusoi muuton, liiallinen proliferaatio, invaasio ja aineenvaihdunta kehossa. VEGF pidetään tunnusmerkki proteiinin kasvaimen angiogeneesiä ja on liitetty neoplastisten solujen transformointi kehon sisällä [27]. Yleisesti ajatellaan erittyvän endoteelisolujen edistää niiden lisääntymistä ja muuttoliike. Aiemmat raportit osoittavat kuitenkin, että eri syöpä ja pahanlaatuiset mesoteliooma solulinjoja myös erittävät tätä proteiinia [28] – [31]. VEGF

165 on ennalta hallitseva isoformi VEGF-proteiini, joka on yksi jäsenistä VEGF-perheen, ja ensisijaisesti sitoutuu kahden tyrosiinikinaasiaktiivisuuden reseptorit VEGFR-1 /Flt-1 ja VEGFR-2 /KDR /Flk -1 hyvin suurella affiniteetilla ja erityisiin yhteistyön reseptorin neuropilins [27]. Mitogeenista signalointi ja solujen lisääntymistä tuumorisoluissa aiheutetaan ilmentyminen VEGFR-2 [32], [33]. Sen sijaan aktivoituminen VEGFR-1 johtaa solun invaasiota ja solumigraatio muttei soluproliferaatiota [34] – [36].

Meidän Edellisessä tutkimuksessa 26-meeri-DNA aptameeriin vastaan ​​hepariinia sitova alue (HBD ) VEGF

165-proteiinia (kutsutaan SL

2-B) saatiin käyttäen kantasilmukan katkaisu strategia [37]. Verrattuna alkuperäiseen untruncated aptameeri, SL

2-B aptameerin esiintyi enemmän kuin 200-kertaiseksi sitoutumisaffiniteetti VEGF

165-proteiinia. Tässä muutimme SL

2-B aptameeriin sisällyttämällä fosforotioaatti (PS) yhteyksiä, testataan sen sitoutumisaffiniteetti, spesifisyys, biostabiliteetin, toissijainen rakenne ja mahdolliset toteutettavuus PS-modifioitu SL

2-B aptameeriin kuten antagonisti proliferaatioon aktiivisuutta syöpäsolujen. Osoitimme, että verrattuna modifioimattomaan SL

2-B aptameeriin, PS-modifioitu SL

2-B aptameeriin on parannettu sekvenssi kannalta seerumin vakauden ja antiproliferatiivinen aktiivisuus uhraamatta sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys VEGF

165 proteiinia.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

HPLC puhdistettu oligonukleotidi (sekä modifioimaton ja PS-modifioitu) ostettiin Sigma-Aldrich. Ihmisen rekombinantti-kantaja-free-VEGF

165 (molekyylipaino 38 kDa, pl = 8,25) ja VEGF

121 (molekyylipaino 28 kDa, pl = 6,4) proteiinit hankittiin R K-järjestelmät. CM5 anturi pelimerkkejä ostettiin GE Healthcare proteiinin immobilisaatiota. 1-etyyli-3- [3-dimetyyliaminopropyyli] hydrokloridi (EDC), N-hydroksisukkinimidiä (NHS), ja etanoliamiini-HCl ostettiin Sigma-Aldrich. Natriumasetaattia (vedetöntä) hankittiin Fluka. Tween-20 hankittiin USB Corporation. Akryyliamidi /bis-akryyliamidia (30%), ja Triton X-100 ostettiin BIO-RAD. Natriumdodekyylisulfaattia (SDS), fosfaattipuskuri suolaliuoksen (PBS), ja natriumhydroksidia (NaOH) hankittiin 1

st Base. Ihmisen maksasyövän (Hep G2) solulinjassa oli lahja Dr. Tong Yen Wah laboratoriosta, joka hankittiin ATCC. Ihmisen rinta-adenokarsinooma (MCF-7) solulinjassa ja ihmisen kolorektaalikarsinoomasolulinjaa (HCT-116) ostettiin ATCC. Hypoksian kammio ostettiin Billups-Rothenberg. Dulbeccon modifioitu Eaglen media (DMEM) media, ja naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin Caisson laboratorioissa. Trypsiini-EDTA ja 1% penisilliini /streptomysiiniä seos ostettiin PAN Biotech. Tiatsolyyli blue tetratsolium (MTT, 97,5%) ammoniumpersulfaattia (APS), urea ja N, N, N ’, N’-metyleeni-bis-akryyliamidia (TEMED, 99%), nadeoxycholate ja tris-puskuria ostettiin Sigma-Aldrich . Monoklonaalinen anti-ihmisen Jagged-1 fluoreseiini-vasta-aine hankittiin R K-järjestelmät. Jagged-1 (28H8) kaniinin monoklonaalinen vasta-aine hankittiin solusignalointia. Puhdistettu hiiren anti-kalneksiini-vasta-aine hankittiin BD transduktion laboratorioissa. Lyysi ja uuttopuskuria RIPA (Radio-Immunosaostusmääritys) puskurina western blotting valmistettiin seuraavat reagenssit: RIPA-puskuri (50 ml), 50 mM Tris (pH 7,8), 150 mM NaCl, 0,1% SDS: ää (natriumdodekyylisulfaatti) , 0,5% Nadeoxycholate, 1% Triton X-100, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF). Yksi tabletti estäjää cocktail, täydellinen mini tabletti (Roche Applied Science, Sveitsi) liuotettiin 10 ml: aan puskuria loppuun lyysipuskuria valmistamiseksi. Polyvinyllidene (PVDF) kalvo, märkä pico kemiluminesenssin alustan ja CL-filmin ostettiin Thermo Scientific. FITC anneksiini V: apoptoosin havaitseminen pakki hankittiin BD Pharmingen, Saksa. PMSF ostettiin CalBiochem.

pintaplasmoniresonanssin (SPR) spektroskopia

sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys modifioitua Aptameerin sekvenssi tutkittiin käyttäen pintaplasmoniresonanssin (SPR) spektroskopiaa, jossa VEGF

165 ja VEGF

121 toimivat ligandeina ja olivat suoraan immobilisoitiin anturin sirulle. Lyhyesti, karboksyyliryhmän sensorisirulla aktivoitiin standardin amiinikytkennällä menettelyä käyttäen juuri valmistettua EDC /NHS. VEGF

165 tai VEGF

121 (25 ug /ml) (pH 6,0) injektoitiin sitten sensorisirulla virtausnopeudella 8 ul /min päästä -200 RU liikkumattomuudesta tasolla. Deaktivointi tehtiin etanoliamiini-HCl estää reagoimattomien karboksyyliryhmien. Sitoutuminen analyysi suoritettiin muokattu Aptameerien eri pitoisuuksilla (0,2 nM ja 100 nM) käyttäen BIAcore 2000 väline (GE Healthcare). Ajotilantee- asetettiin 30 ul /min virtausnopeus, 25 ° C, 3 min yhdistys aikaa ja 5 min dissosiaation aikaa. PBS: ssä ja Tween-20 liuosta seosta käytettiin ajopuskurilla, ja 50 mM NaOH regeneraatiopuskuri. Kaikki puskurit suodatettiin ja poistettiin kaasut ennen kutakin koetta. Tyhjät pinnat käytettiin tausta vähennyslasku. Kun injektion aptameerien, sensorigrammit tallennus yhdistys /dissosiaatio käyttäytymistä VEGF-aptameeriin monimutkainen kerättiin. Vaihtelemalla aptameeri pitoisuus, sarja sensogrammien (kuvio 1) saatiin ja analysoitiin sen jälkeen käyttämällä 01:01 Langmuir mallia käyttäen BIAevaluation-ohjelmiston (versio 4.1) laskemiseksi tasapainodissosiaatiovakio K

d. Kaikki SPR mittaukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

nM). Kohta A: sta B vastaa yhdistyksen vaiheen ja piste B C vastaa dissosiaatiota vaihe kaikissa sensogrammien. Kuvassa PS-modifioitu SL

2-B aptameeriin (K

d = 0,56 ± 0,44 nM).

vakaus SL

2-B aptameeriin Against Nukleaaseja in Serum sisältävät Medium

testaamiseksi vakauden modifioimattoman ja PS-modifioitu SL

2-B aptameerin nukleaaseja vastaan, 10 uM aptameerin inkuboitiin eri aikavälein DMEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 37 ° C. 25 ui näyte otettiin pois eri ajankohtana (0, 12, 24, 48, ja 72 tuntia) ja välittömästi varastoitiin -80 ° C: ssa minimoimiseksi tarpeetonta hajoamista. Sitten näytteet altistettiin 12% denaturoivalla polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE). Bändi tiheys oli määrällisesti mitattiin käyttämällä geeliä densitometrian ja analysoitiin käyttäen geenin työkaluja ohjelmiston Syngene-.

Ympyrädikroismi (CD) spektroskopia

päätellä rakennetta PS-modifioitua SL

2- B aptameeri, 10 uM aptameerin liuotettiin PBS-puskurissa CD-analyysi. CD-spektri kirjattiin aallonpituusalueella 200-320 nm kahdessa eri lämpötilassa 25 ° C ja 37 ° C: ssa ja tiedot olivat keskimäärin 10 skannaa. CD-spektri analyysi suoritettiin käyttäen kyvettiä 1 cm: n valotien pituus Jasco J-810-spektropolarimetrillä. PBS-puskuria käytettiin tyhjinä sekä lämpötilat ja spektritiedot SL

2-B aptameerin on tyhjä korjattu.

antiproliferatiivinen aktiivisuus määritys

Hep G2 ja MCF-7-soluissa ympättiin tiheydellä 2000 solua /ml ja HCT-116-solut ympättiin tiheydellä 3000 solua /ml 96-kuoppaiselle levylle päivänä 0 DMEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja penisilliini /streptomysiiniä seos. SL

2-B aptameeriin (modifioimaton /PS-modifioitu) ja salattu aptameeriin inkuboitiin soluilla eri pitoisuuksina ja inkuboitiin 3 vuorokautta hypoksiaolosuhteisiin (5% CO

2, 1% O

2, ja 94% N

2) sisällä hypoksian kammion. Soluelatusainetta ole muuttuneet 3 päivää. Ei solu transfektoidaan tai läpäiseväksi ainetta lisättiin. Antiproliferatiivinen vaikutus aptameerin soluissa määritettiin mittaamalla solujen elinkelpoisuus käyttäen kolorimetristä MTT-määritystä. Optinen tiheys lukema rekisteröitiin käyttämällä mikrolevyn lukijaa (Tecan, ääretön M200) 570 nm taustan vähentäminen aallonpituudella 620 nm. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Mikroskopia Imaging

antiproliferatiivista vaikutusta PS-modifioitua SL

2-B aptameeriin Hep G2 soluihin arvioitiin käyttäen optista mikroskooppinen kuvantaminen. Samat olosuhteet ylläpidetään varten antiproliferatiivinen vaikutus määrityksessä, ja soluja kuvattiin sen jälkeen, kun 72 tunnin aptameerin hoidon. Mikrovalokuvista otettiin Eclipse T5000 (Nikon, Japani) valomikroskoopilla Tame2u hankintaohjel-.

apoptoosimäärityksessä

anneksiini V apoptoosin määritys suoritettiin tutkimaan solukuoleman mekanismin Hep G2-soluissa mukaan valmistajan protokollaa. Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä (1 x) ja sen jälkeen värjättiin FITC anneksiini V: n ja propidiumjodidin. Analyysi suoritettiin Beckman-couter Cyan ™ ADP -virtaussytometrillä laskemalla 15000 tapahtumista.

Virtaussytometrianalyysi

Virtaussytometria käytettiin tutkittaessa vaikutusta PS-modifioitua SL

2 -B aptameeriin on Jagged-1-proteiinin ilmentymisen Hep G2-soluissa. Hep G2-soluja siirrostettiin tiheydellä 80000 solua /ml 6-kuoppalevyllä päivänä 0 DMEM, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja penisilliini /streptomysiiniä seos. Seuraavana päivänä ymppäämisen jälkeen soluja käsiteltiin muutettu SL

2-B aptameerin ja sekvenssiltään sekoitettua aptameeriä 15 uM aptameerin pitoisuus. Samat hypoksiaolosuhteisiin ylläpidettiin varten antiproliferatiivinen vaikutus määrityksessä. 3 päivän kuluttua aptameerin hoidon solut trypsinoitiin, inkuboitiin anti-ihmisen Jagged-1 fluoreseiini-vasta-ainetta 1 tunnin ajan, suspendoitiin uudelleen PBS-puskurilla ja analysoitiin välittömästi käyttäen Beckman-couter syaani ADP-virtaussytometrillä analysoimalla 15000 tapahtumien ja suhteellisen fluoresenssi määritettiin käyttäen SUMMIT V 4.03.02 ohjelmisto.

Western Blot analyysi

sekvenssi erityinen vaikutus PS-modifioitua SL

2-B aptameeriin on Jagged-1-proteiinin ilmentymisen Hep G2 solut analysoitiin western blotting. Samoissa koeolosuhteissa ylläpidettiin varten virtaussytometrialla. 3 päivän kuluttua aptameerin hoidon, solujen elatusaine poistettiin ja solut pestiin kerran kylmässä 1 x PBS: ää. 500 ui täydellistä lyysipuskuria lisättiin jokaiseen 6-kuoppaan ja soluja poistetusta soluraaputtimella ja kerätään mikrosentrifugiputket. Uutettu proteiinit erotettiin SDS-PAGE-geelissä ja siirrettiin PVDF-kalvolle kautta märkä siirto. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa ja pestiin tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa 1% tween. Tämän jälkeen membraaneja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (Jagged-1 kanin monoklonaalista ja puhdistetun hiiren anti-kalneksiini-vasta-aine) ja sitten vastaavan sekundaarisen vasta-aineen (vuohen anti-kani-anti-hiiri-IgG sekundäärinen vasta-aine konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (HRP)) 3 pesuvaiheet välillä. Proteiinivyöhykkeet kehitettiin länteen pico kemiluminesenssin alustan ja visualisoidaan XPress CL blue ray elokuva. Optiset tiheydet bändejä mitattiin GS800 tiheysmittari ja kaistaintensiteettejä analysoitiin Määrä Yksi kuva-analyysi-ohjelmisto (Biorad, USA).

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± SD. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä käytettäessä opiskelijan t-testissä.

Tulokset ja keskustelu

Sidonta Analyysi PS-modifioitua SL

2-B aptameeriin ja VEGF Complex pintaplasmoniresonanssin (SPR) B

Kuten raportoitu aiemmin tutkimuksessamme muuntamattomalle SL

2-B aptameeriin näkyy K

d = 0,5 nM hepariini sitomisdomeeni (HBD) VEGF

165-proteiini määritettiin kautta SPR-tekniikkaa (taulukko 1) [37]. Modifioimatonta aptameeriin kuitenkin osoittautunut alhaiseksi rakenteellista vakautta solun olosuhteissa. Tämä johtuu siitä, että läsnä on eksonukleaaseja ja endonukleaasien biologisissa nesteissä, jotka hajottavat aptameerit hydrolysoimalla fosfaattiesteri sidos selkäranka [19]. Tämän ongelman helpottamiseksi, tässä tutkimuksessa, SL

2-B aptameeriin kemiallisesti muunnettu fosforotioaatti (PS) -sidoksia 5 ’ja 3’pääteasema (taulukko 1) suojaamaan SL

2-B aptameeriin alkaen eksonukleolyyttistä ruoansulatusta. PS-muuntamiseen liittyy vaihdosta sillattomia fosforyyli- hapen fosfodiesteriliitos mukaan rikkiatomiin. Koska ylimääräinen sisällyttäminen PS-yhteyksiä johtaa epäspesifisen sitoutumisen ja voi hämmentää aptameeriin rakenne ja sen vuorovaikutus kohde, muutos otettiin käyttöön vasta aptameeriin päistä [38].

K

d arvo PS-modifioitu SL

2-B aptameeriin määritettiin käyttämällä SPR tekniikkaa eri aptameeriin pitoisuuksilla (kuvio 1 ja taulukko 1). K

d-arvo PS-modifioitu SL

2-B: n havaittiin olevan 0,56 nM, joka on samanlainen kuin K

d muuntamattoman SL

2-B. Esittelyssä PS-muutos ei näytä vaikuttavan sitoutumisaffiniteetti SL

2-B aptameeriin. Lisäksi affiniteetti PS-modifioitua SL

2-B on samanlainen kuin FDA hyväksyi humanisoitu anti-VEGF monoklonaalinen vasta-aine ”bevasitsumabi” (K

d ~ 0,5 nM), jota käytetään syövän hoidossa [4].

erityisyys PS-modifioitua SL

2-B aptameeriin Sequence

VEGF

165 sekä muita VEGF-isoformit, kuten VEGF

189 ja VEGF

206, muodostetaan silmukoinnin yhden VEGF-geeni, joka jakaa karboksiterminaalisen hepariini-sitovan domeenin (HBD) 50-tähteet ja sitoutuu hepariini eri sitoutumisaffiniteetit [27], [39], [40]. HBD vastaa parantaa vuorovaikutuksen VEGF ja sen reseptorit (VEGFR-1 /Flt-1 ja VEGFR-2 /KDR /Flk-1) ja erityinen co-reseptorin neuropilins käynnistää angiogeenisten vasteen pahanlaatuisten solujen [41].

VEGF

121, ei kuitenkaan yhdy HBD kuin muut VEGF-isoformit ja voidaan käyttää kontrollina HBD sitoutumisspesifisyys tutkimus. SPR sensorigrammin Kuviossa 2 nähdään, että verrattuna VEGF

165 proteiinia samaan aptameeriin pitoisuus (80 nM), vastesignaalin PS-modifioitua SL

2-B sitoutumisen VEGF

121 proteiinia oli heikko ja näytetään korkea K

d arvoon 17 uM. Tämä osoittaa, että PS muutos ei vähennä sitoutumisspesifisyys SL

2-B aptameeriin kohti HBD merkittävästi (K

d = 17 uM PS-modifioitu SL

2-B kohti VEGF

121, K

d = 10 uM muunneltua SL

2-B kohti VEGF

121). Verrattuna ”bevasitsumabi” monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu kaikkiin isoformeja VEGF, PS-modifioitu SL

2-B on spesifinen HBD VEGF

165-proteiini [4]. Koska VEGF-A on osallisena normaaleissa fysiologisissa prosesseissa, kuten muodostuu uusia verisuonia, ja haavan paranemista, täydellinen VEGF-proteiinin voi vaikuttaa ylläpito normaalin verisuoniston kehon sisällä [42], [43]. Siksi esto erityisiä VEGF-proteiinin (esimerkiksi VEGF

165 tässä tapauksessa) voi olla parempi terapeuttinen lähestymistapa.

pisteestä A B vastaa yhdistyksen vaiheen ja piste B C vastaa dissosiaatiota vaihe sekä sensogrammien. Kuvassa PS-modifioitu SL

2-B aptameeriin sitovan VEGF

165 proteiinia (K

d = 0,56 ± 0,44 nM) ja VEGF

121 proteiinia (K

d = 17 ± 1,24 uM) 80 nM aptameeriin keskittyminen.

vakaus SL

2-B aptameeriin Against Nukleaaseja seerumia sisältävässä Medium

testaamiseksi biostabiliteetin modifioimattoman ja PS- modifioitu SL

2-B aptameeriin vastaan ​​nukleaasien läsnä biologisissa nesteissä, molemmat aptameerit inkuboitiin 10% FBS eri ajanjaksoilla. Tulosten perusteella, modifioimattoman SL

2-B hajonnut 50% 24 tunnin kuluessa inkuboinnin seerumia (kuvio 3). Toisaalta, PS-modifioitu SL

2-B näytetään hyvä stabiliteetti, joissa on enemmän kuin 90% aptameerin ehjänä 72 tunnin inkubaation seerumissa. Tiedot osoittavat, että on tärkeää PS-sidosten SL

2-B-sekvenssin päitä, joka suojaa aptameeriin sekvenssin eksonukleaasi hyökkäys.

Aptameerit inkuboitiin 10% FBS liuotetaan DMEM 37 ° C eri ajankohtina ja prosenttiosuus ehjä aptameerin määritettiin mittaamalla bändi tiheys suorittamisen jälkeen denaturoivalla PAGE. Täytetty sarakkeet PS-modifioitu SL

2-B, kun taas avoimet pylväät ovat muunneltua SL

2-B.

Lujuusanalyysi ympyrädikroismilla (CD) spektroskopia

Rakenteelliset tutkimukset ovat osoittaneet vaikutusta konformaatio sitoutumisaffiniteetin ja spesifisyyden aptameerin sen tavoite [44]. Jos konformaatio muuttuu lämpötilan, sitten sitoutumisaffiniteetti saadut tulokset SPR spektroskopia (suoritettiin 25 ° C) ei saa olla edustava

in vitro

määritykset (suoritettiin 37 ° C: ssa). Siten toissijainen konformaation PS-modifioitu SL

2-B aptameeriin tutkittiin. Positiiviset maksimit piikit havaittiin 260 nm ja 220 nm sekä negatiivisena minimit huippu 240 nm ja lisäksi pieni olkapää piikki 290 nm (kuva 4). Edellisen perusteella raportteja, kuten spektrit heijastavat tyypillinen hiusneula varsi-silmukka konformaatioon [45]. Koska mitään muutosta spektreissä havaittiin välillä 25 ° C ja 37 ° C, tämä vahvistaa säilyttämisen toissijaisen konformaatio SPR olosuhteissa (25 ° C), jossa K

d aptameeri määritettiin ja fysiologisissa olosuhteissa (37 ° C). Kuitenkin CD-spektroskopia ei tarjoa täydellisiä ja vahvistettuja tietoja rakenteesta. Kehittyneitä tekniikoita kuten ydinmagneettinen resonanssi (NMR) ja Röntgenkristallografia tarvitaan edelleen syvällistä rakenteellista analyysiä.

uM PS-modifioitu SL

2-B aptameeriin fosfaattipuskurissa (PBS) puskuri, pH-7,2. Spektrit mitattiin 25 ° C: ssa (yhtenäinen viiva) ja 37 ° C (katkoviiva).

Antiproliferative Activity Assay

antiproliferatiivinen ominaisuus SL

2-B aptameeriin tutkittiin Hep G2 syöpäsoluja hypoksiaolosuhteisiin. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että VEGF: n ilmentymistä proteiinin tehostua Hep G2-soluja hypoksiaolosuhteissa [46]. Koska mitään merkittävää vaikutusta proliferaatiota havaittiin 24 ja 48 tuntia, sekä modifioimaton ja PS-modifioitu SL

2-B Aptameerien testattiin 72 tunnin ajaksi. Kuten kuviossa 5 on esitetty, alempi proliferaatiota havaittiin 15 uM muutettu SL

2-B pitoisuus sen jälkeen, kun 72 tunnin aptameerin hoidon (52 ± 2,1%). Ei kuitenkaan väheneminen proliferaatiota havaittiin edelleen lisäämään aptameerin konsentraatio 20 uM. Mahdollinen selitys väheneminen solujen lisääntymisen voisi olla se, että joko ylimääräiset sitoutumiskohdat modifioidun SL

2-B-sekvenssin VEGF

165-proteiinia lopulta estää vuorovaikutusta proteiinin VEGFR-2 (tai KDR /Flk -1) reseptori, joka vaikuttaa soluproliferaatioon. Tai aptameeriin jälkeen sitovan VEGF proteiini sitoutuu VEGFR-2, käy läpi solujen sisäistämistä ja häiritsee alavirran VEGF liittyy solunsisäisen signaloinnin reittejä. Tulos osoittaa myös, että VEGF-proteiini voi olla mukana leviämisen tutkittujen Hep G2 syöpäsolujen hypoksiaolosuhteissa. Päinvastoin, modifioimattoman SL

2-B aptameerin sekvenssi ei ole havaittavissa merkittävää estävää vaikutusta solujen proliferaatiota. Tämä voi johtua hajoamisesta modifioimattoman sekvenssin nukleaasin entsyymien tiedotusvälineissä ennen lausumalla sen vaikutus syöpäsoluja.

sekvenssispesifisyytensä määritettiin käyttäen salattua sekvenssi PS-modifioitu SL

2- B datapisteen samaan pitoisuus muutetun SL

2-B. Yhtenäinen viiva on PS-modifioitu SL

2-B, katkoviiva on muunneltua SL

2-B, ja katkoviiva on salattu järjestyksessä.

Sen osoittamiseksi, että antiproliferatiivinen vaikutus PS modifioituja SL

2-B aptameerin on spesifinen sekvenssi, joka on salattu sekvenssi lisättiin Hep G2-soluja samassa pitoisuudessa kuin PS-modifioitu SL

2-B (kuvio 5). Tulokset osoittivat vähäinen lasku on soluproliferaatioon kanssa sekoitetun sekvenssin, joka vahvistaa, että estävää vaikutusta VEGF

165-proteiinin aktiivisuuden PS-modifioitua SL

2-B oli sekvenssin spesifinen Hep G2-soluissa. Sekvenssi spesifinen esto vahvisti myös solujen määrästä ja morfologisia eroja esitetty mikrovalokuvia (kuva 6). Kuten kuviossa 6A ja 6B, solut käsiteltiin modifioitu sekvenssi on huomattavasti vähemmän soluja verrattuna sekoitetun sekvenssin, jossa näyttää olevan enemmän soluja per-view ja pakataan tiiviisti toisiinsa. Lisäksi saman suurennos, morfologia solujen käsitelty modifioitu sekvenssi näyttää pitemmältä ja ohuempia monia puolella ennusteet verrattuna sekoitettua sekvenssiä, jotka ovat kulmikas ja tarkemmin määriteltyjä kunnossa (kuvio 6C ja 6D). Nämä havainnot osoittavat potentiaalia PS-modifioitu SL

2-B aptameeriin järjestyksessä estämään Hep G2 syöpäsolujen lisääntymistä voimakkaasti ja nimenomaan.

Low suurennus näkymä (A) modifioitu sekvenssi käsittely, (B ) salattu järjestyksessä kohtelu Hep G2-soluissa 72 tunnin kuluttua hypoksiaolosuhteissa kunnossa. Asteikko bar = 200 pm. Lähikuva näkymät (C) modifioitu sekvenssi käsittely, (D) salattu järjestyksessä kohtelu Hep G2-soluissa 72 tunnin kuluttua hypoksiaolosuhteissa kunnossa. Cellular morfologia eroaa päälle erilaisia ​​hoitoja; modifioitu sekvenssi hoito tuottaa soluja, jotka ovat ohuempia enemmän solujen ulokkeet samalla sekoitetun sekvenssin käsittely osoittaa soluja, jotka näyttävät lähempänä käsittelemättömien Hep G2-soluja. Asteikko bar = 50 pm.

määrittämiseksi solukuoleman mekanismin Hep G2-soluissa, anneksiini V: apoptoosimäärityksessä suoritettiin ja analysoitiin virtaussytometrialla. Kuviossa 7A, R9 ja R11 neljänneksessä solujen virtaussytometrialla scatterplot laskettiin ja ilmaistiin prosentteina solujen myöhään ja varhaisen apoptoosin vaihe vastaavasti. Varhainen apoptoottisia soluja sisältävät solupopulaation, joka on anneksiini V: positiivinen vain (R11), ja myöhäinen apoptoottisten solujen sisältää solupopulaation, joka on sekä anneksiini V ja PI positiivinen (R 9). Apoptoosi testi osoitti suuremman prosenttiosuuden solukuoleman kanssa modifioitu sekvenssi verrattuna salatut järjestyksessä hoito lopulla apoptoosin vaiheessa (kuvio 7B, p-arvo 0,05). Kuitenkin solujen prosenttiosuus käynnissä myöhässä apoptoosin ollut kovin korkea, eikä merkittävää eroa solujen määrän välillä havaittiin muutettu ja salattu järjestyksessä alussa apoptoosin vaiheessa (kuvio 7C). Tämä tulos osoittaa, että lisäksi apoptoosia, muut ei-apoptoottisen solukuoleman mekanismia, kuten vanhenemista voi olla mukana solukuoleman induktioon, että Hep G2-soluja.

(EN) scatterplot kuvaa solujen jakauma anneksiini V värjäys pitkin x-akselilla ja niitä värjättiin propidiumjodidilla (PI) y-akselilla. Alue R10 merkitsee elinkelpoinen populaatio (double negatiivisia anneksiini V ja PI), R9 ei-elinkelpoisia soluja (double positiivisia anneksiini V ja PI), R11 esittää anneksiini V: positiivinen (PI negatiivinen) väestöstä, kun R8 ovat vahingoittuneet solut ( PI positiivinen mutta anneksiini-V negatiivinen). (B)% Histogrammi on R9 neljänneksessä tiedot. Analyysi kolmesta näytteestä varten, oli huomattavasti suurempi määrä kuolleita soluja (p-arvo 0,05) modifioitu sekvenssi hoitoa verrattuna salatun sekvenssiohjauksen. (C)% Histogrammi R11 neljänneksessä tietoja. Tulokset osoittavat merkittävää eroa varhaisen apoptoosin. Virhepalkkeja = SEM.

Vahvista antiproliferatiivinen kykyä PS-modifioitu SL

2-B aptameeriin, me tutki tarkemmin vaikutusta MCF-7-solut ja HCT-116-soluissa, koska nykyiset kirjallisuus on osoittanut, että ne myös yli-ilmentävät VEGF-proteiinin hypoksiaolosuhteisiin [47], [48]. 15 uM modifioitu SL

2-B pitoisuus käytettiin tässä tutkimuksessa mutta tulokset osoittivat, että molemmat MCF-7 ja HCT-116 syöpäsolujen näytetään vain 23 ± 3,2% ja 9 ± 1,8%: n lasku solujen lisääntymisen havaittiin vastaavasti . Perustuen näihin solujen lisääntymisen tuloksia, vaikutus PS-modifioitua SL

2-B-sekvenssin soluproliferaatioon uskotaan olevan solutyyppispesifisiä. Koska antiproliferatiivinen vaikutus MCF-7 ja HCT-116 syöpäsolut eivät olleet kovin merkittäviä, niitä ei ole käytetty lisätutkimuksiin alla. Muita antiproliferatiivisia tutkimuksia erilaisista syöpäsolutyyppien olisi tehtävä paljastaa mahdollisia terapeuttisia kohteita sekä tunnistaa tekijöistä solujen erityisiä antiproliferatiivinen tämän Aptameerin.

virtaussytometria ja Western Blot analyysi Jagged-1 Protein Expression

Notch signalointi on kehittyvä konservoitunut signalointireitille vaikuttavat monissa solun prosessit, kuten solun kohtalon määrittämiseen, erilaistuminen, proliferaatio, ja selviytymistä. Viisi Notch ligandeja (Jagged-1, Jagged-2, Delta-1, Delta-3, ja Delta-4) ja neljä Notch reseptorit on vakiintunut nisäkkäillä [49], [50]. Todisteet osoittavat biokemiallinen kytkös VEGF ja delta /rosoinen-lovi reittejä aktivointi, ja yhdessä molemmat ovat mukana edistämässä kasvainprogression [51], [52]. Tässä sidos, VEGF-reitti on välttämätöntä aloittamisen kasvaimen angiogeneesiä ja toimii ylävirran aktivoiva ärsyke, kun taas lovi signalointi joka toimii alavirtaan VEGF koulutusjakson, auttaa vastaamaan aktivoimalla ärsyke ja muokkaavat aktivoinnin tekemällä solun kohtalon päätöksiä [ ,,,0],49].