Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cancer rokotteita on suunniteltu laajentamaan kasvaimen antigeenispesifisten T-solujen efektoritoimintoa. Ne voivat kuitenkin myös tahattomasti laajentaa säätelijä-T-solut (Treg), joka voisi vakavasti haitata kliinistä tehoa. Käsitellä tätä mahdollisuutta, olemme kehittäneet uuden määrityksen havaitsemiseksi antigeenispesifisten Treg perustuva säätely alaspäin pinnan CD3 seuraavista TCR, ja käyttää tätä lähestymistapaa seulontaan Treg spesifinen NY-ESO-1 Kasvainantigeenin melanooman hoidetuilla potilailla kanssa NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM syöpä rokote. Kaikki potilaat testattiin oli Treg (CD25

kirkas FoxP3

+ CD127

neg) erityiset vähintään NY-ESO-1 epitoopin veressä. Silmiinpistävän, verrattuna esikäsittelyn näytteistä paljastui, että monet näistä vastauksista saatiin aikaan tai vahvistaneet rokottamalla. Useimmin havaittu vaste oli kohti HLA-DP 4-rajoitettu NY-ESO-1

157-170 epitooppi, joka on myös tunnustettu T-soluja. Erityisesti toiminnallinen Treg spesifinen HLA-DR-rajoitettu epitoopin sisällä NY-ESO-1

115-132 peptidi tunnistettiin myös korkealla taajuudella kasvainkudoksessa, mikä viittaa siihen, että NY-ESO-1-spesifisiä Treg voi tukahduttaa paikallisen anti-kasvain immuunivasteita. Yhdessä meidän data tarjoavat kiistatonta näyttöä sen kyky syöpärokotteen laajentaa kasvain antigeenispesifisen Treg asettamisessa edennyt syöpä, toteamus joka olisi vakavasti huomioon suunniteltaessa tulevia syövän rokotteen kliinisissä tutkimuksissa.

Citation: Ebert LM, MacRaild SE, Zanker D, Davis ID, Cebon J, Chen W (2012) Syöpä rokote saa laajentaminen NY-ESO-1-Specific Regulatory T solut potilailla, joilla Advanced Melanooma. PLoS ONE 7 (10): e48424. doi: 10,1371 /journal.pone.0048424

Editor: Derya Unutmaz, New York University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 25 syyskuu 2012; Julkaistu: 26 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Ebert et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Cancer neuvoston Victoria myöntää LE (603103, 433626), National Health ja Medical Research Council (NHMRC) hanke avustus WC (433608) ja operatiivinen infrastruktuuri tuki Victorian valtion hallituksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpärokotteet lupaavia hoidettaessa kiinteitä kasvaimia, kuten melanooman, ja painopiste on ollut laajojen prekliinisen ja kliinisen testauksen viime vuosina. Koska sen poikkeuksellisen immunogeenisyyttä, NY-ESO-1 on tullut yksi lupaavimmista tavoitteet tällaiset lähestymistavat [1]. Viime vuosina olemme on suoritettu useita kliinisiä kokeita melanoomapotilaissa käyttäen syöpä rokote koostuu täyspitkän rekombinantin NY-ESO-1-proteiinia muotoiltu ISCOMATRIX

TM adjuvanttia (CSL Limited, Australia). Vaikka tämä rokote oli voimakas anti-kasvain vaikutuksia prekliinisissä eläinkokeissa [2] ja osoittivat lupaavia tuloksia alkuperäisen Faasi I -tutkimuksessa [3], se ei merkittävästi parantaa kliinistä tulosta melanoomapotilaissa myöhemmissä tutkimuksissa [4] ja käsikirjoitus valmisteilla). Lisäksi, vaikka potilaalla on täysin resektoitiin (alkuvaiheen) tauti kehittyi voimakas efektori-T-solujen (Teff) vasteet NY-ESO-1-rokotuksen jälkeen [3], [5], joilla on pitkälle edennyt melanooma oli paljon vähemmän vahvaa vastaukset [4] .

Kuten kokemuksemme NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM rokote, monet muut syövän rokotteita on myös onnistunut indusoimaan merkittävää kliinistä hyötyä, usein huolimatta induktio näennäisesti voimakas kasvaimen antigeenispesifisiä Teff vastaukset [6], [7]. On olemassa monia mahdollisia selityksiä, mutta yksi, joka on saanut erityistä huomiota viime vuosina keskittyy rooli CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ säätelijä-T-solut (Treg). Treg ovat välttämättömiä estämään autoimmuniteetin [8]. Kuitenkin yhä enemmän todisteita tukee sitä käsitystä, että Treg voivat myös estää sukupolven tehokkaan kasvaimen vastaisen immuniteetin [9]. Siksi on välttämätöntä, että syöpä rokote lähestymistapoja välttää laajenee näihin soluihin.

Viime aikoihin asti, todisteet tunnustamista kasvainantigeenien Treg oli niukkaa, ja se oli epäselvää, onko Treg aktivoitaisiin ja laajentaa vastauksena rokotuskäytäntöjen kasvaimen antigeenejä. Viime vuosina on kuitenkin useita raportteja ovat tunnistaneet Treg spesifinen erilaisia ​​kasvaimen antigeenejä ihmisen syövässä, mukaan lukien NY-ESO-1, surviviini, TRP-1, gp100, MAGE-A3, Melan-A, karsinoembryonaalisen Ag ( CEA), telomeraasi, HER2 /neu, WT-1, MUC-1 ja papilloomaviruksen antigeenit E6 ja E7 [10] – [16]. Läsnäoloa solujen syöpäpotilailla herättää vakavaa huolta mahdollisesta syövän rokotteita laajentaa paitsi Teff vaan myös Treg. Se, missä määrin tämä todella tapahtuu, on kuitenkin huonosti.

Tässä tutkimuksessa olemme arvioineet vaikutusta rokotuksen NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM tiheydestä NY- ESO-1-spesifisiä Treg potilailla, joilla on loppuvaiheen melanooma. Koska useimmat Treg eivät tuota sytokiinien aktivoinnin jälkeen [17] – [19], tällä hetkellä ei ole sopivaa analyysiä käytettävissä näytön antigeenispesifisten Treg. Siksi olemme kehittäneet uuden, järjestelmällistä lähestymistapaa, jossa antigeenispesifisen Treg havaitaan säätely alaspäin pinnan T-solureseptorin (TCR) /CD3 kompleksit seuraavien

in vitro

stimuloitaessa kirjaston lyhyt antigeenisten peptidien. Optimointi Tämän menetelmän on hiljattain kuvattu [20]. Tässä olemme käyttäneet tätä lähestymistapaa seulontaan NY-ESO-1-spesifisiä Treg melanoomapotilailla, ennen ja jälkeen rokotuksen NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM rokotetta. Tämä tutkimus on auttanut meitä saamaan ennennäkemättömän ymmärrystä kasvain antigeenispesifisen Treg asettamisessa edennyt syöpä, mukaan lukien niiden toiminta, sijainti, välillä epitooppien tunnustettu ja kuinka niiden taajuus vaikuttaa rokotus.

Tulokset

uudella tavalla perustuva säätely alaspäin pinnan CD3 havaitsee Teff ja Treg spesifinen NY-ESO-1-peptidien

jotta seuloa NY-ESO-1-spesifisiä Treg käytettäessä puolueettomasti, olemme kehittäneet määrityksen, joka perustuu periaatteeseen, jonka mukaan T-solujen alaspäin moduloida CD3 /TCR-kompleksit solun pinnalla sen jälkeen, kun sitoutumisen sukulais-antigeenin [21], [22]. Tämä voidaan havaita määrää alennetaan solun pinnan CD3-värjäyksellä virtaussytometrialla. Koska niiden niukkuudesta, NY-ESO-1-spesifisiä Teff ei juuri koskaan havaita suoraan

ex vivo

verinäytteistä tavallisilla (IFN-γ solunsisäisen sytokiinin värjäys) menetelmää, mutta sen sijaan vaativat ennen laajentumista

vuonna vitro

. Alustavat tutkimukset osoittivat, että tämä oli myös tapauksessa NY-ESO-1-spesifisiä Treg havaittu käyttämällä CD3 alassäätöä menetelmällä (julkaisemattomia havaintoja). Näin ollen potilaan PBMC: itä viljeltiin paneeli 28 osittain päällekkäisiä 18 aminohapon peptidejä, jotka yhdessä kattavat koko sekvenssi NY-ESO-1 [23], jotta laajentaminen NY-ESO-1-spesifisten Teff ja Treg on havaittavissa taajuuksia . Edellytykset, kuten kulttuuri aika, IL-2-pitoisuus ja lähde seerumin, optimoitiin Treg laajentamiseen [20]. Jälkeen 21d laajennus, viljelmiä stimuloitiin uudelleen yksittäisten 18-meeristen peptidien ja tason pinnan CD3 määritettiin virtaussytometrialla, yhdessä värjäys Treg markkereita.

Esimerkki saadut tulokset on esitetty kuviossa 1. Nämä tulokset osoittavat, että selvä populaatio oletettujen Treg voitiin havaita sisällä CD4

+ T-solujen populaatio co-värjäys CD25 ja FoxP3 (kuvio 1A, vasen). Tässä Treg osajoukko, erillinen väestöryhmästä CD3-low (antigeenispesifisiä) soluissa oli ilmeinen jälkeen uudelleen peptidistimulaation NY-ESO-1

157-174 muttei NY-ESO-1

127 -144 tai ilman uudelleen stimulaatiota (kuvio 1A, ylemmät paneelit). Toisaalta CD3-low väestöryhmästä voitu havaita sisällä Teff osajoukon seuraava uudelleen peptidistimulaation NY-ESO-1

127-144 muttei NY-ESO-1

157-174 (kuvio 1A, alempi paneeli). Tulosten yhteenveto tässä potilasryhmässä käyttäen kaikkia 28 peptidejä osoittaa kaksi erillistä Treg vastausten alueiden sisällä NY-ESO-1

37-60 ja NY-ESO-1

157-180 (kuvio 1 B), ja yksi suuri Teff vastaus, alueella NY-ESO-1

127-144 (kuvio 1 C).

CD3

. PBMC: Potilaan 113 viljeltiin yhdistettyjen NY-ESO-1 18-meeristen peptidien kuvatulla

Methods

, jota seurasi uudelleen stimulaation kanssa osoitti yksittäisten peptidien aikana yön yli kasvatettua viljelmää, jotta CD3 alassäätöä. Solut värjättiin vasta-aineilla CD4, CD25, FoxP3 ja CD3 ja analysoitiin virtaussytometrialla. (

): esimerkki värjäyskuvioiden havaittu, kuvaten gating on Treg ja Teff (aidatulla kannattava CD4

+ T-solujen) ja alas-säätely CD3 kussakin väestöstä. (

B

–

C

): Yhteenveto vastauksista havaittujen sisällä Treg (B) ja Teff (C) populaatioissa. Pisteviivat osoittavat lähtötasoon CD3-low-solut (nolla peptidi ehto).

Pyrimme myös analysoimaan sytokiinituotannossa profiilia NY-ESO-1-spesifisiä Treg neljällä potilaalla, joiden Treg alas -regulated CD3 vastauksena NY-ESO-1-peptidejä, käyttämällä solunsisäisiä sytokiinin värjäystä. CD3-low Treg tuotettu alhainen havaitsemattomia tasoja IL-4, IL-10 ja IL-17 kaikilla potilailla. Kuitenkin, IFN-γ: n ja TNF-α oli vaihteleva, ja kaksi potilasta, joka esittää vähäistä tuotannon CD3-low Treg, ja kaksi potilasta, joka esittää korkean tason tuotantoa (kuvio S1). Eritystä pro-inflammatoristen sytokiinien, kuten IFN-γ mukaan Treg on kuvattu aiemmin [16], [24] – [26], ja se näyttää olevan ainutlaatuinen ominaisuus Treg tunnistettu syöpäpotilailla. Kuitenkin meidän tulokset osoittavat, että tämä ominaisuus on satunnaista, ja ei saa vedota Treg tunnistamiseen.

Solut tunnistetaan CD25

+ FoxP3

+ fenotyyppiä on fenotyyppiset ja toiminnalliset ominaisuudet Treg

sekä CD25 ja FoxP3 tiedetään ohimenevästi indusoida Teff aktivaation jälkeen, siten, että aktivoitu Teff voivat mahdollisesti erehtyä Treg [27] – [30]. Koska laajennettu kulttuuri aikana käytetty (21d), on epätodennäköistä, että solut tunnistettiin CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ kulttuurissamme järjestelmässä edustavat aktivoitu Teff, koska ilmaus FoxP3, ja vähäisemmässä määrin CD25, palautuu lähtötasolle jälkeen ~ 10 päivää [12], [27], [28], [30]. Kuitenkin edelleen osoittaa, että nämä solut ovat todellakin Treg, viljelmiä yhteistyössä värjättiin vasta-aineen CD127, joka ilmentyy suuresti vähentynyt tasoilla Treg verrattuna Teff [31], [32]. Kuva 2A osoittaa, että solut tunnistettiin Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+) ilmaistaan ​​tuskin havaittavia määriä CD127, kun taas solut tunnistettiin Teff (CD4

+ FoxP3

-) ilmaistuna yhtä korkealle tasolle. Lisäksi kun suurin Treg olivat FACS-lajiteltu 21d viljelmät (mukaan CD4

+ CD25

+ CD127

– /matala fenotyyppi), nämä solut indusoi annosriippuvaisen laskun leviämisen CD8

+ T-soluja (kuvio 2B).

Patient PBMC viljeltiin 21d kanssa NY-ESO-1 18-meeri-peptidin (t) tunnetaan alustavista tutkimuksista indusoimaan Treg vasteen ja sitten: (

) analysoitiin CD127 ilmentyminen virtaussytometrialla, portittamisella Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+) tai Teff (CD4

+ FoxP3

-) kuten. Esitetyt tulokset edustavat kolmea koetta samanlaisin tuloksin; tai (

B

): Treg puhdistettiin lajittelemalla CD4

+ CD25

+ CD127

alhainen solujen ja testattiin niiden kyky estää leviämisen CFSE-leimatun CD8

+ T-solut pre-stimuloitu 16 tunnin ajan kanssa levyyn sidotun anti-CD3. Kuvaaja osoittaa,% vaimennus suhteessa kulttuureissa toteutettiin ilman Tregs, kun taas virtaussytometria histogrammit valaisevat CFSE profiileista saadaan vastaaja-T-solujen yksinään (vasen) tai 1:02 suhde kanssa Treg (oikealla). Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen käyttäen näytteitä kolmelta eri henkilöitä. In (C), viljeltiin PBMC: itä stimuloitiin uudelleen kyseisen peptidin ja ilmentyminen LAP pinnalla Tregs tai Teffs määritettiin virtaussytometrialla sisällä CD3-low (peptidi-reagoiva) väestön kolme potilasta.

Lopuksi pyrittiin määrittämään, onko antigeenispesifisiä aktivointi Treg johti indusoi TGF-β latenssi liittyvä peptidi (LAP) solun pinnalla. Induktio LAP ilmaisun aktivaation jälkeen on ominaisuus ainutlaatuinen Treg, ja tämä molekyyli ei ilmentyy Teff soluissa, vaikka aktivoinnin jälkeen [18], [33]. Jotta suoraan verrata aktivaation aiheuttamaa LAP ilmentymisen Treg ja Teff, olemme määrittäneet kolme potilasta, jolla Treg ja Teff populaatiot sekä alassäädetty CD3 vastauksena saman peptidin. PBMC näistä potilaista viljeltiin 21d peptidillä uudelleen stimuloitu yön ja arvioitiin CD3 alassäätöä ja pinta LAP ilme. Kuten kuviossa 2C, LAP selvästi aiheuttama pienemmistä väestö Treg vastata NY-ESO-1-peptidin, jonka osoittaa CD3-low fenotyyppi. Sen sijaan, CD3-alhainen Teff vastanneet samaan peptidi ei säätää ylös LAP.

Yhdessä ilmaus CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ CD127

– fenotyypin yhdessä

in vitro

tukahduttava kapasiteetti ja kyky indusoida LAP ilmaisua viittaavat vahvasti siihen, että solut analysoitiin tässä ovat toiminnallisia Treg sijaan aktivoitu Teff joka on tilapäisesti sääteli FoxP3 ilme.

Down-regulation CD3 mukaan Treg riippuu peptidipitoisuutena

tässä tutkimuksessa alas-säätely pinta CD3 käytetään markkerina antigeenispesifisen aktivaation Tregs kautta TCR. Näin ollen, siinä määrin kuin CD3 down-regulation voidaan odottaa tiukasti riippuvainen peptidin pitoisuus. Tämän varmistamiseksi peptidi titraus suoritettiin käyttäen PBMC 4 eri potilailla. Kunkin potilaan kaksi peptidit testattiin, jotka valittiin sen perusteella, esikarsinnasta kokeista pysty aiheuttamaan CD3 alassäätöä vastetta 1 x 10

-4M. Kuten on esitetty kuviossa 3, oli olemassa selkeä annos-riippuvainen suhde osuus CD3-low Treg ja käytetyn peptidikonsentraation uudelleen stimulaatio. Useat näistä vastauksista voitiin titrata alaspäin 1 x 10

-7M peptidi, joka on verrattavissa useiden aiemmin kuvattu CD4

+ Teff vastauksia NY-ESO-1 peptidit [5], [34]. On myös tärkeää huomata, että 18-meeri peptidit käytetään tässä todennäköisesti eivät ole optimaalinen epitoopin T-solu tunnistaa, jolloin vaste havaitaan, kun peptidin pitoisuus tulee rajoittava voi olla huomattava aliarvioida.

PBMC neljästä potilaat olivat viljeltiin 21d kanssa NY-ESO-1 18-meeri-peptidien ja sitten uudelleen stimuloitu yön yli yksittäisten peptidien ilmoitettuina pitoisuuksina. Osuus Treg alaspäin säätäminen CD3 vastauksena peptidi määritettiin virtaussytometrialla.

NY-ESO-1-spesifisiä Treg usein havaitaan veressä myöhäisvaiheen melanooma potilaiden ja voi olla laajennettiin NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM rokotetta

kohortin yhdeksästä joilla on pitkälle edennyt melanooma seulottiin NY-ESO-1-spesifisiä Treg, sekä ennen 42 päivää rokottamisen jälkeen NY -ESO-1 /ISCOMATRIX

TM. Tulokset on esitetty yhteenvetona kuviossa 4A. Rokotuksen jälkeen, kaikilla potilailla oli Treg vasteet spesifisiä ainakin yhden alueen NY-ESO-1-proteiinin; useita oli vastausten kaksi tai kolme erilaista aluetta. Silmiinpistävän, vertailu ennen rokotusta näytteet osoittivat, että monet näistä vasteita rokotteen indusoimat, koska niitä ei voinut havaita ennen rokotusta. Eräs esimerkki tällaisesta vastaus on esitetty kuviossa 4B. Lisäksi jotkut vasteet, jotka olivat havaittavissa ennen rokotusta näytti tehostetaan rokotteen (määritellään 2-kertainen nousu responsiivisten solujen rokotuksen jälkeen, kun kaksi näytettä verrattiin rinnan identtisissä olosuhteissa). Esimerkiksi potilaan 120, taajuus Treg spesifisiä peptidille NY-ESO-1

37-54 oli 4,4% ennen rokottamista mutta 18,3% rokotuksen jälkeen, ja taajuus Treg spesifisiä peptidille NY-ESO-1

79-96 oli 3,3% ennen rokotusta ja 16,3% rokotuksen jälkeen.

(

): jokaista potilasta sisällä kohortin kukin validoitu Treg vaste tiivistää laatikko. Vastaukset pidetään validoitu, jos se havaittiin ainakin kaksi riippumatonta kulttuureissa, kahdella itsenäisesti syntetisoidun erissä peptidin. Asento laatikko kertoo, missä NY-ESO-1 peptidisekvenssi vaste oli lokalisoitu. Siinä tapauksessa, että vasteet havaittiin kaksi peptidejä viereisen sekvenssin, tässä on esitetty yhtenä vastauksena ulottuu kaksi peptidiä. Varjostetut laatikot osoittavat, että vasteen suuruutta nostettiin vähintään 2-kertaisesti rokotuksen näytteitä verrattuna ennen rokotusta näytteet kun molemmat näytteet testattiin samanaikaisesti identtisissä olosuhteissa. Kiinteät laatikot osoittavat, että vaste oli havaittavissa vain näytteistä rokotuksen jälkeen. Avoimet laatikot osoittavat, että suuruuden vaste oli samanlainen ennen ja jälkeen rokotuksen. (

B

): Esimerkki vastauksen, joka on saatu aikaan rokotuksen (Potilasvakuutuksiin 124) näytetään. Treg saatiin erotettua perusteella CD25 ja FoxP3 ilmaisun, ja CD3 alassäätöä arvioitiin seuraavien uudelleen stimulaatio joko verrokkipeptidin tai saman peptidin käytetään laajentamiseen (NY-ESO-1

85-102).

Treg ja Teff vastaamaan samanlaiseen epitooppiin alueella NY-ESO-1

157-170

Kuva 4A osoittaa, että Treg vasteet yleisimmin nähty kohti peptidi NY- ESO-1

157-174, jossa Tregs erityisesti tätä 18-meeri-peptidin havaittavissa 5/9 testatusta potilaasta. Tämä alue sisältää epitoopin (NY-ESO-1

157-170), joka on aiemmin karakterisoitu Teff [35], nostaa sitä mahdollisuutta, että Treg voitaisiin vastata samaan epitooppiin. Käsitellä tätä mahdollisuutta, kaksi potilasta (102 ja 103) havaittiin, joka oli vastauksia NY-ESO-1

157-174 peptidi sekä Treg ja Teff osajoukkoja, ja kyky näiden solujen vastata julkaistu epitooppi (NY-ESO-1

157-170) tai eri katkaisu tai laajentamista variantteja, arvioitiin. Kuten on esitetty kuviossa 5, sekä Treg (vasen paneeli) ja Teff (oikea paneeli) vastasi NY-ESO-1

157-170-peptidi. Katkaisu joko 1 tai 2 aa N-terminukseen, tai 1 aa C-terminuksessa, oli vähän vaikutusta näiden vasteiden. Kuitenkin molemmat populaatiot osoittivat huomattavasti vähentää reagointikykyä seuraava katkaisu 2 aa peräisin C-terminaalissa (peptidi NY-ESO-1

157-168). Samoin laajentaminen ydinsekvenssin 1 aa joko C- tai N-päässä vähensi myös vastata sisällä molemmissa ryhmissä.

Patient PBMC viljeltiin 21d kanssa 18-meeri-peptidin NY-ESO-1

157- 174 ja sitten uudelleen stimuloidaan ilmoitetuilla lyhyen HPLC-puhdistettu peptidit joko lisäämällä suoraan kulttuuriin tavalliseen tapaan (

A-D

) tai sykkivä päälle BCL seurasi pesu (

E-F

). Yön yli inkuboinnin jälkeen solut värjättiin ja analysoitiin virtaussytometrillä, portittamisella Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+

A, C ja E

) tai Teff (CD4

+ FoxP3

–

B, D ja F

). Käytetyt peptidit uudelleen stimulaation perustuivat julkaistuun epitooppi NY-ESO-1

157-170, joko katkaisu (

A-B

) tai laajennus (

C-D

) kussakin päässä. Kuvaajat in

A-D

esittävät saadut tulokset Potilaan 102; samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös Patient 103. kuvaajien

E-F

esittävät keskiarvo + SEM Potilaat 102 ja 113; Tähdellä osoittaa ap ​​arvo 0,05 (t-testi).

Edellä kuvattu NY-ESO-1

157-170 epitooppi on osoitettu rajoittaa HLA-DP4 luokka II alleeli [35], ja molekyylityypitysmenetelmän paljasti, että potilaat testataan kuviossa 5 ilmaistaan ​​HLA-DPB1 * 0401-molekyyliin. Sen vahvistamiseksi, että Tregs myös vastannut tähän epitooppiin, kun se esiteltiin HLA-DP4, paneeli EBV-transformoituja B-solulinjoja (BCL) pulssitettiin NY-ESO-1

157-170 peptidi, pesty ja testattu kykyä indusoida CD3 alassäätöä in Treg ja Teff soluja (kuvio 5E-F). BCL puuttuu DP4 lauseke (9902) ei onnistunut indusoimaan CD3 alassäätöä joko väestö, kun taas BCL ilmentävät HLA-DPB1 * 0401 (rivi 9004) indusoi merkittävän vasteen molemmissa populaatioissa. Näin ollen, NY-ESO-1

157-170 peptidi esitetään sekä Treg ja Teff HLA-DP4.

Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että vähintään sekvenssi on aiemmin kuvattu NY-ESO- 1

157-170 epitooppi [35] voitaisiin tarkistaa NY-ESO-1

159-170, tai mahdollisesti jopa NY-ESO-1

159-169, vaikka juuri tämän peptidin ei testattu meidän määrityksissä. Vielä tärkeämpää on kuitenkin, tiedot osoittavat, että Treg ja Teff vastata täsmälleen saman epitoopin, ja molemmissa tapauksissa, tämä vastaus on rajoitettu HLA-DP 4.

NY-ESO-1-spesifisiä Treg ovat yleisiä sisällä kasvainkudoksen

sen määrittämiseksi, NY-ESO-1-spesifisiä Treg voidaan havaita tuumorin sisällä, sekä veri, tuore kasvainkudoksen saatiin Potilaan 126 kolmen kierroksen jälkeen rokotuksen NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM ja yksisolususpensioon syntyy. Saatu seos kasvainsolujen ja strooman soluja, mukaan lukien TIL, viljeltiin, kun läsnä on suuria annoksia IL-2, mutta lisäämättä mitään eksogeenistä peptidin, antigeenin tai mitogeeni. Laajennetut TIL oli stimuloitu yön yli peptidien NY-ESO-1

85-102 ja NY-ESO-1

115-132 (jotka molemmat indusoi vasteita ääreisveren Treg tästä potilas) ja arvioitiin CD3 alaspäin säätö. Lisäksi näyte kasvaimen digestio analysoitiin virtaussytometrialla ennen kulttuuriin, joka osoitti, että 41,1% CD4

+ T-solujen sisällä kasvain oli Treg fenotyyppi, joka edustaa noin 10-kertainen rikastus yli taajuuksia veri (ei kuvassa).

Peptide NY-ESO-1

85-102 ei stimuloida tahansa toistettavissa vasteet joko Treg tai Teff sisällä TIL. Toisaalta, peptidi NY-ESO-1

115-132 indusoi helposti havaittava vaste Teff solujen laajennetun TIL (kuvio 6A). Huomiota herättävää on, suuruus vastauksen saman peptidin oli ~ 4 kertaa suurempi sisällä Treg väestöä, 40% Treg alaspäin säätäminen CD3 vastauksena tähän peptidi. Osoittaa toistettavuuden tämä ero, kolme riippumatonta TIL riviä muodostettiin jäädytetyt alikvootit saman kasvaimen näyte, ja kukin rivi testataan 1-3 kertaa. Kussakin analyysissä osuus solujen vastata NY-ESO-1

115-132 peptidi oli aina suurempi sisällä Treg väestöstä kuin Teff väestö, joiden keskimääräinen kertainen ero 3,1 (kuvio 6B). Pre-inkubointi estävän vasta HLA-DR estää lähes täysin sekä Treg ja Teff vastauksia tämän peptidin, kun taas estäviä vasta-aineita HLA-DP tai HLA-DQ ei ollut mitään vaikutusta, mikä osoittaa, että vastaus sisällä molemmissa ryhmissä on rajoitettu HLA -DR (kuvio 6C).

Kasvaimen kudosta saatiin Potilaan 126 ja TIL viivat tuotetaan kuten on kuvattu

Methods

. (

A-B

): Soluja käsiteltiin yön yli peptidi NY-ESO-1

115-132 tai valvontaa peptidi, ja sitten värjätään ja analysoitiin virtaussytometrillä, portittamisella Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+) tai Teff (CD4

+ FoxP3

-) kuten. Edustavia virtaussytometrillä pistekuvioita (A) esittävät gating on Treg ja Teff, ja CD3 alassäätöä vaste todettiin kummassakin väestössä uudelleen stimulaation, kun taas (B) esittää yhteenvedon tuloksista viidessä kokeissa kukin jollakin kolmen eri TIL riviä syntyy. (

C

): vaikutus estävien vasta-aineiden HLA-DR, HLA-DP tai HLA-DQ on vaste peptidille NY-ESO-1

115-132 sisällä Treg (vasemmalla) ja Teff (oikealla) populaatioissa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin toisessa kokeessa. (

C

): TIL oli stimuloitu yön yli NY-ESO-1

115-132 peptidi ja sitten peptidi erityisiä (CD3

lo) ja epäspesifistä (CD3

hi) Treg (CD4

+ CD127

lo CD25

hi) puhdistettiin solujen lajittelua ja testataan niiden kykyä tukahduttaa leviämisen CFSE-leimatun CD8

+ T-solujen esi-stimuloitiin 4 tuntia anti- CD3 ilmoitetuilla Treg: responder suhteet. Vertailun Treg myös järjestetty aiemmin jäädytetyt PBMC: saatu terveestä luovuttajasta. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin toisessa kokeessa, vaikka korkeampi Treg: vastaajan suhteet olivat tarpeen nähdä tukahduttamista.

Kuvassa 2, osoitimme, että irtotavarana Treg eristetty 21 päivän viljelmät tukahdutti leviämisen CD8

+ T-soluja. Kuitenkin se oli myös mielenkiintoista vahvistaa, että NY-ESO-1-spesifisiä Treg oli samanlainen aktiivisuus. Laajennetut TIL Patient 126 stimuloitiin NY-ESO-1

115-132 peptidi yössä aiheuttavan CD3 alassäätöä ja peptidi-spesifisten Treg sittemmin lajiteltu perusteella CD4

+ CD25

+ CD127

– CD3

alhainen fenotyyppi ja testataan tukahduttaminen määrityksessä. Nämä solut tukahdutti leviämisen anti-CD3-stimuloiduissa CD8

+ T-solujen terveen luovuttajan samassa määrin kuin bulk Treg eristetty terveestä luovuttajasta (kuvio 6D). Mielenkiintoista, CD3

hi Tregs lajiteltuna TIL linjan (ts Treg joka ei ollut vastannut peptidin stimulaatio) myös tukahdutti CD8

+ T-solujen lisääntymistä, mikä viittaa siihen, että viimeaikainen antigeenistimulaation ollut välttämätöntä hankintaan vaimentimen toimintoa näissä soluissa. Mahdollisesti läsnä tuumorisolujen muodostamisen aikana TIL line aktivoituu Tregs erityisiä erilaisia ​​kasvaimen antigeenisiä epitooppeja, ja tämä aktivoitu tila säilyi laajennus, jolloin Treg erilaisia ​​antigeenin spesifisyyksiä käyttämään suppressiivinen aktiivisuus.

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että kasvain kudosta potilaan 126 sisältää merkittävä populaatio Treg spesifinen HLA-DR-rajoitetun epitoopin NY-ESO-1

115-132-peptidi. Lisäksi Treg erityisiä tätä epitooppia voi estää CD8

+ T-solujen lisääntymistä ja ovat siten täysin toimiva. Immunohistokemia värjäys kasvainkudoksen osoitti, että kasvainsolut vielä ilmensivät runsaita tasoja NY-ESO-1 tällä hetkellä (tietoja ei esitetä), viittaa siihen, että kudos asuva NY-ESO-1-spesifisiä Treg voidaan aktivoida paikallisesti.

keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme käytetty uusi lähestymistapa, jonka avulla puolueeton tunnistamisen Treg mihinkään erityiseen epitooppiin tietyssä kasvain antigeeni. Osoitamme, että NY-ESO-1-spesifisiä Treg ovat hyvin yleisiä veressä sairastavien potilaiden loppuvaiheen melanooma, sillä ne olivat havaittavissa 9/9 testatusta potilaasta. Lisäksi kuusi näistä yhdeksästä potilaasta, NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM rokotetta joko indusoi ainakin yhden uuden vasteen, joka ei ollut havaittavissa ennen rokotusta tai kasvatti olemassa oleviin vasteita.

niukkuuden vuoksi kasvaimen antigeeni-spesifisten T-solujen (mukaan lukien Treg) veressä, oli tarpeen laajentaa näitä soluja in vitro antigeenillä. Tämä kulttuuri vaihe saattaneet saada väliaikaisen säätely ylöspäin FoxP3 ja CD25 Teff soluissa, kuten on raportoitu aiemmin [27] – [30], ja nämä solut voisivat teoriassa olla luullaan Treg. Kuitenkin useita rivejä todisteet viittaavat vahvasti siihen, että tämä ei ole. Ensinnäkin, nämä solut tukahdutti leviämisen CD8

+ T-solut, kun arvioidaan joko irtotavarana väestöstä (kuvio 2) tai eristää mukaan NY-ESO-1 spesifisyyttä (kuvio 6). Toiseksi ne ilmaisivat alhainen havaitsemattomia tasoja CD127 ilmaisua. Kolmanneksi he up-säänneltyjen LAP aktivoinnin kanssa samankaltaisella peptidillä. Lopuksi Treg ja Teff väestön yksittäisillä potilailla joskus tunnustettu erillisiä epitooppeja (kuten esimerkissä on esitetty kuviossa 1), jotka osoittavat, että nämä ovat erillisiä populaatioita, ja Treg eivät yksinkertaisesti tuottamat muuntaminen Teff tunnustaa saman epitoopin. Johtopäätöksemme että CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ solujen läsnä 21 päivän kulttuurit ovat Treg eikä aktivoitu Teff on yhtäpitävä aiempien tutkimusten kanssa osoittavat, että hankinta näiden merkkiaineiden Teff on väliaikainen, ja ilmaisu on pitkälti menetetty päivällä 10 kulttuurin [12], [27], [28], [30]. Huomattavaa on, että kaksi aiemmat tutkimukset ovat myös tunnistettu NY-ESO-1-spesifisiä Treg veressä melanoomapotilaalta käyttää vaihtoehtoisia lähestymistapoja, mikä edelleen tukee meidän havainnot [12], [24].

Treg vasteet havaittiin Tutkimuksemme kattavat suuren osan NY-ESO-1-proteiinia. Vaikka yksityiskohtainen luonnehdinta jokaisesta näistä epitooppien ei kuulu tämän tutkimuksen, voisimme vahvistaa, että usein havaitaan Treg vastauksena 18-meeri-peptidin NY-ESO-1

157-174 johtui tunnustaa aiemmin kuvattu DP4- rajoitettu immunodominantti NY-ESO-1

157-170 epitooppi. Siten olemme osoittaneet kiistattomasti, että Treg ja Teff voi tunnistaa täsmälleen sama pienin epitooppiin samassa HLA-alleelin. Tämä puolestaan ​​viittaa siihen, että ihmisen Treg ja Teff jakaa ainakin osittain päällekkäisiä TCR valikoimia, joka on yhtäpitävä aiempien tutkimusten kanssa ihmisellä [36] ja hiirillä [37]. Toisaalta, yksi Treg vastausten havaittu tässä (alueella NY-ESO-1

49-72) ei sisällä mitään aiemmin kuvattu Teff epitooppeja (ks https://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase) ja tämä vaste ei havaittu sisällä Teff väestön tällä potilaalla (tietoja ei ole esitetty). Siten tämä spesifisyys voi olla ainutlaatuinen Treg väestölle.

On vielä Kiistanalaista Treg välittävät niiden tukahduttava vaikutus pääasiassa toissijainen imukudoselimiin, paikallisella sivustoja periferiassa (kuten kasvainkudoksen) tai, todennäköisemmin, molempia. Käytännön syistä olemme arvioineet NY-ESO-1-spesifisiä Treg vasteita pääasiassa veressä, jonka pitäisi heijastaa solujen läpi kiertävän toissijainen imukudoselimien. Kuitenkin Patient 126, voisimme lisäksi saada tuoretta kasvainkudoksen ja osoittavat, että Treg spesifinen HLA-DR-rajoitettu epitooppia peptidi NY-ESO-1

115-132 olivat paitsi läsnä veressä, mutta olivat myös läsnä korkealla taajuudella sisällä kasvain. Nämä NY-ESO-1

115-132 erityisiä Treg olivat täysin toimiva, koska ne tukahdutetaan CD8

+ T-solujen lisääntymisen. Ottaen huomioon, että potilaan 126 ilmaisee HLA-DRB1 * 04-alleeli, tämä vaste on todennäköisesti suunnattu kohti aikaisemmin kuvattu DR4-rajoitettu NY-ESO-1

121-130 epitooppi [34].