Krooninen sairaus

tiivistelmä

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta pidetään negatiivinen ennustava merkkiaine vastaus EGFR hoitomuotojen kolorektaalisyövässä (CRC) potilasta. Kuitenkin ristiriitaiset tiedot ovat olemassa koskien muuttujan vastaus EGFR-täsmähoitoihin. Vaikutukset onkogeenisten

KRAS

loppupään tavoitteista tutkittiin solulinjoissa erilaisilla

KRAS

mutaatioita. Solut, yksi

KRAS

G13D

alleeli näytti kaikkein tuumorigeenistä profiilin, jossa on konstitutiivinen aktivaatio loppupään koulutusjakson, tehden ne EGF-penseä. Kääntäen,

KRAS

A146T

solut osoittivat täyden EGF-vasteen suhteen signaalitransduktioreitteihin, solujen proliferaatiota, migraatiota tai tarttumista. Lisäksi globaali acetylome CRC-soluja oli myös riippuvainen

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta. Useat hnRNP perheenjäsenet tunnistettiin sisällä 36 asetyloitu-proteiineja. Asetylointi tila tiedetään olevan osallisena modulaatioon EGF-vasteen. Kanssa tässä esitetyt tulokset, hnRNPA1 ja L asetylointi aiheutettiin vastauksena EGF

KRAS

A146T

soluja, kun taas asetyyli-hnRNPA1 ja L pysyivät ennallaan jälkeen kasvutekijän hoidon

KRAS

G13D

penseä soluja. Tuloksemme osoittivat, että hnRNPs aiheuttama-asetylointi riippuu KRAS mutaatiostatuksesta riippumatta. Kuitenkin hnRNPs asetylointi voi olla piste, jossa eri onkogeenista reittejä lähenevät toisiaan.

Citation: Roda D, Castillo J, Telechea-Fernández M, Gil A, López-Rodas G, Franco L, et al. (2015) EGF-indusoitu asetylointi heterogeeninen Nuclear ribonukleoproteiineissa riippuu

KRAS

Mutaatiotutkimukset Status peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 10 (6): e0130543. doi: 10,1371 /journal.pone.0130543

Editor: Matias A. Avila, Navarran yliopisto School of Medicine ja Center for Applied Medical Research (CIMA), ESPANJA

vastaanotettu: 1. huhtikuuta 2015; Hyväksytty: 22 toukokuu 2015; Julkaistu: 25 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Roda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain avustuksia Espanjan hallituksen, Ministerio de Economía y Competitividad ja Feder apurahat (FIS PI09 /02480 ja PI12 /02767 AC; FIS PI12 /02394 ja ERGT ja FIS PI12 /02110 ja GLR) ja Valencian (PROMETEO 2013-005 AC). DR ollut vierailevana tutkijana päässä Ministerio de Ciencia e Innovación (Rio Hortega Program) ja Sociedad Española Oncología Médica (SEOM); MTM on väitöskirjaa Fellow Valencian (Prometeo) ja AG on vastaanottajan tutkijatohtorin espanjasta Association Against Cancer (AECC, maakunnan hallitus Baleares).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että mitään kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä kasvaimia maailmanlaajuisesti [1] ja vaikka monet edistysaskeleet terapiassa, pysyvyyttä metastasoituneen taudin silti huono [2]. Vasta-aineita epidermaalisen kasvutekijän reseptoria (EGFR), on menestyksekkäästi käytetty CRC potilailla, joilla on pitkälle edennyt tauti. Kuitenkin alle puolet ovat herkkiä tällaiseen hoitoon [3].

KRAS

tai

sääntelyviranomaisten

mutaatiot ovat tärkein negatiivinen ennustearvo markkereita EGFR-vasteen [4]. Siksi hoito anti-EGFR-vasta-aineita on vain otettava huomioon potilailla, joilla on täysi

RAS

villityypin fenotyyppiin [5, 6]. RAS proteiineja varmistaa signaalitransduktion välillä kalvoreseptorit, kuten EGFR, ja sisäinen sytoplasman seriini /treoniini-kinaasien; mikä edistää sääntelyä useita olennaisia ​​solutoiminnoille. Mutatoidut RAS tekee proteiinin konstitutiivisesti aktiiviseen muotoon, mikä puolestaan ​​deregulates alavirran signalointireitteihin [7]. Kuitenkin useat kliiniset ja kokeelliset tulokset osoittavat, että kaikki

RAS

mutaatiot ovat tasavertaisia ​​niiden biologisia ominaisuuksia ja ne voisivat sen vuoksi antaa vaihtelevia vaikutuksia [8, 9]. Yleisimpiä KRAS mutaatiot löydettiin CRC potilaat ovat kodonissa 12 ja 13. Kuitenkin aktivoimiseksi

KRAS

mutaatiot kodoneissa 61 ja 146 on hiljattain liittynyt lyhyempi ilman taudin etenemistä verrattuna villityypin

KRAS

CRC saaneilla potilailla [10]. Lisäksi kasvainsoluja paineessa estämällä niiden onkogeenisten väyliä kehittää spontaani mutaatio. Todellakin, metastaattinen CRC potilaiden meneillään kasvaimia torjuvaa hoitokokemusta

KRAS

genotyypin muutoksia [11]. Havaitsimme myös tämä vaikutus viljellyissä soluissa; poistetaan mutatoitunut

KRAS

G13D

alleeli HCT116-soluissa (

KRAS

G13D /WT

) indusoi spontaanin

KRAS

A146T

mutaation jäljellä villityyppisen alleelin. Paljastaa molekyylitason mekanismeista ero vaste havaittiin kasvainsolujen eri mutaatioita

KRAS

tuntuu tärkeä kysymys uusien kasvaimia torjuvaa hoitojen ja henkilökohtaista lääketiedettä.

Äskettäin uudenlainen deasetylaasi-riippuvaisen mekanismin on ehdotettu selittämään resistenssiä EGFR-hoitoja mutantti

KRAS

keuhkoadenokarsinooma soluihin [12]. Asetylaatiosta translaation jälkeistä palautuva muutos säätelee kahdenlaisia ​​entsyymit: lysiiniä deasetylaaseja (KDACs) ja lysiiniä ase- tyylitransferaaseja (Kats). Todellakin, deasetylaasin inhibiittorit ovat nousseet mahdollisia syöpälääkkeitä lisäämällä hyperasetylaation sekä histonien ja nonhistone proteiinit [13]. Lisäksi jotkin raportit kuvaavat vuorovaikutusta KDAC estäjiä ja RAS-ERK signalointiryöpyn solulinjoissa joilla on eri mutaatiostatuksesta asema

KRAS

,

BRAF tai PI3KCA

[14-17].

alavirtaan vaikutuksia harvemmin, mutta ei vähemmän tärkeänä

KRAS

A146T

mutaatio on tällä hetkellä epäselvä. Tässä artikkelissa vaikutusten arvioimiseksi

KRAS

A146T

mutaatio

versus KRAS

G13D

soluproliferaatioon, tarttuvuuden ja migraatio HCT116 johdettujen CRC solulinjoissa. Koska äskettäin kuvattua vuorovaikutusta asetylaatiot ja RAS-ERK signalointikaskadien, tutkimme myös vaikutusta KRAS mutaatiostatuksesta riippumatta proteiinia asetylointi mallia saadakseen käsityksen mahdolliset molekyylitason mekanismeista ero vaikutus

KRAS

mutaatioita .

Materiaalit ja menetelmät

2.1. Materiaalit

Vasta-aineita hnRNPA1 (ab5832, ab50492), hnRNPA3 (ab50949), hnRNPA

2 /B

1 (ab64800), hnRNPL (ab6106, ab65049) ja GAPDH (ab8245) tai β- aktiini (ab8227) kuin lastaus valvonta, olivat Abcam. Vasta-aineita asetyyli-Lys (9441), Pakt (40665) ja AKT (9272) olivat Cell Signaling Technology. Muita vasta-aineita käytettiin: ERK (sc-93) ja Perk (sc-7383) Santa Cruz Biotechnology; KRAS (05-516) Millipore ja Talin (T3287) Sigma-Aldrich.

epidermaalisen kasvutekijän (EGF 20 ng /ml), trikostatiini (TSA, 0,5 uM) ja natriumbutyraatti olivat Sigma-Aldrich, UO126 (10 uM) Promegalta, LY294002 (10 uM) Calbiochem ja fibronektiinin BD Biosciences.

2.2. Soluviljely

koolonsyöpäsolulinjaa HCT116 ja niiden johdannaiset HAE6 ja HAF1 olivat kaupallisesti hankittiin GRCF Biorepository ja Cell Center, Johns Hopkins University. Kaikkia solulinjoja viljeltiin McCoyn 5A muokattua alustaa (Gibco), johon 10% FBS, penisilliini /streptomysiini ja L-glutamiinia ja ylläpidetään normaaliolosuhteissa.

2.3. Proteiinin uutto ja immunoblottianalyysi

Yhteensä proteiinit uutettiin RIPA-puskurissa, johon oli lisätty estäjien ja natriumbutyraatti. Yhtä suuret määrät proteiineja elektroforeesi SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja testattiin immunoblot kuten muualla on kuvattu [18]. Blotit kehittänyt parannetun chemoluminiscence (ECL Detection Kit, GE Healthcare). Proteiini tasojen määrä densitometrillä ja normalisoidaan β-aktiinin tai GAPDH ilme.

2.4. 2D-elektroforeesi ja acetylome analyysi

Proteiiniekstraktit (100 ug) erotettiin kaksiulotteisella (2D) elektroforeesilla, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Proteomic kuvat oli hankittu Typhoon Trio Imager. Samanaikaisesti, 2D-geelit elektroblotattiin nitroselluloosakalvoille ja analysoitiin Western blot anti-asetyloitu lysiini-vasta-ainetta. Asetyloitu proteiinit päällekkäin SYPRO Ruby-värjätyissä geeleissä leikattiin MS-analyysi. Gel näytteet prosessoitiin MassPrep asemalle (Waters). NanoLC-ESI-MS /MS ja data-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu [19], jonka proteomiikka ja bioinformatiikka yksikkö, (CIMA-Navarran yliopiston, Espanja).

2.5. Immunosaostus

500 ug proteiineja immunosaostettiin yli yön spesifisillä vasta-aineilla tai normaali seerumin IgG: tä (Dako) 4 ° C: ssa pyörivällä laitteella. Proteiini-vasta-aine-kompleksit vedetty alas 50% (v /w) Dynabeads (Invitrogen, Life Technologies). Usean pesun jälkeen PBS, immunokompleksit otettiin talteen keittämällä LB ja sitten analysoitiin Western blot kuvatulla. 1% proteiinia uutteet immunosaostamiseen ladattiin syötteenä.

2.6. RNA: n eristys ja ilmaisun analyysin qPCR

RNA, täydentäviä DNA-synteesiä ja qRT-PCR toteutettiin preciously kuvattu. [18]. Alukesekvenssit

hnRNPA1

,

hnRNPA3

,

hnRNPA2 /B1

,

hnRNPL

ja

GAPDH

esitetään täydentäviä tietoja. Pre-kehitetty Taqman alukkeita

KRAS

,

ADAM19

,

katepsiini C

,

katepsiini L

ja

18S

olivat Applied biosysteemien. Suhteellinen geenien ilmentyminen ilmoitettiin 2

-Δ (ACt) Data normalisoitiin

18S

kvantifiointiin samasta näytteestä reaktion. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina.

2.7. Microarray geenien ilmentyminen. Hybridisaatio ja tietojen analysointi

Yhteensä-RNA (5 ug) käytettiin saamaan biotinyloidun cRNA mukaan valmistajan protokollan (Affymetrix). Laatu Leimatun cRNA varmistettiin hybridisoimalla kohteena on Affymetrix testi siru (Test3-chip). Merkityt cRNA hybridisoidaan Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0ST. Microarray tiedot saatiin AGCC Affymetrix ohjelmisto. Raakatietoja kolme toistoa kutakin solulinjaa analysoitiin R /Bioconductor käyttäen Limma paketti [20]. F-tilastot, t-tilastot ja log kertoimella differentiaalikaavojen laskettiin empiirinen Bayes maltilliseen standardin virheiden kohti yhteistä arvoa. Ilmentyvät eri geenit tunnistettiin pareittain vertailu, (p-arvo sulku = 0,05). Vain geenejä kertamuutos yli 1,5 ja alle -1, katsottiin ilmentyvät eri jatkotutkimuksiin ja luokiteltu biologisen prosessin luokassa seuraavat kriteerit Gene ontologia Consortium [21].

2.8. BrdU Soluproliferaatiomääritys

Solulisääntyminen tutkittavana bromideoksiuridiinia (BrdU) sisällyttäminen iinianalyysikitissä (Calbiochem). Lyhyesti, solut siirrostettiin tiheyteen 5×103 solua /kuoppa 96-kuoppaiselle viljelylevylle. 24 tunnin kuluttua nälkään, soluja käsiteltiin EGF: llä (20 ng /ml) seerumia. BrdU reagenssia lisättiin kuoppiin 4h läsnä ollessa tai poissa ollessa EGF. Tällä ilmoitettu ajankohtina solut kiinnitettiin aikana 30min in kiinnitysnesteeseen /denaturoivaa liuosta. Soluja inkuboitiin anti-BrdU-vasta-ainetta (1: 100) 1 h ja sen jälkeen useita pesuja, inkuboitiin HRP-konjugoitua IgG: tä 30 minuutin ajan. Tetra-metyyli bentsidiinin substraattia lisättiin sitten 15 minuutin ajan ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 1,25 M rikkihappoa stop-liuosta. Absorbanssi mitattiin kunkin kuopan kahdella aallonpituudella 450-540nm.

2.9. Haavan paranemista määritys

Kolme solulinjoja viljeltiin normaaliolosuhteissa. Yhtyviä monokerrosten raaputettiin 10 ui pipetin kärki aiheuttamaan haavaan. Haavoittuneet reunat oli kuvattu käyttämällä käännettyä mikroskooppia Nikon Eclipse Ti (10-kertainen suurennus). Kuvat kerättiin 0, 24 ja 48 tunnin kuluttua alusta.

2.10. Tilastollinen analyysi

Tulokset ovat keskiarvo ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Merkittäviä eroja määritettiin yhden otoksen t-testiä. Eroja pidettiin merkittävinä osoitteessa

p

0,05. Edustavia blotit näkyvät.

Tulokset

3

.

1

. Differential vaikutus

KRAS

A146T

ja KRAS

G13D in EGF-käsiteltyjen CRC solujen

HCT116 CRC solulinja, kätkeminen endogeeninen aktivoiva

KRAS

G13D /paino mutaatio, ja kaksi isogeenisistä HAF1 (

KRAS

paino /-) ja HAE6 (

KRAS

G13D /-) klooneja käytettiin tässä tutkimuksessa. Kaikki nämä geenit suositellaan ennustaa kliininen tulos syöpähoitoa sekvensoitiin kolmessa solulinjoissa [22] (S1 taulukko). Mielenkiintoista, kun taas kaikki mutaatiot löydettiin HCT116 havaittiin myös HAE6 soluissa, huomasimme, että HAF1 soluissa

KRAS

A146T

hotspot mutaatio oli spontaanisti syntynyt, mitä tähän asti oli tarkoitus olla villityypin alleelin. Koska tämä tulos, me tunnettu

KRAS

A146T

soluja ja vertasi niitä HCT116 tai HAE6 solulinjoja (S1 Kuva ja S1 File). HAE6 solut osoittivat korkeinta proliferaationopeus ja alhaisin soluadheesion. Haavan paranemista analyysi solumigraation paljasti eroja kolmen solulinjoissa (, HCT116 osoittaa korkeampi kuin HAF1 mutta pienempi kuin HAE6 soluja. Toisin kuin aikaisemmat tulokset,

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta ollut mitään näkyvää vaikutusta on ERK ja AKT fosforylaatio, perusolosuhteissa. Tämä ei ole yllättävää, sillä kolme solulinjojen satama PIK3CA aktivoiva mutaatio.

KRAS

A146T

tuntui olla vähemmän tuumorigeenistä mutaatio. kuitenkin unsynchronized soluviljelmässä perusolosuhteissa voisi peittää vaikutus KRAS mutaation vastauksena erityisiin ärsyke. Siksi tutkimaan edelleen alavirtaan vaikutusta

KRAS

A146T

verrattuna hyvin tunnettu

KRAS

G13D

mutaatio, HAF1 ja HAE6 soluja kasvatettiin seerumideprivaatio median ja stimuloitiin sitten EGF. poissulkemiseksi mahdollisuus, että mutaatio voi vaikuttaa

KRAS

ilmaisu, qPCR oli suoritettu, ja

KRAS

mRNA-tasot löytyvät sekä solulinjoissa oli samanlainen (tuloksia ei ole esitetty). Vaikka EGF-hoidon aiheuttama nopea fosforylaatiota ERK1 /2 ja AKT vuonna HAF1, tämä vastaus oli huono HAE6 soluissa (kuvio 1A). Huomattavaa, Perk tasot olivat jo korkealla käsittelemättömät HAE6 valvontaa. Lisäksi, kuten on jo kuvattu muissa solulinjoissa, joiden hyperactivated ERK-reitin [23], EGF laski Pakt tasoa tässä HAE6 solulinjassa.

. Alavirtaan tavoitteet KRAS signalointireitin analysoitiin western blot määrittää Pakt ja pERK1 /2 tasossa jälkeen EGF-hoidon. B. Solujen adheesio määritettiin western blot-analyysi Talin lohkaisu HAF1 ja HAE6 soluja. C. Migration suhde tutkittiin jälkeen EGF (20 ng /ml) käsittely haavan paranemista määrityksessä. Kaavio näyttää prosentteina solut, jotka muuttivat haava-alueen jälkeen 24h. D. Solulisääntyminen mitattuna BrdU määritystä analysoida proliferatiivinen aktiivisuus EGF-käsiteltyjen (20 ng /ml) soluihin. * P 0,05 EGF-käsiteltyjen vs käsittelemättömiin kontrolleihin (n = 4).

Soluadheesio kokeissa ei voitu suorittaa seerumittomassa elatusaineessa, koska HAF1 solut olivat herkkiä trypsinoimalla jälkeen 24-seerumideprivaation. Korkeampi Talin-pilkkominen on liittynyt alhaisempi soluadheesiota [24]. Siksi olemme analysoineet lohkaista-Talin epäsuorana tapa mitata soluadheesion. Stimuloimattomissa soluissa, taliini-lohkaisu oli jo korkeampi HAE6 kuin HAF1 soluissa. Lisäksi vaikka Talin-lohkaisu aiheutettiin vastauksena EGF HAF1 soluissa, tämä proteolyyttisen oli EGF-riippumattomia HAE6 soluissa (kuvio 1 B). Me seuraavaksi analysoidaan solujen vaeltamiseen ja havaitsi, että HAE6 solut olivat myös vastetta EGF, toisin kuin solumigraatio indusoimaa EGF HAF1-solulinjassa (kuvio 1C). Lopulta solujen lisääntymistä, vaikka aiheuttama EGF molemmissa solulinjoissa, nostettiin vähemmässä määrin HAE6 kuin HAF1 soluissa (kuvio 1 D). Me perusteltu, että hyperactivation ERK1 /2 aiheuttama KRAS

G13D saattaa tasaantua, jonka jälkeen soluja ei voida vielä EGF.

3.2. Differential mRNA tasot KRAS

G13D vs KRAS

A146T CRC solulinjoissa

Tutkimme näitä mahdollisia KRAS riippuvia transkription vaikutuksia sekä solulinjoissa käyttämällä Affymetrix DNA mikrosiruja (S2 ja S3 Files). Alle läsnäolo

KRAS

G13D

mutaatio, useimmat ilmentyvät eri geenit alassäädetty (kuvio 2A ja 2B, S2 kuvassa) verrattuna

KRAS

A146T

mutaatio (HAF1). Ilmaisulla enemmistön geenit eivät olennaisesti muutu, ja vain harvat niistä sääteli. Voidakseen vahvistaa nämä tiedot, ilmaus valikoima up geenien analysoitiin qPCR. Nämä geenit valittiin niiden merkittävä rooli tuumorin etäpesäkkeiden, kasvutekijää irtoaminen tai CRC lääkeresistenssideterminantit [25, 26]. Ilmaisu Näiden geenien oli dramaattisesti säädellään ylöspäin solujen mutatoitunut

KRAS

G13D

alleeli, mikä vahvistaa microarray data (kuvio 2C ja S2 kuvassa). Niistä geenit säädellä vähentävästi HAE6 vs. HAF1 soluja, edustavimmat polku vaikuttaa oli EGFR1 signalointia; 43 geenejä alassäädetty ulos 156 kuvattiin EGFR1 kanoninen kautta. Kuitenkin muita reittejä laukaisee sytokiinien ja kasvutekijöiden, kuten VEGF, PDGF, HGF, IGF1, TGFp, TNFa ja useita interleukiinit, myös alas-säädellä. Tämä ei ole yllättävää, koska useimmat jakavat useita vaiheita sisällä RAS signalointireitin.

Yhteensä RNA CRC viljellyistä soluista pohjapinta olosuhteissa 10% FBS analysoitiin microarray. A. Venn-kaavio, joka näyttää prosenttiosuuden ylä- ja alas geenien löytyy solulinjassa kätkeminen

KRAS

G13D

mutaatio (HAE6), verrattuna mRNA-tasoja löydetty HAF1 soluissa (

KRAS

A146T

)

. B. Pylväsdiagrammi edustavat ilmentyvät eri geenit (p-arvo ≤ 0,001) joukossa kaksi solulinjoista HAE6

versus

HAF1 soluja, kun otetaan huomioon vain-log2 kertainen muutos 1,5 ja -1.5. Gene symboli jokaisen geenin on osoitettu vasemmalla. C. Kolme geeneistä,

katepsiini L

,

katepsiini C

ja

ADAM19

valittiin perustuen niiden mahdollisesta roolista solun invaasiota ja muuttoliikkeen mikrosiru validointi käyttäen qPCR. * P 0,05 vs. HAF1 soluja.

3.3. Vaikutus KRAS mutaatioiden maailmanlaajuiseen acetylome CRC

Yksi mahdollisista vuotoreiteistä vaikuttaa KRAS mutaatiostatuksesta asema, joka voi säädellä useita biologisia prosesseja on proteiini asetylaatio. Olemme pyrkineet tutkimaan, onko maailmanlaajuinen asetylointi profiili CRC vaikuttivat eri aktivoitu KRAS

G13D ja aktivoitu KRAS

A146T. Eristetyt proteiinit sekä solulinjoja kasvatettiin 10% FBS: ää, immunosaostettiin ja analysoitiin Western blot anti-asetyyli-Lys-vasta-aineita (kuvio 3A). 2D western blot proteomic lähestymistapaa käytettiin syväanalysoimaan asetyloitua-proteiinien kahdessa solulinjassa. Global proteiini Lys-asetylointi nostettiin HAE6 verrattuna HAF1 soluihin, mukaan lisääntynyt havaittujen paikkoja (Kuva 3B).

. Soluhomogenaattien immunosaostettiin anti-asetyyli-lysiini-vasta-aineen ja sakat sitten immunoblotattiin vastaan ​​asetyyli-lysiinitähdettä, mukaan lukien sama määrä alkaa homogenaattia (nimetty syöttö). IgG: Homogenaatteja immunosaostettiin normaali seerumin IgG. Molekyylimassamarkkerit (kDa) ovat Geelin vasemmalla puolella. B. Proteiinin ilmentyminen profiilit molempien solulinjojen erotettu IEF kaksiulotteinen PAGE, värjättiin SYPRO Ruby (vasen paneeli) tai immunoblot vastaan ​​asetyyli-lysiini-vasta tunnistamiseksi asetyloitua proteiineihin (oikea paneeli). PH kasvaa vasemmalta oikealle abskissa ja molekyylimassa pienenee ylhäältä alas ordinaatalle. C. jakelu GO Biological määritetyt toiminnot asetyloitu proteiinit tunnistettu acetylome on HAE6 soluja.

Positiiviset täplät HAE6 acetylome irrotettiin ja tunnistettiin massaspektrometrillä. 67 täplät havaittiin vaan ainoastaan ​​ne, joilla on luottavainen Mascot ioni pisteet ja suuri peptidi matching valittiin (S2 taulukko). The (GO) biologisen toiminnan analysointi meidän 36 asetyloitu proteiineja paljasti, että Kohdeproteiinit rikastuneet neljään pääryhmään liittyvät solun kasvuun, energia-aineenvaihduntaan, RNA aineenvaihduntaa ja proteiinien aineenvaihduntaan (kuvio 3C). Monet näistä proteiineista kuvattiin jo olevan tavoitteisiin otaksuttu ase- tyylitransferaaseja tai deasetylaaseja ja tulla asetyloitua erilaisissa koeolosuhteissa (tarkistetaan S2 taulukko). Meidän mikrosirujen tulokset vahvistivat, että erot asetylaatiossa rakenteessa eivät lisääntyneen mRNA ilmaisun. Todellakin, nämä geenit, joiden tuotteet tunnistettiin meidän acetylome analyysi pysyi ennallaan HAE6 verrattuna HAF1 soluihin (S2 ja S3 Files).

3.4. Asetylaatio hnRNP perheenjäsenten

joukossa asetyloitu-tavoitteet oli mielenkiintoinen ryhmä RNA sitovia proteiineja, ne kaikki perheenjäsenet heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiineissa (hnRNPs), osallistuvat erilaisiin molekyylien toimintoja menee mRNA käsittely, kuljetus, vakautta tai jopa käännös [27]. Olemme analysoitiin kahdessa solulinjassa, onko pohjapinta asetylointi hnRNPs oli riippuvainen

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta. Asetylaatio mitattiin immuunisaostuskokeissa asetyyli (Lys) vasta sen jälkeen western blot, jossa tunnustetaan erityiset hnRNP jäsen. Kuten on esitetty kuviossa 4A, hnRNPA1 ja A2 /B1 havaittiin hyperacetylated mukaisesti kasvuolosuhteissa (10% FBS) in HAE6 verrattuna HAF1; kuitenkin, tämä malli ei ollut niin selvä muut perheenjäsenet testataan kuten hnRNPA3 tai L. mRNA ja proteiini tasoilla hnRNPs analysoitiin qPCR ja western blot vastaavasti (kuvio 4B ja 4C); ilmaus yksikään hnRNPs oli merkittävä muutos, kun verrataan niiden eri solulinjoissa. Siksi eri asetylointi havaitut ole seurausta korkeampi geeniekspression tai proteiinin vakauttamiseen.

. Yhteensä otteita kahdesta CRC solulinjoista perusolosuhteissa (10% FBS) eristettiin ja immunosaostettiin α-asetyyli-lysiini vasta-aineita. Immunosaostunut näyte analysoitiin sitten western blot, jossa tunnustetaan erityiset hnRNP jäsen (vasen paneeli). Tulot kunkin erityisen hnRNP eri solulinjoissa esitetään (oikea paneeli). B. mRNA: n tasot hnRNPs analysoitiin qPCR (n = 3). Ei tilastollista merkittävyyttä ei löytynyt. C. Western blot-analyysi osoittaa proteiinin tasot eri hnRNPs vuonna HAF1 ja HAE6 soluja. p-aktiini käytettiin latauskontrollina.

3.5. Asetylaatio hnRNPA1 ja L vastauksena EGF

Vaikka asetylaatio hnRNPs on jo kuvattu muissa solun järjestelmissä, tällä hetkellä ei tiedetä, onko tämä Asetylaatiosta osa EGR vasteen CRC soluissa. Jos on kyse, on tärkeää selvittää,

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta voisi kunto differentiaalisesti aiheuttama-asetylaatio hnRNPs kun EGF ärsykkeitä. Molemmat solulinjat kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa ja sitten stimuloitiin EGF lyhyen (20min.) Ja pitkän (2h) ajan (kuvio 5A). Näytteet kustakin kunnossa immunosaostettiin joko anti-hnRNPA1 tai anti-hnRNPL-vasta-aineita. Nämä hnRNPs valittiin, koska ne edustavat niitä isoformia, jolla on suurin ja pienin asetylointi eroja verrattaessa HAF1 ja HAE6 soluja. Perustaa asetylaatio suhde (asetyyli-hnRNP /yhteensä hnRNP), pull-down proteiinit analysoitiin edelleen Western blotilla erityisten vasta-aineiden asetyyli-Lys tai vastaava hnRNP.

Molemmat CRC solulinjoja kasvatettiin seerumin vapaa keskipitkän ja stimuloitiin sitten EGF (20 ng /ml) 20 ja 120 min. A. Proteiiniekstraktit ohjaus- tai EGF-käsiteltyjen soluja eristettiin ja immunosaostettiin α-hnRNPA1 (ylempi paneeli) tai hnRNPL (alempi paneeli) vasta-aineita. Immunosaostetut Sitten näytteet analysoitiin Western blot, jossa on tunnustaa asetyyli-lysiinitähteet ja joko hnRNPA1 tai hnRNPL. Tulot kunkin erityisen hnRNP eri solulinjoissa on esitetty. B. mRNA tasot hnRNPA1 ja hnRNPL analysoitiin qPCR valvonta ja 2h EGF-käsiteltyjen solujen. Tilastollisesti merkitseviä löytynyt (n = 3). C. Western blot-analyysi osoittaa proteiinin tasot molempien hnRNPs vuonna HAF1 ja HAE6 solujen valvontaa ja 2h EGF-hoidon olosuhteissa. Intensiteetti hnRNPs bändejä mitattiin ja normalisoitu β-aktiini; kaaviot alapaneeli osoittavat määrällisen sekä hnRNPL ja A1 HAF1 (valkoiset pylväät) ja HAE6 (harmaat palkit) solulinjat.

Under seerumideprivaation, pohjapinta asetylaatio tasot molempien hnRNPs olivat korkeampia HAE6 kuin HAF1 soluissa (kuvio 5A, kaista 0). Kuitenkin, asetylaatio sekä, hnRNPA1 ja hnRNPL päätepisteessä EGF-hoito oli sama molemmissa solulinjoissa. Mielenkiintoista on, että kun asetylointi EGF-käsiteltyjen näytteiden verrattiin käsittelemättömiin kontrolleihin, asetyloitu-hnRNP tasot eivät merkittävästi muutu koko sen ajan aikana EGF-hoidon HAE6 soluissa (kuvio 5A). Kääntäen, EGF aiheuttama dramaattinen asetylaatio molempien hnRNPs in HAF1 soluissa. Mielenkiintoista saman vasteen havaittiin jälkeen EGF hoidon HCT116 emosolulinjassa (S3 kuvassa). Lopuksi mRNA ja proteiini tasoilla hnRNPA1 tai-L ei todettu mitään EGF-käsiteltyjen solulinjan testatuilla ajankohtina (kuvio 5B ja 5C, S3 kuvassa). Näin ollen EGF aiheuttama asetylointi havaittu HAF1 ei voida katsoa johtuvan transkription tai translaation modulaatio hnRNPs.

3.6. Rooli

KRAS

A146T mutaatio hnRNP asetylointi

tutkia,

KRAS

A146T

mutaatio voi selittää EGF aiheuttaman asetylaatio hnRNPs, me nimenomaan esti KRAS signalointireitin että HAF1 solulinjassa. Riippumatta

KRAS

A146T-mutaatio, HAF1 solut käsittävät myös

PI3KCA

mutaatio. Siksi olemme analysoineet asetylaatio hnRNPs aiheuttama EGF soluissa esikäsitelty estäjiä molempien, MEK1 /2 (U0126) ja PI3K (LY294002). Esto yhden reitin joko MEK1 /2 tai PI3K, käyttämällä erityisiä inhibiittoria yksinään, ei ollut vaikutusta proteiinien asetylointi (kuvio 6A). Kyky RAS vaikuttaa PI3K ja päinvastoin on hyvin dokumentoitu [28, 29]. Itse asiassa estää MEK1 /2 aktiivisuus on osoitettu aiheuttavan AKT-fosforylaation CRC solulinjoissa [30]. Toisaalta, estää PI3K on osoitettu lisäävän pERK1 /2 tasoa vastauksena erilaisiin ärsyke [28]. Kanssa Tässä, kun molemmat inhibiittoreita käytettiin samanaikaisesti, esto RAS /PI3K signalointireittejä esti täydellisesti EGF: n indusoiman asetylaatio sekä hnRNPA1 ja hnRNPL (kuvio 6B). Mielenkiintoista on, että pohjapinta tasot asetyloitiin hnRNPs seerumin puutteessa tarkastuksia ei vaikuta kinaasien inhibiittoreita.

. HAF1 soluja käsiteltiin EGF: n läsnä tai poissa ollessa MAPK-estäjät (MEK, UO0126 tai PI3KA, LY294002). Uutteissa HAF1 solut immunosaostettiin α-hnRNPA1 tai hnRNPL vasta-aineita. Immunosaostunut Sitten näytteet analysoitiin Western blot, jossa tunnustetaan asetyyli- lysiinitähteet ja joko hnRNPA1 tai hnRNPL (vasen paneeli). Fosforylaatiota ERK1 /2 ja AKT vuonna HAF1 soluissa arvioitiin myös vahvistaa tehokkuutta yksittäisten estäjien annoksilla käytetty (oikea paneeli). B. Molemmat MAPK inhibiittorit samanaikaisesti käytettiin tutkittaessa niiden vaikutusta EGF aiheuttamaa asetylaatio hnRNPs. C. rooli deasetylaaseja perustason asetylaatio tasoilla hnRNPs tutkittiin edelleen in HAF1 käsitellyissä soluissa trikostatiini A. Immunosaostus hnRNPs vasta-aineilla ja Western blot vastaan ​​asetyyli-lysiini, hnRNPA1 tai L HAF1 soluissa, joita käsiteltiin EGF, TSA tai molempien yhdistelmä on esitetty.

Basal tasot asetyyli-hnRNPs voisi olla riippuvainen puoliintumisaika asetylaatiot. Itse asiassa, asetylaatio proteiineja ei ole vain tuloksena raasi-indusoidun aktiivisuuden, vaan myös deasetylaasit. Jotta voidaan tutkia roolia deasetylaaseja perustason asetylaatio, tutkimme, onko deasetylaasin inhibiittorilla trikostatiini A (TSA) voivat jäljitellä vaikutus EGF HAF1 soluissa. Todellakin, TSA lisäsi asetylaatio sekä hnRNPs samalle tasolle kuin saavutetaan EGF-hoito, vaikka mitään synergistinen vaikutus havaittiin (kuvio 6C).

Keskustelu

Tässä me paljastaa useita näkökohdat molekyyli tapahtumien taustalla paksusuolen karsinogeneesin, jota käsitellään tarkemmin. Tarjoamme ensimmäinen raportti osoittaa, että asetylaatio 36 tiettyjen proteiinien riippuu

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta; joukossa, useat jäsenet hnRNP perheen. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että hnRNP asetylaatio on osa EGF-indusoituvan vasteen. Toiseksi, meidän osoittaa molekyyli seurauksia alleelin epätasapaino poistetaan joko villityypin tai mutantti alleeli

KRAS

G13D /WT

CRC-soluja. Poistetaan villityypin alleelin (HAE6) johtaa, paitsi hnRNP asetylaatio, mutta myös tuumorigeenisemmiksi ja EGF-komentoihin profiili näiden solujen. Käänteisesti poistaminen mutantti alleeli (HAF1) indusoi spontaani

KRAS

A146T

mutaatio villityypin alleelin.

Yhdessä havaintojemme näyttävät rinnakkain kliiniset havainnot osoittavat, että häiriöt

KRAS

villityypin alleeli on haitallinen ennustetekijä CRC [31]. Yllättäen HAF1 soluissa, spontaani

KRAS

A146T

pistemutaatio todettiin. Tästä samaa mieltä, viimeisimmät raportit osoittavat dynaaminen

KRAS

genotyypin muutoksia koko etenemistä metastaattisen CRC [11]. Tässä vaiheessa mutaatio tekee myös konstitutiivinen aktivointi KRAS [32], Lähitulevaisuudessa olisi tärkeää analysoida mahdollisia spontaaneja mutaatioita muulla CRC solulinjaa käytettiin kokeellista mallia tutkia molekyylitason mekanismeja hoidon vastus tai uusi lääke kehittäminen.

mutaatio seulontatestit perustuvat hotspot

KRAS

kodoneja 12 ja 13 ovat johtaneet mis-luokituksen jopa kolmasosa potilaista, jotka virheellisesti pidetään

KRAS

villityypin ja olivat resistenttejä anti-EGFR-hoitoja [33, 34].

KRAS

mutaatiot kodoneissa 61 ja 146 liittyvät merkittävästi lyhyempi ilman taudin etenemistä verrattuna villityypin

KRAS

CRC saaneilla potilailla setuksimabin ja kemoterapian [10].