Krooninen sairaus

tiivistelmä

Stress-indusoituvan transkriptiotekijöiden keskeinen rooli solujen sopeutuminen olosuhteet säilyttää homeostaasin ja genomin eheyttä. Aktivoiva transkriptiotekijä 3 (ATF3) indusoidaan erilaisia ​​stressiä ja tulehdustiloja, ja yli-ilmentyy monenlaisissa syöpäsoluja. Kuitenkin molekyylitason mekanismit pleiotrooppisten toiminnot ATF3 ovat pysyneet vaikeasti. Tässä käytimme järjestelmien analyysi tunnistaa genomin laajuinen tavoitteet ATF3, joka on joko indusoi alkylointiaineella metyylimetaanisulfonaatin (MMS) tai yli-ilmentyy eturauhassyövän LNCaP. Osoitamme, että stressin aiheuttama ja syöpään liittyvän ATF3 rekrytoimista 5984 ja 1423 tavoitteet, vastaavasti, ihmisen perimässä, 89%, jotka ovat yhteisiä. Erityisesti ATF3 tavoitteita erittäin runsaasti paitsi ATF /CRE motiiveja vaan myös sitoutumiskohtiin useiden muiden stressiin indusoituvan transkription tekijöitä laaja stressin vastetekijöitä transkription säätelyyn kohdegeenien. Tarkempi analyysi vaikutuksista ATF3 Knockdown seuraavilla tavoitteista osoitti, että stressin aiheuttama ATF3 säätelee geenien metaboliareitit, solusyklin, apoptoosin, soluadheesiota, ja signalointi kuten insuliini, p53, Wnt, ja VEGF polkuja. Syöpään liittyvän ATF3 osallistuu säätelyyn erillisiä sarjaa geenien prosesseja, kuten kalsiumia signalointi, Wnt, p53 ja diabetes polkuja. Varsinkin stressin aiheuttama ATF3 sitoutuu 40% p53 tavoitteista ja aktivoi proapoptoottisiin geenejä, kuten TNFRSF10B /DR5 ja BBC3 /PUMA. Syöpään liittyvän ATF3, sen sijaan, tukahduttaa nämä pro-apoptoottisten geenien lisäksi CDKN1A /p21. Yhdessä meidän tiedot osoittavat laajan stressiin indusoituvan transkriptiotekijöiden ja osoittavat, että ATF3 on vastakkaiset, solu kontekstisidonnaisia ​​vaikutuksia p53 kohdegeenien DNA-vaurioita vastaus ja syövän kehittymisessä.

Citation: Tanaka Y, Nakamura A, Morioka MS, Inoue S, Tamamori-Adachi M, Yamada K, et al. (2011) Systems Analysis of ATF3 stressin Response ja Cancer paljastaa vastakkainen vaikutus proapoptoottisen Geenit p53 Pathway. PLoS ONE 6 (10): e26848. doi: 10,1371 /journal.pone.0026848

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 elokuu 2011; Hyväksytty: 04 lokakuu 2011; Julkaistu: 26 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Tanaka et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain apurahoja SK (18012015, 18055008 ja 21590302) sekä apurahan Y.T. (20510183) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology, Japani. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Transkriptiotekijöihin tärkeitä rooleja ajallinen geenin ilmentymisen säätelyyn seerumissa stimulaatio ihmisen soluista [1], [2]. Cellular sopeutuminen erilaisiin ympäristön stressiolosuhteissa säädellään myös transkriptiotekijöitä että yhteistyö ordinately moduloida geenien ilmentymisen huoltoon osallistuvan solun homeostaasin ja geneettinen eheys. Tällainen järjestelmä on tärkeä rooli ei vain selviytymisen normaaleissa soluissa, mutta myös vastus syöpäsolujen aineenvaihdunnan ja genotoksinen jännityksiä. Ratkaiseva askel kohti ymmärtäminen molekyyli- mekanismien stressistä on tunnistaminen kohdegeenien kunkin transkriptiotekijän. Tutkimukset hiivan käytetään geenin ilmentymisen profilointi [3], [4] ja viime aikoina järjestelmien analyysi kromatiinin immunosaostus transkriptiotekijöiden [5] ovat osoittaneet, genomin laajuisia verkkoja transkriptiotekijöiden säätelevä geenien ilmentymisen, joka järjestää solusyklin, geenin transkription, proteiinisynteesiä ja DNA korjaus vastauksena MMS. Nisäkkäillä, kasvain p53: lla on keskeinen rooli DNA-vaurioita vaste transkriptionaalisen kontrollin useita satoja geenejä [6], [7]. Tärkeää on, vain pieni alijoukko p53 tavoitteet aktivoituvat tietyissä olosuhteissa [8], mikä osoittaa, että joko sitoutuminen p53 tavoitteet [9] – [11], tai trans-aktivoitumisen potentiaalin p53-proteiinien [12], [13] voi olla vaikuttaa apumolekyylejä.

ATF3 on jäsenenä ATF /CREB perheen perus-leusiinivetoketjun (b-Zip) tyyppi transkriptiotekijöitä [14] ja on erittäin monipuolinen Jännitysanturiin varten monenlaisissa olosuhteissa mukaan lukien hypoksia, hyponutrition, oksidatiivisen stressiä, ER jännitykset ja erilaisia ​​genotoksinen korostaa [15], [16] sekä tulehdusreaktioita [17], [18]. ATF3 aktivoituu myös seerumin stimulointi ja loppupään c-Myc [19], ja on usein yli-ilmentynyt useissa kasvaimissa mukaan lukien eturauhasen [20], rintojen [21], ja Hodgkinin lymfoomat [22]. Tärkeää on, useita rivejä todisteita on osoittanut tiiviin yhteyden ATF3 ja p53 signalointireitteihin. Näin ollen, ATF3 indusoidaan alavirtaan p53, kun DNA: n vaurioita ja efektorikompo- p53-välitteisen solukuoleman [6], [23] – [25]. Lisäksi, ATF3 tehostaa p53 suoraan sitoutumisen ja estämällä sen ubiquitilation, mikä tarkoittaa, että ATF3 voi moduloivat p53 [26], [27]. Lisäksi ATF3 näyttää antavan negatiivista palautetta p53-reitin säätelyssä alaspäin

TP53

geenin ilmentymistä [28], pääpiirteittäin samanlainen palautetta säätely inflammatoristen sytokiinien geenien ATF3 [17]. Vahvistavia tällaista negatiivista palautetta malli, tuore tutkimus on osoittanut, että ATF3 indusoidaan Siklosporiini, immuunivasteen vaimennin, ja edistää ihosyövän by alaspäin säätäminen

TP53

[29]. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että ATF3 vuorovaikutuksessa p53-reitin sekä alavirtavaikuttajainhibiittorit p53-välitteisen solukuoleman ja positiivisena ja negatiivisena säätelijänä p53 signaloinnin.

muuttaminen vuorovaikutuksessa ATF3 ja transkriptiotekijöitä kuten kuten p53 eri solutyypistä ja /tai ympäristöolosuhteet voivat osittain selittää erilliset vaikutukset ATF3 solujen kohtaloon (eli proapoptoottisten tai kasvua edistävät varten transformoimattomia soluja tai pahanlaatuisiksi transformoituneiden solujen, vastaavasti) [21]. Edellinen työ meidän laboratorio on myös kuvattu pleiotrooppisten toimintoja ATF3 erilaisissa stressiolosuhteissa [18], [19], [25], [28], [30]. Täällä suoritimme järjestelmiä analyysin ATF3 tavoitteiden ja tunnistettu tuhansia ATF3 sitoutumiskohtien genomissa. Osoitamme, että ATF3 muodostaa laajasti päällekkäin geeniregulatiivista verkon muiden stressi-indusoituvan transkriptiotekijöiden ja säätelee solusyklin, solukuoleman, tarttuvuus, ja useat signalointireittejä lukien p53. Erityisesti ATF3 sitoutuu 40% tunnetuista tavoitteet p53 ja säätelee apoptoottisen solukuoleman kautta yhteistyössä aktivointi osajoukon proapoptoottisten geenien korostaa vastaus samalla tukahduttaa samat tavoitteet syöpäsoluissa konstitutiivisesti ilmentävien ATF3. Vaihtamisesta välisiä pro-selviytymisen ja proapoptoottisiin ATF3 toimintoja käsitellään.

Tulokset

Systems analyysi jakautuu tuhansia ATF3 tavoitteita ihmisen genomin

tunnistaa genomista tavoitteet ATF3, kromatiinin immunosaostusanalyysille suoritettiin käyttäen HCT116 ihmisen koolonisyöpäsolulinja kannustanut MMS ja LNCaP eturauhassyöpäsolulinja joka ekspressoi konstitutiivisesti ATF3. Kuten raportoitu aiemmin [24], MMS hoito HCT116-solujen aiheuttamaa ohimenevää ilmentymistä ATF3 huipussaan 6 tuntia stimulaation jälkeen (Kuva. 1A), kun taas kohonnut ATF3 proteiinien havaittiin 3 tunnin kuluttua ja saavutti huipputason 12 tunnin kohdalla stimulaation (Fig. 1 B). Genominen DNA valmistettiin joko HCT116-solut käsiteltiin MMS 6 tuntia tai käsittelemätöntä LNCaP-soluja, immunosaostettiin anti-ATF3 vasta-aineita, ja hybridisoitiin NimbleGen n ihmisen RefSeq HG18 promoottorin laatoitus taulukot. Myöhemmin huippu havaitseminen suoritettiin Mallipohjaiset analyysi 2-väriä Array (MA2C) paketti [31], joka paljasti odottamattoman suuri määrä ATF3 tavoitteita cut-off 0,2% FDR (Fig. S1A ja S1B) . Havaitsimme 5984 ja 1423 tavoitteet ATF3 MMS-käsiteltyjen HCT116-solut ja LNCaP vastaavasti 1269 (eli 89%) oli murtunut kahden mallin välillä. (Fig. 1 C). Emme havainneet mitään tavoitteita Y-kromosomin HCT116 johdonmukainen sen naisen alkuperää. Olemme myös onnistuneesti tunnistettu kolmetoista ATF3 tavoitteita, joka oli aikaisemmin osoitettu säänneltävä ATF3 erilaisissa solutyypeissä.

(A) RT-PCR-analyysi ATF3 vuonna HCT116-soluissa käsiteltiin 50 ng /ml MMS. (B) Western blot-analyysi ATF3 proteiinien MMS-käsiteltyjen HCT116-soluissa. (C) Yhteiset ja ainutlaatuinen tavoitteet ATF3 vuonna HCT116-soluissa ja LNCaP.

Motiivit stressiin liittyvien transkriptiotekijöiden ovat yliedustettuina ATF3 tavoitteet

ATF3 voitaisiin palvelukseen tavoitteensa joko suoraan sitoutumalla konsensus tunnistussekvenssiin TGACGTCA tai vaihtoehtoisesti vuorovaikutuksessa muiden transkriptiotekijöiden mukaan lukien suuren määrän b-Zip proteiinit [14], [32]. Arvioida, ATF /CRE motiivi tai muu transkriptiotekijä motiivien rikastetaan joukossa mahdollisten ATF3 tavoitteiden määrä promoottorit ATF3 tavoitteet sisältävät vähintään yksi osuma tietyn motiivi Transfac tietokannassa analysoitiin P-Match algoritmi (Fig. S2). Taulukossa 1 on yhteenveto rikastuminen tietyn motiivi edustama useissa promoottorien ATF3 tavoitteet sisältävä motiivi vähennetty useissa promoottorien taustalla geeniperimä sisältää samaa motiivi. Kuten odotettua, ATF /CRE sitoutumiskohdat olivat rikastettu motiiveja ATF3 tavoitteita (

p

-arvo varten HCT116-erityisiä tavoitteita: 3.76 × 10

-40-+4,34 × 10

-22,

p

-arvo yhteisiä tavoitteita HCT116 ja LNCaP: 0-4,20 x 10

-6). Lisäksi fyysinen etäisyys ennustetun ATF /CRE sekvenssit motiivin scan ja ATF3 huiput siru analyysi oli alueella muutama sata emäsparia (eli lähelle päätöslauselman sirun analyysi) useimpien ATF3 tavoitteiden (kuvio . 2). Sitä vastoin ei ollut tällaista yhdistyksen välillä etuyhteydettömien BRCA1 ja GATA1 motiiveja ja ATF3 huiput (Fig. 2). Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että suurin osa ATF3 huiput sirun analyysi selittyy suoraan sitoutumisesta ATF3 että ATF /CRE motiiveja.

Distribution fyysisen etäisyyden ATF /CRE, BRCA1 ja GATA1 motiivia ATF3 tauluja ATF3 huiput tunnistetaan Chip analyysi. ATF3 piikit vastaavat pitkälti ATF /CRE motiiveja, mutta eivät osoita yhdistys toisiinsa liittymättömiä BRCA1 ja GATA1 motiiveja.

Kiehtovaa, motiivi skannaus osoitti myös, että sitoutumiskohtien muiden stressiin indusoituvan transkription tekijöitä olivat korkeasti yliedustettuina ATF3 tavoitteita vastauksena DNA vaurioita (taulukko 1). Näihin sisältyy merkittävä säätelijöitä ER stressin (DDIT3, NF-E1), hypoksia (HIF-1A), UV stressi (USF2, RFX1), oksidatiivisen stressin (c-Ets), ja DNA-vaurioita (NF-Y, E2F, EGR- 1, FOXJ2, SP1). Huomattavaa on, että jäsenet b-Zip perhe (AP-1, DDIT3, ja USF2) on potentiaalia heterodimerisoitua ATF3 [33] ja SP1 on raportoitu fyysisesti vuorovaikutuksessa ATF3 [34]. On siis mahdollista, että ATF3 rekrytoimista osajoukko tavoitteensa välillisesti yhdessä muiden stressitekijöiden indusoitavissa transkriptiotekijöiden.

ATF3 säätelee erillisiä biologisia prosesseja stressin vasteen ja syövän

Todettuaan mahdollisia kohteita ATF3 genomin vieressä pyrittiin tunnistamaan ne geenit, jotka ilmentymistä säädellään ATF3. Tätä varten me arvioinut ATF3 pudotus siRNA (Fig. 3A) on geeniekspressiomalleja 0, 6, 12, ja 24 tuntia stimulaation jälkeen MMS käyttämällä Agilent kaikkiaan Human Genome Microarray. Sen jälkeen normalisointi taulukoihin käyttäen joukko talon pitäminen geenien (kuvio. S3A), kaksi kolmasosaa geenien (eli 28872 antureista ulos 43925) todettiin ilmaistava yli taustan tasoilla HCT116-soluissa (kuvio. S3B). Sitä vastoin 90% ATF3 tavoitteet ilmaistiin tausta-arvoja suurempi, mikä viittaa siihen, että ATF3 edullisesti on yhteydessä aktiivisesti puhtaaksi geenejä. Maailmanlaajuisesti, vertailu signaalit (log

2-suhde) välillä ohjaus ja knockdown solut paljastivat rajallinen vaikutus ATF3 alas-asetuksen transcriptome (Fig. S3B ja S3C).

(A) HCT116 -solut transfektoitiin joko siRNA varten ATF3 (siATF3) tai salattu siRNA (siControl) ja käsiteltiin MMS 0, 3, ja 6 tuntia. Määrä ATF3 proteiinien analysoitiin Western blot, jossa β-aktiini latauskontrollina. MMS indusoi ATF3 3 ja 6 tuntia stimulaation jälkeen, mikä on merkittävästi estänyt siATF3. (B) Heat kartta edustus geeniekspressiotasot 0, 6, 12, ja 24 tunnin kuluttua MMS stimulaatio tunnettujen tavoitteita ATF3 (ylempi kuva) tai transkriptiotekijöitä, jotka sitovat motiivit ovat yliedustettuina ATF3 tavoitteita (alempi kuva). Signaalit ovat normalisoitu niitä vastaan ​​hetkellä 0 siControl ja suhteellisia tasoja tai suhde siATF3 /siControl ovat värikoodattuja 2

-2,5-+2

2.5.

tarkempi analyysi sirun -identified tavoitteet ATF3 osoitti, että ilmentyminen 6-30% geenien vaikutti ATF3 pudotus alle 0,8-kertainen tai yli 1,2-kertainen eri ajankohtina sen jälkeen, kun MMS-stimulaatiota. Tunnistaa biologisia prosesseja säätelevät ATF3, polku kartoitus tehtiin käyttämällä DAVID [35] varten osajoukon ATF3 tavoitteiden joko alas- tai ylöspäin-säätelee ATF3 taintumisen (muokattu Fisherin testiä

p

-arvo 0,1). Jotka esitetään taulukossa 2, stressin aiheuttama ATF3 liittyi erilaisiin solun prosesseihin kuten metaboliareitit (sokereita, aminohappoja, lipidejä), anabolisia ja catabolic prosesseja (steroidi ja foolihapon biosynteesin, ubiquitilation, ureakiertoon), energiantuotannossa (TCA cycle , oksidatiivinen fosforylaatio), solusyklin, apoptoosin, tarttuvuus, solun tukirangan ja signalointireitteihin (ErbB-, p53, insuliini, Wnt, VEGF).

Seuraavaksi tunnistaa mahdolliset kohteet ATF3 syöpään liittyvän ATF3 teimme ATF3 knockdown ja ilmaisun profilointi käyttäen LNCaP-soluja (kuvio. S4). Pathway kartoitus analyysi geenin osajoukkoja joko alassäädetty ( 0,8-kertainen) tai säädelty ( 1,2-kertaisesti) knockdovvn ATF3 on koottu taulukkoon 3. konstitutiivisesti ATF3 LNCaP solut näyttivät olevan osallisena biologisessa prosessit melko erilaiset kuin stressistä aiheutuvat lukien soluadheesion, diabetes, ja signalointi (ErbB-, p53, Wnt, kalsium) juurikaan yhdessä aineenvaihduntaan. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että metaboliareitit, solusyklin, apoptoosin, ja insuliinin ja VEGF signalointi ovat ainutlaatuisia tavoitteita stressin aiheuttama ATF3, kun taas diabeteksen ja kalsiumin signalointia, mutta ei solusyklin ja apoptoosin, ovat ainutlaatuisia tavoitteita ATF3 ilmaistuna syöpäsoluja. Välinen mahdollinen yhteys ATF3 ja diabetes polku kuten todettu Tutkimuksessamme on yhdenmukainen tuoreessa tutkimuksessa osoittaa, että ATF3 aktivoitu lihavilla rasvasolujen myötävaikuttaa insuliiniresistenssin kautta alas-säätely adiponektiini ja glukoositransportteria GLUT4 [36].

DNA-vaurion aiheuttama ATF3 aktivoi osajoukko pro-apoptoottisen geenit p53-reitin

tunnistaminen p53-reitin mahdollisena kohteena ATF3 sai meidät analysoimaan edelleen sääntelyn p53 kohde- geenien ATF3 . Ensin analysoidaan kuinka moni aikaisemmin tunnettuja p53 tavoitteet [6] ovat myös tavoitteita ATF3 meidän ChIP määrityksessä. Huomasimme, että stressin aiheuttama ATF3 rekrytoitiin peräti 40% (eli 97/244) p53 tavoitteet, mikä ensimmäistä kertaa, että suuri osa p53 tavoitteet voivat olla kopioinnin suhteen yhteistyötä säädellään ATF3. Seuraavaksi arvioinut ATF3 knockdown ekspressioon yhteisten tavoitteiden ATF3 ja p53 eri ajankohtina stimulaation jälkeen HCT116 solujen MMS. Kuten havainnollistettu lämpökartalla kuvassa. 4A (suhde signaalien siControl ja siATF3), useimmat niistä ovat hieman alas-säädellä ATF3 Knockdown lukien proapoptoottisten geenejä, kuten BBC3 /PUMA, TNFRSF10A /DR4 ja TNFRSF10B /DR5.

(A) lämpö kartta edustus geeniekspressiotasot 0, 6, 12, ja 24 tunnin kuluttua MMS stimulaation yhteisiä tavoitteita ATF3 ja p53. Signaalit ovat normalisoitu niitä vastaan ​​hetkellä 0 siControl ja suhteellisia tasoja tai suhde siATF3 /siControl ovat värikoodattuja 2

-2,5-+2

2.5. Geenit ovat ryhmittyneet mukaan ekspressiokuvioiden jälkeen MMS stimulaation: a, voimakkaasti aktivoitunut; b, voimakkaasti tukahdutettu, c, heikosti aktivoitu; d, sekoitettu; e, heikosti tukahdutettu. Useimmat geenit ovat heikosti alas-säädellä ATF3 Knockdown, kun DNMT1 on poikkeus, joka on ajan säädellään ATF3 knockdown. (B) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi ATF3 ja proapoptoottisten tavoitteet p53. Ekspressiotasot siATF3-transfektoiduissa soluissa (hajauttamat palkit) on merkitty suhteessa kuin kontrolli (avoimet pylväät). (C) Faasikontrasti- mikroskooppikuva HCT116-solujen käsittelyn jälkeen 50 ng /ml MMS 12 tuntia, kun läsnä on siControl tai siATF3. (D) määrä eläviä HCT116-solujen hoidon jälkeen 50 ng /ml MMS 0, 8, 12, ja 24 tuntia, kun läsnä on siControl (avoimet ympyrät) tai siATF3 (umpinaiset ympyrät). (E) kaspaasi 3 mitattuna sen lohkaistun tuotteita. HCT116-solut transfektoitiin siControl tai siATF3 ja käsiteltiin 50 ng /ml MMS 0, 3, 6, ja 12 tuntia. Koko solu-uutteita alistettiin Western blot-analyysi käyttäen vasta-aineita vastaan ​​ATF3, β-aktiini, Caspase 3, ja pilkottiin kaspaasi 3 Arrowhead osoittaa katkaistun kaspaasi 3 ennustettu molekyylipaino.

edelleen arvioimiseksi funktio ATF3 p53 kohdegeenin ilmentymistä, me suorittaa kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi pro-apoptoottisten geenien MMS-stimuloiduissa soluissa pre-transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai siATF3. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, ATF3 knockdown aiheutti vähensi induktion TNFRSF10A /DR4, TNFRSF10B /DR5 ja BBC3 /PUMA MMS hoitoa. Seuraavaksi analysoimme vaikutukset ektooppisesti ilmaisi ATF3 p53 kohdegeenien käyttämällä lusiferaasia toimittajille kätkeminen proksimaalinen promoottorien kanssa ATF /CRE motiivi kuten kuvassa. 5A. Kotransfektion HCT116-solujen lusiferaasin toimittajille ja ATF3 ekspressiovektoreita johtanut merkittävään aktivointi TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /PUMA, ja DDIT4 (Fig. 5B), mikä on yhdenmukaista microarray tietoja, jotka osoittavat, että ATF3 pudotus aiheutti heikennetty näiden geenien ilmentymistä (Fig. 4A). Sitä vastoin vimentiinistä-geeni, joka oli tukahdutettu MMS hoitoon (Fig. 4A), ei merkittävästi aktivoi ektooppinen ilmentyminen ATF3 (Fig. 5B).

(A) DR5-lusiferaasireportterilla konstrukti, joka sisälsi DR5 promoottori katkelma -1226 (Pstl) +1 (elokuu kodoni), joka alakloonattiin PicaGene PGV-B2. ATF /CRE motiiveja (ATF) ja p53-motiivi (p53) on merkitty. (B) Dual lusiferaasireportterista määritykset TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /PUMA, DDIT4, ja VIM. HCT116-solut transfektoitiin kukin reportteri ja stimuloitiin 50 ng /ml MMS 12 tuntia. Firefly lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoitui CMV-Renilla lusiferaasiaktiivisuus. (C) Dual lusiferaasianalyysissä käytetään villityyppistä tai ATF3

– /- hiiren alkion fibroblasteja (MEF).

Valaistaan ​​toiminnon ATF3

in vivo

, otimme etu of ATF3-hiirillä äskettäin perustettu laboratoriossamme ([37]). Hiiren alkion fibroblastit transfektoitiin DR5-lusiferaasi toimittajat ja stimuloidaan MMS. Mielenkiintoista on, että menetys ATF3 aiheutti merkittävästi alhaisempia perustason DR5-promoottorin aktiivisuutta, kuten on esitetty kuviossa. 5C, mikä viittaa siihen, että pohjapinta DR5 ilme oli riippuvainen ATF3. Lisäksi MMS aiheuttama aktivaatio DR5 promoottorin vähennettiin noin puoleen ATF3

– /- solut verrattuna villityypin soluihin, mikä tarkoittaa, että DNA-vaurioita aiheuttama aktivointi DR5 oli osittain riippuvainen ATF3. Yhdessä nämä tappiota ja saada-of-function tutkimukset osoittavat, että ATF3 aktivoi valitse tavoitteita p53.

DNA-vaurioita aiheuttama ATF3 herkistää soluja solukuolemaan

arvioimiseksi biologista merkitystä rajat -talk välillä ATF3 ja p53, me seuraavaksi analysoidaan vaikutus ATF3 knockdown solujen elinkelpoisuus stimulaation jälkeen MMS. Kuten on esitetty kuviossa. 4C ja 4D, oli suurempi määrä HCT116-soluja, jotka on transfektoitu siATF3 kuin transfektoitu ohjaus siRNA jälkeen MMS hoidon. Tällainen ero solujen määrä voi heijastaa joko lisääntynyt solujen kasvuun tai vähentynyt solukuolema. Tämän kysymyksen, analysoimme kaspaasi 3, tunnusmerkki apoptoottisen solukuoleman, Western blotilla. Kuten on esitetty kuviossa. 4E, knockdovvn ATF3 aiheuttama väheneminen kaspaasi 3 arvioituna tuotannon katkaistun kaspaasi 3. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​ATF3 aktivaatio pro-apoptoottisten geenien (Fig. 4B, Fig. 5) ja viittaavat vahvasti siihen, että DNA- vaurioita aiheuttama ATF3 edistää stressi-indusoidun solukuoleman co-aktivoimalla osajoukko p53 kohdegeenien.

Cancer liittyvä ATF3 edistää solujen lisääntymistä ja inhiboi apoptoosia

Mielenkiintoista, knockdovvn ATF3 vuonna LNCaP aiheutti kasvu p21 proteiineja (Fig. 6A) samanaikainen vähentäminen solujen kasvun (Fig. 6B). Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien mukaan roolin ATF3 soluproliferaatioon syöpään [20], [22], [38] ja c-Myc aiheuttama solujen kasvua [19]. Lisäksi nykyinen analyysi ATF3-säänneltyjen reittejä LNCaP (taulukko 3B) on ilmoittanut, että peräti 13 geenien p53-reitin voi aktivoida ATF3. Vaikutuksen arvioimiseksi on ATF3 on p53-välitteisen solukuoleman, suoritimme kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi proapoptootti- geenien p53-reitin. Kuten kuviossa. 6C, ATF3 knockdown aiheutti säätely ylöspäin FAS, TNFRSF10B /DR5, BBC3 /PUMA, ja CASP10 sekä CDKN1A /p21, mikä viittaa siihen, että ATF3 säätelee negatiivisesti p53-solukuolema ja tehostaa solujen lisääntymistä estämällä p21 ilmaisua.

(A) Western blot -analyysi ATF3 ja p21 LNCaP-soluissa, jotka on transfektoitu siControl tai siATF3 kanssa β-aktiini latauskontrollina. (B) elävien solujen lukumäärä 0, 3, ja 5 päivää transfektion jälkeen siControl (avoimet ympyrät) tai siATF3 (umpinaiset ympyrät). (C) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi pro-apoptoottisten geenien p53-reitin ja p21 transfektion jälkeen. Ilmentymistasoissa siATF3 (hajauttamat palkit) suhteessa kuin siControl (avoimet pylväät) on osoitettu.

Keskustelu

Osoitimme, että DNA-vaurioita aiheuttama ATF3 sitoutuu lähes kolmanneksella ihmisen RefSeq promoottorit. Tunnistaminen niin suuri määrä tavoitteita ei ole poikkeuksellinen, koska E2F1 ja MYC tiedetään palvelukseen 20000 ja 17000 tavoitteita vastaavasti ihmisen genomissa [39], ja hiiva INO4 on raportoitu sitoutuvan 1078 tavoitteet upon MMS stimulaation [5]. Useita kohteita syöpään liittyvien ATF3 oli pienempi kuin DNA-vaurion aiheuttaman ATF3 heijastaen ehkä sekä korkeampi ja suurempi kertainen induktio ATF3 MMS vastauksena kuin saavutetaan knockdovvn ATF3 LNCaP-soluissa (tietoja ei ole esitetty) . Kuitenkin määrityksessä oli huomattavan yhdenmukainen vuodesta 89% tavoitteista LNCaP-soluja löydettiin myös MMS-käsiteltyjen HCT116-soluissa, ja yksitoista 41 aiemmin tunnettujen ATF3 tavoitteita kuten EGR1 [40] ja HIF-2A [30] voitiin tunnistaa. Tutkimus ATF3 ChIP-seuraavissa data ENCODE tietokannan (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeHaibTfbs/) osoittaa myös, että merkittävä osuus ATF3 tavoitteita, eli 37,6% (768/2041 ) K562 (leukemia), 71,9% (742/1032) HepG2 (maksa), ja 76,2% (809/1062) H1-kantasoluja (alkion kantasoluja), jaetaan 2711 tavoitteiden GM12878 (lymfoblastoidisissa), joka voidaan pitää konservatiivinen luvut muunnelmia ChIP-seq tietojen laadun (joka vaikuttaa herkkyys huipun tunnistus) ja ero kudostyypeissä.

on huomattava, että siteet sivustoja useiden muiden transkriptiotekijöiden indusoiman DNA: n vaurioiden (NF Y, E2F, YY1 /NF-E1, FOXJ2, SP1), UV-säteilytys (USF2, RFX1) ja oksidatiivisen stressin (c-Ets) ylittyivät huomattavasti edustettuina ATF3 tavoitteet (taulukko 1), joka osoittaa laaja näistä stressivaste tekijät (Kuva. S6). Mahdollinen selitys tälle sattuma stressiin liittyvien transkriptiotekijöiden että ATF3 saattavat synergoida näiden transkriptiotekijöiden moduloimaan kohdegeenin ilmentymisen. Vaihtoehtoisesti ATF3 tavoitteet tunnistaa ChIP analyysi saattaa sisältää välillistä sitoutumisen ATF3 vuorovaikutuksessa muiden stressin aiheuttama transkriptiotekijöiden. Todellakin, ATF3 kuuluu suuri perhe bZip tyypin transkriptiotekijöiden, mukaan lukien mainittuja olevassa tutkimuksessa (eli AP-1, DDIT3, ja USF2), jotka muodostavat homo- ja hetero-dimeerit, joilla on erilaiset affiniteetit on variantit konsensus ATF /CRE motiivi [32]. Lisäksi, Sp1 nykyisiin analyysitulokset ovat fyysisesti vuorovaikutuksessa ATF3 [33], [34]. Lisätutkimuksia tarvitaan määrittämään rooli stressiin indusoituvan transkription tekijöitä, erityisesti sellaisia, joita ei ole tiedetään olevan vuorovaikutuksessa ATF3 ennen, sitoutumiseen ATF3 kohdistaa geenejä.

Nykyinen tutkimus osoittaa, että vaikutus ja ATF3 kunkin kohdegeenin ilmentymistä ei ole kaikki-tai-ei mitään vaikutuksia. Pikemminkin, vaikutukset ATF3 monia, mutta valittuja geenejä, kuten ne, jotka osallistuvat solusyklin ja solu- kuolema, yhdessä oli biologisesti merkittävä tulos, koska solukuolema ATF3 stressin vastetta (kuvio. 4C-E) tai solujen kasvua syöpään liittyvän ATF3 (Fig. 6B). Lisäksi meidän knockdown tutkimus osoittaa, että vain 6-30%: n mahdollisia kohteita ATF3 olivat suoraan säätelee ATF3 linjassa aiempien käy ilmi, että vain 25% p53 tavoitteista [6], 26%: STAT1 tavoitteista [41], ja 11% hiivan transkriptiotekijän tavoitteet vaikuttaa geenin pudotus [5]. Useita mekanismeja on ehdotettu p53 selittää, miksi vain osa mahdollisia kohteita vastata manipulointia p53 kuten epigeneettiset valtioiden kohdegeenien, promoottori käyttöaste RNA polymeraasien, ja rekrytointi välttämättömiä kofaktoreita [42]. Samanlaisia ​​menettelyjä voisi olla vastuussa geeni-selektiivisiä vaikutuksia ATF3. Vaihtoehtoisesti monenlaisen ATF3 komplekseja, kuten hetero-dimeerit eri bZip proteiineja, saattaa taustalla ero vaikutuksia ATF3 kohde geenejä.

Viimeisten vuosien, yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että ATF3 on pleiotrooppinen toimintoja riippuen solujen yhteydessä. Tärkeää on, tutkimuksemme osoitti, että stressin aiheuttama ATF3 ja syöpään liittyvän ATF3 on vastakkaiset vaikutukset p53 ja Wnt reittejä: p53-reitin aktivoidaan stressin vastetta (kuvio. S5) mukainen funktio ATF3 p53-välitteisen solukuoleman [6 ], [23] – [25], kun taas Wnt -systeemi aktivoituu syövässä kuten aiemmin raportoitu tutkimus ATF3 siirtogeenisiä hiiriä kehittää nisäkasvaimia [43]. Voisi väittää, että erilainen geneettinen tausta ja /tai kudosten tyyppejä välillä HCT116-solut ja LNCaP voinut vaikuttaa toimintaa ATF3. Todellakin, ATF3 näyttää pelata erilliset tehtävät eri kudoksissa: ATF3 toimii tuumorisuppressorina kolorektaalisyövässä [24], [44], kun se on onkogeeninen eturauhassyövässä [20], rintasyöpä [21], ihosyöpä [29] ja Hodgkinin lymfooma [22]. Meidän havainnot HCT116-soluissa (paksusuoli) ja LNCaP (eturauhanen) ovat yhdenmukaisia ​​niin hypoteesin.

Muutokset sääntely toiminta ATF3 korostuu meidän havainto, että ATF3 vaaditaan sekä aktivoinnin ja tukahduttamisesta pro -apoptotic geenejä kuten BBC3 /PUMA ja TNFRSF10B /DR5 stressivaste ja syöpä. Huomattavaa on, että vastakkaiset vaikutukset ATF3 on sykliini D1 ilmentyminen on dokumentoitu: ATF3 sitoutuu AP-1 motiivi ja aktivoi sykliini D1 mitogeenistimuloidut hiiren hepatoomasolujen [45], kun taas se sitoutuu ATF /CRE päällä ja tukahduttaa sykliini D1 hiiren fibroblasteissa stimuloi seerumin [46]. Kirjallisuudessa on runsaasti ennakkotapauksia transkription tekijöitä, joilla on kontekstisidonnaisia ​​vastakkaiset toimintoja syövän kehitykseen ([47] ja viite siihen). Klf4, esimerkiksi aktivoi p21 ja tukahduttaa p53 jotka molemmat vaimennetaan aktivoitu Ras johtaa kasvun pysähtymisen puuttuessa Ras tai pahanlaatuinen ilmiasu läsnä ollessa Ras. Vaihtoehtoisesti tuore tutkimus on osoittanut, että Kruppel kaltainen tekijä 5 (KLF5) tarvitaan MYC transkription lisääntyvissä epiteelisolujen mutta on välttämätöntä TGFb välittämää tukahduttamisesta MYC [48]. Differential sitoutuminen KLF5 ja TGFp estävä osa läsnä tai poissa ollessa TGFp on ehdotettu mekanismi päinvastaiset vaikutukset. Lisätutkimuksia tarvitaan sen määrittämiseksi yhdistelmiä ATF3 ja muiden transkriptiotekijöiden kytkeä toiminnon ATF3 erityisiä tavoitteita.

Resistance syöpäsolujen eri stressiolosuhteissa edelleen tärkeä kysymys. Kuitenkin tietomme roolista solustressiä vasteen koneiden syövän kestävyys hypoksia [49] tai kemoterapia-aineiden [50] on edelleen rajallista. Meidän toteamisesta ATF3 on vastakkaiset vaikutukset proapoptoottisten geenejä viittaa siihen, että on huolehdittava joko parantaa tai estää toimintaa ATF3 uudella lähestymistapa syövän hoidossa. Edelleen ymmärtäminen kytkentämekanismi ATF3 toimivat transkription aktivaattori tai repressorin saattaa auttaa kehittämään strategioita selektiivisesti manipuloida osajoukko ATF3 kohdegeenien auttaa hoitoon kemoterapia-resistenttien syöpien.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki eläin työ hyväksyttiin ja toteutettiin ohjeiden mukaisesti valiokuntien eläinkokeet ja yhdistelmä-DNA-kokeet Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen University (lisenssi nro 2010-205).

Plasmidit

Luciferase reportterit DR5 [51], GADD45A [52], PUMA [53], ja vimentiinistä [54] oli ystävällinen lahja Dr. Toshiyuki Sakai (Kioto Prefectural University, Japani), Dr. Kazuhiro Daino (National Institute of säteilytieteet, Japani), Dr. Jian Yu (Johns Hopkins Oncology Center, USA), ja tohtori Susan Rittling (Forsyth Institute, USA), tässä järjestyksessä. DR5 lusiferaasireportterista uusittiin subklonaamalla DR promoottori katkelma PstI (-1226) AUG kodoni PicaGene PGV-B2 vektori (Toyo B-Net Co., Ltd, Japani). PCI-ATF3 ekspressiovektori kuvattu aiemmin [55].

Soluviljely

Ihmisen kolorektaalisen HCT116-solut ja eturauhasen syöpä LNCaP-solut saatiin American Type Culture Collection (USA). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia ennen stimulaatiota MMS, kasvatusalustaa HCT116-soluja korvattiin alustalla, joka sisälsi 0,25% FCS. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, HCT116-solut transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai siATF3 käyttämällä X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent. ON-TARGETplus siRNA SMART altaan Dharmacon käytettiin knockdovvn ATF3.