Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

tetraspanin CD151 toimii edistäjänä metastaasin ja invaasion useissa kasvaimissa. Kuitenkin rooli CD151 ihmisen mahasyövän (HGC) jää epäselväksi.

Methods

Kaksikymmentä HGC yksilöitä ja Hyväksytty nontumor näytteitä, ihmisen mahalaukun epiteelisolujen (HGEC), ja neljä mahalaukun syöpäsolun linjat käytettiin analysoitaessa CD151 ilme. Lyhyt hiusneula-RNA-välitteinen downregulation CD151 ilmentyminen HGC soluissa suoritettiin tutkia roolia CD151 in leviämisen ja metastaasin /invaasion HGC solujen

in vivo

ja

in vitro

. Suhdetta CD151 kanssa integriinisalpaajien α3 in HGC soluissa tutkittiin hiljentämällä integriinin α3 seurasi samanaikainen immunosaostus ja immunofluoresenssivärjäyksen. Lopuksi ennustetekijöiden arvo CD151 ja integriinin α3 arvioitiin immunohistokemia kudossiruina 76 HGC potilaista.

Tulokset

CD151 ilmaistiin korkeammalla tasolla HGC kudoksissa ja HGC soluissa kuin nontumor kudosten ja HGEC soluja. Down-regulation CD151 by vshRNA-CD151 heikentynyt metastaasin ja invaasion HGC-27-soluissa, mutta ei vaikuttanut solujen lisääntymistä. CD151 muodostivat kompleksin integriinin α3 in HGC soluissa. CD151-cDNA transfektio pelasti metastaattista potentiaalia ja invaasiokyvyssä HGC-27-vshCD151 soluja, mutta eivät HGC-27-vshintegrin α3 solujen

in vitro

. Kliinisesti CD151 yliekspressio korreloi merkitsevästi korkea TNM, syvyys invaasion ja positiivinen imusolmuke osallistuminen (

p

0,05), ja korkea-integriinin α3 liittyi suuri kasvain koko, korkea TNM vaiheessa syvyys hyökkäyksen ja imusolmuke osallistuminen (

p

0,05). Tärkeää on, että leikkauksen jälkeinen 5 vuoden eloonjäämisaste potilaalla on CD151

alhainen ja /tai integriinin α3

alhainen oli korkeampi kuin potilailla, joiden CD151

korkea ja /tai integriinin α3

korkea.

Johtopäätös

CD151 on positiivisessa yhteydessä invasiivisuus on HGC, ja CD151 tai yhdistelmä CD151 ja integriini α3 on uusi merkki ennustamiseksi ennustetta HGC potilaiden ja saattaa olla mahdollisia terapeuttisia kohteita.

Citation: Yang YM, Zhang ZW, Liu QM, Sun YF, Yu JR, Xu WX (2013) yli-ilmentyminen CD151 ennustaa Prognoosi potilailla, joilla resekoituun syöpään. PLoS ONE 8 (3): e58990. doi: 10,1371 /journal.pone.0058990

Editor: Yves St-Pierre, INRS, Kanada

vastaanotettu: 07 lokakuu 2012; Hyväksytty: 08 helmikuu 2013; Julkaistu: 22 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat akateemikko työasema Fund Shaoxing Second kansan sairaalassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ihmisen mahalaukun syöpä (HGC) on yleisin syy syövän liittyvän kuoleman [1]. Ilmaantuvuus HGC arvioitiin olevan 934000 tapausta vuodessa 56% uusista tapauksista esiintyy Itä-Aasiassa, mukaan lukien 41% Kiinassa ja Japanissa 11% [2]. Vaikka maailmanlaajuinen esiintyvyys GC on vähentynyt viime vuosina, sen kuolleisuus Kiinassa on korkein kaikista kasvaimista ja edustaa 25% GC kuolleisuus kaikkialla maailmassa [3]. Huolimatta viime aikoina saavutetut edistysaskeleet kemoterapiassa ja kirurgisia menetelmiä, 5 vuoden yleinen (OS) korko Kiinassa on alhainen 40%. Useimmat HGC: t diagnosoidaan vaiheen III tai IV, ja määrä imusolmuke etäpesäke GC on korkea (50-75%) [4]. Patogeneesin HGC on monitekijäinen kuten geneettinen alttius ja ympäristötekijät. Useita geneettisiä muutoksia liittyy taipumusta HGC, mukaan lukien ne, joihin liittyy kasvaimen synnyssä, onkogeenit, soluadheesiomolekyylit, kasvutekijöitä, ja geneettinen epävakaus [5]. Näin ollen saavutetaan parempi käsitys molekyylitason mekanismeja HGC ja tunnistaa arvokkaita diagnostisina markkereina ja uusia hoitostrategioita on suuri kliininen merkitys.

Tetraspanins ovat solupinnan proteiineja, jotka ylittävät kalvon neljä kertaa, ja ovat löytynyt useissa solutyypeissä useilla organismeihin. Ne näyttää lukuisia ominaisuuksia ilmaisevan niiden fysiologisen merkitys solun tarttumisen, liikkuvuuteen, aktivointi ja leviämisen sekä niiden vaikutus patologisten tilojen kuten etäpesäkkeiden ja patologinen angiogeneesi [6], [7], [8]. CD151 on pintaglykoproteiinille kuuluvat tetraspanin superperheen esiteltiin ensimmäisen kerran edistää etäpesäkkeiden tutkimuksessa, jossa tuntematon vasta-aine spesifisesti inhiboi etäpesäkkeiden muodostumisen ihmisessä epidermoidikarsinooman

in vivo

[

9

]. Vasta-aine tunnustettu CD151 ja estivät solujen vaeltaminen vaikuttamatta tarttumisen lisääntymistä. Sirna (siRNA) välittämää downregulation CD151 ilmaisun ensisijainen melanosyyteissä johti liikkuvuuden menetystä, kun se oli vain vähän vaikutusta vakaan tilan tasoja integriinien. Lisäksi nämä muutokset voitaisiin kääntää silloin, kun CD151 uudelleen ilmaistaan ​​[10]. Yliekspressio CD151 oli osoitettu aktivoivan integriiniä ja kasvutekijän reseptorin riippuvainen signalointireittejä, mikä johti lisääntyneeseen motiliteettia ja invasiivisuus syöpäsolujen [11]. Tämä prosessi oli myös ehdotettu vaikuttavan aktivoitumista teille, joita välittävät pienet GTPaasit, mikä lisää GTP: n sitoutumista Cdc42 ja Rac, järjestäjät solun tukirangan. Adheesio-riippuvainen aktivaatio Ras, ERK /MAPK1 /2 ja proteiinikinaasi B (PKB) /Akt on osoitettu moduloivan CD151 [7], [12]. Laaja toimintojen CD151, ja erityisesti sen osallistumista invasiivisuus ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen, viittaavat siihen, että ymmärtää paremmin sen ilmaisun ja roolia HGC voivat olla tärkeitä.

Tässä tutkimuksessa olemme tutki ilmaus CD151 ihmisen mahalaukun epiteelisolujen (HGEC), HGC solulinjat, HGC näytteitä, ja viereisten nontumorous kudoksiin. Lisäksi selvitimme vaikutus siRNA hiljentäminen CD151 proliferaatioon, invasiivisuus ja metastaattisen kyvyn HGC-27 soluihin ja tutkittiin suhdetta CD151 ja integriini α3. Lopuksi, ilmaus CD151 ja integriini α3 tutkittiin immunohistokemiallisesti kudoksessa microarray koostuu 76 tapausta HGC, ja prognostisia rooli CD151 ja /tai integriinin α3 in HGC tutkittiin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines

HGEC ja HGC solulinjoja, mukaan lukien HGC-27, AGS, MKN28, ja MGC803, saatiin American Type Culture Collection ja pidetään laboratoriossamme. Kaikkia solulinjoja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Invitrogen), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone), 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2.

Potilaat ja seuranta

Kaksikymmentä tuoretta kasvainnäytteestä alueilta lähellä kasvain marginaalin ja sovitettu ei-tuumorikudoksista (yli 3 cm: n päässä kasvain) on sokeasti saatu peräkkäisen potilaalla on HGC joille tehtiin parantava resektiota helmi 2009 ja marraskuun 2010 Shaoxing Second kansan sairaalassa (Shaoxing, Kiina). Toinen 76 potilaalla on mahasyöpä, joille tehtiin R0 resektiota laajennetulla imusolmukedissektiossa (D2) syyskuusta 2005 ja syyskuun 2008 Shaoxing Second Kansan sairaalassa otettiin tässä tutkimuksessa. Arviointi resektoitiin yksilöitä suoritettiin ohjeiden mukaisesti ja Japani mahasyövän Association (1998). Jokainen standardi resektio myötä poistettiin ryhmän 1 ja 2 imusolmukkeiden (alue 36-60, keskiarvo 47,6). Stage luokittelu suoritettiin TNM luokituksen HGC (UICC). Näytteet valittiin sen perusteella, sopivien formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset ja täydellinen ennusteeseen viittaavia ja seuranta tietoja potilaista. Ominaisuudet oppiaineista tiivistetysti taulukossa 1. Tämä tutkimus hyväksyi Shaoxing Second Kansan sairaalan tutkimus- eettinen komitea ja kirjallinen suostumus saatiin kaikille yksilöille. Kukaan potilaista ei saanut kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen tai jälkeen leikkauksen osana adjuvanttia ohjelman. Seuranta tiedonkeruu lopetettiin syyskuuta 2012. Seuranta-ajan mediaani oli 43,0 kuukautta (vaihteluväli 6-78 kuukautta). Jatkotoimet koostui väliaikaisen historia, lääkärintarkastus, arviointi kasvainmerkkiaineet (CEA, CA-199), vatsan ultraääni ja rintakehän röntgen 2-3 kuukauden välein tai CT 6 kuukauden välein. Kokonaiselinaika (OS) määriteltiin väli leikkauksen ja kuoleman välillä tai kirurgian ja viimeinen havainto elossa olevien potilaiden. Tiedot sensuroitiin viimeisessä seurannassa eläviä potilaita.

RNA ja käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRI -reagenssia (Sigma) mukaisesti valmistajan protokollaa. RNA käsiteltiin sitten DNaseI (Roche Diagnostics), puhdistettiin RNeasy-pylvästä (Qiagen) ja elektroforesoitiin niiden eheyden määrittämiseksi RNA ennen käyttöä 5′-RACE kokeissa. Komplementaarisen DNA: n (cDNA) syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä sattumanvaraisia ​​heksameerejä (Proligo) ja SuperScript III käänteistranskriptaasia (Invitrogen). RT-PCR suoritettiin paneelin solulinjojen ja kasvainnäytteet. Alukkeita käytettiin PCR olivat seuraavat: CD151, 5′-ACTTCATCCTGCTCCTCATCAT-3 ’ja 5′-TCCGTGTTCAGCTGCTGGTA-3′; integriini α3, 5’-CGAGAGGAAAGAGGAAGTAGGGGGT-3 ’ja 5′-ATGAAGAAGGAGTGAGGGGTGAGCA-3′; Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), 5’-GGCATCCTGGGCTACACTGA-3 ’ja 5′-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’. RT-PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 10 min 94 ° C: ssa, denaturointi 94 ° C: ssa 20 s, pariutuminen 59 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 60 s. Ilmentyminen CD151 ja integriinin α3 suhteessa taloudenhoito geeni GAPDH analysoitiin tiheys analyysin avulla Band Scan v5.0 ohjelmisto. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

immunoblottauksella ja immunofluoresenssimääritystä

Yhteensä solu-uute-proteiinia (30 ug) erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja, ja inkuboitiin vastaavat vasta-aineet. Membraanit kehitettiin tehostetun kemiluminesenssin menetelmällä (Pierce, Rockford, IL, USA). Hiiren anti-ihmisen CD151 (11G5a, 1:200; Serotec, UK) ja anti-integriini α3 monoklonaalisia vasta-aineita (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) käytettiin ekspression havaitsemiseksi CD151 ja integriini α3, vastaavasti . GAPDH (1:5,000; Chemicon, USA) käytettiin sisäisenä kontrollina. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

HGC-27-soluja käytetään havaitsemaan sijainnin CD151 ja integriini α3 kuten aiemmin on kuvattu [13]. Hiiren anti-ihmisen CD151 monoklonaalinen vasta-aine (11G5a, 1:200; Serotec, UK) ja hiiren anti-ihmisen integriini α3 vasta-ainetta (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) käytettiin. Viipaleet analysoitiin fluoresenssimikroskopialla (Leica Imaging Solutions).

transfektio lentivirusvektorien Small Hairpin RNA Against CD151 ja integriini α3

pGMLV /Neo-shRNA-CD151 vektori koottiin mukaan valmistajan ohjeiden (pGMLV, pieni hiusneula-RNA (shRNA) i Vector, Shanghai Genomeditch Co. Ltd). Kolme shRNA-CD151 lentivirusvektoreita (pGMLV-GFP-shRNA -CD151) tuli vaientaa ilmentymistä CD151 in HGC-27-solut (shRNA-CD151-HGC-27). ShRNA kohdistaminen sekvenssit CD151 olivat seuraavat: # 1, 5′-CATGTGGCACCGTTTGCCT-3 ’; # 2, 5’-TACCTGCTGTTTACCTACA-3 ’; # 3, 5’-CATACAGGTGCTCAA TAAA-3 ’. ShRNA kohdentaminen sekvenssi integriinin α3 oli seuraava: 5’CCTCTATATTGGGTACACGAT-3 ’(Shanghai Genomeditech, Shanghai, Kiina). Stabiilisti transfektoidut kloonit karakterisoitiin RT-PCR: llä ja analysoitiin immunoblottauksella ilmentämiseen tasot CD151 ja integriinin α3 proteiineja.

MTT-määritys, Cell Migration, ja Matrigel Invasion Analyysit

Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (2000 per 200 ul-kuoppa) ja inkuboitiin 24, 48 ja 72 h. 20 ui MTT-liuosta lisättiin osoitettuina ajankohtina ja inkuboitiin 4 tuntia. Väliaineen (200 ui DMEM, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia), korvattiin sitten 150 ui DMSO: ta, maljoja ravisteltiin 10 minuutin ajan ja absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin määrittämiseksi elävien solujen lukumäärä jokaisessa kuopassa. Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa.

Cell Migraatio arvioitiin käyttäen haavan paranemista määrityksessä. Soluja kasvatettiin 80-90% konfluenssiin 24-kuoppaisilla levyillä. Haava tehtiin vetämällä muovista pipetin kärjen poikki solun pinnalla. Jäljellä olevat solut pestiin kolme kertaa solujätteen poistamiseksi ja inkuboitiin 37 ° C: ssa seerumia. Ilmoitettuina aikoina, vaeltavien solujen haavan etu- valokuvattiin ja verrattiin. Kolme erillistä koetta suoritettiin.

Cell invasion analyysit suoritettiin käyttäen 24-kuoppaista siirtoaltaat (8 um huokoskoko; Millipore) esipäällystetty matrigeelin (Falcon 354480; BD Biosciences). Yhteensä 1 x 10

5-solut suspendoitiin sitten 500 ul: aan DMEM, joka sisälsi 1% FBS: ää ja lisättiin ylempään kammioon, kun taas 750 ui DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, pantiin alempaan kammioon. 48 tunnin kuluttua inkuboinnin matrigeelin ja soluja jäljellä ylemmässä kammiossa poistettiin vanupuikkoja. Solujen alapinnalle kalvon kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin Giemsa. Solut 5 mikroskooppikentäs- (suurennos, × 200) laskettiin ja valokuvattiin. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

In vivo Metastasis -määritykset

in vivo etäpesäkkeiden määrityksissä, MGC-803-Mock, MGC-803-vshRNACD151 ja MGC-803-vshRNA CD151-cDNA- CD151-soluja istutettiin nude-hiiriin (5 viikkoa vanhoja BALB /c-nu /nu, 5 ryhmää kohti, 1 x 10

6 solua kutakin hiiren) läpi lateraalisen häntälaskimon [14]. Jälkeen 7 viikkoa, hiiret tapettiin. Niiden keuhkot poistettiin ja alistettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H eosiini värjäystä, ja edustava alueet ennalta merkitty vuonna parafiiniblokit, pois nekroottisen ja hemorraginen materiaaleja. Kopiot 1 mm halkaisijaltaan sylinterit kahdesta eri alueilla, kasvain keskustasta ja lähimmästä noncancerous marginaali (nimetty tuumorinsisäinen ja peritumor, vastaavasti, yhteensä neljä lyöntejä) sisällytettiin kussakin tapauksessa yhdessä erilaisia ​​tarkastuksia, joilla varmistetaan toistettavuus ja homogeeninen värjäys diojen (Shanghai Biochip Co Ltd, Shanghai). Näin ollen neljä eri kudosten microarray lohkojen rakennettiin, joista jokainen sisältää 140 sylinterit. Luvuissa 4 pm paksu sijoitettiin objektilaseille päällystetty 3-aminopropyylitrietoksisilaani. Monoklonaalinen hiiren anti-ihmis-CD151 (11G5a, 1:200; Serotec, UK) ja hiiren anti-ihmisen integriini α3 (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA), vasta-aineita käytettiin ekspression havaitsemiseksi CD151 ja integriini α3 . Kuvat otettiin vangiksi Leica QWin Plus v3 ohjelmisto. Intensiteetti positiivista värjäytymistä mitattiin, kuten on kuvattu. Intensiteetti CD151 ja integriinin α3 luokiteltiin kahteen ekspressiotasot mukaan keskimääräinen alue positiivisen värjäytymisen cutoff-arvo seuraavasti: CD151

korkea, 50% tuumorin osassa; ja integriini α3

korkea, 25%: n kasvain osassa; CD151

alhainen, 50%, ja integriinin α3

alhainen, 25% [15].

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 16.0 ohjelmistolla ( SPSS). Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. Immunohistokemiallista markkereita, sulku määritelmässä alaryhmien oli mediaanin voimakkuuden arvon. Χ

2-testi ja Studentin t-testiä käytettiin vertailussa ryhmien välillä. OS on määritelty kuten aiemmin on kuvattu [15]. Prognostic merkittävyys arvioitiin käyttäen Kaplan-Meier eloonjäämisennusteet ja log-rank testejä. Coxin suhteellisten riskien regressiomallia käytettiin analysoimaan itsenäisen ennustavat tekijät. Kaikki testit olivat kaksisuuntaisia ​​ja

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

CD151 yliekspressoituu HGC

CD151 ilmentyminen analysoitiin RT-PCR: lla ja immunoblottaus vuonna HGC kasvain ja Hyväksytty nontumor kudoksiin. CD151 ilmentyi alhaisilla tasoilla nontumor kudoksissa verrattuna HGC kudoksiin. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, B ja C, suhteellinen ilmentyminen CD151 proteiinin HGC näytteissä oli 2,95 ± 0,21 (vaihteluväli 1,13-3,59) verrattuna 1,30 ± 0,09 (vaihteluväli 1,00-1,81) vuonna nontumor näytteissä, ja ero oli tilastollisesti merkitsevä (

p

0,01). Lisäksi CD151 ekspressiotasot olivat huomattavasti matalammat HGEC kuin HGC-27, AGS, MKN28 ja MGC803 solut (p 0,05). Mitään eroja CD151 ekspressiotasoja havaittiin muun HGC solut (Fig. 1 D, E ja F). Immunohistochemstry (IHC) analyysit vahvistivat, että CD151-proteiini ilmentyi korkeammalla tasolla HGC kudoksissa kuin Hyväksytty nontumor kudoksissa (Fig. 1 G).

(A) ilmentyminen CD151 mRNA ja proteiini GC näytteiden ja Hyväksytty nontumorous näytteitä; (B ja C) histogrammia osoitti CD151 mRNA GC näytteiden ja vastaavan nontumorous näytteistä (p 0,05); (D) RT-PCR ja immunoblottausta analysoitiin ilmentymistä CD151 vuonna HGEC ja HGC-27, AGS, MKN28 ja MGC803 solut (p 0,05); (E ja F) Histogrammi osoitti CD151 mRNA ja proteiini HGEC ja HGC-27, AGS, MKN28 ja MGC803 solut (p 0,05).

CD151 edistänyt Invasion ja metastaasin HGC Cells

in vitro ja in vivo

Jotta voidaan tutkia roolia CD151 on HGC-soluissa, muutimme ekspressiota CD151 in HGC-27-solujen RNA-interferenssi ja cDNA-CD151 transfektiolla (Fig. 2A) . Tulokset haavan paranemista testi osoitti viivästynyt haavan sulkemiseen määrä shRNA-CD151-HGC-27 soluja 48 h verrattuna HGC-27-Mock soluja, jotka otettiin talteen cDNA-CD151 transfektiolla (Fig. 2B). Down-regulation CD151 ei ollut merkittävää vaikutusta soluproliferaatioon (

p

0,05, Fig. 2C). Kuitenkin downregulation CD151 ilmaisun heikentynyt invasiivisuus on HGC-27-soluissa (kuviot. 2D, E).

(A) ilmentymistä CD151 in HGC-27 solujen RNA-interferenssi ja cDNA-CD151 transfektio; (B) Alas /tai ylös-säätely CD151 ei ole vaikutusta soluproliferaatioon (

p

0,05); (C) arpeutumisprosessit määritys paljasti, että ilmeinen viivästys haavansulkemiseen määrä HGC-27-vshRNA-CD151 soluja löydettiin 24 ja 48h, verrattuna HGC-27-Mock soluissa, kun se oli elvytysohjelmasta cDNA- CD151 transfektio; (D ja E) matrigeelin invaasio määritykset osoittivat, että alas /tai ylös-säätely CD151 ilmentyminen oli mukana Laskeudu /tai nousta invaasion HGC solujen in vitro; (F ja G) Serial kohdat hiiren keuhkon osoitti etäpesäke kyky syöpäsolujen ilmaista erilaisia ​​CD151 (Mitta-asteikko: 50 um).

edelleen tutkia roolia CD151 tuumorimetastaasissa in vivo, MGC-803-Mock, MGC-803-vshRNACD151 ja MGC-803-vshRNACD151-cDNA-CD151-soluja istutettiin nude-hiirissä siten sivusuunnassa häntälaskimoon. Histologinen analyysi hiirten keuhkoissa vahvisti, että alas-säätely CD151 tukahdutetaan keuhkometastaasitestissä muodostumista. Numerot ja koko keuhkometastaasitestissä kyhmyt olivat merkittävästi vähentynyt MGC-803-vshRNACD151 ryhmässä verrattuna MGC-803-Mock ja MGC-803-vshRNACD151-cDNA-CD151 soluja (kuviot. 2 F, G). Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että CD151 on positiivinen säätelijä mahasyövän etäpesäkkeiden.

CD151 muodostaa kompleksin integriini α3 ja vaiennettu integriini α3 Heikentää HGC Cell Invasion indusoima CD151 Yliekspressio

osallistuminen tetraspanins, että integriini-säätelyyn syövän etäpesäkkeiden on osoitettu, ja α3β1 integriinin on osoitettu edistävän GC ja metastaasit [16]. Siksi tutkimme suhdetta integriini α3 ja CD151 in HGC soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, integriinin α3 ilmentyi korkeammalla tasolla HGC soluissa kuin HGEC soluissa. Samanaikainen immunosaostus kokeet osoittivat, että CD151 muodostettu kompleksin integriinin α3 in HGC-27-solut (kuviot. 3B, C). Lisäksi CD151 ja integriini α3 co-paikallistettu solukalvon HGC-27-soluissa, kuten on esitetty immunofluoresenssilla (Fig. 3d).

(A): n ekspressio integriinin α3 oli paljon suurempi HGEC ja HGC-soluja ; (B ja C) Yhteistyössä IP tunnistettu, että integriini α3 muodostaa kompleksin integriini α3; (D) Kaksoisvärjäys osoitti CD151 ja integrinα3 yhteistyötä lokalisoitu kalvolle on HGC-27-solut; (E) Alas-säätely integriinin α3 vuonna HGC soluissa; (F) matrigeelin invaasio määritykset osoittivat, että alas-säätely integriinin α3 liitteenä oli laskeutuvat invaasion HGC solujen integriini α3 häiriöitä ja integriini α3 vasta esti solujen invaasiota suotu CD151.

tarkastelemaan lähemmin osallistumista CD151 on integriini α3 toiminto, solut altistettiin RNA-interferenssi tai cDNA: transfektio ja analysoitiin Transwell kokeissa vaihdon jälkeen matriisi geeli laminiinin-332 [17]. Tulokset osoittivat, että hiljentäminen integriini α3 merkittävästi esti hyökkäyksen HGC-27-solut, ja CD151 cDNA transfektio pelasti invasiivisia kykyä HGC-27-vshRNACD151, mutta ei että HGC-27-vshRNA integriinin α3 soluja. Lisäksi integriinin α3 vasta esti hyökkäyksen HGC-27-vshRNACD151-cDNA-CD151 soluja (kuviot. 3E, F). Nämä tulokset viittaavat koordinoitua toimintaa CD151-integriini α3 monimutkainen, ja osoitti, että korkea CD151 ja integriini α3 liittyy lisääntynyt metastaattista potentiaalia GC soluja.

ilmentäminen CD151 tai integriinin α3 on positiivisessa yhteydessä jossa pahanlaatuiset fenotyypit HGC immunohistokemiallisesti

ilmentyminen CD151 ja integriini α3 proteiini tutkittiin 76 ensisijainen HGC käyttävillä potilailla kudossiruina (TMA). CD151-proteiinin immunoreaktiivisuus lokalisoitu solukalvon (Fig. 4A). Kasvainkudoksissa, CD151 ilmentyminen osoitti huomattavaa heterogeenisyyttä eri näytteissä (kuviot. 4a1, b1, c1 ja d1). CD151

korkea osuus oli 50% (38/76) koko kohortin. Kuten taulukosta 1, CD151

korkea korreloi merkitsevästi kasvaimen kokoa (

p =

0,021), syvyys invaasio (

p =

0,004), imusolmuke osallistuminen (

p =

0,028) ja korkea kasvain vaiheessa (

p =

0,002). Kuitenkin muiden kliinisten ominaisuuksien, kuten ikä, sukupuoli ja kasvaimen erilaistumista, eivät olleet merkitsevästi yhteydessä ilmentymiseen CD151.

(A) immunoreaktiivisuus CD151 ja integrinα3 proteiini sijaitsi solukalvojen. Kasvainkudoksessa, CD151 ilmentyminen osoitti huomattavaa heterogeenisyyttä eri näytteissä (Fig.4a1, b1, c1 ja d1). Positiivinen värjäytyminen Integrinα3 havaittiin kalvon karsinooman solut (Fig. 4 a2, b2, c2 ja d2). (B, C ja D) Prognostic merkitys arvioitiin Kaplan-Meier eloonjäämisennusteet ja log-rank testejä. Vertailut OS mukaan CD151 (B), Integrinα3 (C), ja Co-yliekspressio CD151 ja integrinα3 (D).

Kalvot syöpäsolujen värjätty positiivisia integriini α3 (kuviot. 4a2, b2, c2, ja d2). Kaikissa kudoksissa analysoitiin, korkeat integriinin α3 ilmentymistä havaittiin 27 HGC kudosnäytteistä (35,52%). Yhdenmukainen tuloksia aikaisempien tutkimusten [16], [18], potilailla, joilla on korkea integriinin α3 ilme olivat todennäköisemmin näytteille aggressiivista ominaisuuksia. Integriini α3

korkea potilailla havaittiin suurempia kasvaimia (

p =

3.46E-4), tarkemmin invaasion (

p =

0,001), suurempi kasvain vaiheessa (

p =

0,005), ja lisää imusolmuke osallistuminen (

p =

0,040) kuin potilailla, joilla on alhainen integriinin α3 lauseke (taulukko 1).

yli-ilmentyminen CD151 ja /tai integriini α3 ovat Independent tekijöitä ennustaminen prognoosi HGC Potilaat

viimeiseen seurannan, 3- ja 5-vuoden OS hinnat koko väestöstä oli 53,0 ja 40,78%, 5 vuoden OS että CD151

pieni ryhmä oli merkittävästi suurempi kuin vuonna CD151

korkean ryhmässä (68,42%

vs.

23,68%: lla,

p

= 0,007, Fig. 4B), ja leikkauksen jälkeisen 5 vuoden OS HGC potilaiden oli suurempi integriinin α3

alhainen kuin integriini α3

korkean ryhmässä (66,67%

vs.

13,51%,

p

= 6,67 E-6). Arviointi yhdistetty vaikutus CD151 ja integriinin α3 ennusteeseen HGC osoitti, että 5 vuoden OS CD151

korkea /integriinisalpaajien α3

korkea potilailla (ryhmä III, n = 23) oli 17,40%, mikä oli huomattavasti alhaisempi kuin CD151

pieni /integriinisalpaajien α3

pieni potilasta (77,78% ryhmä I, n = 27) ja joko pieni potilailla (potilaat, joilla joko alhainen CD151 tai matala integriini α3 yksin) (23,08%, ryhmä II , n = 26, kuviot. 4C ja D).

univariate analyysi osoitti, että kasvaimen koko, syvyys invaasio, imusolmuke osallistuminen, korkea kasvain vaiheessa korkea CD151 ilmentyminen, korkea integriinin α3 ja koekspressoimalla of CD151 ja integriini α3 olivat ennustavat OS. Muut ominaisuudet kuten ikä, sukupuoli ja eriyttäminen ollut ennustetekijöitä merkitystä OS (taulukko 2). Monimuuttuja Coxin suhteellisen vaarat malli osoitti, että syvyys hyökkäys oli itsenäinen prognostinen indikaattori OS (taulukko. 2).

Keskustelu

tulokset Tämän tutkimuksen osoitti, että CD151 ilmaistiin korkeammalla tasolla GC solujen ja kasvaimen kudokset kuin HGEC solujen ja nontumor kudoksissa, mikä on aikaisempien raporttien kanssa yhtäpitävä on CD151 ilmentyminen eri kasvaimia, mukaan lukien maksansisäinen kolangiokarsinooma, HCC, rinta-, keuhko-, koolon- ja eturauhassyövän [15], [19], [20], [21]. Lisäksi meidän tutkimus osoitti, että CD151 muodostaa toimivan kompleksin integriinin α3, ja vaimennussäätely CD151 tai integriinin α3 ilmentyminen inhiboitui merkittävästi hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden HGC-solujen in vitro. Kliinisesti, tuloksemme osoittivat, että korkea CD151 ilmentymisen tai co-yliekspressio CD151 ja integriini α3 voi olla epäsuotuisasti prognostisia vaikutuksia potilaille, joilla on GC.

Ensimmäinen todisteita siitä, että CD151 edistää etäpesäke tuli tutkimus, jonka vasta-aine, jossa tuntematon spesifisyys esti etäpesäkkeiden muodostumista ihmisen epidermoidikarsinooman linja

in vivo

. Vasta-aine tunnustettu CD151 ja estivät solujen vaeltaminen vaikuttamatta tarttuvuus ja jakaantumista [22]. Yliekspressio CD151 on havaittu monissa kasvaintyypeissä, ja lisääntynyt CD151 ilmentyminen on liitetty huonoon ennusteeseen rinta-, haima-, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, sekä HCC. Lisäksi CD151: n on osoitettu olevan parempi ennustaja ennusteen potilailla, joilla on eturauhasen syöpä kuin histologista luokittelu [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa, kaksi riviä näytön mukaan yliekspressio CD151 on kliinistä merkitystä HGC. Ensinnäkin, CD151 yliekspressio havaittiin useammin in HGC joilla on huono ennuste. Toiseksi, lisääntynyt ilmentyminen CD151 tehostetun hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden HGC soluja. Lisäksi kliininen data paljasti, että kohonnut CD151 ilmentyminen päihitti muut yleisesti käytetyt kliinisten parametrien, kuten lisääntynyt kasvaimen koon ja huono erilaistumisen ennustamiseen HGC ennustetta. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CD151 on tärkeä rooli etenemistä HGC. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että CD151 vuorovaikutuksessa integriini α3 in HGC-soluissa. Modulaatio ekspressiotasoja integriini α3 in HGC-27-vshCD151-cDNA-CD151 soluja paljasti muodostumista toiminnallisen CD151-integriinin α3 monimutkainen ja osoitti, että co-yliekspressio CD151 ja integriini α3 liittyi lisääntynyt metastaattista potentiaalia HGC-solujen . Kun otetaan huomioon vakiintunut asema integriini α3 vuonna HGC [16], on kohtuullista olettaa, että CD151 yliekspressio voi edistää etäpesäke /hyökkäyksen GC.

Koska niiden hydrofobisesta luonteesta, tetraspanins liittävät keskenään ja muiden kalvo proteiinit [24]. Itse asiassa se on vakiintunut, että tetraspanins tarjoavat signaloinnin alustan solukalvon muodostumisen kautta tetraspanin rikastettu mikrodomaineja (TEM) [6], [7]. Tähän mennessä erilaisia ​​kalvon proteiineja, mukaan lukien kasvutekijän reseptoreita, integriinit, immunoglobuliinidomeenit ja EWI-F (alaperheen Ig-proteiinien) on löydetty TEM [25]. Lisäksi toimintoja näiden kalvon proteiineja on raportoitu liittyvät läheisesti TEM. Esimerkiksi erilaisia ​​yhdistelmiä tetraspanins muodostavat TEM todettiin vaikuttavan toimintaan kasvutekijän reseptorit ja integriini. Vielä tärkeämpää on, ekspressiotaso yksittäisten tetraspanins in TEM on myös merkittävä vaikutus siihen liittyvät proteiinit [26], [27]. Viimeaikaisissa tutkimuksissa, knock-alas CD151 oli osoitettu heikentävän muodostumista TEM ja CD151 poistetaan esti funktiona useiden kalvon proteiineja, mikä osoittaa, että CD151: lla on ratkaiseva merkitys TEM muodostuminen ja toiminta [7], [26]. Lisäksi esto CD151 merkittävästi alentunut invasiivisuus ja metastaattisen potentiaalin kasvainsolujen, ja kohdistamalla CD151-proteiini tai TEM on tullut lupaava terapeuttinen strategia [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa, ilmentyminen CD151 on osoitettu olevan riippumaton ennustaja OS. Kuitenkin yhdistetty ilmaus CD151 ja integriini α3 oli luotettavampi ennustaja OS kuin CD151 tai integriinin α3 ilmaisua yksin, tukee käsitystä, että sekä CD151 ja integriini α3 tärkeä rooli HGC. Näin ollen meidän tulokset ovat merkittäviä, ja osoittavat, että CD151 tai CD151-integriinin α3 kompleksi voi olla tärkeitä tavoitteita hoidettaessa potilaita, joilla on GC.

Lopuksi, CD151 yli-ilmentyminen on ennustaja huono tulos potilailla, joilla on HGC