PLoS ONE: kliinis merkitys ja ennusteen arvioinnissa DNA metyylitransferaasi 1, 3a, ja 3b ilmaisujen Sporadic munasarjan epiteelin Cancer
tiivistelmä
Altered DNA: n metylaatio tuumorisuppressorigeenien promoottorit on tärkeä rooli ihmisen syövän synnyn ja DNA metyylitransferaasit (DNMTs) ovat vastuussa. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää poikkeava ilmentymä DNMT1, DNMT3a, ja DNMT3b vuonna munasarjojen hyvän- ja pahanlaatuisten kasvainten kudokset niiden yhdessä kliinis merkitys ja ennusteen arvioinnissa. Kaikkiaan 142 munasarjojen syöpien ja 44 hyvänlaatuisia munasarjan kasvaimet rekrytoitiin immunohistokemiallista analyysia varten niiden ilmaisua. Tiedot osoittivat, että ilmentyminen DNMT1, DNMT3a, ja DNMT3b havaittiin 76 (53,5%), 92 (64,8%) ja 79 (55,6%) ja 142 tapausta munasarjasyövän kudoksiin, vastaavasti. Ja pahanlaatuisten kasvainten, DNMT3a proteiinin ilmentyminen oli huomattavasti korkeampi kuin hyvänlaatuinen kasvain näytteissä (
P
= 0,001); DNMT3b oli marginaalisesti merkitsevä alas säännelty munasarjasyöpiä verrattuna hyvänlaatuisia kasvaimia (
P
= 0,054); DNMT1 ilmaisu ei ole tilastollista eroa munasarjasyöpiä ja hyvänlaatuinen kasvain kudosten (
P
= 0,837). Ja mucious kasvaimia, ilmaus DNMT3a, DNMT3b, ja DNMT1 ei ollut eroa kasvain. Lisäksi DNMT1 ilmentyminen liittyi DNMT3b ilme (
P
= 0,020, r = 0,195). DNMT1 ilmentyminen liittyi potilaan iästä, vaihdevuodet asema, ja kasvainpaikantumisen, kun DNMT3a ilmentyminen liittyi histologisia tyyppejä ja seerumin CA125 tasoilla ja DNMT3b ilmentyminen liittyi imusolmuke etäpesäke. Lisäksi potilailla, joilla on DNMT1 tai DNMT3b ilme oli suuntaus parempi eloonjäämisen kuin ne, joilla on negatiivinen ilmaus. Co-ilmentymä DNMT1 ja DNMT3b merkitsevästi yhteydessä hyvään yleiseen eloonjäämiseen (
P
= 0,014). Aineisto Tämän tutkimuksen toimittanut ensimmäiset todisteet erilainen ekspressio on DNMTs proteiinien munasarjasyövän kudoksiin ja niiden yhteenliittymien kanssa kliinis ja selviytymisen tietojen satunnaista munasarjasyöpää sairastavilla potilailla.
Citation: Bai X, Song Z, Fu Y, yu Z, Zhao L, Zhao H, et al. (2012) kliinis merkitys ja ennusteen arvioinnissa DNA metyylitransferaasi 1, 3a, ja 3b ilmaisujen Sporadic epiteelikasvaimet munasarjasyöpä. PLoS ONE 7 (6): e40024. doi: 10,1371 /journal.pone.0040024
Editor: M.Carolina Elias, Instituto Butantan, Laboratório erityishallintoalueen Toxinologia Aplicada, Brasilia
vastaanotettu: 08 helmikuu 2012; Hyväksytty: 30 toukokuu 2012; Julkaistu: 29 kesäkuu 2012
Copyright: © 2012 Bai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 30873097 ja nro 30973559) ja Science and Technology Department of Liaoningin maakunnassa (nro 2010225001). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Epigeneettiset muuttaminen genomisen DNA viittaa toiminnallisesti merkityksellisiä muutoksia genomin, joka vaikuttaa geenin ilmentymistä, mutta ei liity muutos nukleotidisekvenssissä, joka on tärkeä rooli ihmisen syövän synnyssä. Tällaisia modifikaatioita ovat DNA: n metylaatio, kromatiinin remodeling ja histoni variantteja, ja epigeneettisiä toiminta ei-koodaavan RNA [1]. Näistä DNA: n metylaatio on kovalenttinen modifikaatio, DNA, jolla on tärkeä rooli, jossa geeni-ilmentymisen ohjelmien kehityksen aikana [2]. Kuitenkin, epänormaali DNA: n metylaatio ei myös tärkeä rooli ihmisen syövän kehitykseen, ja useimmat syöpäsolujen näyttää globaalin hypometylaatio genomin, joka aiheuttaa epänormaalien geenien ilmentymistä, mutta paikallisen hypermetylaatio, joka vaimentaa tuumorisuppressorigeeneille [1], [3]. Nisäkkäillä, DNA: n metylaation luomiseen ja ylläpitämiseen pääasiassa kolmella DNA metyylitransferaaseja (DNMTs), nimittäin DNMT1, DNMT3a, ja DNMT3b. Edullinen kohde DNMT1 on hemi-metyloitu DNA [4], [5] ja tämä proteiini toimii ”huolto” metyylitransferaasiestäjiä ja ensisijaisesti vastaava entsyymi kopiointi metylaation jälkeen DNA: n replikaatiota. Se paikantuu replikaatioin- pesäkkeitä ja vuorovaikutuksessa leviämisen solun tuma-antigeenin (PCNA) [6]. Sen sijaan DNMT3a ja DNMT3b ovat välttämättömiä alkion varhaiskehityksen ja vastaavat de novo metylaation [7]. Yliekspressio näistä kolmesta DNMTs on raportoitu oli erilaisia pahanlaatuisia kasvaimia ja liittyy huono selviytyminen eri syöpiä, kuten keuhko-, maksa- ja kohdunkaulan syöpiä ja lymfoomat [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Toisin kuin syöpään liittyvän geenin mutaatiot, monistumiset, ja poistot, DNA: n metylaatio on mahdollisesti palautuvia. Siten DNMTs on tutkittu kohteena uudelleen ilmentyminen kasvainten synnyssä ja kääntyminen pahanlaatuisten fenotyyppien eri pahanlaatuisia kasvaimia [19]. Viimeksi antisense-oligonukleotidit kohdistaminen DNMT geenejä, esimerkiksi MG98, näyttävät olevan tehokkaita prekliinisissä tutkimuksissa ja on nyt tehnyt kliinisen vaiheen I ja vaiheen II tutkimuksia [20], [21].
epiteelikasvaimet munasarjasyöpä on kuudenneksi yleisin syöpä naisilla maailmanlaajuisesti ja toiseksi yleisin gynecologic syöpä, jonka osuus on noin 4% kaikista naisten syövistä [22], [23]. Puutteiden takia aikaisin varoitusmerkit ja tehokkaita seulonta työkaluja, suurin osa potilaista esiintyy loppuvaiheissa tauti [24]. Epiteelin munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin gynecologic maligniteetti ja viiden vuoden eloonjäämisaste on alle 25% potilaista diagnosoitu vaiheen III – IV sairaudet [25], [26]. Samanlaisia muiden pahanlaatuisten kasvainten poikkeava DNA: n metylaatio on CpG-saarekkeiden on myös tärkeä mekanismi munasarjasyöpä kehittämiseen. Prekliiniset tutkimukset osoittivat, että de-metylaatio agentit onnistuivat kääntämään vastustuskyky munasarjojen syöpäsolujen platina [27], [28], mikä johtaa käyttäen DNMT estäjien kliinisissä tutkimuksissa munasarjasyövistä [29], [30], [31], [32]. On kuitenkin olemassa ole saatavilla tietoa tutkimuksen DNMT proteiinien munasarjasyövän kudoksissa, vaikka kaksi aiemmat tutkimukset ovat raportoineet ilmentymistä DNMT mRNA munasarjasyövän solulinjoissa ja pieni kudosnäytteitä [33], [34]. Tässä tutkimuksessa olemme keränneet 142 tapausta epiteelin munasarjasyövän näytteitä ja 44 tapauksissa, joissa munasarjojen hyvänlaatuisten kasvainten havaitsemiseksi DNMT1, DNMT3a, ja DNMT3b proteiinin ilmaisuja, jotta voidaan määrittää asema DNMT proteiinien munasarjasyövän ja kliinistä merkitystä.
tulokset
Potilastiedot
tässä tutkimuksessa rekrytoimme kudosnäytteitä 186 munasarjakasvain näytteitä arviointia DNMTs proteiinin ilmentymisen. Kliinis tietoja potilaista on esitetty taulukossa 1. Lyhyesti, keski-ikä potilaiden leikkaus oli 53 vuotta (vaihteluväli 20-74 vuotta). 27 (23,3%) potilaista oli imusolmuke-etäpesäkkeitä taudin aikaan leikkauksen ja 110 (77,5%) potilaista oli serous syöpä on tärkein histologinen diagnoosin, jonka jälkeen mucinous karsinooma (8,5%), kirkas cell carcinoma (~5.6%) ja erilaistumaton karsinooma (~5.6%). Seerumin CA125, CA199, ja CEA kohosivat ennen leikkausta mutta yksikään potilaista saanut neo-adjuvanttihoitoa. Seuranta oli saatavilla 85 potilasta. Keskiarvo ja mediaani yleinen eloon jäämisestä (OS) oli 56,1 ja 41,0 kuukautta, vastaavasti, 95%: n luottamusväli 45,3-66,9 ja 33,2-48,8 kuukautta. Keskiarvo ja mediaani taudista vapaan eloon jäämisestä (DFS) oli 46,6 ja 26,0 kuukautta, vastaavasti, 95%: n luottamusväli 36,4-56,9 ja 14,6-37,4 kuukautta. Vuonna 44 hyvänlaatuisia kasvaimia, 31 olivat serous ja 13 mucinous.
Differential ilmentäminen DNMT proteiinit Pahanlaatuinen ja hyvänlaatuinen Munasarjojen Kasvaimet
Differential ilmentymistä DNMT proteiinien pahanlaatuisia ja hyvänlaatuisia munasarjan kasvaimet mukaan histologinen tyyppi on esitetty taulukossa 2. erityisesti ilmaus DNMT3a proteiini oli merkittävästi korkeampi kuin hyvänlaatuinen kasvain kudosten (Mann-Whitney U-testi testi,
P
= 0,001; taulukko 2), mutta ero ei havaittu mucious kasvaimissa (Mann-Whitney U-testi testi,
P
= 0,813; taulukko 2). Vaikka DNMT3b-proteiinia ei havaittu 64 (58,2%), 110 vakavien syöpätapausta ja 22 (71,0%) ja 31 vakavien hyvänlaatuisia kasvaimia, mikä osoittaa, että DNMT3b ilmentyminen munasarjasyöpiä oli pienempi, mutta ei merkittävästi kuin hyvänlaatuiset kasvaimet (Mann- Whitneyn U-testi testi,
P
= 0,054; taulukko 2), mutta ero ei havaittu mucious kasvaimissa (Mann-Whitney U-testi testi,
P
= 0,536; taulukko 2 ). Sitä vastoin ilmaus DNMT1 proteiinin ollut merkitsevää eroa munasarjasyövän ja hyvänlaatuinen kasvain näytteet joko vakavia tai mucious kasvaimet (Mann-Whitney U-testi testi, serous:
P
= 0,837; mucious:
P
= 0,315 taulukko 2). Edustaja ekspressiomalleja immunohistokemiallisella värjäyksellä DNMTs munasarjasyövän ja hyvänlaatuinen kasvain kudoksia on esitetty kuviossa 1 ja kuviossa 2 vastaavasti. Seuraavaksi liittyvä ilmaus näistä kolmesta DNMT proteiinien munasarjasyöpä kudoksiin käyttämällä Spearmanin rank korrelaatio testi. Tiedot osoittivat, että ilmentyminen DNMT1 oli merkitsevästi yhteydessä DNMT3b (r = 0,195,
P
= 0,020, taulukko 3), mutta ei DNMT3a proteiinia (r = 0,130,
P
= 0,122 ; taulukko 3) välissä tai DNMT3a ja DNMT3b proteiinit (r = 0,152,
P
= 0,071, taulukko 3).
Edustavia esimerkkejä negatiivinen (A, E, I) heikosti positiivinen (B, F, J), kohtalaisen positiivinen (C, G, K), ja vahva positiivinen (D, H, L) immunovärjäys DNMT3a, DNMT3b, ja DNMT1 ilmaisu on esitetty, vastaavasti; Nuolet osoittavat kentän laajentunut. Suurennus: × 400; laajentuneessa sivustot: × 1000.
Edustavia esimerkkejä negatiivinen (A, E, I), heikosti positiivinen (B, F, J), kohtalaisen positiivinen (C, G, K), ja voimakas positiivinen (D, H, L) immuunivärjäykseen DNMT3a, DNMT3b, ja DNMT1 ilme on esitetty vastaavasti. Suurennus: × 400.
Association between ilmentäminen DNMT Proteiinit ja kliinis parametrit
Kun havaitaan ilmentymistä näiden kolmen DNMT proteiineja käyttäen Immunohistokemian me liittyy niiden ilmaisuja kliinis data potilailta. Tuloksemme osoittivat, että DNMT1 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä ikään ja vaihdevuodet tilan potilaiden ja kasvainpaikantumisen. Expression of DNMT1 proteiinin vanhemmat ( 53 vuotta) tai postmenopausaalisilla potilailla oli suurempi kuin nuoremmilla potilailla (Pearson Chi-Square testi,
P
= 0,028; taulukko 4) tai premenopausaaliselle potilailla (Pearson Chi neliö testi,
P
0,000; taulukko 4). Lisäksi ilmaus DNMT1 proteiini oli suurempi potilailla, joiden kasvain esiintyi yhdellä puolella kuin potilailla, joiden kasvain tapahtui molemmilla puolilla (Pearson Chi-Square testi,
P
= 0.010; taulukko 4). Kuitenkin, ei ollut merkittäviä yhdistystä välillä DNMT1 immunoreaktiivisuus ja kasvaimen kokoa, imusolmuke etäpesäke, kliiniseen vaiheeseen, histologinen tyyppi, CA125 tai CA199.
Lisäksi oli merkitsevästi yhteydessä DNMT3a ja seerumin CA125 taso (Pearson Chi-Square testi,
P
= 0,044; taulukko 4). Expression of DNMT3a proteiini oli 69,1% vuonna vakavasta syöpä, joka oli korkeampi kuin mucinous karsinooma (33,3%) ja selkeä cell carcinoma (50%) (Fisherin testiä,
P
= 0,027; taulukko 4). Mutta ei ollut yhdistyksen välillä DNMT3a immunoreaktiivisuus ja muita kliinisiä patologisia parametrit, kuten on esitetty taulukossa 4.
Lisäksi data paljasti, että DNMT3b ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä imusolmuke etäpesäke munasarjasyöpä (Pearson Chi-Square testi,
P
= 0,027; taulukko 4). Vaikka ei ole tilastollisesti merkitsevä, ilmentymistä DNMT3b proteiinin näytti olevan yhteydessä korkea seerumin CA199 (Pearson Chi-Square testi,
P
= 0,061; taulukko 4).
Co- ilmaus DNMT1 ja DNMT3a merkitsevästi liittyvät vaihdevuodet tila (Pearson Chi-Square testi,
P
= 0,008; taulukko 4) ja sijainti kasvain (Pearson Chi-Square testi,
P
= 0,036, taulukko 4), kun taas koekspressio DNMT1 ja DNMT3b merkitsevästi liittyvät vaihdevuodet tila (Pearson Chi-Square testi,
P
= 0,001; taulukko 4) ja sijainti kasvain (Pearson Chi neliö testi,
P
= 0,015; taulukko 4). Co-ilmentymä DNMT1 ja DNMT3b oli myös merkitsevästi yhteydessä seerumin CA199 tasot (Pearson Chi-Square testi,
P
= 0,013; taulukko 4).
Association of DNMT Protein ilmaisujen kanssa Survival ja potilaat
Sen jälkeen meidän liittyvä ilmaus DNMT proteiinin selviytymistä käyttävien potilaiden Kaplan-Meier-analyysi (kuvio 3). Erityisesti vaikka se ei ole merkittävästi erilainen, potilailla, joilla on DNMT ilmaisuja oli suuntaus parannetun selviytymisen kuin ne, joilla on negatiivinen ilmaus, vastakohta havaintoja aikaisemmista tutkimuksista muiden syöpien [8], [13], [17], [18 ], [35], [36]. Meidän näytteet, DNMT1 ilmaisu marginaalisesti liittyy parannettu OS (
P
= 0,084; Kuva. 3A) ja DFS (
P
= 0,186; Kuva. 3D); ja niin teki DNMT3b. Lisäksi koekspressio DNMT1 ja DNMT3b oli merkitsevästi yhteydessä parannetun eloonjäämiseen verrattuna muihin näytteisiin (vain DNMT1 tai DNMT3b ilmentymistä tai molemmat negatiivinen) (
P
= 0,014, Fig. 4C). Univariate analysoidaan mahdollisuudet ennustetekijöiden vaikutuksia kliinisten ja histopatologisten parametrien tunnistettu kliiniseen vaiheeseen, sijainti kasvain, ja seerumin CA125 tasolla merkittävästi tai marginaalisesti merkitsevää yhteyttä lyhyempiä OS ja DFS (taulukko 5).
Eloonjäämiskäyrät osoittavat vaikka ei ollut tilastollista merkitystä, potilailla, joilla on DNMT1 ilme oli suuntaus parani kokonaiselinaika (A) ja taudista vapaan eloonjäämisen (D) kuin ne, joilla on negatiivinen ilmaus, ja niin teki DNMT3b (C ja F). Mutta ei ole merkittävää eroa DNMT3a ilmaisun ja kokonaiselossaoloaika tai taudista vapaan elinajan (B ja E).
P
-arvon saatu log-rank-testi.
Eloonjäämiskäyrät osoittavat koekspressio DNMT1 ja DNMT3b oli merkitsevästi yhteydessä parantunut kokonaiselinaika verrattuna negatiivisten näytteiden (
P
= 0,014, Kuva. 3E).
P
-arvon saatu log-rank-testi.
Myöhemmin Coxin monimuuttuja regressiomallit käyttäen kliiniseen vaiheeseen, kasvaimen koko, sijainti neoplasian DNMT1 ja DNMT3b co -ilmaisu paljasti, että vain kliiniseen vaiheeseen (OS,
P
= 0.022, RR = 6,977, 95% CI: 1.322~36.822, DFS,
P
= 0,026, RR = 4,686, 95% CI: 1.207~18.196) pysyi itsenäisenä ennustetekijä (taulukko 6).
alaryhmäanalyysi of Association between DNMT ilmaisujen ja kliiniset tulokset Potilaat
Lisäksi analyysi suoritettiin huomioon DNMTs ilmaisun potilasryhmissä eri kliinis parametreja, kuten ikä, vaihdevuodet valtio, kasvaimen koon, kliiniseen vaiheeseen, imusolmuke etäpesäke, ja sijainti kasvain. Tuloksemme osoittivat, että ilmentyminen DNMT1 proteiinin liittyi parantunut DFS potilailla, joilla on suurempi koko kasvaimia (DFS,
P
= 0,027; Kuva S1). Expression of DNMT1 näytti olevan suojaava tekijä potilailla, joiden kasvaimen tapahtui molemmilla puolilla, mutta se ei ole tilastollisesti merkitsevä (OS,
P
= 0,139, kuvio S1) (DFS,
P
= 0.269; Kuva S1); vastakohta havainnot potilailla, joiden kasvain esiintyi yhdellä puolella (OS,
P
= 0,429; Kuva S1) (DFS,
P
= 0,210; Kuva S1). Sitä vastoin DNMT3a proteiinin tasot ole osoittanut mitään assosiaatioita elossaololuku (
P
0,05, kuva S2). DNMT3b ilmentyminen liittyi pitkäaikaiseen OS vanhemmilla potilailla (
P
= 0,011; Kuva S3), postmenopausaalisilla potilailla (
P
= 0,019; Kuva S3), ja potilaat, joiden kasvain tapahtui molemmilla puolilla (
P
= 0.022; kuva S3). Expression of DNMT3b proteiinin myös marginaalisesti liittyy pitkittynyt DFS postmenopausaalisilla potilailla (
P
= 0,098; Kuva S3) ja potilailla, joiden kasvain tapahtui molemmilla puolilla (
P
= 0,097; Kuva S3).
keskustelu
esillä olevassa tutkimuksessa olemme ensimmäistä kertaa immunohistokemiallisesti määritetään ilmentymisen DNMT1, DNMT3a, ja DNMT3b proteiinit munasarjojen hyvän- ja pahanlaatuisten kasvainten kudokset. Tiedot osoittivat, että DNMT3a ekspressio oli suurempi munasarjasyövän kuin että hyvänlaatuisia kasvaimia, jotka oli yhdenmukainen aiempien tutkimusten muiden syöpien [15], [37], [38]. Kuitenkin, vaikka useita aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ekspressiotasot DNMT3b mRNA [8], [9], [39], [40] ja proteiini [13], [40], [41] lisättiin erilaisia pahanlaatuisia kasvaimia , nykyinen data osoitti alempaa ilmaus DNMT3b munasarjasyövän kudoksissa verrattuna hyvänlaatuinen kasvain. Tässä tutkimuksessa, Huomasimme myös, että ei ollut eroa ilmentymistä DNMT1 proteiinin välillä munasarjojen hyvän- ja pahanlaatuisten kudosten. Se on miellyttävä aiemman tutkimuksen raportoinnin ettei eroa DNMT1 mRNA: n ilmentymisen keskuudessa normaali munasarjakudoksen, ensisijainen munasarjasyöpä, ja toistumisen munasarjasyövän kudosten [33]. Toinen raportti osoitti, että ilmentyminen DNMT1 mRNA-tasojen munasarjasyövän HeyA8 ja HeyC2 solulinjoissa oli korkeampi kuin normaalien munasarjaepiteelisoluilla [34]. Nykyinen tutkimus havaittiin ensimmäisen kerran ilmentymistä DNMT proteiinien munasarjasyövän verrattuna hyvänlaatuinen kudoksiin; Näin on vielä analysoitava tarkemmin analysoida muuttunut ilmentyminen DNMT proteiinien munasarjasyöpää kanssa verrattuna normaalin munasarjan kudoksiin. Joka tapahtumia, koska monimutkaisia mekanismeja vastuussa sääntelystä DNMT ilmauksia ja toiminnot DNMTs karsinogeneesis-, muuttuneen ilmaisun ja vaikutukset DNMTs olisi edelleen tutkittava munasarjasyövän vaikka niiden poikkeava ilmaisuja todettiin olevan koska metylaation niiden geenin promoottorit eri syöpien, kuten glioomat ja alkiokudosten [42], [43]. Kuitenkin mutaatio ja menetys p53-proteiinin johti yli-ilmentymisen DNMT1 leukemia, peräsuolen syöpä ja keuhkosyöpä [44]. Lisäksi MikroRNA ovat myös mukana säätelyyn DNMT ilmaisun [45], [46]. Borderline epiteelin kasvain oli merkittävä ja tärkeä ryhmä epiteelin munasarja-. Olemme myös kerännyt rajatapaus kasvaimia mutta määrä raja kasvainten saatavilla tutkimuksessamme oli vain 6, joten emme analysoineet raja kasvaimia tässä tutkimuksessa, ja aiomme edelleen kerätä enemmän raja kasvaimia tulevaa tutkimusta.
Lisäksi nykyinen tutkimus liittyy edelleen merkitystä kolmen DNMT proteiinin ilmaisuja kliinis piirteitä munasarjasyöpä potilaille. Tiedot osoittivat, että DNMT1 ilmentyminen korreloi positiivisesti potilaan iästä, ts DNMT1 proteiini ilmentää vanhemmilla potilailla, jonka data oli sopusoinnussa lymfooman [13]. Lisäksi DNMT1 ekspressoitiin enemmän postmenopausaalisilla potilailla kuin premenopausaalisilla potilailla. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että ilmentyminen DNMT1 proteiini oli relevantti kanssa kasvaimen sijainnista. Tähän mennessä emme tiedä, miksi nämä tapahtui tai epäsuorasti näiden yhdistysten. Lisäksi olemme myös havainneet, että ilmaus DNMT1 oli suurempi yksipuolinen munasarjasyöpä kuin kahdenvälisissä munasarjasyövän, jotka voivat viitata ero yksipuolisen ja kahdenvälistä munasarjasyövän suhteen biologisia ominaisuuksia, genetiikka, ja mekanismi. Aikaisempi tutkimus on raportoitu, että DNMT1 ilmentyminen liittyi imusolmuke etäpesäke haimasyövän [17], mutta emme löytäneet tällaista yhdistystä munasarjasyöpä.
Lisäksi nykyinen tutkimus osoitti, että DNMT3a ilme oli liittyvä histologinen tyyppi, esim munasarjan serous karsinooma ilmaistuna korkeampi DNMT3a proteiinia. DNMT3a ilmentyminen positiivisessa yhteydessä seerumin CA125 tasolla, kun taas DNMT3b ilmentyminen liittyi imusolmuke etäpesäke ja seerumin CA199 taso, joka on uusi ja ei raportoida ennen.
Mitä selviytymisen ennustuksen käyttämällä erilaisia DNMT ilmaisuja, edellinen tutkimukset osoittivat, että yli-ilmentyminen DNMT1 tai DNMT3b liittyi huonon ennusteen keuhko- [15], maksan [18], [35], ja haiman [17], lymfooma [13] ja muiden maligniteettien. Munasarjasyövän, nykyinen tutkimus osoitti erilaista suuntaus DNMT yhdistysten ennusteeseen, eli kokonaiselinaika (OS) ja taudista vapaan eloonjäämisen (DFS) munasarjasyöpä potilaat olivat paremmin ilmaus DNMT1 ja DNMT3b proteiineja verrattuna potilaiden ilman ilmentymistä DNMT1 ja DNMT3b proteiineja. Lisäksi koekspressio DNMT1 ja DNMT3b proteiinit oli myös merkitsevästi yhteydessä parannetun OS. Lisäksi meidän ylimääräistä tulokset osoittivat, että DNMT3a eri osajoukkoja munasarjasyöpäpotilaalle ei ollut vaikutusta selviytymisen tila, vaikka DNMT1 ilme osoitti parempaa OS ja DFS potilailla, joilla on suuria kasvaimia kuin potilaan pienempiä kasvaimia. Samanlainen pätee DNMT3b ilmaisun vanhemmilla potilailla, postmenopausaalisilla potilailla, ja potilaalla on molemminpuolinen kasvaimia positiivinen. Nämä täysin eri tietoja nykyisestä aiheen olettaa erilaiset biologiset ominaisuudet munasarjasyövän muista syövistä. Kuitenkin tulevaisuudessa tutkimus on tarpeen vahvistaa nykyinen havainto.
erilaisia syöpiä, DNMT1, DNMT3a, ja DNMT3b raportoitiin olevan erittäin ilmaistaan ja liittyvät huonoon ennusteeseen. Hypermetylaatiota jotkut kasvain tukahduttaa geenin promoottorit (APT), jotka vaikuttavat ennusteeseen voi osittain selittää huonon ennusteen liittyy potilaalla on DNMT yliekspressio [47], [48], [49], [50], vaikka metylaatio useimpien geenipromoottorit doesnt ’ t on korkea korrelaatio ilmentymisen DNMTs [35], [51]. Kuitenkin on tuntematon, miksi suuri kuvaamaan joitakin näistä DNMTs liittyi parempi ennuste munasarjasyöpä potilaille. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että metylaatio DNA-CpG-saarekkeen kasvainkudoksissa ei ollut vain osa hypermetylaation geenien, jotka hypometylaatio myös esiintynyt joillakin alueilla perimän DNA ja että epänormaali hypometylaatio ihmisen genomissa vaikuttaa ennusteen potilaita, joilla on eturauhasen syöpä, maksan syöpä, ja gliooma [52], [53], [54]. Kuten muut syövät, munasarjasyöpä solut osoittavat myös globaali hypometylaatio genomissa ja paikallinen hypermetylaatiota tuumorisuppressorigeenin promoottorit [55]. Kahdessa aiemmassa tutkimuksessa käytetty metylaation siru suurikapasiteettisten menetelmä seuloa geeni hypermethylations jotka voivat vaikuttaa ennusteen munasarjasyöpäpotilaalle [56], [57] ja totesi, että korkeampi CpG-saarekkeen metylaation liittyy alentunut potilaan progression- elinaika (PFS). Vaikka muut tutkimuksesta osoitti, että promoottori hypermetylaation oli mukana DNA-vaurioiden korjaus geenien munasarjasyöpää ja paranemiseen liittyvistä ennusteen potilaita lisäämällä herkkyyttä kemoterapiaa [58], [59]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että DNMT estäjä pystyi osittain kääntää platinaa vastarintaa munasarjasyöpäpotilaalle [32]. Toisessa tutkimuksessa arvioitiin aktiivisuus ja siedettävyys on demetylaatio aineen fatsarabiini (Ara-AC) potilailla, joilla on munasarjasyöpä, eikä täydellistä tai osittaista vastetta havaittiin 19 potilaalla [29]. Ryhtynyt kaiken, nykyinen tutkimus osoittaa, että mekanismi ja kliininen merkitys muuttuneen ilmentymisen DNMTs munasarjasyövän voitaisiin arvioida.
Materiaalit ja menetelmät
kudosnäytteiden
Tissue näytteitä 186 Munasarjasyöpäpotilaiden kasvaimia rekrytoitiin osastolta Surgical Oncology ja General Surgery, Kiina Medical University-Affiliated ensimmäisen ja toisen sairaalat vuosien 2002 ja 2010 loppu 186 tapausta, 142 tapausta histologisesti vahvistettiin munasarjojen epiteelin syöpä ja 44 tapausta olivat hyvänlaatuisia munasarjojen kasvaimia. Yksikään potilaista ollut suvussa syöpää. Potilaat kirurgisesti lavastettu mukaan nykyinen FIGO (International Federation of gynekologien ja synnytyslääkärit luokitusjärjestelmä). Histologinen diagnoosi päästiin perusteiden Maailman terveysjärjestön. Tutkimuksemme oli liitetty toiseen kliiniseen tutkimukseen jotka saimme tietoisen suostumuksen kaikilta osallistujille. Koska tämä tutkimus oli noin DNMT estäjä ja haluamme tietää kliinis merkityksen ja ennusteen arvioinnissa on DNMT ilmaisujen satunnaista munasarjasyöpä. Joten haluamme lisätä tämän tutkimuksen noin DNMT ilme. Soitimme kullekin potilaalle, selitti Tutkimuksessamme ja saatu tietoon perustuvan suostumuksen. Kun vaadimme, julkisen notaarin oli läsnä ja antaa todistuksen, ja saimme matkapuhelimen lyhyen viestin jota vaaditaan osallistujia, jotka hyväksyvät tutkimuksen lähettää meille. Koska aika oli rajallinen ja jotkut osallistujat olivat pois sairaalasta, joten on vaikea saada kirjallinen suostumus. Instituutti Research Medical Ethics komitean Kiinan Medical University käsitelty ja hyväksytty lupamenettelyssä. Lopuksi saatu suullinen suostumus 186 potilasta.
immunohistokemia
Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut kudosnäytteet leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä ja kiinnitettiin poly-L-lysiinillä päällystettyihin lasi dioja. Immunohistokemiallista värjäystä, osat poistettiin parafiini ksyleenillä, vedettömät sarjassa alkoholia, ja pestiin vesijohtovettä. Sitten leikkeitä keitetään 10 mM natriumsitraatti, pH 6,0, 10 minuutin ajan autoklaavissa antigeenin haku. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla kohdissa 3% H
2O
2 37 ° C: ssa 20 minuutin ajan. sen jälkeen, osat blokattiin välttää epäspesifisen sitoutumisen lisäämällä 10% normaalia vuohen seerumia, 37 ° C: ssa 30 minuuttia ja sitten inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli polyklonaalisella vasta-aineella DNMTs (DNMT1, sc-20701, 1: 200 laimennus; DNMT3a, sc-20703, 1:200 laimentamista; DNMT3b sc-130740, 1:100 laimennus; Santa Cruz Biotechnology, USA). Vasta-aineiden spesifisyys oli vahvistettu käyttäen Western blot-analyysi (tietoja ei esitetty). Seuraavana päivänä, leikkeitä pestiin viisi kertaa 0,01 mol /L fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS; pH 7,4) 15 minuutin ajan ja inkuboitiin sitten biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Tämän jälkeen leikkeitä inkuboitiin streptavidiini piparjuuriperoksidaasi liuosta vielä 30 min (LSAB kit; Dako, Glostrup, Tanska), pestiin PBS: ssä ja värjättiin DAB (3, 3-diaminobentsidiiniä). Lopuksi leikkeet vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä, kuivattu ja kiinnitetty. Negatiiviset kontrollit rinnakkain, ja muodostettiin PBS korvaamalla anti-DNMTs vasta-aine.
arviointi immunohistokemia
immunovärjättiin osat tarkistettiin ja teki itsenäisesti kaksi tutkijaa, jotka olivat sokaissut potilaiden kliinis ominaisuudet. Ydinvoima ilmaisi DNMTs ovat toiminnallisia tyyppi DNMT proteiinit; Näin ollen, vain ydinvoiman positiivisuus varten DNMTs proteiinien arvioitiin käyttäen semi-kvantitatiivinen pisteytys kriteerien mukainen värjäytymisen intensiteetti (0, negatiivinen; 1, heikko, 2, kohtalainen ja 3, vakava) ja osa-positiivisten solujen (0, negatiivinen; 1, positiivinen ≤10%, 2, positiivinen 10% ja ≤50%, 3, positiivinen 50% ja ≤80%, 4, positiivinen 80% syöpäsoluja). Kaksi pistemäärät kerrotaan kunkin tapauksen ja ilmaisu luokiteltiin: negatiivinen, pisteet = 0; heikko ilmaisu, pisteet = 1-4; maltillinen ilme, pisteet = 5-8; ja vahva ilmaus, pisteet = 9-12.
Tilastollinen analyysi
Comparison of DNMT ilmaisun tulokset näytteiden välillä analysoitiin käyttäen Mann-Whitneyn U-testiä. Spearmanin suoritettiin analysoida yhdistyksen välillä DNMT ilmaisuja. Korrelaatioita kliinis tekijöiden ja DNMTs ilmaisun analysoitiin käyttämällä Chi-square (X
2) testi tai Fisherin tarkka todennäköisyys Test. Survival potilaista mukaan DNMT ilmaisuja analysoitiin Kaplan-Meier käyrä analyysi log-rank-testi. Cox regressioanalyysi käytettiin monimuuttuja-analyysiin. Tilastollinen merkittävyys määritettiin
P
0,05. Kaikki tilastolliset testit suoritettiin SPSS ohjelmistopakettia (SPSS 11.5 Inc, Chicago, IL, USA).
tukeminen Information
Kuva S1.
Kaplan-Meier selviytymisen analyysi yhteydestä DNMT1 ilmaisun ja käyttöjärjestelmän ja DFS eri alaryhmiin.
doi: 10,1371 /journal.pone.0040024.s001
(TIF) B Kuva S2.
Kaplan-Meier selviytymisen analyysi yhteydestä DNMT3a ilmaisun ja käyttöjärjestelmän ja DFS eri alaryhmiin.
doi: 10,1371 /journal.pone.0040024.s002
(TIF) B Kuva S3.
Kaplan-Meier selviytymisen analyysi yhteydestä DNMT3b ilmaisun ja käyttöjärjestelmän ja DFS eri alaryhmiin.
doi: 10,1371 /journal.pone.0040024.s003
(TIF) B
Kiitokset
Haluamme kiittää tohtori Hua Chang ja teräs Liu osastolta Surgical Oncology ja General Surgery, Kiina Medical University-Affiliated ensimmäisen ja toisen Hospitalsille apua kudosnäytteiden kokoelma.