Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä on edelleen johtava kuolinsyy maailmassa ja kaikista tapauksista maailmanlaajuisesti kasvaa. Novel hoito strategioita siis kipeästi tarvitaan radikaalia syöpien ja pitkä potilaiden selviytymiseen. Uusi teknologia käyttää korkean pulssi sähkökenttä on syntynyt sotilaallinen sovelluksen biologian ja lääketieteen soveltamalla nsPEF keinona estää syöpää. Kuitenkin molekyylimekanismeja nsPEF kasvaimiin tai syövistä ovat vielä epäselviä. Tässä artikkelissa, huomasimme, että nsPEF oli laaja biologisia vaikutuksia syöpiin, ja selventää sen mahdollista molekyylitason mekanismeja

in vitro

ja

in vivo

. Se ei ainoastaan ​​indusoimaan apoptoosin kautta riippuvainen-mitokondriot luontainen apoptoosireittiä joka laukaisi epätasapaino anti- tai pro-apoptoosi-Bcl-2-perheen proteiinit, vaan myös estävät solujen proliferaation tukahduttamiseen NF-KB: n signalointireitin vähentää ilmaisuja sykliini proteiineja . Lisäksi nsPEF voisi myös inaktivoivat etäpesäke ja invaasio syöpäsoluissa tukahduttamalla Wnt /β-kateniinin signalointireitin alaspäin säätäminen ilmaisuja VEGF ja MMP proteiinit. Vielä tärkeämpää on, nsPEF voisi toimia turvallisesti ja tehokkaasti syövän hoidossa läpi indusoimiseksi tuumorisolujen apoptoosin, tuhoaa kasvaimen mikroympäristössä, ja painamalla angiogeneesin kasvainkudoksessa

in vivo

. Nämä havainnot voivat tarjota luova ja tehokas terapeuttinen strategia syöpiin.

Citation: Ren Z, Chen X, Cui G, Yin S, Chen L, Jiang J, et al. (2013) nanosekunti Pulssi Sähkökenttä Estää syövän kasvua Seuraaja muutosta ilmaisujen NF-KB ja Wnt /β-kateniinin signalointimolekyylien. PLoS ONE 8 (9): e74322. doi: 10,1371 /journal.pone.0074322

Editor: Irina U Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 10, 2013; Hyväksytty: 25 heinäkuu 2013; Julkaistu: 17 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Ren et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National S T suurhanke of China (2012ZX10002-017, 2012ZX10002-004), NSFC for Innovative Research Group of China (81121002), Zhejiang Medical Research Funding (2008B079, LY13H180003), SRF varten ROCS, SEM (J20120279 ), ja Xinjiangin Science and Technology Bureau Project (2013911131). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä on edelleen johtava kuolinsyy maailmanlaajuisesti ja osuus 7,6 miljoonaa kuolemantapausta (noin 13% kaikista kuolemista) vuonna 2008 WHO, ja syöpäkuolemaa ennustetaan nousevan yli 11 miljoonaan vuonna 2030 [ ,,,0],1]. Merkittävä osa syövistä voidaan parantaa leikkaus, sädehoito tai kemoterapia, varsinkin jos ne havaitaan varhaisessa vaiheessa. Kuitenkin jotkut syöpien voida löydettiin alkuvaiheessa ja on vain vähän vastauksena sädehoidon ja kemoterapia, mikä potilaalla on tällaisista syövistä on huono ennuste. Esimerkiksi haimasyöpä on noin 23% 1 vuoden elossaolo diagnoosin jälkeen ja 5% 5 vuoden pysyvyys parhaimmillaan [2]. Lisäksi oli arviolta 43140 uutta tapausta ja 36 800 kuolemantapausta johtuu haimasyövän Yhdysvalloissa [3,4]. On tärkeää etsiä uuden hoidon tekniikka parantaa ennustetta ja selviytymisen syöpäpotilailla.

Uusi tekniikka käyttämällä korkean pulssi sähkökenttä on syntynyt sotilaallinen sovelluksen biologian ja lääketieteen soveltamalla nanosecond pulssi sähkökentän (nsPEF ) keinona estää syöpää [5]. Tärkein ominaisuus nsPEF on sen suuri teho ja alhainen energiankulutus johtaa hyvin vähän lämmön tuotannon ja sen erityinen kyky tunkeutua soluun vaikuttamaan solunsisäiseen soluelimiin [6,7]. Aivan erilainen kuin klassisen solukalvon elektroporaatio, nsPEF voi tuottaa hyvin pakattu teho (miljardeja wattia), erittäin lyhyen pulssin kestojen (nanosekunti), nopea nousu kertaa (nanosekunti) ja korkea sähkökentät (kV /cm). Tuloksena nanosecond pulssi voi tunkeutua soluun ennen solukalvon on ladattu täyteen mahdollistaa nsPEF olevan minimaalinen vaikuttaa solukalvon siten ole aiheuttamatta elektroporaatio [8]. Viime vuosina on tehty tutkimuksia määrittämään vaikutukset nsPEF kokeellisessa ja malli tutkimuksia. Tulokset osoittivat, että nsPEF voivat aiheuttaa apoptoosin erilaisissa syöpäsolulinjoissa

in vitro

[9,10] ja fibrosarkoomakasvain

ex vivo

[7], ja hävittää B16F10 melanoomakasvain

in vivo

[11,12,13]. Kuitenkin molekyylimekanismeja biologisista vaikutuksista nsPEF kasvaimiin tai syövistä ovat vielä epäselviä.

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet selvittämään syövän vastaisen vaikutuksen nsPEF ja sen mahdolliset molekyylitason mekanismeja

in vitro

ja

in vivo

kokeita. Täällä, osoitimme että nsPEF voisi merkittävästi estää syövän kasvua

in vitro

ja

in vivo

kautta aiheuttamaan apoptoosin, proliferaation estossa, inaktivoimalla invaasio ja etäpesäkkeiden, ja tuhoamalla kasvaimen mikroympäristössä, mikä aikaan uudenlainen ja tehokas terapeuttinen strategia syöpiin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen haiman karsinoomasolulinja (PANC-1) ja HCC (Hep-3B) olivat ostettu Cell Bank of Kiinan Academy of Science (Shanghai, Kiina). Molemmat solulinjat viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, SAFC Biosciences, Lenexa, KS, USA), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

induktio solukuoleman nsPEF

Kuten edellisessä kuvauksessa [11], nsPEF generaattori kesto 100 -ns on esitetty kuviossa S1. Sähkökentät vaihteli 20 kV /cm 60 kV /cm. Aaltomuodot seurattiin digitaalisen fosfori oskilloskooppi (kuva S1 A B, DPO4054, Tektronix, USA) varustettuna Suurjännitemittapää (P6015A, Tektronix, USA). PANC-1-solut kerättiin trypsiini ja suspendoitiin uudelleen tuoretta DMEM-alustassa, jossa oli 10% FBS: ää pitoisuuteen 5,0 x 10

6 solua /ml. 500 ui solususpensiota pantiin 0.1cm aukko kyvetti (kuvio S1 C, Biosmith, alumiini elektrodien) ja altistettiin 100 pulssia 0, 20, 40 ja 60 kV /cm sähkökentän voimakkuus vastaavasti. Useimmat havainnot soluvasteiden tehtiin 1 h käsittelyn jälkeen, lähinnä lukien siirtokuoppaan määritys, solun TEM, DNA tikkaat määritys, solun TUNEL määritys, virtaussytometrialla ja western-blot. Solujen elinkelpoisuus ja proliferatiiviset esto mitattiin eri ajankohtina hoidon jälkeen tarkkailla vähitellen aktiivinen prosessi. Koko Kokeet toistettiin kolme kertaa.

mittaaminen solujen elinkelpoisuuden ja proliferatiivinen esto

PANC-1 solut altistettiin nsPEF ja sitten viljeltiin. 2 x 10

5 solut altistettiin nsPEF eriasteisesti ja sen jälkeen viljelty 0, 0,5, 1, 2, 24 ja 48 tuntia vastaavasti. Solut trypsinoitiin ja elävät solut laskettiin solun elinkelpoisuuden analysaattorin (Vi-solu, Backman). Kun oli inkuboitu 24, 48 ja 72 tuntia vastaavasti, solut laskettiin Cell Counting Kit-8 (CCK-8) määritys (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani) valmistajan ohjeiden, mikä soluproliferaatioon inhibition.

Detection of cell metastaasin ja invaasion kyky kanssa transwell määrityksessä

1 h kuluttua nsPEF hoidon, käsitelty selviytymisen solut sama määrä saatiin suorittaa transwell määritykset, jotka perustuvat transwell kammioiden (Millipore, USA), mikä solu etäpesäke ja invaasio kyky, kuten aiemmin on kuvattu [14].

Observation solujen hienorakenteet TEM

1 h kuluttua nsPEF hoidon, käsitellyt solut saatiin ja kiinnitettiin 2,5% glutaraldehydillä tarkkailla solun ultrastruktuuri trans- (TEM) Imaging Facility Core palvelut, Zhejiangin yliopiston lääketieteellisessä, kuten aiemmin on kuvattu [15].

määritys DNA: n fragmentoituminen DNA tikkaat määrityksen

1 h jälkeen nsPEF hoidon, käsitellyt solut saatiin tutkia solun DNA: n fragmentoituminen DNA-tikkaat mukainen määritys valmistajan ohjeiden kuten aikaisemmin on kuvattu [11].

mittaus yksisoluiset apoptoosin TUNEL-määrityksellä

At 1 h kuluttua nsPEF hoidon, käsitellyt solut saatiin määrittää yhden solun apoptoosin käyttäen määrityksessä TdT-dUTP Terminal Nick-end Labeling (TUNEL), jossa

In situ

Cell Death Detection Kit (Millipore, USA) valmistajan ohjeen, kuten aiemmin on kuvattu [14].

havaitseminen apoptoosin virtaussytometrillä

1 h kuluttua nsPEF hoidon, käsitellyt solut saatiin havaita solujen apoptoosia anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences), kuten aiemmin on kuvattu [16].

analyysi solusyklin virtaussytometrillä

1 h kuluttua nsPEF hoidon, käsitellyt solut saatiin sen määrittää solukierron muutoksen. Solusyklin määritys ja analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [17].

Western blotting -analyysi

1 h kuluttua nsPEF hoidon, käsitellyt solut saatiin poimia proteiinia. Proteiini uuttamalla ja Western blotting -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [18]. Ensisijainen vasta-aineet ja yksityiskohdat ovat taulukossa S1.

Kasvain induktio nude-hiirissä kanssa Hep-3B solujen

5 viikkoa nude-hiiret ostettiin Shanghai Experimental Animal Centre, Kiina Academy of Science . Koe-eläimet pidettiin Keski eläinyksikön Zhejiangin yliopistossa School of Medicine ja majoitettu laminar- fl ow kaappien alle erity fi c patogeenittomassa olosuhteissa 22 ° C: ssa 12 tunnin valo /pimeä sykli. Kaikki hiiret nukutettiin ketamiinin (100 mg /kg intraperitoneaalisesti). Tuumoreita kantavaa hiirtä malleja lävitse injektio 2 x 10

6 Hep-3B solujen oikeaan vatsan hiirillä. 1 viikon kuluttua solujen injektion, kasvain oli tyypillisesti 3 mm leveä ja oli näytteillä angiogeneesiä. Kun kasvaimet kasvoivat 10 mm leveä tai useamman — tyypillisesti noin 4 viikon kuluttua solujen injektion, 50 tuumoreita kantavaa hiirtä malleja onnistunut ja jaettu kahteen ryhmään: Kontrolliryhmä (n = 17) ja nsPEF ryhmä (n = 33) . Hiiristä nsPEF ryhmässä altistettiin nsPEF (kuva S1 D 0.05.

Tulokset ja keskustelu

Huolimatta intensiivisesti syövät hoitokäytännöissä, eloonjäämisasteesta joidenkin syöpien ei ole merkittävästi parantunut viime vuosina, kuten haimasyöpä [2], eturauhasen karsinooma [20] ja keuhkosyövän [21]. Novel hoidon strategioita siis kipeästi tarvitaan syöpien ja pitkän potilaiden selviytymiseen. Aikana monivaiheinen kehittäminen, ihmisen syövissä hankkia kymmenen biologisia tunnusmerkkejä mukaan lukien vastustavat solukuoleman, ylläpitävä proliferatiivinen signalointi, aktivoimalla invaasio ja metastaasi, joka mahdollistaa replikatiivisia kuolemattomuus, kiertää kasvu vaimentimet, angiogeneesin, kyseeseen energia-aineenvaihduntaan, kiertää immuuni tuhoutuminen, kasvain edistäviä tulehdus, ja genomin epävakaus ja mutaatio [22,23]. Nämä tunnusmerkkejä muodostavat järjestää periaate rationalisoinnille monimutkaisuutta neoplastisten sairauksien ja myös tullut pääkohteita syöpätutkimukseen ja hoitostrategioita. Suhteellisen uusi tekniikka tulkita syöpä, nsPEF on tehokas erilaisissa solulinjoissa

in vitro

[5,9,10], ja B16F10 melanooma ja maksasyövän [11,24], sekä ihmisen haiman karsinooma [25]

in vivo

, jotka osoittavat mahdollisen soveltamisen mahdollisuuden nsPEF syöpähoitoa varten. Kuitenkin vasta nyt, se jää epäselväksi molekyylimekanismeihin of nsPEF on syöpiin.

Tässä tutkimuksessa käytimme syöpä malleja sekä

in vitro

ja

in vivo

kokeissa etsimään mahdollisia molekyylimekanismeja.

NsPEF aiheuttama syöpäsolujen kuolemaa ja proliferatiivinen esto

in vitro

Voit osoite vaikutusta nsPEF in PANC-1-solut, solut altistettiin nsPEF jossa sähkökenttä 0, 20, 40 ja 60 kV /cm (kuvio 1A). Nopeus Elävien solujen /kontrolli havaittiin laskemalla trypansininen negatiivisia solut 0h, 0,5 tuntia, 1h ja 2h post pulssi (kuvio 1 B). Huomasimme, että elävät solut lähettää pulssi merkittävästi vähentynyt verrattuna kontrolliin (p 0,001), mutta aika-riippuvaisella tavalla ja annosriippuvaisesti Tämän alennetun suuntausta ei havaittu lyhyessä ajassa post pulssi, ainakin sisällä 2h. Lisäksi käsiteltyjä soluja viljeltiin 24 tunnin ajan ja 48 tuntia, ja sitten lasketaan vastaavasti. Olemme havainneet, että elävät solut myös vähensi huomattavasti verrattuna kontrolliryhmään (molemmat p 0,001) (kuvio 1 C 0,001. (C ja D) määrä sekä elävät solut laskettiin altistuksen jälkeen nsPEF eriasteisesti 24 h ja 48 h vastaavasti. * P 0,05, *** p 0,001. (E) mukaan CCK-8 määritystä inhibiitionopeudet solujen lisääntymistä indusoitu nsPEF eriasteisesti havaittiin. ** P 0,01.

NsPEF indusoi apoptoosin kautta riippuvainen-mitokondriot luontainen apoptoottista koulutusjakson

in vitro

Ensimmäinen, tutkimaan kuolemaan ominaisuuksien aiheuttama nsPEF haimakarsinooma- soluissa, havaitsimme morfologian muutoksia solujen käsittelyn jälkeen TEM: llä (kuvio 2A). Apoptoottista ominaisuudet soluja havaittiin harvoin kontrolliryhmässä (0kV /cm). Kuitenkin käsitelty solut 20kV /cm nsPEF alkoi esitellä solumorfologialtaan muuttaminen varhaisen apoptoosin: ydin- kutistuminen, ydinvoima lovi, kromatiinin kondensaatio ja marginaatioon ja pieniä mitokondrioita rappeuma. Alle vaikutus 40 kV /cm nsPEF, lisämuutoksia havaittiin, lähinnä lukien kromatiinin paakkuuntuu, sytoplasma tiivistymistä ja jotkut vacuoles esiintyvät solukalvon tai solulimassa. Samaan aikaan, ydin- fragmentit ja solulimassa aineosat pakataan apoptoottisia kappaleita, ja mitokondriot osoitti vakuolaarisen rappeuma. Kun sähkökentät kasvoi jopa 60 kV /cm, käsitellyt solut esitetään kalvo lyysi, tumakalvoa kupliminen, ydin- lyysin ja pirstoutumisen sekä mitokondriot vahinkoja, joita tyypillisesti pidetään kuolion.

(A) morfologiset muutokset syöpään solut altistetaan nsPEF eriasteisesti havaittiin solujen transmissioelektronimikroskopia (TEM). N: ydinvoima muutokset kuten ydinaseiden kutistuminen, tumakalvoa kupliminen ja ydinvoiman hajoamiseen. M: mitokondrioissa rappeuma tai vakuolaarisen rappeuma. (B) Yhden solun apoptoosin syöpäsolujen altistuvat nsPEF eriasteisesti on laskettu solu TUNEL määrityksessä. Alkuperäinen suurennus, 400 ×. *** P 0,001. (C) Cell DNA: n fragmentoituminen syöpäsolujen altistuvat nsPEF havaittiin apoptoosin DNA tikkaat määrityksessä. (D) Apoptosis hinnat syöpäsolujen alttiina nsPEF eriasteisesti testattiin PI ja anneksiini-V-värjäyksellä määritys virtaussytometrillä. Tulokset analysoitiin FlowJo 7.6.1 Software. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. (E) Proteiini ilmauksia anti- /pro-apoptoosi Bcl-2-perheen, sytokromi C ja kaspaasi-3 syöpäsoluissa altistuksen jälkeen nsPEF eriasteisesti havaittiin Western-blot-määritystä. Suhteellinen intensiteetti kunkin proteiinin analysoitiin Photoshop CS4 ohjelmisto. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

Myöhemmin olemme tutkineet DNA-vaurioita ja pirstoutumista TUNEL määritys ja apoptoosin DNA tikkaat määrityksessä. Tunelin värjäys, tarrat yhteenlaskettu vaurioitunut sivustoja DNA, ja apoptoottiset solut värjättiin ruskehtavan keltainen. Havaitsimme, että TUNEL positiivisten oli ilmeisesti nousemassa PANC-1-soluissa pulssi 20, 40, ja 60 kV /cm kontrolliin verrattuna, vastaavasti (kaikki p 0,001) (kuvio 2B). Yhdenmukainen TUNEL tuloksia, DNA pirstoutuminen esitetty PANC-1-solut altistettiin nsPEF 20 ja 40 kV /cm verrattuna positiiviseen kontrolliin ja negatiivisen kontrollin DNA ladder määrityksessä (kuvio 2C).

tutkimiseksi edelleen apoptoottista asteen syöpäsoluissa lähettää pulssin, testasimme apoptoottinen hinnat käsiteltyjen solujen anneksiini V /PI-värjäys virtaussytometrialla (kuvio 2D). Kontrolliin verrattuna, määrä anneksiini V

pi

– soluja (elävät solut) oli merkittävästi vähentynyt altistuksen jälkeen nsPEF, mutta määrä anneksiini V

+ PI

– soluja (varhainen apoptoosin) oli huomattavasti kasvanut 20 kV /cm (p 0,001), ja sitten laski merkittävästi 40 kV /cm (p 0,05) ja 60 kV /cm (p 0,01). Jyrkästi, määrä anneksiini V

+ PI

+ soluja (myöhäinen apoptoosin tai nekroosin) oli jatkuvasti kasvavat annoksesta riippuen 20, 40 ja 60 kV /cm (kaikki p 0,01). Nämä tiedot viittasivat solujen kuoleman aiheuttama nsPEF esitetään varhaisesta apoptoosin myöhään apoptoosin tai nekroosin lisääntynyt intensiteettejä nsPEF, toisin sanoen annos-riippuvuus. Nämä tulokset olivat identtiset havaintomme kautta solun TEM.

Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että apoptoosin tärkeä rooli solukuoleman aiheuttama nsPEF [11,26]. Yhdenmukainen Näiden tutkimusten löysimme apoptoottinen ruumiin ja mitokondriot rappeuma TEM jälkeen nsPEF hoidon. Lisäksi tulokset TUNEL määrityksen, apoptoosin DNA tikkaat määritys ja anneksiini V /PI-värjäys osoitti myös indusoiman apoptoosin nsPEF in PANC-1-soluissa. Joissakin tutkimuksissa [5,9] kertoi, että syöpäsolun kuoleman aiheuttama nsPEF oli pääasiassa johtuvan apoptoosin, ja tulkitaan, että kasvu anneksiini V

+ PI

+ solujen annoksesta riippuen voidaan katsoa johtuvan erityinen ”matkii kuolion ”että suuri annos pulssi aiheuttama isompi reikiä solukalvojen ja sitten PI tahra tuli soluja. Kuitenkin meidän lisänäyttöä kautta solu TEM osoittaneet, että solukuolema esitetään varhaisesta apoptoosin myöhään apoptoosin tai nekroosin lisääntynyt intensiivisyys nsPEF, ei vain apoptoosia.

luontainen indusoiman apoptoosin stressi-asiakkuutta ärsykkeisiin ja ulkoisten apoptoosin kautta kuolema reseptorin aktivaation kaksi pääasiallista polkuja apoptoosin. Mitokondrioita toiminto ja anti- /pro-apoptoosi Bcl-2-proteiinien perhe on olennaiset roolit luontainen apoptoosireitin [27]. Anti /pro-apoptoosi Bcl-2-proteiinien perheenjäsenet ovat aluksi kiinteä kalvo proteiineja löytyy mitokondrioissa Endoplasmakalvosto (ER), tai tumakalvoa [28]. Merkittävä aktivoiva päällä Bcl-2-proteiinien on mitokondrion kalvon [27]. Tutkia mahdollisia mekanismeja indusoiman apoptoosin nsPEF, havaitsimme suhteellinen proteiinien ilmentyminen luontaisen apoptoottisen reitin, kuten pro-apoptoosi Bcl-2-perheen proteiinit (Bad, p-Bad, Bax, Bik, Bim, BID, Bak ja Puma) , pro-selviytymisen Bcl-2-perheen proteiinit (p-Bcl-2, Bcl-2, Bcl-x L ja Mcl-1), ja apoptoosia suoraan suhteessa proteiineja (sytokromi-C ja kaspaasi-3) (kuvio 2E). Kontrolliin verrattuna, ilmauksia anti-apoptoosin Bcl-2-perheen proteiinit, lähinnä lukien p-Bcl-2, Bcl-x L ja Mcl-1, vähenivät huomattavasti eri astetta, kun taas ilmaisuja pro-apoptoosi-Bcl-2-perheen proteiinien , lähinnä lukien Bax, Bim ja BID, olivat selvästi kohonneet eriasteisia lisääntynyt intensiivisyys nsPEF. Samaan aikaan ilmauksia sytokromi-C ja kaspaasi-3 oli ilmeisesti lisännyt altistumisen jälkeen nsPEF. Olemme päätellä, että indusoiman apoptoosin nsPEF sai aikaan säätelemällä epätasapaino anti- tai pro-apoptoosi-Bcl-2-perheen proteiinien mitokondrion kalvon. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​mitokondrioita rappeutuminen ja vahinkoja solujen ultra-rakenne. Yhdessä nämä apoptoottisia tiedot osoittivat, että nsPEF indusoi apoptoosia PANC-1-solujen avulla riippuu mitokondrion luontainen apoptoosireittiä joka laukaisi epätasapaino anti- tai pro-apoptoosi-Bcl-2-perheen proteiineihin.

NsPEF esti solujen lisääntymistä kautta tukahduttaa NF-KB signalointireitin

in vitro

lisäksi apoptoosin, nsPEF oli merkittävä vaikutus soluproliferaatioon meidän CCK-8 määritys että esto soluproliferaation oli huomattavasti kasvanut tavalla annos-riippuvuuden ja aika-riippuvuus jälkeen 48 h pulssin. Solusyklin, käännös vaiheesta G1 vaiheeseen S ja prosenttiosuus vaiheen G2 /M tyypillisesti kuvastaa soluproliferatiivisen kyky. Tutkimme solusyklin käsiteltyjen solujen, ja totesi, että prosenttiosuus vaiheen G1 ilmeisesti lisääntyi (p 0,01), kun taas prosenttiosuus vaiheessa G2 /M aleni (p 0,05) altistumisen jälkeen nsPEF (kuvio 3A), joka osoittaa, että nsPEF voisi pidättää vaiheen G1 solusyklin inhiboida soluproliferaatiota.

(A) Cell cycle syöpäsolujen alttiina nsPEF eriasteisesti tutkittiin PI-värjäyksellä määritys virtaussytometrillä, ja tulokset analysoitiin FlowJo 7,6 0,1 Software. * P 0,05, ** p 0,01. (B) Proteiinin ilmaisuja NF-KB: n signalointireitin lukien IKK-α, IKK-β IKB-α, p65 ja p-p65 syöpäsoluissa altistuksen jälkeen nsPEF eriasteisesti havaittiin Western-blot-määritystä. (C) proteiini ilmauksia sykliini proteiinien, mukaan lukien sykliini D1 ja sykliini syöpäsoluissa altistuksen jälkeen nsPEF eriasteisesti havaittiin Western-blot-määritystä. Suhteellinen intensiteetti kunkin proteiinin analysoitiin Photoshop CS4 ohjelmisto. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

NF-KB-signalointireitin on tärkeä rooli solujen lisääntymisen [29]. Syövän kasvun inhibitio kautta estämällä NF-KB: n reitin on viime aikoina raportoitu useissa ihmisen karsinoomien, kuten paksusuolen [30], keuhkosyöpä [31] ja rintojen [32]. Tavoitteena säätelevien geenien solujen lisääntymistä kautta NF-KB-reitin sisältävät c-Myc, CyclinD1, sykliini E ja CDK2 joka on keskeinen rooli positiivinen tai negatiivinen säätely solusyklin [33,34]. Tutkimaan edelleen mahdollisia mekanismeja proliferatiivisten passiivisuudesta pulssi soluja, havaitsimme ilmauksia NF-KB signalointireittiä proteiinit ja sykliini proteiinien PANC-1-soluissa. Tuloksemme paljasti, että ilmaukset NF-KB-reitin proteiinit kuten IKK-α, IKK-β, IKB-α, NF-KB p-65 ja p-p65 olivat ilmeisesti väheni altistumisen jälkeen nsPEF verrattuna kontrolliryhmään (kaikki p 0,01 tai 0,001) (kuvio 3B). Suurempi intensiteetti nsPEF johti paljon pienempi ilmaisuja näiden proteiinien kontrolliin verrattuna. Samaan aikaan ilmauksia sykliini proteiinien kuten CyclinD1 ja sykliini vähenivät merkittävästi altistumisen jälkeen nsPEF verrattuna kontrolliryhmään (p 0,01, 0,001 tai 0,05) (kuvio 3C). Niinpä me katsoi nsPEF voisi laskea NF-KB signalointireitistä vähentää ilmauksia sykliini proteiineja.

Nämä tiedot osoittivat, että nsPEF estivät solujen proliferaatiota kautta tukahduttaa NF-KB signalointireitistä vähentää ilmauksia sykliini proteiineja, mikä pidätti vaihe G1 solusykliä.

NsPEF inaktivoidun solumigraatioon ja invaasion kautta tukahduttamalla Wnt /β-kateniinin signalointireitistä

in vitro

aktivointi etäpesäkkeiden ja invaasio on tärkeä tuntomerkki syöpä [22,23]. Aste etäpesäke ja invaasio on standardi luokitella vaiheeseen pahanlaatuinen kasvain, ja myös suoraan määrittää hoitostrategioiden syöpien ja potilaiden selviytymiseen [35]. , Joten me havainneet kykyä maahanmuuton ja invaasion syöpäsolujen käsittelyn jälkeen. Tutkimuksessamme muuttoliike kyky syöpäsolujen lähettää pulssi voimakkaasti kaataa verrattuna valvonta Trans-hyvin määritys (p 0,001) (kuvio 4A). Lisäksi olemme havainneet, että syöpäsoluja altistetaan nsPEF hallussaan merkittävästi heikko kyky hyökätä verrattuna kontrolliin käyttäen Matrigel invaasiomääritys (p 0,001) (kuvio 4B). Nämä tulokset osoittivat, että nsPEF saattaa vähentää solujen etäpesäke ja hyökkäyksen syövissä.

(A) Migration kyky syöpäsolujen altistuvat nsPEF testattiin trans-hyvin määritys. Siirrettyjä soluja altistetaan nsPEF värjättiin violetti 0,1% kristalliviolettiliuoksella, tarkasteltiin valomikroskoopilla 40 tai 400 suurennoksia, ja laskettiin tilastolliseen analyysiin. Alkuperäinen suurennus, 40 x 400 ×. *** P 0,001. (B) Invasion kyky syöpäsolujen alttiina nsPEF havaittiin käyttäen matrigeeliä invaasiomääritys. Sen jälkeen nsPEF hoito, solut hallussaan invaasio kyky lävistää matrigeelin, värjättiin violetti 0,1% kristalliviolettiliuoksella, ja laskettiin tilastolliseen analyysiin. Alkuperäinen suurennus, 40 x 400 ×. *** P 0,001. (C) proteiini ilmauksia Wnt /β-kateniinin signalointireitistä lukien hDPR1, β-kateniinin ja c-Myc syöpäsoluissa altistuksen jälkeen nsPEF eriasteisesti havaittiin Western-blot-määritystä. (D) proteiini ilmauksia MMP perheen ja VEGF syöpäsoluissa altistuksen jälkeen nsPEF eriasteisesti havaittiin Western-blot-määritystä. Suhteellinen intensiteetti kunkin proteiinin analysoitiin Photoshop CS4 ohjelmisto. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

Kertyneet todisteet ovat osoittaneet, että Wnt /β-kateniinin signalointireitistä on kriittinen rooli alkion kehitykseen ihmisen oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [36]. Toimet Wnt /β-kateniinin signalointireitin kohdesoluihin pääasiassa muutoksia geenien ilmentymisessä, solujen polarisaatio, muuttoliike ja hyökkäyksen kautta sääntelyn erillisiä loppupään reagoivat molekyylit [37]. Koska alavirtavaikuttajainhibiittorit Wnt /β-kateniinin signalointireitin, MMP proteiinit ja VEGF on keskeinen rooli kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [38]. Niinpä havaitsimme proteiinin ilmentymiä Wnt /β-kateniinin signalointireitistä, MMP perhe ja VEGF. Huomasimme, että ilmaukset Wnt /β-kateniinin signalointireitistä proteiineja lähinnä lukien hDPR1, β-kateniinin ja c-Myc syöpäsoluissa altistuvat nsPEF oli huomattavasti vähentynyt annoksesta riippuvuus verrattuna kontrolliryhmään (p 0,05 at 20 kV /cm, p 0,001 at 60 kV /cm) (kuvio 4C). Lisäksi tulokset osoittivat myös, että ilmaukset VEGF ja MMP proteiinit lähinnä lukien MMP-1, MMP2, MMP9, MMP11, MMP-12, MMP14 ja MMP21 vähensi merkittävästi eri asteen eri voimakkuudet nsPEF verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 4D). Joten ajattelimme että nsPEF voisi tukahduttaa Wnt /β-kateniinin signalointireitin alas-säädellä geeniekspressioiden VEGF ja MMP proteiinit.

Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että nsPEF voisi inaktivoivat etäpesäkkeitä ja invaasiota kyvyt syöpäsolujen estämällä Wnt /β-kateniinin signalointireitin alas-säädellä geeniekspressioiden VEGF ja MMP proteiinit.

NsPEF toimivat turvallisesti ja tehokkaasti kuin kasvainhoitojen

in vivo

Käytössä perusteella

in vitro

kokeessa nsPEF voivat aiheuttaa solujen apoptoosin, estävät solujen lisääntymistä, ja inaktivoivat metastaasi ja invaasio. Edelleen tunnistaa kasvaimen vastainen toiminta nsPEF, teimme nsPEF kokeilu ektooppisen on kasvain malli. Kohdunulkoinen kasvainmuoto on pilottitutkimus varten syvällisempää potilaalle tehdä malli, paremmin heijastaa kliinisiä sovelluksia.

aikana koko eläinkoe, 2 hiiret nsPEF ryhmässä kuoli yli-annos anestesian ja 1 ohjaus kuoli epäselvä syistä. Havaitsimme selviytymisen ehto loput 47 on kasvain (16 Ohjaus ja 31 nsPEF ryhmässä), ja totesi, että nsPEF ylläpidetään hiiret normaalia liikuntaa ja ei ollut vaikutusta hiirten paino (kuvio 5A), mikä osoittaa, että anti kasvain toiminta nsPEF oli turvallinen laitos itse

in vivo

.