Krooninen sairaus

tiivistelmä

solunpintaproteiinit CD133, CD24 ja CD44 ovat otaksuttu markkereita syövän kantasolupopulaatioita paksusuolisyövän liittyvät aggressiivinen syöpätyyppeihin ja huonon ennusteen. On tärkeää ymmärtää, miten nämä merkit voidaan ennustaa hoitotuloksia, vaikuttavat tekijät, kuten radioresistance. Laajuus Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida yhteys EGFR, CD133, CD24, ja CD44 (myös isoformit) ekspressiotasot ja säteilyherkkyydestä, ja lisäksi analysoida vaikutusta AKT-isoformien ilmenemistä malleja näistä merkeistä, ymmärtää paremmin taustalla molekyylitason mekanismeja solussa. Kolme paksusuolensyöpä solulinjojen käytettiin, HT-29, DLD-1, ja HCT116 yhdessä DLD-1 isogeenisestä

AKT

knock-out solu-linjat. Kaikki kolme solulinjat (HT-29, HCT116 ja DLD-1) ilmaisi vaihtelevia määriä CD133, CD24 ja CD44 ja kymmenen prosenttia CD133 ja CD44 ilmentävien solujen (CD133

korkea /CD44

korkea) olivat vastustuskykyisempiä gammasäteilyn kuin kymmenen prosenttia alhaisimman ilme (CD133

pieni /CD44

alhainen). Akt ilmentyminen oli alempi osa solujen alhainen CD133 /CD44. Ehtyminen AKT1 tai AKT2 käyttäen knock out solut osoittivat ensimmäistä kertaa, että CD133 ilmentyminen liittyi AKT1 muttei AKT2, kun taas CD44 ilmentyminen vaikutti läsnäolo joko AKT1 tai AKT2. Oli useita geenejä soluadheesion kulkureitti oli merkittävästi korkeampi ilmaisun

AKT

2 KO cell-line verrattuna

AKT

1 KO cell-line; kuitenkin tärkeää geenien epiteelin ja mesenkymaalitransitioon polku (

CDH1

,

VIM, TWIST1, SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, FN1, FOXC2

ja

CDH2) B teki poiketa toisistaan. Tuloksemme osoittavat, että CD133

korkea /CD44

korkea ilmentävien koolonkarsinoomasoluissa liittyy AKT ja lisääntynyt säteilyn kestävyys, ja että eri AKT isoformit on erilaisia ​​vaikutuksia ilmaus syövän kantasolujen markkereita, mikä on tärkeä näkökohta kun kohdistaminen AKT kliinisessä ympäristössä.

Citation: Sahlberg SH, Spiegelberg D, Glimelius B, Stenerlöw B, Nestor M (2014) Evaluation of Cancer Stem Cell tussit CD133, CD44, CD24: Assosiaatio AKT isoformien ja säteily Resistance in koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 9 (4): e94621. doi: 10,1371 /journal.pone.0094621

Toimittaja: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 syyskuu 2013; Hyväksytty: 19 maaliskuu 2014; Julkaistu 23. huhtikuuta 2014

Copyright: © 2014 Sahlberg et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on rahoittaa avustuksin Ruotsin Cancer Society, www.cancerfonden.se. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on yksi yleisimmistä diagnosoitu pahanlaatuinen kasvain maailmassa. Useat tutkimukset ovat tunnistaneet alapopulaatioista peräsuolen syövän solut, jotka ovat vastustuskykyisempiä syövän hoitojen, kuten kemoterapeuttiset aineet ja säteily [1], [2]. Onnistunut hoito riippuu poistamista näiden erittäin kestävä alapopulaatioiden, eikä vain tärkeimmät kasvain massa. Näitä soluja kutsutaan usein syövän kantasoluja tai kasvaimeen aloittamista soluja ja useat solun pinnan markkereita on osoitettu ilmaistaan ​​näiden solupopulaatioiden [3]. CD133, CD44 ja CD24 kolme ehdotettua kantasolujen merkkiaineita kolorektaalisyövässä, mutta masentavan jakautuminen vaihtelee potilaiden ja kasvainsolulinjoissa [4]. Siksi on erittäin kiinnostunut ymmärtää niiden toiminta ja miten biomarkkerit ovat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa.

CD24 on solun pinnan proteiini, joka on ankkuroitu ulkoiseen puolella solukalvon. Sen uskotaan olevan tärkeä rooli solujen erilaistumiseen, ja se on myös ilmaistu osallistuvien solujen immuunijärjestelmän, kuten B-lymfosyyttien, jossa se säätelee positiivisesti leviämisen aktivoitujen T-solujen. CD24 ilmentyminen kuvataan myös keskushermostossa [5]. Jakelu peräsuolen syöpä on alle riita, vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että välillä 50 ja 68% potilaista kärsii kolorektaalisyövissä ilmaisivat CD24 suuressa määrin [5], [6], ja edelleen, että CD24 positiivinen osapopulaatioiden paksusuolen syöpäsolu -Lines hallussaan kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia [7]. Sen sijaan, kasvaimen aloittamista soluja pään ja kaulan ja rintasyövän on osoitettu olevan CD24-negatiivinen [8], [9].

CD133 (kutsutaan myös Prominin-1) uskotaan liittyvän tuumorigeenisyyteen ja taudin etenemistä. Ylös-sääntely CD133 kolorektaalisyövässä korreloi voimakkaasti huonon ennusteen ja synkronisen maksan etäpesäke [10], vaikka tarkka asema ja tehtävä CD133 ei tunneta.

CD44 on rooli helpottamalla solusta soluun ja soluväliaineen vuorovaikutuksia kautta affiniteetti hyaluronihappoa ja on mukana solun tarttumisen ja kokoaminen kasvutekijöiden solun pinnalla. CD44 koodaa yksittäinen geeni, mukaan lukien 20 eksonit. Vakiolomake (kutsutaan CD44s) koostuu eksonin 1-5 ja 15-20. Muuttujan eksonit tunnistetaan v1-v10, vastaavasti. Tasauspyörästön hyödyntäminen 10 variantin eksonit generoi useita CD44 variantteja (CD44v) erilaisilla yhdistelmillä variantin eksonin tuotteita. Erilaisia ​​isomuotoja CD44 syntyy insertoimalla yksi tai useampi variantti eksonit yhteisen runkoverkon jakavat kaikki muodot CD44. Rooli näiden variantti isomuotojen ei täysin ymmärretä, vaikka jotkut uskotaan välittävän kriittinen vaihe paksusuolensyöpä etäpesäkkeiden [8], [11], [12]. CD44 voidaan käyttää samanaikaisesti immunosaostettiin perheeseen ErB reseptorityrosiinikinaasien kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja se toimii vuorovaikutuksessa HER2, HER3- ja HER4 [8], [13]. EGFR uskotaan olevan tärkeä rooli säätelyssä ja ylläpitää syövän kantasoluja, pääasiassa alavirtaan signaloinnin Phospho-inositoli 3 kinaasi (PI3K) /AKT-reitin [14], [15].

AKT on seriini /treoniini-kinaasi, jossa on kolme eri isoformeja, AKT1, AKT2 ja AKT3, ilmaistaan ​​kolmesta eri geenejä ja aktivoi monia ärsykkeet, kuten useita kasvutekijän reseptoreita (esimerkiksi EGFR), B- ja T-solujen reseptoreihin. Sillä on keskeinen rooli monissa solun toimintoja vastaavat lisääntymistä, eloonjääntiä, kasvua, anti-apoptoosin, glukoosin ottoon, aineenvaihduntaan, angiogeneesi ja radioresistance [16]. AKT uskotaan myös olevan osallisena epiteelisolujen ja mesenkymaalitransitioon (EMT) polku, joka johtaa lisääntyneeseen liikkuvuuteen, vähentää solujen välistä adheesiota, kasvaimen etenemisen ja pahanlaatuisiksi. EMT reitti on siis mukana syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden [17]. Indusoijien EMT, kuten reseptorin tyrosiinikinaasin ligandeja tai transformoiva kasvutekijä beeta (TGF), Wnt ja Notch, laukaisee cascade solu-signalointia, joka johtaa tukahduttaminen soluadheesion proteiini E-kadheriinin. Prosessissa säätely ylöspäin suoran toimii transkriptiorepresso- kuten Snail, Slug, Forkhead laatikko C2 ja Zeb1, Zeb2 sekä Twist ja E47, joka epäsuorasti tukahduttavat E-kadheriinin. Muut markkerit EMT ovat N-kadheriinin, vimentiinistä ja fibronektiinin-1, jotka ilmentyvät mesenkyymisolujen [18]. EMT on myös osoitettu olevan osallisena syövän kantasolujen jossa koolonsyöpäsoluihin suurella ilmaus CD133 /CD44 osoitti EMT jälkeen pitkän aikavälin kulttuuri [18], [19].

AKT on ehdotettu voidaan koekspressoitu CD133, joka tarjoaa CD133 ilmentäviä solupopulaation kanssa suurempi vastustuskyky kemoterapeuttisia, mutta yksityiskohtia tästä vuorovaikutuksesta ei tunneta [20], [21]. CD44 uskotaan negatiivisesti korreloivan AKT [22]. Kuitenkin, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että AKT on sen sijaan fosforyloitu kun stimuloimalla CD44 ligandin kanssa, mikä aiheuttaa solun selviytymisen vaikutus [23] – [25], ja on todennäköistä, että CD44-isoformeja on säätelevä rooli pystyy sekä aktivoida ja tukahduttaa aktivointi AKT. Säteily itsessään on myös osoitettu lisäävän ilmentymistä AKT, CD133, ja vähentää ilmentymistä CD44 peräsuolen syövän soluihin [26]. Kuitenkin on tärkeää, että eri AKT isoformeja on CD133 tai CD44 ilmaisua ei ole aiemmin tutkittu.

Olemme äskettäin osoittaneet, että sekä AKT1 ja AKT2 ovat tärkeitä vastauksena säteily [27]. Koputtaa-out joko

AKT

1 tai

AKT

2, tai molempia samanaikaisesti, lisäsi säteilyherkkyydestä ja DNA kaksijuosteisen palaa-korko oli heikentynyt

AKT

1 /2 KO cell-line. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet erot ekspressiomalleja CD133, CD24, CD44 ja EGFR kolmessa paksusuolisyövän solulinjoja; HT-29, HCT116 ja DLD-1. Olemme myös analysoineet säteilyn herkkyys koolonkarsinoomasoluissa lajiteltu CD133

korkea /CD44

korkea ja CD133

pieni /CD44

heikkoa ilmentymistä, ja tutki tarkemmin vaikutuksen kaksi AKT isoformia (AKT1 , AKT2) on CD133 ja CD44 ilme, mukaan lukien CD44 silmukointivariantti isoformit. AKT3 ei ilmenny tutkituissa solulinjoissa, ja tästä syystä se jätettiin. Lisäksi me validoitu vaikutus AKT geenien ilmentymisen suuressa mittakaavassa transcriptomic analysoidaan eri reittejä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

paksusuolen syöpä solu- linjat HT-29 ja HCT116 hankittiin American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), luettelonumerot ATCC CCL-221 ja ATCC CCL-247, vastaavasti. DLD-1 X-MAN isogeenisiin solulinjoja saatiin Horizon Discovery Oy: n eri AKT isoformeja geneettisesti tippuu-out, luettelonumero HD-R00-001, HD-R00-002 ja HD-R00-003. Soluja viljeltiin 75 cm

2 viljelypulloihin (Nunclon pinta, Roskilde, Tanska) McCoyn 5A-alustassa (Flow Irvine, UK), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), 2 mM L-glutamiinia, 100IU /ml penisilliiniä ja 10 ug /ml streptomysiiniä (Biochrom kg, Berliini, Saksa). Soluja viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa ja käsiteltiin trypsiinillä trypsiini-EDTA, 0,25% trypsiiniä, 0,02% EDTA: a (Biochrom kg, Berliini, Saksa).

Cell lajittelu kanssa virtaussytometria

Virtaussytometriako- analyysissä solulinjojen kerättiin käyttämällä ei-entsymaattista soluhajotusprosessin ratkaisu (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) tai 0,25% trypsiiniä, 0,02% EDTA, (Biochrom kg , Berliini, Saksa). Sekoittamisen jälkeen suspension solujen solu-elatusaineet, solut laskettiin ja pestiin PBS: ssä, jossa oli 0,5% BSA: ta ja otettiin talteen sentrifugoimalla. Soluja inkuboitiin 10-30 minuuttia leimattujen vasta-aineiden, katso taulukko 1. Sen jälkeen, kun vasta-aine leimaamalla solut pestiin PBS: ssä, jossa oli 0,5% BSA: ta, ennen virtaussytometria-analyysi suoritettiin Sorp BD LSRII (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, USA). Kuolee ja kuolleet solut värjättiin propidiumjodidilla ja pois analyysistä. Kopiot ja kuolleet solut myös suljettu pois gating kanssa FSC ja SSC. Solujen lajittelu varten klonogeeniset määrityksessä FACSVantage SE DiVa tai FACSAriaIII Cell lajittelija (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, USA) käytettiin.

Cell-cycle Analysis

Solut kiinnittyneiden 70% etanolia, 30% PBS: ssä ja pidettiin -20 ° C: ssa vähintään 24 tunnin ajan. Soluja sentrifugoitiin 10 minuutin ajan, 2000G 4 ° C: ssa ja pestiin kahdesti PBS: lla ennen inkubaatiota 5 ug propidiumjodi- jodia /0,1% NP-40 (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) PBS: ssä, yhdessä 5 ug RNase (Sigma Aldrich St. Louis, USA) 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Analyysi tehtiin virtaussytometrialla (BD LSRII Biosciences).

klonogeeninen Pitoisuus

välinen yhteys ilmaus CD133 ja CD44 ja säteilyherkkyydestä arvioitiin lajittelemalla ja keräämällä CD133

high /CD44

korkea ja CD133

pieni /CD44

alhainen ilmentävien solujen. Solu määrä lajittelun jälkeen määritettiin solun laskuri (TC20 Automated solulaskijaa, Biorad Life science, Hercules, CA, USA)), ja tietty määrä soluja oli esi-levytettiin 25 cm

2 kudosviljelykolveissa. Seuraavana päivänä solut altistettiin ulkoisesti käytettävää säteilyä käyttäen

137Cs lähde (Best Theratronics Gammacell 40 Exactor, Springfield, USA). Sen jälkeen kun oli inkuboitu ajanjakso 8-14 päivää solut pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin 99,5% etanolissa 5-10 min. Pesäkkeet värjättiin Mayerin hema- (Histolab Products AB, Västra Frölunda, Ruotsi) 20-30 minuutin ajan ja sen jälkeen huuhdeltiin vedellä. Pesäkkeitä, joiden yli 50 solua pesäke laskettiin ja maljaustehokkuus (PE = pesäkkeiden lukumäärä käsittelemättömissä soluissa /solujen lukumäärä kylvetään) ja hengissäsäilymisosuus (SF = pesäkkeiden määrä käsitellyissä soluissa /kylvettyjen solujen lukumäärä x PE) laskettiin ja piirrettiin.

TILASTOANALYYSI

Virtaussytometria analyysit arvioitiin käyttämällä BD FACSDiva ohjelmisto 7.0 (BD Biosciences). Klonogeeniset määritys Aineisto käsiteltiin Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, Redmond) ja kaavioita piirrettiin ja analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, USA). Merkitsevyystasolla 95% oli käytetty. Tämä analyysi arvioi, onko hengissäsäilymisosuudet että säteilevän CD133 ja CD44 lajitellut solut olivat merkittävästi eroavat toisistaan ​​kunkin säteilyannoksen.

Western Blot

Soluja viljeltiin 3 cm petrimaljoille ssa vähintään kolme kaksinkertaistaa kertaa ennen lysation tai kolme erillistä solujen viljelmistä DLD-1 lajiteltiin virtaussytometrialla (katso edellä) ja tilavuus lyysipuskuria säädettiin solujen määrä kerätään kuhunkin pulloon. Lysaatit valmistettiin jälkikäsittelyä pesemällä solut jääkylmällä PBS: llä, minkä jälkeen lisättiin 10 000 000 solua /ml lyysipuskuria, joka sisälsi 1% Tween-20, 20 mM Tris (pH 8,0), 137 mMNaCl, 10% glyserolia, 2 mM EDTA, 1 mM aktivoitu natriumortovanadaattia (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) ja proteaasiestäjäseostabletit (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) ja inkuboitiin jäillä 30 min. Lysaatit sentrifugoitiin 10 min 4 ° C: ssa. Supernatantti siirrettiin uusiin putkiin, ja pelletti heitettiin pois. Proteiinipitoisuus lysaattia määritettiin BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce). Yhtä suuret määrät proteiinia, ladattiin Tris-asetaatti 3-8% SDS-PAGE-geelillä (Life Technologies, Carlsbad, CA) ja sen jälkeen siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Millipore) märkä-blottauksella. Nitroselluloosakalvolle blokattiin 1 tunnin ajan 5% BSA: ta, PBS: ssä ja sitten inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yön yli 4 ° C: ssa. Spesifistä vasta CD133 /1 (W6B3C1) oli Miltenyiltä biotekniikan (Heidelberg, Saksa) ja CD44 (103014) alkaen Biolegend (San Diego, CA, USA). Vasta-aineet FoxO3a (2497), fosfori-FoxO (2599) ja GSK-3B (9315) ja fosfo-GSK3b (9323) olivat kaikki peräisin Cell Signaling Technology (Beverly, MS, USA). AKT1 (sc55523 ja AKT2 (sc5270) oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta vastaan ​​β-aktiini (A5441) oli Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Pesun jälkeen PBS: ään 1% Tween-20, kaivoa inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-leimattua sekundaarista vasta-ainetta (626520 ja 656120) (Invitrogen, Camarillo, CA, USA) tai (405405) (Biolegend, San Diego, CA, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Immuno-reaktiiviset vyöhykkeet visualisoitiin CCD-kamera (SuperCCD HR, Fujifilm, Japani) käsittelyn jälkeen Immobilon elektro-kemiluminesenssi-liuosta (Millipore, Billerica, MA, USA) 5 minuuttia.

Microarray Expression Analysis

Kaksi erillistä kohtia DLD-1 vanhempien,

AKT

1 KO,

AKT

2 KO ja

AKT

1/2 KO soluja viljeltiin 70% yhtymäkohdassa ja RNA uutettiin (RNeasy mini-prep, Qiagen, Valencia, CA, USA) RNA-pitoisuus mitattiin ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) ja RNA laatu arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer järjestelmä (Agilent Technologies Inc, Palo Alto, CA). 250 nanogrammaa kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä käytettiin tuottavat monistetun ja biotinyloitua sense-juosteen cDNA koko ilmaistaan ​​genomin mukaan GeneChip WT PLUS Reagent Kit User Manual (P /N 703174 Rev 1 Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) . GeneChip HTA Arrays (GeneChip Human transcriptome Array 2.0) hybridisoitiin 16 tuntia 45 ° C: ssa inkubaattorissa, pyöritettiin nopeudella 60 rpm. Mukaan GeneChip- Expression Wash, Stain ja Scan Manual (PN 702731 Rev 3, Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) taulukot pestiin ja värjättiin käyttäen Fluidics Station 450 ja lopuksi skannataan GeneChip- Scanner 3000 7G.

Microarray data Analysis

raakadataa normalisoitui vapaiden ohjelmien Expression Console tarjoamia Affymetrix (https://www.affymetrix.com) käyttäen vankka multi-array keskiarvo (RMA) menetelmän ensimmäiseen ehdotti Li ja Wong vuonna 2001 [28], [29]. Myöhempi analyysi geenien ilmentyminen tietojen toteutettiin vapaasti käytettävissä tilastollinen tietojenkäsittely kielen R (https://www.r-project.org) käyttäen olevia paketteja Bioconductor hanke (www.bioconductor.org). Jotta etsiä ilmentyvät eri geenien välillä vanhempien ja

AKT

KO ryhmien empiirinen Bayes moderoitu t-testiä levitettiin sitten käyttämällä ”Limma” paketti [30]. Tämän ongelman ratkaisemiseksi useita testejä, p-arvot korjattiin käyttäen menetelmää Benjamini ja Hochberg [31]. Normalisoitu data arvioitiin edelleen käyttäen DAVID bioinformatiikka- resursseja 6,7 ​​yhdessä Kioto tietosanakirja geenien ja genomien (Kegg) reitin tietokanta (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) ja toiminnallisesti luokitella ja klusterin geenit liittyvä epiteeli- ja mesenkymaalitransitioon reittejä [32], [33].

vahvistus

AKT

1 ja

AKT

2 Knock-out PCR

kokonais-RNA eristettiin DLD-1 vanhempien,

AKT

1 KO,

AKT

2 KO ja

AKT

1/2 KO solujen RNeasy mini (Qiagen, Valencia , CA, USA). cDNA syntetisoitiin 0,1 ug kokonais-RNA käyttäen RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit satunnaisella heksameerialukkeita (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ja PCR suoritettiin Taq DNA Polymarese (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) alukkeita vastaan ​​AKT1 (fwd: AGGCTCCCCTCAACAACTTC, rev: CTCCTCCTCCTCCTGCTTCT) tai AKT2 (fwd: GGTGCCTCCTGCATGTCC, rev: CCTCTCGGTCTTCATCAGC).

transfektio siRNA vastaan ​​AKT1 DLD-1 Vanhempien Cells

soluja transfektoitu siAKT1 äänenvaimennin (Ambion Life Technologies, Carlsbad, CA) ja Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) (sense: 5 ’GCGUGACCAUGAACGAUUtt ja antisense: 5’AACUCGUUCAUGGUCACGCGG). Transfektoidut solut inkuboitiin 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa 48 tuntia ennen analysointia CD133, CD44 ja CD24 ilme virtaussytometrillä, katso edellä.

Re-aktivointi AKT1 tai AKT2 vuonna DLD-1

AKT

1/2 KO Cells

DLD-1

AKT

1/2 KO soluja viljeltiin yhtymäkohdassa 30-50% antibioottia ilmaiseksi McCoys cell media (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) 24 tuntia ennen transfektiota. Solut transfektoitiin pcDNA3 myr HA AKT1 ja pcDNA3 myr HA AKT2 plasmideja ystävällisesti William Sellers (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA) kautta Addgene (Cambridge, MA). Lipofectamine 2000 OptiMEMiin olivat Life technologies (Carlsbad, CA). Transfektoidut solut inkuboitiin 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa 72 tuntia ennen edelleen analysoimalla CD133, CD44 ja CD24 ilmaisun virtaussytometrillä, katso edellä.

Tulokset

CD133, CD44, CD24 ja EGFR ilmentäminen Colon Cancer Cell-linjat

CD133, CD44, CD24 ja EGFR kolmessa paksusuolisyövän solulinjoja analysoitiin virtaussytometrillä, katso kuva 1A. Oli ero ilmaisun CD133, CD44, CD24 ja EGFR välillä solu- linjat. CD44 näkyi yksi väestön ulottuu pienestä suureen ilmentyminen kaikissa kolmessa solulinjoja. Havaitsemiseksi CD24 ekspressio oli riippuvainen anti-CD24-vasta-aine. Korkein ilmentymä CD24 nähtiin HT-29-solujen kanssa 95% positiivisia soluja käyttämällä CD24-vasta-ainetta MACS), katso kuva 1B. CD133 on ilmaistu suurin osa HCT116-ja HT-29-soluja, kun taas vain 14% DLD-1-solut olivat positiivisia CD133. Kaikki kolme solulinjat ilmaisi EGFR. Noin 80% HT-29 ja HCT116 jossa positiivinen EGFR taas 40% oli positiivisia DLD-1.

A) HT-29, HCT116 ja DLD-1. Ilmaisu kuvioita pistekuvaajat ovat yhdestä edustavasta virtaussytometrillä kokeessa. Hila osoittaa marginaali korkean ja matalan proteiinin ekspression määritelty isotyyppikontrolleja. B) ekspressio CD24-positiivisten solujen virtaussytometrialla riippuu anti-CD24-vasta-ainetta. Taulukossa on esitetty prosenttia CD24-positiivisten solujen käyttäen kolmea eri CD24-vasta-aineita.

radioherkkyyttä of CD133

korkea /CD44

korkea ja CD133

pieni /CD44

alhainen ilmaiseminen solut

välinen yhteys ilmentymisen CD133, CD44 ja säteilyherkkyydestä arvioitiin lajittelemalla ja keräämällä CD133

korkea /CD44

korkea ja CD133

pieni /CD44

alhainen ilmentävien solujen , jota seurasi altistus ulkoisesti käytetyt gammasäteilyä, ja edelleen analysoitiin klonogeeniset määrityksissä, katso kuva 2. suurempi vastustuskyky säteilyn CD133

korkea /CD44

korkea väestö verrattuna CD133

low /CD44

harvaan havaittiin kaikissa solulinjoissa. Nämä erot olivat tilastollisesti merkitseviä lainkaan säteilyannosten (2, 4 ja 6 Gy) ja DLD-1-solut, katso kuvio 2C, 4 ja 6 Gy HCT116-soluja, ja 4 Gy HT-29-solut, katso kuvio 2A ja B, jossa on P-arvo 0,05 (yksisuuntainen ANOVA). Ei ollut tai pieni ero ilmentymistä CD24 on CD133

korkea /CD44

korkea ja CD133

pieni /CD44

harvaan, paitsi HCT116 joissa oli vähemmän positiivisia CD24 solujen CD133

pieni /CD44

pieni osuus. Numerot EGFR-positiivisten solujen lajitellut jakeet olivat lähes kaksinkertainen CD133

korkea /CD44

korkea verrattuna CD133

pieni /CD44

pieni murto HT-29 ja DLD-1 solut taas HCT116 oli vain pieni ero EGFR fraktioiden välinen. Säteilyn herkkyys lajittelemattoman solujen on esitetty kuviossa S1.

klonogeeninen määritys A) HT-29, B) HCT116 ja C) DLD-1-soluja. Ylä- ja alareunassa 10 prosenttia CD133 ja CD44 ilmentävät solut lajiteltu virtaussytometrialla (CD133

korkea /CD44

korkea tai CD133

pieni /CD44

pieni) ja säteilyn herkkyys analysoitiin käyttämällä klonogeeniset määrityksiä. Hallintalaitteet Molempien jakeiden normalisoitiin ja asetettu 100% eloonjääneitä. Virhepalkit edustavat keskivirheen keskiarvon ainakin kahdesta erillisestä kokeesta, jossa kolmesta näytteestä. Korkeampi Säteilynsietotestin että CD133

korkea /CD44

korkea väestö verrattuna CD133

pieni /CD44

harvaan havaittiin kaikissa solulinjoissa. Nämä erot olivat tilastollisesti merkitseviä lainkaan säteilyannosten (2, 4 ja 6 Gy) ja DLD-1-soluissa (kuvio 2C), 4 ja 6 Gy HCT116-soluja, ja 4 Gy HT-29-soluihin (kuvio 2A ja B ), jossa on P-arvo 0,05 (yksisuuntainen ANOVA). Prosenttiosuus positiivisten solujen EGFR, CD24 BD biotieteiden vasta-aineen tai CD24 kanssa Miltenyi Biotech /MACS analysoitiin virtaussytometrialla.

ilmentäminen AKT vuonna CD133

positiivinen /CD44

positiivinen ja CD133

negatiivinen /CDD44

negatiivinen Population in DLD-1

eri populaatioissa CD133

positiivinen /CD44

positiivinen, CD133

negatiivinen /CD44

positiivinen ja CD133

negatiivinen /CD44

negatiivisia DLD-1-solut lajiteltiin, kerätään ja analysoidaan ilmentämiseen AKT kanssa western blot, katso kuva 3A ja B. ilmentyminen koko AKT oli pienempi CD133

negatiivinen /CD44

negatiivinen väestö verrattuna väestöön positiivinen CD44 ja /tai CD133. Samansuuntainen nähtiin AKT1 ja AKT2, katso kuva 3B.

A) DLD-1-solut lajiteltiin virtaussytometrialla ja eri populaatioissa kanssa CD44

positiivinen /CD133

negatiivinen (Q1), CD44

positiivinen /CD133

positiivinen (Q2), CD44

negativeCD133

negatiivinen (Q3), kerättiin. B) Lajitellut solut edelleen analysoitiin western blot täydellisen AKT, AKT1 tai AKT2 ja betaactin ilme.

vaikutus AKT isoformien on Expression of CD24, CD133 ja CD44

koska AKT ilmaus oli erilainen lajitellut CD133

positiivinen /CD44

positiveand CD133

negatiivinen /CD44

negatiivinen väestön vaikutuksesta AKT isoformeja arvioitiin käyttämällä paksusuolen syöpäsolu-line DLD-1 ja

AKT

1,

AKT

2 ja

AKT

1/2 isogeenisistä knock-out solu-linjat, katso kuva 3AB, ja vahvistus läpilyöntiaihioilla kuvassa S2. Keskimääräinen fluoresenssin voimakkuus (MFI) CD44 ekspressio lisääntyi 100% vanhempien 150% vuonna

AKT

1 KO ja

AKT

2 KO ja 250% vuonna

AKT

1/2 KO cell-line, katso kuva 4A ja B. Lisäksi CD133 ilmentyminen väheni kun AKT1 putosi-out nähty

AKT

1 KO sekä

AKT

1/2 KO cell-line. Kuitenkin single knock-out

AKT

2 nähty

AKT

2 KO cell-line ei alentaa CD133, katso kuva 4A. CD24 ilmentyminen poistetaan kokonaan

AKT

1/2 KO mutta nousivat yhden

AKT

1 tai

AKT

2 KO solulinjoja katso kuva 4C. Vaikutus AKT-isoformien ilmenemistä koskevat CD24, CD133 ja CD24 oli edelleen todentaa siRNA vastaan ​​AKT1 ja uudelleen AKT1 tai AKT2 että DLD-1

AKT

1/2 KO cell-line, katso kuvat S3 ja S4. Lisäksi olemme vahvistaneet, että ei ollut eroa solusyklin jakautumisen solulinjojen, katso kuva 4D.

) Kun vanhempien soluissa, noin 10% soluista oli CD133 positiivisia soluja. Kuitenkin

AKT

1 ja

AKT

1/2 läpilyöntiaihioilla, The CD133 positiiviset solut vähenivät 0,3 ja 0,1% tässä järjestyksessä. Tätä ei nähty

AKT

2 knock-out solu-line, jossa 33% soluista oli positiivisia CD133. B) keskimääräinen fluoresoiva intensiteetti CD44 normalisoitu DLD-1 vanhempien solulinjassa nousi 150% vuonna

AKT

1 KO, 160% vuonna

AKT

2 KO ja 300% vuonna

AKT

1/2 KO cell-line. Virhepalkit edustavat standardipoikkeamaa (SD) ainakin kahdesta kokeesta. C) prosenttiosuus CD24-positiivisten solujen analysoitiin kahdella eri CD24-vasta-aineiden BD Biosciences ja Miltenyi /MACS virtaussytometriassa. Keskihajonta ovat kokeiden toisto. D) Cell-cycle jakelun DLD-1 vanhempien,

AKT

1 KO,

AKT

2 KO ja

AKT

1/2 KO soluja.

vaikutus AKT isoformien ilmenemistä koskevat CD44 Variant isoformien

suurin osa (98-100%), on DLD-1, HCT116 ja HT-29-solujen olivat positiivisia CD44, havaitaan vasta-aineen kanssa joka tunnistaa kaikki variantteja CD44. Ekspressiokuviota CD44 variantin isomuotojen v3, v4 /5, v6, v7 ja V7 /8 tutkittiin tarkemmin vuonna DLD-1 vanhempien ja

AKT

1/2 KO solulinjoja katso taulukko 2. Vain pieni määriä (~1-6%) soluista oli positiivinen CD44 variantin isoformit (ilmentyminen yhdellä, elävät solut), ja ilman merkittäviä muutoksia ekspressiotasot välillä AKT taitavia ja puutteellinen DLD-1 solulinjoja. Kun kyseessä on CD44v7, joka oli korkeampi havaittavissa tasolle, ilmaisu pieneni hieman

AKT

1/2 KO soluja verrattuna vanhempien.

biokemialliset analyysit DLD- 1

AKT

Knock Out Cell-linjat

Western blot-analyysi arvioidaan edelleen proteiinin ilmentymistä CD133 ja CD44 sekä Fox0 ja GSK3p ja niiden vaikutus mukaan AKT isoformit. Ilmaisu on CD44 oli säädelty vahvistavasti

AKT

1 KO,

AKT

2 KO ja

AKT

1/2 KO solulinjoja verrattuna vanhempien ja CD133 ilmentyminen väheni

AKT

1 KO ja

AKT

1/2 KO solulinjojen, mutta ei

AKT

2 KO cell line katsottuna virtauksen cytometry analyysi.

AKT

1, A

KT

2 ja

AKT

1/2 KO solulinjoja oli alennettu ilmaus fosforyloidun Fox01 ja Fox03a sekä alennettu ilmentyminen yhteensä Fox03a in

AKT

1/2 KO cell-line. Kuitenkin, ei ollut eroja ilmaisua fosforyloidun (S9) tai kokonaan GSK3p välillä

AKT

KO solulinjojen, katso kuva 5A.

A) proteiini ilmentymä CD44, CD133, fosfo-FOXO, yhteensä FOX03a, fosfo-GSK3p ja yhteensä GSK3p Länsi-blot-analyysi. B) geeniekspressio ylössäätöä (+), alassäätöä (-) tai ei ole muuttunut (NC), ja CD44, CD24, CD133, FOX01, FOX03, FOX04, GSK3p ja LYN DLD-1

AKT

1 KO,

AKT

2 KO tai

AKT

1/2 KO soluja verrattuna DLD-1 vanhempien soluissa.

erot Gene Expression in DLD-1 AKT isoformien Knock-out Cell-linjat

Geenien ilmentyminen analyysi tehtiin tutkia tarkemmin eroja isogeenisissä

AKT

isoformi knock-out solulinjoja katso kuva 5B. Geenit katsottiin merkittävästi ylös- tai alaspäin säädellä tunnusluvut ≥ 1,5 kertaiseksi ja p 0,05. Knock-out

AKT

1 ja

AKT

2 isomuotojen vahvistettiin DLD-1 solulinjoja ja geenin ilmentymisen CD44 ja CD133 vahvistivat tulokset virtaussytometrialla ja western blot-analyysi. CD44 oli säädelty vahvistavasti

AKT

1,

AKT

2 ja

AKT

1/2 KO solulinjoja verrattuna vanhempien solulinjassa ja CD133 oli alku- säännelty

AKT

2 KO mutta säädellä vähentävästi

AKT

1 ja

AKT

1/2 KO solulinjoja. CD24 ekspressio oli pienempi

AKT

1/2 KO cell-line verrattuna vanhempien kuitenkin; ei ollut eroa

AKT

1 tai

AKT

2 KO solulinjoja. FOXO1 oli säädellään ylöspäin

AKT

1 KO ja

AKT

1/2 KO cell-line, kun taas FOXO3 oli vain säädellään ylöspäin single

AKT

1 KO ja

AKT

2 KO solulinjoja. Ei ollut eroa FOXO4 ilmentymisen välillä solulinjojen. LYN oli säädelty vain

AKT

1/2 KO kuitenkaan ollut eroa ilmaus GSK3p välillä solulinjojen, katso kuva 5B.

arviointi erot epiteelin ja mesenkymaalitransitioon, Notch, Wnt ja Cell Adhesion Väylät välillä

AKT

2 KO ja

AKT

1 KO Cell-linjat

Yksi merkkiaine epiteelin kohteeseen mesenkymaalitransitioon (EMT ) on vähentää soluadheesion. Oli useita geenejä soluadheesiota koulutusjakson (

CLDN1, ITGB8, NEO1

ja

PVRL3

), joka oli merkittävästi korkeampi ilmaisun

AKT

2 KO cell-line verrattuna että

AKT

1 KO cell-line. Lisäksi induktio EMT liittyy Notch ja Wnt ja tyrosiinikinaasireseptorit.