Krooninen sairaus

tiivistelmä

Photoimmunotherapy (PIT) on uusi syövän hoito, jossa yhdistyvät vasta-aineiden spesifisyys kohdistamiseen kasvainten kanssa aiheuttama myrkyllisyys valoherkisteiden altistuksen jälkeen lähi-infrapuna (NIR) valoa. Suoritimme PIT mallissa levittää mahasyövän vatsakalvon carcinomatosis ja seurataan tehokkuus voidaan

in vivo

GFP fluoresenssikuvantamisella.

In vitro

ja

in vivo

kokeita, joiden HER2-ilmentävät GFP-proteiinia ekspressoivien, mahasyövän solulinja (N87-GFP). Konjugaatti koostuu valolle, IR-700, konjugoitu trastutsumabi (tra-IR700), mitä seurasi NIR valoa käytettiin PIT.

In vitro

PIT arvioitiin mittaamalla sytotoksisuuden kuolleen värjäys ja lasku GFP fluoresenssin.

In vivo

PIT arvioitiin levitetään vatsakalvon carcinomatosis mallista ja kylki ksenograftin käyttäen kasvaimen tilavuus mittauksia ja GFP fluoresenssin intensiteettiä.

In vivo

anti-kasvain vaikutuksia PIT varmistettiin merkittäviä vähennyksiä kasvaimen tilavuus (päivänä 15, p 0,0001 vs. kontrolli) ja GFP fluoresenssin voimakkuus (kylki malli: vuorokautena 3, PIT käsitelty vs. ohjaus p 0,01 ja vatsakalvon Disseminated malli: vuorokautena 3 PIT käsitelty vs. kontrolli, p 0,05). Sytotoksiset vaikutukset

in vitro

osoitettiin olevan riippuvainen valon annoksesta ja aiheutti nekroottinen solujen repeämä johtaa GFP vapautumista ja vähentää fluoresenssin intensiteetin

in vitro.

Siten menetys GFP fluoresenssin toimi hyödyllisenä biomarkkeri solunekroosi jälkeen PIT.

Citation: Sato K, Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy mahasyövän peritoneaalisille carcinomatosis hiirimallissa. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10,1371 /journal.pone.0113276

Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. heinäkuuta, 2014; Hyväksytty: 21 lokakuu 2014; Julkaistu: 17 marraskuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Data Saatavuus: Kirjoittajat vahvistaa, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat NIH Intramural ohjelma ja JSPS Research Fellowship. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mahakarsinoo- aiheuttaa yli 740000 syöpään liittyvien kuolemien vuodessa maailmanlaajuisesti erityisesti Aasiassa [1] – [3]. Suurin osa mahasyöpä potilailla esiintyy paikallisesti edennyt, uusiutuva tai etäpesäkkeitä esteenä parantava leikkaus, joka on enimmäkseen hallinnoi kuin parantavaa hoitoa [1]. Vatsakalvon carcinomatosis ja maksan etäpesäke ovat yhteisiä hengenvaarallisia ilmenemismuodot pitkälle mahasyövän [1], [4]. Peritoneaalisille carcinomatosis esiintyy myös munasarja-, appendiceal, paksusuoli-, haima- ja syöpien. Ennuste on yleisesti heikko ja paikalliset hoidot ovat poikkeuksetta epäonnistuneet korkea uusiutuminen ja sairastuvuutta liittyvät vatsaonteloon sekä suolitukos. Systeeminen hoito on myös yleensä onnistu. Näin uudet hoitomenetelmät vatsakalvon carcinomatosis tarvitaan.

Photoimmunotherapy (PIT) on uusi kohde-solun erityinen syövän hoidossa, jossa käytetään vasta-valoherkiste konjugaattia (APSC) ja sen jälkeen lähi-infrapuna (NIR) valaistuksessa. APSC koostuu syöpäsolu-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine (mAb) ja valolle, IR700, joka on pii-ftalosyaniini johdannainen kovalenttisesti konjugoitu vasta-aineeseen. APSC sitoo kohde- molekyylien solukalvon ja sitten indusoi lähes välittömästi solunekroosin altistumisen jälkeen NIR valoa 690 nm: ssä.

In vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, PIT olevan erittäin soluspesifisiä, siis, ei-ilmentävien solujen välittömässä läheisyydessä kohteena oleviin soluihin osoita mitään myrkyllisiä vaikutuksia [5]. Solut käsiteltiin PIT tehdään nopea tilavuuden laajeneminen johtaa repeäminen solukalvon, suulakepuristus solun sisällön solunulkoiseen tilaan, ja peruuttamaton kuolion [6] – [8]. Tuloksemme ja muut osoittavat, että sytotoksisuus indusoi PIT ei täysin luottaa reaktiivisen hapen tai olemassaolon singlettihappea sammuttajien [9]. Lisäksi sytotoksisuus aiheuttama PIT on ensisijaisesti solukalvon pikemminkin sisällä mitokondriot kuin tapahtuu PDT.

Vaikka PIT johtaa nopeasti solunekroosiin, kokonaismäärän kasvain voi muuttaa useita päiviä. Tämä johtuu se kestää vähintään useita päiviä makrofagien tulla, prosessi ja jättää kasvaimen. Siksi tarvitaan uusia menetelmiä, kuin koon mitat, tarvitaan vaikutuksia seurataan PIT. Fluoresenssi proteiinit (fps), käytetään yleisesti visualisointiin soluprosessien [10], [11]. Vaikka useimmat apoptoottista solukuolemaa johtaa säilyttäminen solukalvon ja säilyttämistä FP tehdä fluoresenssi tunteeton solukuolemaan [12], [13] ja PIT, äkillinen repeämä solukalvojen aiheuttaa suulakepuristus sytoplasman puiteohjelmien ja siis ole suhteellisen nopea lukema solukuoleman. Etuna fps

in vivo

kuvantaminen on, että ne eivät vaadi ulkoisia injektioita aineet (kuten lusiferiini ollessa kyseessä bioluminenssi) ja voidaan seurata reaaliaikaisesti [14] – [18]. Koska ne vaativat geenitransfektion, he olisivat todennäköisesti vain olla hyödyllinen prekliinisissä tutkimuksissa.

Tässä tutkimuksessa selvitimme tehoa PIT hiirimallissa on levitetty vatsakalvon mahasyövän käyttäen in vivo GFP fluoresenssin kuvantamiseen seurata vastaus.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Vesiliukoisia, pii-ftalosyaniini johdannainen, IRDye 700DX NHS-esteriä ja IRDye 800 CW NHS-esteriä saatiin LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA). Panitumumabi, täysin humanisoidun IgG

2-mAbin kohdistuvista EGFR, ostettiin Amgen (Thousand Oaks, CA, USA). Trastutsumabi, 95% humanisoitu IgG

1 mAb suunnattu HER2, ostettiin Genentech (South San Francisco, CA, USA). Kaikki muut kemikaalit olivat reagenssilaatua.

synteesi IR700-konjugoitua trastutsumabi tai panitumumabin ja IR800-konjugoidun trastutsumabi

konjugointi väriaineiden mAbrllä suoritettiin aiemman raportin [19]. Lyhyesti, panitumumabipitoisuus tai trastutsumabi (1 mg, 6,8 nmol) inkuboitiin IR700-NHS-esteriä (60,2 ug, 30,8 nmol) tai IRDye 800 CW-NHS-esteriä (35,9 ug, 30,8 nmol) 0,1 mol /l Na

2HPO

4 (pH 8,6) huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Seos puhdistettiin Sephadex G50-pylvääseen (PD-10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Proteiinipitoisuus määritettiin Coomassie Plus proteiini iinianalyysikitissä (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA) mittaamalla absorptio 595 nm: ssä spektroskopialla (8453 Value System, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Pitoisuus IR700 tai IR800 mitattiin vastaavasti absorptiolla 689 nm: ssä tai 774 nm: ssä spektroskopialla vahvistaa useita fluorofori molekyylejä konjugoitu kunkin mAb. Synteesi ohjataan siten, että keskimäärin neljä IR700 molekyylien ja kaksi IR800 molekyylejä sidottiin yhteen vasta-aineeseen. Suoritimme SDS-PAGE laadunvalvonnassa kunkin konjugaatin aiemmin raportoidun [19]. Me lyhentää IR700 konjugoitu trastutsumabille kuin tra-IR700, panitumumabista kuten yleiseurooppalainen IR700 ja IR800 konjugoitu trastutsumabille kuin tra-IR800.

Soluviljely

N87-GFP-solujen, jotka ilmentävät stabiilisti GFP hankittiin alkaen ANTI syöpä (San Diego, CA, USA). Korkea GFP: n ilmentymisen vahvistettiin puuttuessa selektioainetta 10 kohtia. Arvioida tietyssä solussa tappaminen PIT, 3T3-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti DsRed (3T3 /Dsred) käytettiin negatiivisena kontrollina [5]. Soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Life Technologies) kudosviljelmäpulloissa kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa atmosfäärissä 95 % ilmaa ja 5% hiilidioksidia.

fluoresenssimikroskopia

tunnistaa antigeeni-spesifiseen paikantamiseen IR700 konjugaattien ja muutos solujen morfologia, kun PIT, fluoresenssimikroskopiaa suoritettiin (IX61 tai IX81; Olympus America, Melville, NY, USA). Kymmenentuhatta solut ympättiin kannessa-lasipohjaisella ruokia ja inkuboitiin 24 tunnin ajan. Tra-IR700 lisättiin sitten viljelyalustaan ​​(fenolipunaista) 10 ug /ml, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 6 tunnin ajan. Sitten solut pestiin PBS: llä; Propidiumjodidia (PI) (1:2000) tai Cytox Blue (1:500) (Life Technologies) lisättiin tiedotusvälineille 30 minuuttia ennen PIT havaita kuolleita soluja. Sitten solut altistettiin NIR valoa ja sarja kuvia saatiin. Yhden päivän kuluttua PIT, solut pestiin ja inkuboitiin uuden keskipitkän jälkeen PIT (0,5 J /cm

2) ja PI lisättiin jälleen. Sen varmistamiseksi, että saman alueen kuvioitiin merkinnät tehtiin kunkin viljelymaljalla ilmoittamaan jossa kuvantaminen hankittiin. Suodatin asetetaan tunnistamaan IR700 fluoresenssin 590-650 nm: n virityksellä suodatin ja 665-740 nm: n bändi pass emissiosuodatinta. Analyysi kuvien suoritettiin ImageJ ohjelmisto (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

virtaussytometria

Fluoresenssi soluista inkuboinnin jälkeen yleiseurooppalaisten IR700 tai tra-IR700 mitattiin virtaussytometrillä (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ja CellQuest ohjelmistojen (BD Biosciences). -Soluja (1 x 10

5) inkuboitiin kunkin konjugaatin 6 tuntia 37 ° C: ssa. Validoida spesifinen sitoutuminen konjugoidun vasta-aineen, ylimäärä vasta-ainetta (50 ug) käytettiin estämään 0,5 ug väriaine-vasta-aineen konjugaatit [8].

In vitro PIT

Yksi satatuhatta soluja ympättiin 24-kuoppalevyille ja inkuboitiin 24 tunnin ajan. Elatusaineita korvattiin tuoreella elatusaineet sisältävät 10 ug /ml tra-IR700 ja soluja inkuboitiin 6 tunnin ajan 37 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen, fenolipunaista viljelyalustaa lisättiin. Sitten solut säteilytettiin NIR laservalon 685-695 nm (BWF5-690-8-600-0.37; B W TEK INC., Newark, DE, USA). Varsinainen tehotiheys mW /cm

2 mitattiin optinen teho mittari (PM 100, Thorlabs, Newton, NJ, USA).

Sytotoksisuusmääritvs

sytotoksisia vaikutuksia PIT kanssa tra-IR700 määritettiin virtaussytometrisellä PI-värjäyksellä, joka havaitsee heikentynyt solukalvot. Sillä virtaussytometristä määritystä solut trypsinoitiin 1 tunti käsittelyn jälkeen, ja pestään PBS: llä. PI lisättiin solususpensiota (lopullinen 2 ug /ml) ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen virtaussytometrialla.

arviointi GFP fluoresenssin voimakkuuden in vitro

Satatuhatta solut ympättiin kannessa-lasipohjaisella ruokia ja inkuboitiin 12 tunnin ajan. Tra-IR700 lisättiin sitten viljelyalustaan ​​(fenolipunaista) 10 ug /ml, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 6 tunnin ajan. Solut pestiin PBS: llä ja korvataan uudella, fenolipunaista elatusaineessa ja alapuolen kannen lasi oli merkitty (sijainnin määrittämiseen havainto). Jälkeen PIT, soluja inkuboitiin jälleen 1 päivä. Yhden päivän kuluttua PIT, solut jälleen havaittu. GFP voimakkuus arvioitiin yhteensä pikseleihin samaa kynnystä samalla alalla [20]. Analyysi kuvien suoritettiin ImageJ ohjelmisto (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Fluoresenssi käsitellyistä soluista mitattiin myös käyttäen virtaussytometrillä (FACS Calibur).

eläinten ja kasvainmuodoista

Kaikki

in vivo

menetelmät suoritettiin noudattaen opas hoito ja käyttö Laboratory Animal Resources (1996), US National Research Council, ja hyväksymä NIH Animal Care ja käyttö komitea. Kuudesta kahdeksaan viikkoa vanhat naaraspuoliset homozygoottisia kateenkorvattomia nude-hiiriä ostettiin Charles River (NCI-Frederick). Jotta voitaisiin arvioida vain suoran tuumorisoluja tappava vaikutus

in vivo

PIT, immunosuppressoiduilla nude-hiiriä käytettiin. Toimenpiteiden aikana, hiiret nukutettiin isofluraanilla. Kymmenen miljoonaa N87-GFP solua injektoitiin ihonalaisesti oikeaan dorsum ja hiirillä. Jotta voidaan määrittää kasvaimen tilavuus, suurin pitkittäinen läpimitta (pituus) ja suurin poikittainen halkaisija (leveys) mitattiin ulkoinen paksuus. Tuumoritilavuudet perustuu mittaharppimittauksilla laskettiin seuraavalla kaavalla; kasvaimen tilavuus = pituus x leveys

2 x 0,5. Kasvaimet saavuttaa noin 100 mm

3 tilavuudessa valittiin tutkimukseen. Mitata GFP fluoresenssin jälkeen PIT, kymmenen miljoonaa N87-GFP-soluja ihon alle injektoituna molempiin dorsi hiiristä. Jotta levitettävä vatsakalvon syövän hiirimallissa, viisikymmentä miljoonaa N87-GFP-soluja PBS: llä (yhteensä 300 ui) injektoitiin vatsaonteloon.

In vivo fluoresenssin kuvantamisen

In vivo

fluoresenssikuvia saatiin Pearl Imager (LI-COR Bioscience) havaitsemiseksi IR700 /IR800 fluoresenssi, ja Maestro Imager (CRi, Woburn, MA, USA) GFP. GFP, joka on kaistanpäästösuodatin, 445-490 nm (viritys) ja pitkä-pass sininen suodatin yli 515 nm (emissio) käytettiin. Viritettävän emissiosuotimen oli automaattisesti astui 10 nm välein 500-600 nm vihreän suodinsarjat kiintein altistus (500 ms). Spektrin fluoresenssi kuvat koostuvat autofluorisaatiota spektrien ja spektrejä GFP (N87-GFP kasvain), jotka sitten sekoittamattomia, joka perustuu tunnusomainen spektrinen kuvio GFP, avulla Maestro ohjelmisto (CRi). Kiinnostavat alueet (ROI) oli käsin piirretty joko kupeeseen kasvain tai yli vatsan alueella tarvittaessa mallin ja mitattiin fluoresenssi-intensiteetti [19].

karakterisointi levittää vatsakalvon hiirimallissa

Hiiret joko levitetty vatsakalvon syöpää (6 viikon kuluttua soluistutusryhmä) tai kylkeen kasvaimet (7 päivää soluistutusryhmä) injektoitiin suonensisäisesti 100 ug tra-IR700 ja tra-IR800. Yhden päivän kuluttua injektion sarja kuvia suoritettiin Pearl Imager havaitsemaan IR700 /IR800 fluoresenssi, ja Maestro GFP. Valkoinen valo kuvia hiiret saatiin kanssa iphone5 (Apple Inc., Cupertino, CA, USA).

In vivo PIT

Jotta vaikutuksen arvioimiseksi PIT kylkeen malli , N87-GFP tuumoreita kantavaa hiirtä jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään, vähintään 10 eläintä ryhmää kohti seuraavasti: (1) ei käsittelyä (kontrolli); (2) vain NIR valotettiin 50 J /cm

2 päivänä 1 ja 100 J /cm

2 päivänä 2; (3) 100 ug tra-IR700 i.v., ei NIR valaistuksessa; (4) 100 ug tra-IR700 i.v., NIR valoa annettiin 50 J /cm

2 1. päivänä injektion jälkeen ja 100 J /cm

2 päivänä 2 injektion jälkeen. Nämä ehdot sovellettiin viikoittain jopa 3 viikkoa. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin, ja Fluoresenssikuvat saatiin alkaa 1 päivä ennen PIT, ja kasvainten tilavuudet mitattiin kolme kertaa viikossa, kunnes kasvain halkaisija saavutti 2 cm, jolloin hiiret lopetettiin hiilidioksidilla. Sillä fluoresenssikuvantamiseen, hiiriin injisoitiin 100 ug tra-IR700 tai säteilytetty seuraavasti: (1) NIR valoa annettiin 50 J /cm

2 1. päivänä injektion jälkeen ja 100 J /cm

2 päivä 2 oikealle kasvain (2) ei ole NIR valoa annettiin vasemmalle kasvain, joka toimi kontrollina. Kontrollit sisälsivät (1) vain NIR valotettiin 50 J /cm

2 päivänä 1 ja 100 J /cm

2 päivänä 2 oikealle kasvain; (2) ei käsittelyä varten vasemman kasvain.

arvioimiseksi levitetään vatsakalvon syöpää, hiiret jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään 5 eläintä ryhmää kohti seuraavista hoidoista: (1) ei käsittelyä (kontrolli); (2) vain NIR valotettiin 50 J /cm

2 päivänä 1 ja 100 J /cm

2 päivänä 2; (3) 100 ug tra-IR700 i.v., ei NIR valaistuksessa; (4) 100 ug tra-IR700 iv, NIR valoa annettiin 50 J /cm

2 päivänä 1 ja 100 J /cm

2 päivänä 2 injektion jälkeen.

Tilastollinen analyysi

tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± sem alkaen vähintään neljästä kokeesta, ellei toisin mainita. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen tilasto-ohjelmaa (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Monimuuttujille, yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) ja post testi (Kruskal-Wallisin testi testin jälkeen) ja Tukeyn testillä. Kumulatiivinen eloonjäämisen todennäköisyys, määritetty tässä kasvaimen halkaisija eivät pääse 2 cm, arvioitiin kussakin ryhmässä käyttäen Kaplan-Meierin selviytyminen käyräanalyysi, ja tuloksia verrattiin log-rank-testi ja Wilcoxonin testi. Opiskelijan

t

testiä käytettiin myös vertaamaan kahta

in vitro

tutkimuksessa; p 0,05 katsottiin osoittavan tilastollisesti merkitsevä ero.

Tulokset

Vahvistus ilmaisun profiilia N87-GFP soluja kohteena PIT

tutkinut fluoresenssisignaaleita yleiseurooppalaisten IR700 ja tra-IR700 sitoutuneen N87-GFP-solujen FACS. Kun 6 tunnin inkuboinnin joko yleiseurooppalainen IR700 tai tra-IR700, N87-GFP solut osoittivat johdonmukaisesti korkeampia kirkkaus tra-IR700 kuin pan-IR700 (Fig. 1A). Nämä signaalit olivat lähes kokonaan estää lisäämällä ylimäärä trastutsumabi tai panitumumabipitoisuus, mikä viittaa siihen, spesifisen sitoutumisen ja vahvisti suurempi ekspressio HER2 kuin EGFR [21]. Nämä tiedot osoittivat, että HER2 oli parempi tavoite PIT in N87-GFP solut koska sen korkeamman ilmentymisen.

(A) ilmentyminen HER1 ja HER2: N87-GFP solut tutkittiin FACS. HER2 yliekspressoitui yli HER1. Spesifinen sitoutuminen osoitettiin vasta-aineella esto. (B) N87-GFP-soluja inkuboitiin tra-IR700 6 tuntia ja havaittu mikroskoopilla (ennen ja jälkeen säteilytyksen NIR valoa, 2 J /cm

2). Nekroottinen solukuolemaa havaittiin viritettäessä NIR valo (30 min). Bar = 25 pm. PI värjäys osoitti kalvon vahinkoja. (N = 4, * p 0,001, vs. käsittelemätön kontrolli, Studentin t-testi) (C) kalvo aiheuttaman vaurion PIT mitattiin kuolleiden solujen määrä käyttämällä PI värjäystä, joka kasvoi tavalla riippuvainen valon annoksesta. (D) N87-GFP-soluja inkuboitiin tra-IR700 6 tuntia ja säteilytetään NIR-valoa (0,5 J /cm

2). GFP-fluoresenssin intensiteetti laski kuolleita soluja, mutta pysyi muuttumattomana elävissä soluissa 1 päivänä PIT (*). Bar = 200 pm. Musta viiva oikeassa yläkulmassa oli merkki määrittää aseman havainto. (E) Vähenevät GFP-fluoresenssin intensiteetti 1 päivänä PIT tapahtunut tavalla riippuvainen valon annos (yhteensä pikseli GFP fluoresenssin samassa) (n = 12 kentät) (** P 0,0001, vs. käsittelemätön kontrolli, Studentin t-testi). (F) pienenee GFP fluoresenssin voimakkuus aiheuttama PIT mitattuna FACS, vahvistavasta NIR-valoa annoksesta riippuvuutta. (N = 4, *** P 0,0001, vs. käsittelemätön kontrolli, Studentin t-testi).

Mikroskopia in vitro PIT

Serial fluoresenssimikroskopiaan of N87-GFP-solujen tehtiin ennen ja jälkeen PIT. Altistumisen jälkeen NIR valoa (2 J /cm

2) solujen turvotus, bleb muodostumista ja repeämä lysosomissa havaittiin, jolloin suulakepuristus sytoplasman solun ulkopuolelle (Fig. 1 B). PI värjäys osoitti akuutti sytotoksista kalvo aiheuttamia PIT. Useimmat näistä solujen muutoksia havaittiin 30 minuutin kuluessa valaistuksessa (tukeminen Information video S1 ja S2). Mitään merkittäviä muutoksia ei havaittu EGFR-negatiivisten 3T3-soluja säteilytetään NIR valoa, mikä viittaa siihen, PIT ei aiheuttanut vahinkoa muille kuin kohde-soluissa (kuvio. S1).

arviointi in vitro PIT vaikutus

jotta kvantifioimiseksi vaikutus

in vitro

PIT, teimme sytotoksisuuskoetta perustuu sisällyttämistä PI, joka osoitti, että solukuolema lisääntynyt valon lisääntyessä annoksen (Fig. 1 C). Mitään merkittävää sytotoksisuutta havaittiin NIR valotus tai tra-IR700 yksin.

Arviointi GFP fluoresenssi in vitro jälkeen PIT

Yksi päivä altistumisen jälkeen NIR valossa 0,5 J /cm

2, noin 50% soluista osoitti akuutin sytotoksisuuden (Fig. 1 C), ja GFP fluoresenssin intensiteetti pieneni huomattavasti vuonna kuolleita soluja (värjätty positiivinen PI), kun taas GFP fluoresenssi säilyi elossa soluissa (Kuva. 1 D). Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että GFP suulakepuristettiin solusta jälkeen kalvon repeämä. Tutkiakseen muutoksen GFP fluoresenssin vertasimme koko GFP pikselien samaan kenttään ennen ja yhden päivän kuluttua PIT (Fig. S2). GFP fluorenssisuhteessa laski suoraan valoannokseen taas ei laskua havaittiin NIR valotus tai tra-IR700 yksinään (Fig. 1 E). Nämä tulokset vahvistettiin FACS-analyysillä (Kuva. 1 F ja kuvio. S3) ja viittaavat siihen, että PIT johtaa lasku GFP fluoresenssin seuraavista nekroottinen solukuolema 1 päivänä PIT tavalla riippuvainen valon annoksesta.

in vivo PIT vähentää kasvaimen tilavuus kylkeen ksenograftimallia

Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus PIT

in vivo

kylkeen kasvain hiirille (Fig. 2A). PIT indusoi merkittäviä vähennyksiä kasvaimen tilavuus (n = 10 kussakin ryhmässä, * p = 0,0456 0,05, Tukeyn testi). Neljä hiirtä kymmenestä vuonna PIT ryhmässä olivat täysin kovettunut käsittelemällä (Fig. 2B). Survival pidennettiin merkittävästi PIT ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (n = 10 kussakin ryhmässä, ** p 0,0001, pitkän rank testi ja Wilcoxonin testi) (Fig. 2C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että PIT aiheutti merkittäviä kasvain vähentäminen ja pidensi elinaikaa

in vivo

.

(A) PIT hoito. (B) PIT johtaa N87-GFP kylkeen tuumorin tilavuuden vähentäminen (n = 10 hiirtä kussakin hoitoryhmässä; * p = 0,0456 0,05, vs. APSC), Tukeyn testi ANOVA). Hoito on osoitettu kaavion alapuolella. (C) Toistuva PIT johtaa pitkäaikaiseen eloonjäämisen N87-GFP kasvain hiirille (n = 10 hiirtä kussakin testiryhmässä ** P 0,0001), Long-rank-testi ja Wilcoxonin testi). Täydellinen kasvaimen tappaminen saavutettiin 4 hiiristä 10. PIT ryhmän jälkeen uudelleen käsittelyyn.

GFP Fluoresenssi kuvantamisen jälkeen In vivo PIT vuonna kylkeen ksenograftimallia

Jotta voidaan seurata

in vivo

PIT, reaaliaikainen GFP kuvantaminen suoritettiin hiirillä kanssa N87-GFP molempiin kylkiin kasvaimia (Fig. 3A). GFP fluoresenssi osoitti kasvaintaakkaa ja vastaus PIT. GFP-fluoresenssi korreloi IR700 fluoresenssi, joka väheni nopeasti sen jälkeen, PIT (Fig. 3C). Yhteensä fluoresenssikuvantamiseen (TFI) GFP käsittelemättömän kasvaimet (kontrolli) ja kasvaimissa valon vastaanottamiseksi vain lisääntynyt kasvaimen kasvua. Kasvaimissa käsitelty PIT, TFI GFP vähitellen vähentyneet, kasvaimen, kun taas päinvastainen kasvain samalla hiiren (iv vain, ei valoa) havaittu olevan GFP fluoresenssin (Fig. 3B).

(A) PIT kuuri. Fluoresenssikuvat otettiin kussakin aikapisteessä, kuten on ilmoitettu. (B)

In vivo GFP

fluoresenssi reaaliaikaisen kuvantamisen molempiin kylkiin kasvain hiirillä, vastauksena PIT. Kasvain käsitelty PIT osoitti vähentämällä GFP fluoresenssin jälkeen PIT. (C) kvantitatiivinen analyysi GFP fluoresenssivoimakkuuksien (yhteensä intensiteetti /kasvain) in N87-GFP kasvain hiirille osoitti merkittävästi vähentynyt fluoresenssi välillä kontrolliryhmän ja PIT ryhmä (n = 5 hiirtä kussakin ryhmässä, (* p = 0,0118 0,05, vs. kontrolli) (* p = 0,0016 0,01, vs. NIR valo) (* p = 0,0012 0,01, vs. APSC) (** p = 0,0010 0,01, vs. kontrolli) (** p = 0,0003 0,001, vs. NIR valo) (** p = 0,0003 0,001, vs. APSC) (*** p = 0,0049 0,01, vs. kontrolli) (*** p = 0,0039 0,01, vs. NIR-valoa) (*** p = 0,0012 0,01, vs. APSC), Tukeyn testi ANOVA).

kvantifiointi koko GFP fluoresenssin intensiteetin paljasti, että oli merkittävä lasku jälkeen PIT (n = 5 hiirtä kussakin ryhmässä, * p = 0,0118 0,05, ** p = 0,0010 0,01, *** p = 0,0049 0,01, Tukeyn testi ANOVA) (Fig. 3C) . Johtuen tuumorin uudelleen kasvua, GFP suhde nousi uudelleen päivänä 4 jälkeen PIT, vaikka se oli alhaisempi kuin muissa kontrolliryhmiin. Reaaliaikaista GFP fluoresenssikuvantamisella ja sen kvantifiointi käytössä reaaliaikainen vertailu ryhmien ja osoittivat vahvan korrelaation korkeampi GFP fluoresenssin ja syövän etenemistä kussakin ryhmässä.

Vahvista Tätä

ex vivo

analyysi suoritettiin (Fig. 4A). PIT vaikutus varmistettiin pienentynyttä IR700 fluoresenssin (Fig. 4B). Tässä tilanteessa, GFP intensiteetti

ex vivo

kasvaimet pienenivät jälkeen PIT (Fig. 4B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että reaaliaikainen GFP live kuvantaminen on yhdenmukainen

ex vivo

kuvantamiseen.

(A) PIT hoito. Fluoresenssi kuvia

ex vivo

kasvaimia saatiin kussakin aikapisteessä, kuten on ilmoitettu. (B)

Ex vivo

fluoresenssin kuvantamiseen N87-GFP kasvaimen vastauksena PIT. Fluoresenssi muutokset nähdään sekä GFP ja IR700 fluoresenssin vastauksena PIT. (C) Fluoresenssikuvat saatiin kussakin aikapisteessä, kuten on ilmoitettu. (D)

In vivo

fluoresenssi reaaliaikaisen kuvantamisen molempiin kylkiin kasvain hiirillä, oli vastaus useisiin PIT. GFP-fluoresenssin voimakkuus kasvain oli lähes eliminoitu jälkeen toisen PIT.

Kun PIT toistettiin viikoittain, GFP fluoresenssi aktiivisuus lopulta katosi (Fig. 4C ja D), mikä osoittaa täydellistä tappamista kasvain.

karakterisointi levitetään vatsakalvon malli fluoresenssikuvantamisella

jotta voidaan määrittää luonnollisen historian levittää vatsakalvon malli, sarjanumero fluoresenssikuvantamisella tehtiin. Istutettu kasvaimia osoitti korkean fluoresenssin signaalia IR700, IR800, ja GFP, jotka kaikki yhteistyössä lokalisoitu toistensa kanssa (IR800 käytettiin välttää suolen autofluoresenssi) (Fig. 5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että tämä malli levittää vatsakalvon syöpää voidaan seurata suorana hiiriin käyttäen GFP fluoresenssia.

In vivo

GFP fluoresenssikuvantamisella on N87-GFP kylki kasvain ja levitetään vatsakalvon malli. Rinnakkaispaikantumisen of tra-IR700 ja tra-IR800 vahvistettiin vatsakalvon Disseminated kasvaimeen fluoresenssikuvantamisella. Laskimonsisäinen injektio agentti pääsee Disseminated kasvaimia vatsaonteloon. Välttämiseksi auto-fluoresenssi suolistossa, tra-IR800 käytettiin sekä tra-IR700.

GFP Fluoresenssi kuvantamisen jälkeen In vivo PIT in levitetään vatsakalvon mallissa

Reaaliaikainen GFP fluoresenssikuvantamiseen suoritettiin levitetään vatsakalvon mallia ennen ja jälkeen PIT (Fig. 6A). IR700 fluoresenssi laski jälkeen PIT (Fig. S4). GFP TFI lisääntynyt vähitellen ei-PIT ryhmien takia kasvaimen kasvua. Vuonna PIT käsitellyssä ryhmässä, GFP TFI laski 1 päivä ja 3 päivää sen jälkeen, kun PIT (Fig. 6B). Kvantifiointi koko GFP fluoresenssin intensiteetti paljasti huomattavan laskun jälkeen PIT (n = 5 hiirtä kussakin ryhmässä, * p = 0,0295 0,05, ** p = 0,0355 0,05, Kruskal-Wallisin testi testin jälkeen) (Kuva. 6C). Koska kasvaimen uudelleen kasvua, GFP suhde kasvoi jälleen 4 päivänä PIT, vaikka se säilyy alhaisempi kuin muiden ryhmien, kuten havaittiin kylkeen tuumorin mallin. Siten PIT aiheutti merkittäviä kohdistettuja kasvaimen tappava vaikutus sekä kyljen ja levitetään vatsakalvon kasvainmuodoista ja tämä voitaisiin seurata GFP TFI.

(A) PIT hoito. Reaaliaikainen GFP fluoresenssikuvantamisella saatiin kunakin ajankohtana ilmoitettu. (B)

In vivo

reaaliaikaisen fluoresenssin kuvantamisen vastauksena PIT. (C) kvantitatiivinen analyysi GFP fluoresenssivoimakkuudet osoitti merkittäviä vähenee päivä 3 jälkeen PIT välillä kontrolliryhmässä ja PIT ryhmä (n = 5 hiirtä kussakin ryhmässä, (* p = 0,0295 0,05 vs. NIR valo) (** p = 0,0489 0,05 vs. kontrolli) (** p = 0,0355 0,05 vs. APSC), Kruskal-Wallisin testi testin jälkeen).

keskustelu

tutkimus osoittaa, että vaikutus PIT voidaan seurata GFP fluoresenssin kuvantamisen. Toisin apoptoosin [12], [13], jossa GFP ja niihin liittyvät fluoresoivat proteiinit kirkastuneet johtuen vähentyneestä sytoplasmisen tilavuuden aikana nekroottinen solukuolema kanssa PIT, membraanivaurion johtaa vapauttaa sytoplasmista sisällöstä GFP. Tämä ainutlaatuinen ominaisuus GFP ja niihin liittyvien fluoresoivat proteiinit tekee niistä käyttökelpoisia biomarkkereita PIT.

In vivo

GFP fluoresenssikuvantamisella mahdollistaa koko prosessin tumorigeneesin, hoito, regressio, etäpesäke tai uusimisesta, havaitaan samassa eläimessä invasiivisia [10], [11]. Käyttämällä soluja, jotka ilmentävät sytoplasmista GFP, antituumo- aiheuttamia vaikutuksia PIT voitiin helposti tarkkailla vuoksi suulakepuristus GFP hoidettujen soluista.

käsite kohdistamalla valohoito on yli kolme vuosikymmentä sitten [22]. Johtuen hydrofobisuuden perinteisten fotodynaamisen hoidon (PDT) herkistimiä, farmakokinetiikkaan vasta-aineen konjugoitu PDT on erittäin rajallinen kyky tuottaa konjugaatteja kohde. Siksi PDT herkisteitä kohdistettuja vasta-aineita on vain onnistunut malleissa, joissa konjugaatin ruiskutettiin suoraan kasvaimeen tai vatsakalvon [23]. Jotta saadaan vasta-aine-valolle herkistävä konjugaattia (APSC) systeemisesti, valolle tulisi mieluiten hydrofiilisiä. Hydrofiiliset ftalosyaniini-pohjainen valolle herkistävä, IR700DX kun konjugoida vasta- tulee APC, joka voidaan antaa laskimoon. Tämä hoitomuoto, kutsutaan PIT, eroaa perinteisestä PDT paitsi hydrofiilisyyttä photosensitizer, mutta myös sen riippuvuus NIR valo aktivoi valolle. NIR valo on parempi kudospenetraatio kuin pienempi aallonpituus valoa käytetään PDT. Tämä uusi sukupolvi APC-solujen havaitaan vastaavaa laskimoon farmakokinetiikkaa paljain vasta, jolloin kohdistettuja kasvain kerääntyminen vähällä kuin kohde sitovia ja voidaan soveltaa laaja kirjo vasta, jonka avulla monia mahdollisia sovelluksia koko elimistöön.

Huolimatta solunsalpaajahoito, lopputulos on pitkälle mahasyövän edelleen heikko. Koska suurin osa potilaista vatsakalvon etäpesäkkeitä läsnä salakavala oireita, kuten huono ruokahalu, painon lasku, turvotus tunne, kipu tai anemia diagnoosi usein viivästyy ja paikalliset hoidot ovat enää mahdollista [24]. PIT on lupaava hoitomenetelmä levittää vatsakalvon syöpää. Voidakseen suorittaa tehokkaasti PIT, The APSC olisi systeemisesti ja valo tulee valikoivasti soveltaa vatsakalvon. Näissä olosuhteissa on riittävästi toimituksen APSCs johtaa vähentämiseen levitetään kasvainten jälkeen PIT. Tätä prosessia voidaan seurata reaaliaikaisesti

in vivo

GFP fluoresenssikuvantamisella.

On olemassa useita rajoituksia tämän tutkimuksen. On huomattava, että kaikki syöpien näihin HER2 ja siten, tra-IR700 voi olla tasaisesti tehokas levitetään mahasyövässä. Itse asiassa, voi olla tarpeen käyttää cocktail on APSCs tehokkaasti kattaa suurimman ilmentymisen profiilien tietyn kasvaimen [25]. Toinen varoitus tässä tutkimuksessa on, että valoa voidaan antaa ihon läpi pienissä hiirillä, mutta tämä ei ole mahdollista ihmisillä.