Krooninen sairaus

tiivistelmä

ennustetta epiteelin munasarjasyövän on huono johtuu osittain tiheä chemoresistance. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen Toll-like receptor-4 (TLR4), ja erityisesti sen sovitin proteiini MyD88, yhtenä potentiaalisena välittäjänä tämän resistenssin. Tutkimuksen tavoitteena on antaa lisää todisteita siitä, että MyD88 positiiviset syöpäsolut ovat kliinisesti merkittäviä, varsi kaltaiset ja toistettavasti havaittavissa varten prognoosi- kerrostumista. Expression TLR4 ja MyD88 arvioitiin immunohistokemiallisesti 198 parafinoidut munasarjojen kudosten ja käytettäessä alkion karsinooma malli syövän stemness. Samanaikaisesti, ilmentyminen TLR4 ja MyD88-mRNA: n ja sääntelyn MikroRNA (miR-21 ja miR-146a) arvioitiin, samoin kuin sarjan chemosensitive ja resistenttien syöpäsolujen linjat. Toiminnallinen analyysi reitin arvioitiin solunsalpaajaresistentti SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja. TLR4 ja MyD88 ilmaisua voidaan toistettavasti arvioida kautta immunohistokemiallisesti käyttäen puolikvantitatiivinen pisteytysjärjestelmä. TLR4 ilmentyminen oli läsnä kaikissa munasarjojen epiteelin (normaali ja neoplastiset), kun taas MyD88 rajoitettiin neoplastisten solujen riippumatta kasvaimen ja liittyy alentunut etenemisestä vapaa ja kokonaiselossaolo, käytettäessä immunohistologinen tarkennetun osan vakavien karsinoomien, p 0,05. MiR-21 ja miR-146a ilmentyminen oli lisääntynyt MyD88 negatiivinen syövissä (p 0,05), mikä osoittaa niiden osallistuminen sääntelyä. Merkittävät muutokset MyD88 mRNA: n ilmentymisen havaittiin välillä chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti solujen ja kudosten. Knockdown TLR4 in SKOV-3 munasarjojen soluista talteen kemosensitiivisyys. Knockdovvn MyD88 yksin ei. MyD88 ilmentyminen alassäädetty eriytetty alkion karsinooma (NTera2) solut, tukee MyD88 + syövän kantasoluja hypoteesi. Meidän havainnot osoittavat, että ilmentyminen MyD88 liittyy merkittävästi vähentää potilaan selviytymistä ja muuttuneet microRNA tasoa ja ehdottaa ehjä /toimiva TLR4 /MyD88 koulutusjakson tarvitaan hankinnasta solunsalpaajaresistentti fenotyypin. E

x vivo

manipulointi munasarjasyövän kantasolujen (CSC) eriyttäminen voidaan pienentää MyD88 lauseke, joka tarjoaa potentiaalisesti arvokkaan CSC malli munasarjasyöpää.

Citation: d’Adhemar CJ, Spillane CD, Gallagher MF, Bates M, Costello KM, Barry-O’Crowley J, et al. (2014) MyD88 + fenotyyppi positiivisena ennustetekijä epiteelikasvaimet munasarjasyöpä. PLoS ONE 9 (6): e100816. doi: 10,1371 /journal.pone.0100816

Editor: Chiara Romualdi, Padovan yliopisto, Italia

vastaanotettu: 27 tammikuu 2014; Hyväksytty: 30 toukokuu 2014; Julkaistu: 30 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 d’Adhemar.Hotellin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Cancer Research Irlanti (avustus viitenumero ICS CRP09OLE), Meath säätiö, The Royal City of Dublin Hospital Trust, BDI-2 (10 /CE /B1821), The Emer Casey Foundation, Irlannin Cancer Society ja Marie Curie EU myöntää. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjojen syöpä on yksi yleisimmistä ja tappava naisten syöpätapausta [1], [2], jossa ilmaantuvuus ja kuolleisuus ennustetaan kasvavan länsimaissa [3]. Munasarjan epiteelin syövät (EOCs) käsittävät suuren enemmistön aikuisen munasarjojen maligniteettien, jotka ovat yleisimmin vakavien karsinoomien [4], [5]. Koska munasarjasyöpä on usein oireeton alkuvaiheessa tai hänelle epämääräisiä oireita matkien extra-munasarjojen sairaus; Useimmilla potilailla (70-75%) esiintyy laajalle levinnyt tauti diagnoosin kanssa tuloksena korkea kuolleisuus [6]. Nykyinen hoito vaihtoehtoja ovat leikkaus ja platina ja /tai taksaani kemoterapian [7]. Vaikka EOC tyypillisesti vastaa hyvin tavanomaista kemoterapiaa, jossa aluksi 70-80% hoitovaste, tämä on usein seuraa toistuminen, joka on usein solunsalpaajaresistentti [8], [9]. Ennustaminen ja voittamiseen chemoresistance edelleen keskeinen haaste hoidossa, mutta tällä hetkellä ei ole saatavilla biomarkkerit (seerumi tai kudosta), jotka ovat todella ennakoivaa käyttäytymistä tai chemoresponsiveness.

Toll-like-reseptorien (TLR) toimivat olennaisia ​​osia luontaisen immuunijärjestelmän. Ne ovat kalvoon sitoutuneiden reseptorien, jotka tunnistavat komponenttien eksogeenisen patogeenien, kuten bakteerin lipopolysakkaridin (LPS) ja virus-RNA: t, jotka johtavat tulehdusvasteen. TLR: t voidaan myös aktivoida endogeenisten ligandien, mukaan lukien solujätteiden johdettu syövän etenemisessä [10] – [13]. Useimmat TLR signaalin kautta myeloidinen erilaistumiseen primäärivasteen geeni 88 (MyD88) ja ilmaistaan ​​sekä imukudoksen ja ei-imukudoksissa (pääasiassa entisen), jossa on yhä enemmän todisteita siitä, että niillä on tärkeä rooli syövän synnyssä [14], [15] . Nettovaikutus TLR signaloinnin (+/- MyD88) on transkriptiotekijä aktivointi, kuten Nukleaaritekijä-KB (NF-KB). NF-KB on yleisesti ilmaistu transkriptiotekijä, joka on erityisen tärkeä sekä osana normaalia tulehdusreaktio ja tuumorigeneesiä, ekspressiota säätelevät erilaisten tulehdustautien, apoptoottiset ja onkogeeninen geenit [16]. Lopulta NF-KB: n aktivaatio johtaa lisääntyneeseen sytokiinien, kemokiinien ja kasvutekijät. Aktiivisuus tämän reitin on yleensä kurissa, normaalin immuunivasteen, osittain kautta microRNA sääntelyn TLR4 signalointi, joista esimerkkejä ovat mikroRNA 21 (miR-21) ja miR-146a [17], [18], [ ,,,0],19].

TLR4 /MyD88 reitin on viime vuosina ehdotettu riskitekijä syövän synnyn ja chemoresistance munasarjasyövän [20], [21]. Vaikka on havaittu, että TLR4 ilmaisu on kaikkialla EOC soluja, alaryhmä differentiaalisesti ilmentävät MyD88 on havaittu olevan sytokiinien /kemokiinin tuotannon ja solujen lisääntymistä aktivoituessa TLR4 [20]. Chen et ai. [21] ovat käyttäneet tätä differentiaalikaavojen jakaa EOC osaksi MyD88 positiivisia ja MyD88 negatiivinen. MyD88 positiivinen EOCs ole toimivaa TLR4 /MyD88 polku ja voi edustaa munasarjasyövän kantasolu (CSC), joka on erittäin vastustuskykyinen proapoptoottiseen signalointi ja jotka voivat rekrytoida valkosoluja aktiivisesti edistää tulehdusta, pro-proliferatiivinen mikroympäristölle [22] . MyD88 negatiivinen EOCs toisin ole MyD88 ja voi edustaa eriytetty kasvaimia, jotka ovat vähemmän biologisesti aggressiivisia [20], [23]. Alvero et ai. [12] osoittivat, että CSCS peräisin munasarjakasvain näytteistä on ainutlaatuinen CD44 + /MyD88 + fenotyyppi, mikä helpotti kestävyys sekä tuumorinekroositekijä (TNF) indusoi apoptoosia ja sytotoksisen hoidon. Viime aikoina MyD88-proteiinin ilmentymisen osoitettiin olevan merkittävästi huono ennustetekijä EOC [24].

ero luokittelu MyD88 positiivisten ja negatiivisten EOC on vaikutuksia tämänhetkiset terapeuttiset strategiat. Vaikka sisplatiini-resistenssi tapahtuu pienellä osalla naisista aikana niiden alustava käsittely (30%), se olisi myöhemmin kehittyy kaikilla naisilla, jotka saivat hoitoa uusiutuva sairaus [9], ja on todennäköisesti johtuu vastustuskyky apoptoottinen signalointi MyD88 positiivisissa soluissa [12 ], [25], [26]. Lisäksi paklitakseli (taksaani perustuva aine) on TLR4 ligandi ja voi aktivoida TLR4 /MyD88 väylän MyD88 positiivisissa soluissa, todella asiakkuutta niiden leviäminen [20], [27]. Tällaiset MyD88 toimivaltainen syöpäsolut ovat teoriassa voivat hyödyntää nykyistä kemoterapeuttisten strategioita, ei vain vastustavat niiden sytotoksisia vaikutuksia, mutta myös käyttämällä paklitakseli-ligaation helpottamiseksi niiden kasvua ja sitä ympäröivän strooman kautta tehostaa NF-KB: n tuotantoa. Siksi nykyinen näyttö viittaa siihen, että paklitakseli voi itse asiassa olla epäedullista potilailla, joiden kasvaimet sisältävät MyD88 positiivisia EOC soluja huolimatta säilyttäen sytotoksisia vaikutuksia MyD88 negatiivisissa soluissa [20], [27]. On myös mahdollista, että uusiutuva sairaus voi edustaa pooli aggressiivisempi syöpäsolujen (CSCS), joka on tosiasiallisesti ”valittiin” by paklitakselihoidolla.

hypoteesin, että MyD88 + syöpäsolujen edustavat alapopulaatio soluja EOC jotka antavat enemmän aggressiivinen biologista käyttäytymistä ja chemoresistance. Tähän mennessä suhteellisen harvat munasarjasyövän näytteitä, tai eristetty syöpäsolun linjat, on tutkittu suhteessa TLR4 /MyD88 ilmaisun [20], [23], [27], [28]. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia kattavasti luonnehtia jakelun ja kliinistä merkitystä TLR4 ja MyD88 ilmaisun kohortin munasarjojen kasvainten, joka sisältää kaikki yhteiset histologisen alatyyppejä ja on suurin tällainen sarja tutkittu tähän päivään mennessä [20], [23], [ ,,,0],24], [27], [28]. Ilmaus kaksi MikroRNA tiedetään säätelevän TLR4 /MyD88 reitin arvioitiin myös osajoukko pahanlaatuinen kasvain näytteet tutkia niiden rooli epigeneettisellä modulaattoreina tämän reitin. Knockdown TLR4 /MyD88 arvioitiin leikellä toiminnallista roolia näiden geenien. Rinnakkain edellä kokeissa TLR4 /MyD88 ilmentyminen arvioitiin eriytymättömissä ja eriytetty alkion karsinoomasoluja lisänäyttöä syövän kantasolujen hypoteesia munasarjasyöpä.

Tulokset

TLR4 ja MyD88 Expression testisarjassa

ensisijainen koesarja pahanlaatuisia munasarjojen kasvaimia käsitti 20 potilasta, joilla vakavien adenokarsinooman, jotka oli sovitettu grade (korkealaatuisesta) ja vaiheen (FIGO III), ja jotka olivat saaneet platinapohjaisen adjuvantti kemoterapiaa. TLR4 ilme oli yleisesti läsnä ja sai positiivisina (immunoscore 4) kaikissa kasvaimet (20/20). Sen sijaan positiivinen immuunivärjäykseen MyD88 havaittiin vain 12/20 tapauksissa ja loput (8/20) luokiteltiin MyD88 negatiivinen. Kliinistä seurantaa tiedot olivat saatavilla kaikista potilaista, joista 12 oli kuollut aikaan tämän tutkimuksen, ja retrospektiivinen analyysi suoritettiin onko MyD88 ilmentyminen liittyi potilaan selviytymistä. Progression elinaika (PFS) ja kokonaiselossaoloaika (OS) arvioitiin. Kuva 1 osoittaa, että MyD88 ilmentyminen liittyi merkittävästi lyhentää PFS ja OS (p 0,05). Mediaaniaika toistuminen (leikkauksen aikana) potilaille, joilla MyD88 kasvaimia oli 16 kuukautta, kun taas MyD88 syöpäkasvain uusiutunut klo mediaani 42 kuukauden (p = 0,018). MyD88 positiivisia kasvaimia liittyy myös huomattavasti lyhyempi OS. Mediaani OS aikaa potilaille, joilla MyD88 kasvaimia oli 43 kuukautta, kun 108 kuukautta MyD88 syöpäkasvain (p = 0,008).

MyD88 kasvaimia (n = 12) oli merkittävästi vähentynyt ilman taudin etenemistä ( A) ja kokonaiseloonjääminen (B) (p = 0,018 ja p = 0,008, tässä järjestyksessä).

TLR4 ja MyD88 olevassa Varmistus Sarja

Expression TLR4 ja MyD88 arvioitiin sitten 178 potilasnäytteistä voidakseen varmistaa koesarjan tulokset ja tutkia ilmaisun hyvänlaatuisen munasarjakudoksen ja eri histologisia alatyyppejä EOC. Nämä näytteet ovat normaaleja munasarjat (n = 50), hyvänlaatuiset kystat (n = 15), rajatapaus kasvain (n = 28) ja pahanlaatuiset kasvaimet (n = 85). Potilaiden keskimääräinen ikä heti leikkauksen oli 51 vuotta raja- kasvaimia (vaihteluväli 20-81) ja 59 vuotta kaikkien pahanlaatuisten kasvainten (vaihteluväli 23-94). Suurin osa pahanlaatuisia kasvaimia olivat korkealaatuista, 62% annetaan arvosana 3 (pääasiassa vakavien karsinoomat), ja korkea vaihe (51,3% FIGO vaiheessa IIIC, 8,1% vaihe IV). Kaikki kasvaimet, jotka järjestetään IIB ja suuremmat olivat vakavasta karsinoomat. Immunofenotyyppi kunkin kudostyypin on yhteenveto taulukossa 1.

Ilmaisu Sekä TLR4 ja MyD88 oli kaikkein yhtenäinen ja voimakkainta vakavien kasvainten, erityisesti raja ja pahanlaatuiset vakavasta kasvaimia. Esimerkkejä TLR4 ja MyD88 IHC ilmaisun esitetään kuvissa 2 3. Normaali munasarjojen pinnan epiteeli (NOSE) osoitti vaihteleva ilmentyminen TLR4 (7/50), mutta oli tasaisen negatiivinen MyD88 (0/50). Noin puolet hyvänlaatuinen kystat olivat TLR4 positiivisia (7/15, mixed alalajit), mutta vain vähemmistö oli MyD88 positiivisia (3/15, kaikki vakavasta). Valtaosa raja vakavien kasvaimia olivat molemmat TLR4 ja MyD88 positiivinen (12/15), jolla on vahva värjäytyminen havaittiin 7/12. Sen sijaan kaikki raja mucinous kasvaimet olivat MyD88 negatiivisia. Vaikka 73% (62/85) pahanlaatuisia kasvaimia olivat TLR4 positiivisia (mixed alalajit), koekspressoimalla MyD88 havaittiin vain 47% tapauksista, jotka olivat kaikki vakavasta karsinoomat. Kaikki ei-vakavien karsinoomien (mucinous, kirkas solu ja endomet-) olivat MyD88 negatiivisia. Tämä data tuotetaan 40 MyD88 positiivisia ja 45 MyD88 negatiivinen syöpiä. MyD88 ilmentyminen havaittiin sekä poorly- ja hyvin erilaistunut kasvainsoluja, ja oli vahva lähellä alueita kuolion. Kuten taulukosta 2 ei ollut korrelaatiota potilaan iästä tai yleisarvosanaksi erilaistumisen ja TLR4 tai MyD88 ilme. Kollektiivisesti TLR4 + /MyD88- fenotyyppi liittyi kaikenlaisia ​​kudos, mukaan lukien ei-dysplastic epiteelin, kun taas TLR4 + /MyD88 + (co-lauseke) liittyi ainoastaan ​​munasarjojen kasvaimet.

V: polttoväli heikko värjäytyminen normaali munasarjojen pinnan epiteeli (40x); B: diffuusi kohtalainen värjäytyminen hyvänlaatuinen vakavien cystadenoma (20x); C: diffuusi vahva värjäytyminen rajatapaus vakavien kasvain (10x); D: diffuusi vahva värjäytyminen on (grade 2) vakavien karsinooma (40x).

, negatiivinen hyvänlaatuinen mucinous cystadenoma, jossa positiiviset strooman tulehdussolujen (20x). B, positiivinen rajatapaus vakavien kasvain (20x). C, positiivinen huonolaatuisen vakavien karsinooma (40x). D, positiivinen laadukkaat vakavien karsinooma (40x). E, negatiivinen endomet- karsinooma (20x). F, positiivinen vakavien karsinooma (pitkä nuoli), jossa on negatiivisia kirkas cell carcinoma (lyhyt nuoli) (40x).

Retrospective analyysi suoritettiin onko TLR4 /MyD88 ilme vaikuttaa elossaololuku tässä suurempia sarjassa. Kliiniset seurantatiedot oli käytettävissä 39 potilaalla, joilla pahanlaatuisia kasvaimia, 33 joista oli kuollut aikaan tässä tutkimuksessa. Tapauksessa kuulu seurannan sisältyvät ei-vakavien karsinoomien (kaikki MyD88 negatiivinen), joilla on uusiutuva sairaus (n = 2), potilaat, jotka kuoli leikkauksen jälkeisiä komplikaatioita tai jopa sellaisten syiden (n = 2) ja potilaat menettivät seurata (jatkokäsittelyä ja seuranta on eri laitos). Valikoiduissa tapauksissa luokiteltiin 2 ryhmään perustuen MyD88 proteiinin ilmentymiseen: Ryhmä 0 (MyD88 negatiivinen); Ryhmä 1 (MyD88 positiivinen). Kaikki tapaukset olivat laatu ja vaihe-Hyväksytty (asteen 3, FIGO III /IV), olivat optimaalisesti rajatusta ja potilaat olivat saaneet liitännäishoitona platinapohjaisen kemoterapian kanssa (n = 28) tai ilman (n = 11) paklitakseli. Kuten on havainnollistettu kuvioissa 4 5, TLR4 ja MyD88 ilmaisun molemmat liittyvän merkittävästi lyhentää ilman taudin etenemistä (PFS), ja MyD88 ilmentyminen nähtiin lisääntynyt kokonaiselinaikaa (p 0,05). Mediaani aika uusiutumiseen potilaille, joilla kasvainten ilmaistu TLR4 oli 12 kuukautta (n = 20), kun taas TLR4 syöpäkasvain uusiutui mediaani 27 kuukauden (n = 19); p = 0,016. Vastaavasti keskimääräinen aika uusiutumiseen varten MyD88 kasvaimia oli 13 kk (n = 21), verrattuna 31 kuukauteen, jos MyD88 negatiivinen (n = 18); p = 0,02. Ero OS välillä TLR4 positiivinen (n = 19) ja TLR4 syöpäkasvain (n = 14), ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,312). Mediaani OS aikaa potilaille, joilla MyD88 positiivinen EOC oli 28 kuukautta (n = 21), kun taas potilailla, joilla MyD88 syöpäkasvain (n = 12) oli merkitsevästi pidempi kokonaiselossaoloaika (47 kuukautta, p = 0,029). MyD88 positiivinen maligniteetit siis olivat yhteydessä alentuneeseen elossaololuku ja taudista vapaan välein.

TLR4 (A) tai MyD88 (B) negatiiviset tapaukset oli merkitsevästi parempi PFS (15 18 kuukautta pidempi; p 0,05).

Survival oli pidempi MyD88 (B) negatiiviset tapaukset (19 kuukauden aikana; p 0,05). Ero selviytymisen liittyy TLR4 (A) ei ole merkitsevä (p 0,5).

MicroRNA Expression Testisarjassa

EOC näytteitä alkuperäisestä koesarjan jaettiin kaksi ryhmää perustuvat aikaisempiin immunohistokemiallista tuloksiin (MyD88 positiivinen, n = 11; MyD88 negatiivinen, n = 9). Kuten kuviossa 6 on esitetty, keskimääräinen ekspressio miR-21 ja miR-146a in MyD88 negatiivinen syöpien nostettiin suhteessa keskiarvo MyD88 positiivisen (p 0,001).

sirontakaavioissa osoittaa suhteellisen microRNA ilmaisu keskihajonta (kertamuutoksia avulla laskettuna 2

-ΔΔCt menetelmä). 20 EOC tapauksissa (serous karsinoomat) ryhmitellään MyD88 + tai MyD88- perustuu proteiinin ilmentymiseen; data esitetään suhteessa kunkin ryhmän. Keskimääräinen ilmentyminen miR-21 miR-146a kasvoi MyD88 negatiivinen EOC (p 0,05).

Gene ja microRNA Expression olevassa Varmistus Sarja

Selected pahanlaatuinen potilaan kasvain näytteet jaettiin kahteen ryhmään sen perusteella, edellinen IHC tulokset (MyD88 positiivinen, n = 10; MyD88 negatiivinen, n = 12). Expression of miR-21 ja miR-146a analysoitiin rinnakkain TLR4 ja MyD88 geeniekspressioanalyysissä. Kuvio 7 osoittaa, että samanlainen koesarjan, ekspressiota sekä MikroRNA oli merkittävästi lisääntynyt MyD88 negatiivinen syöpien suhteen MyD88 positiivinen ryhmä (miR-21, p = 0,0046; miR-146a, p = 0,0191), joissa on enemmän biologisia heterogeenisyyttä havaittiin miR-146a tasolle. Siihen liittyvä tasot TLR4 MyD88 mRNA olivat tilastollisesti muuttumattomana välillä MyD88 positiivisen ja negatiivisen syöpiä (p = 0,8777 ja 0,1348, vastaavasti). Siksi miR-21 ja miR-146a näyttävät käänteisesti sidoksissa MyD88 munasarjasyövän. Puuttuminen MyD88 mRNA muutoksen MyD88 negatiivinen ryhmä ehdottaa, että molemmat miR-21 ja miR-146a on kohdistettu MyD88 at transkription jälkeisellä tasolla.

sirontakaavioissa osoittaa suhteellista geenin ja microRNA ilmaisutapoja keskihajonta (fold muutokset saadaan seuraavan 2

-ΔΔCt menetelmä). 22 EOC tapauksissa (serous karsinoomat) ryhmitellään MyD88 + tai MyD88- perustuu proteiinin ilmentymiseen; data esitetään suhteessa kunkin ryhmän. A B, TLR4 MyD88 mRNA tilastollisesti muuttumattomina MyD88 positiivisen MyD88 negatiivinen ryhmät (p 0,05); C D, tasot sekä miR-21 miR-146a säädellään ylöspäin MyD88 negatiivinen EOC (p 0,05).

TLR4 ja MyD88 ilmaisun kohortin vastanneiden ja vastetta

MyD88 mRNA voimistunut 4,9 kertaiseksi kohortin ei-vastetta verrattuna vasteen (p 0,05). Samoin TLR4 mRNA yliaktiivista 3,4 kertaiseksi tässä kohortissa (p 0,05). Kaikki potilaat analysoitiin tässä oli edennyt serous papillaarikuvioiden adenokarsinomia ja sai karboplatiinin ja paklitakselin ensilinjan kemoterapiaa seuraavat optimaalisen debulking leikkauksen.

Gene ja miRNA ilmentyminen solulinjoissa

Merkittävät muutokset TLR4 mRNA ilmaisun havaittiin välillä chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti soluja, vaikka aste muutos oli vaihteleva (kuvio 8A). A2780cis solut osoittivat 24,1 kertainen nousu TLR4 verrattuna A2780. Sitä vastoin oli 18,8-kertainen lasku TLR4 on solunsalpaajaresistentti IGROV-1CDDP solujen suhteessa IGROV-1. KB-05.08.11 solut osoittivat pienikin muutos vanhempiensa mukaisesti vain 1,6 kertainen lisäys TLR4.

Data esitetään kertainen muutos ilmaisun suhteen A2780 syöpäsolujen (sekä keskihajonta) .

Lisääntynyt MyD88 mRNA: n ekspressio havaittiin kaikissa solunsalpaajaresistentti syöpäsolulinjoissa; nämä muutokset olivat pieniä, mutta tilastollisesti merkitsevä (kuvio 8B). Oli 2,6 kertainen lisäys MyD88 in A2780cis soluissa verrattuna MyD88-negatiivisten A2780 soluissa. IGROV-1CDDP solut osoittivat 1,6-kertainen lisäys MyD88 suhteessa chemosensitive IGROV-1-soluissa. Samanlainen TLR4 tietojen muutos MyD88 ilmentymisen KB-05.08.11 solut chemosensitive KB-3-1 vanhempi linja oli pienin vain 1,4 kertainen lisäys MyD88.

Variable muutokset tasojen miR-21 ei havaittu chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti soluja (kuvio 9A). A2780cis solut osoittivat 1,5-kertainen lasku miR-21 verrattuna A2780, mutta tämä muutos ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,5958). A2 kertainen nousu miR-21 havaittiin solunsalpaajaresistentti IGROV-1CDDP solujen suhteessa IGROV-1. KB-05.08.11 soluista osoitti 2,9 kertaisesti alentunut miR-21 verrattuna vanhempiensa (chemosensitive) viiva.

Data esitetään kertainen muutos ilmaisun suhteen A2780 syöpäsolujen (sekä keskihajonta ).

Kuten miR-21, muutokset miR-146a tasojen chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti syöpäsolujen vaihtelivat (kuvio 9B). Oli 6,5 kertaiseen kasvuun miR-146a in A2780cis soluissa verrattuna MyD88-negatiivisten A2780 soluissa. IGROV-1CDDP solut osoittivat 1,2-kertainen lisäys MyD88 suhteessa chemosensitive IGROV-1-soluissa, mutta tämä muutos ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,4557). 2,5 kertainen väheneminen miR-146a havaittiin KB-08.05.11 solujen verrattuna niiden chemosensitive (KB-3-1) vanhemman linja.

Alennettu TLR4 ilmaisu johtaa lisääntyneeseen kemosensitiivisyys munasarjasyövän solujen

toiminnallisesti arvioida roolia TLR4: /MyD88 polku on kemosensitiivisyys munasarjasyöpä solujen solunsalpaajaresistentti munasarjasyövän solulinja SKOV-3 transfektoitiin siRNA erityisesti suunnattu MyD88 tai TLR4. 72 tunnin kuluttua MyD88 oli merkittävä vähentynyt sekä mRNA: sta (kuvio 10A) ja proteiini (kuvio 10B) taso soluissa, jotka on transfektoitu siMyD88. Kuitenkin menetys MyD88 ilmaisun ei ollut vaikutusta kemosensitiivisyys solujen (kuvio 10C). Merkittäviä vähennyksiä ilmaisussa TLR4 mRNA (kuvio 10A) ja proteiini (kuvio 10B) taso havaittiin myös soluissa 72 tuntia transfektion jälkeen. Kuitenkin alentuneen TLR4 ilmentymisen vaikutti merkittävästi vaste SKOV-3 kohti paklitakselia (kuvio 10C). Oli 27,1%: n lasku solujen elinkelpoisuuden siTLR4 transfektoiduissa paklitakselilla käsitellyissä soluissa verrattuna transfektoimattomiin paklitakseliin käsitellyistä soluista ja 19,6%: n lasku verrattuna siNeg transfektoitujen solujen. Siten hiljentäminen TLR4 tuotti enemmän chemosensitive fenotyyppi SKOV-3 munasarjasyöpäsoluja.

SKOV-3-solut jätettiin transfektoimattomissa (Unt), transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA (siNeg), MyD88 kohdistaminen siRNA ( siMyD88) tai TLR4 kohdistaminen siRNA (siTLR4). Transfektoituja soluja inkuboitiin 72 tuntia, ennen kuin joko sadonkorjuun mRNA-analyysi (A), proteiinien analyysi (B) tai käsittely paklitakselia (C). (A) MyD88 ja TLR4 mRNA ekspressiotasot arvioitiin TaqMan RT-PCR. MyD88 ja TLR4-mRNA normalisoida, että endogeenisen ohjaus, B2M ja kalibroitu kuin käsittelemättömien solujen luoda suhteellinen osuus mRNA: n ilmentymisen (n = 3, keskiarvo ± SD). (B) MyD88 ja TLR4 mRNA: n ilmentymisen tasot arvioitiin Western blot -analyysillä. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (C) Transfektoidut solut jätettiin joko hoitamatta, käsiteltiin DMSO (ajoneuvon hallintaan) tai 3,5 nM paklitakselin (IC25). 48 tuntia käsittelyn jälkeen, solujen elinkelpoisuus arvioitiin avulla CCK-8-määrityksessä. % Solujen elinkelpoisuus laskettiin vertaamalla absorbanssiarvot ajoneuvonhallintajärjestelmän vastaavaan paklitakselia käsitellyn näytteen. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona + SD, n = 3; * P 0,05, ** p 0,01 (un-pariksi Studentin t-testi).

alkiosyövät kohdunkaulan soluissa näkyy pienentää MyD88 ilmaisua seuraava erilaistuminen

Tiedot suuren mittakaavan microarray kokeilu (M Gallagher, julkaisematon data), joihin liittyy alkion karsinooma syövän kantasoluja (NTera2 ja 2102Ep) kuulusteltiin varten ero TLR4-signaloinnin geeniekspressiota, mikä osoitti, että MyD88 ilmentyminen oli korkea eriytymättömissä NTera2 soluissa ja laski nopeasti, kun eriyttäminen retinoiinihappo ( RA). Validoida microarray tiedot, erilaistumaton ja eriytetty NTera2 ja 2102Ep näytteet arvioitiin MyD88 geenin ja proteiinin ilmentymiseen. Kuten TLR4 on oletettu säännellä MyD88 näissä soluissa, ilmentymistä TLR4 arvioitiin myös huolimatta konstitutiivista ilmentymistä array tutkimuksissa. Down-regulation MyD88 kun erilaistumisen pluripotenttien NTera2 solujen varmistettiin useiden ajanjaksojen (kuvio 11A). TLR4 oli konstitutiivisesti, validointi array data. Sitä vastoin ilmaus TLR4 ja MyD88 oli muuttumattomina nullipotent 2102Ep käsitellyissä soluissa RA (kuvio 11A). Näiden muutosten peilattu klo proteiini tasolla (kuvio 11 B, C). MyD88 proteiinin ilmentyminen heikkeni merkittävästi erilaistumisen NTera2 solujen (MyD88-), kun taas mitään merkittävää muutosta ei havaittu TLR4 värjäytymistä (kuvio 11 B). Sen sijaan 2102Ep soluissa, sekä eriytymättömiä ja käsiteltiin retinoiinihapon, olivat TLR4 +, MyD88 + (kuvio 11C). Mitä liittyy mikroRNA muutoksia, ryhmämme on aiemmin osoittanut, että vaikka miR-21 on muuttumattomana kummassakin solulinjassa vastauksena RA, miR-146a on säädelty aikana erilaistumisen NTera2 soluissa, mutta muuttumattomana 2102Ep soluissa [29]. Tämä viittaa siihen, samanlainen EOC, miR-146a on kääntäen liittyy MyD88 eriytetty alkion karsinooma syövän kantasoluja.

, qPCR tiedot: MyD88 ilmentyminen säätyy alas upon NTera2 erilaistumista, minimaalisella muutokset TLR4 ; toisin 2102Ep soluissa välttää erilaistuminen ja säilyttää sekä TLR4 MyD88 lauseke (kertamuutoksia osoittaneet ovat verrannollisia sisäisen valvonnan GAPDH ja laskea kautta 2

-ΔΔCt menetelmä). B, TLR4 ja MyD88 proteiinin ilmentymistä NTera2 soluissa: TLR4 värjäytymistä jälkeen ennallaan erilaistumiseen (vasen paneeli); MyD88 värjäystä eriytymättömissä NTera2 solut osoittivat merkitsevästi alentunut värjäyksen jälkeen erilaistumisen (oikea paneeli) (kaikki 40x). C, TLR4 ja MyD88 ilmaisun 2102Ep soluissa: minimaalinen muutokset TLR4 (vasen paneeli) tai MyD88 (oikea paneeli) havaittiin seuraavat RA-hoitoa (kaikki 40x).

Keskustelu

luonnehdinta täällä TLR4 ja MyD88 ilmaisun munasarjan epiteelin neoplasia on osoittanut, että vaikka TLR4 ilmaisua jonkinasteinen on kaikkialla kaikentyyppisille munasarjojen epiteelin, myös ei-dysplastic epiteelin, MyD88 on vain ilmaistu kasvainkudoksessa. Tällainen rajoittaminen MyD88 neoplastisten munasarjakudoksen vahvistavat vastaavia löydöksiä äskettäin raportoitu kirjallisuudessa [24]. Kuitenkin tässä tutkimuksessa, TLR4 /MyD88 koekspressoimalla osoitti mieltymys serous kasvaimet yleensä, erityisesti raja ja pahanlaatuiset vakavasta kasvaimia, ja ilmaistiin niin korkean ja heikompilaatuisen vakavasta karsinoomia. Sen sijaan TLR4 puuttuessa MyD88 oli yhteydessä ei-pahanlaatuista kudosta, ei-serous hyvänlaatuisia ja rajatapaus kasvaimia, alaryhmä serous karsinoomien ja ei-vakavien karsinoomien (MyD88 negatiivinen EOC). Kuten TLR4 ilmentyminen oli läsnä kaikenlaisia ​​munasarjojen epiteelin, näyttää siltä, ​​että TLR4 signalointi on yhdistetty joko pahanlaatuisia serous kasvaimia tai ei-vakavien kasvainten suhteessa on MyD88-riippuvainen tai sta riippumatonta.

Chen et al. [21] alun perin esitetty, että suhde MyD88 positiivisia ja negatiivisia EOC solut voivat määritellä kasvainten ominaisuuksiin suhteen etenemistä, chemoresistance ja toistumisen. Tämä on täysin sopusoinnussa meidän tulokset, jotka kuvaavat jakautumista MyD88 ilmaisun munasarjojen neoplasian ja yhdistysten kanssa potilaan eloonjäänti. MyD88 positiivinen syöpiä analysoitu tässä tutkimuksessa uusiutunut 18 kuukautta aikaisemmin kuin MyD88 negatiivinen syöpiä, joilla on samanlainen väheneminen eloonjäämiseen 19 kuukauden (p 0,05). Tulokset Tämän analyysin ovat täsmälleen yhdenmukaiset viimeaikaisten kertomuksia vähennykset tautivapaan välein ja potilaan selviytymisen MyD88 positiivinen syöpiä, jotka vaihtelevat 11-35 kuukautta vähennykset ilman taudin etenemistä [20], [24], [27] , [28] ja 26-36 kuukautta vähennykset kokonaiselossaoloaikaa [24], [27]. Erittäin suuri ero selviytymisen joka havaittiin Testisarjassa suhteessa MyD88 ilme johtuu todennäköisesti pienestä otoskoko tässä kohortissa, koska se on selvästi ristiriitainen kaikkien aikaisempien tutkimusten ja validointi sarjan käsitellä tässä.

lisäksi havaitut muutokset MyD88 ilmentymisen alkion karsinooma (EY) syöpä kantasolut, yksi parhaista tunnettu CSC mallien käytössä nykyään [30] – [32], viittaavat myös siihen, että MyD88 positiiviset syöpäsolut ovat biologisesti aggressiivisia kuin MyD88 negatiivinen solut. Erilaistumaton kantasolun kaltaisia ​​populaatioita pahanlaatuisia kasvaimia riittävät usein tehokkaasti uudistua kasvaimia. NTera2 EY solut erikoistuvat

in vivo

muodostamaan teratokarsinoomiksi, kolme alkio kerros kasvaimia, jotka voivat syntyä munasarja [33]. NTera2 solut ovat erittäin tuumorigeenisen in erotukseton tilassa, ominaisuus, joka on suuresti vähentynyt tai eliminoidaan erilaistuminen [32], [33]. Sen sijaan, 2102Ep EY solut voidaan välttää erilaistumista

in vivo

tuottaa erittäin aggressiivinen puhdasta alkion karsinoomien [31]. Olemme osoittaneet, että vaikka TLR4 ilmentyy jatkuvasti EY soluissa, menetys MyD88 ilmentyminen liittyy ”eriyttäminen kytkin”: siirtyminen NTera2 EY soluja niiden korkeasti kasvaimia (erilaistumaton) vähemmän-kasvaimia (eriytetty) toteaa. Tämä muutos ilmaus upon eriyttäminen on pieni mutta hyvin toistettavissa, ja osoittaa, että

ex vivo

manipulointi munasarjojen CSC eriyttäminen voidaan pienentää MyD88 ilme. Uskomme, että se tukee oletusta, että EOC MyD88 positiiviset solut voivat olla varren kaltainen johtuen niiden MyD88 ekspressiokuviota [12], [21] ja myös osoittaa käytännön ja helposti manipuloitavissa syövän kantasoluja mallin merkitystä munasarjasyöpä.

viime aikoina on raportoitu, että miR-21 säätelee TLR4 kohdistamalla tuumorisuppressoriproteiinia PDCD4 [19], kun taas miR-146a on NF-KB-riippuvaista [34] ja tavoitteet ja vähentää ilmentymistä IRAK-1, IRAK -2 ja TRAF-6, jotka ovat keskeisiä MyD88 koulutusjakson osia [18], [35]. Lopulta miR-21 ja miR-146a vastavuoroisesti osallistua sääntelyn TLR4 /MyD88 ilmaisu, joka palvelee negatiivisena säätelijöinä MyD88 riippuvaisten TLR4 signalointi. Romaani analyysi miR-21 ja miR-146a ilmentyminen Tässä tutkimuksessa, joka perustuu luokitteluun EOC osaksi MyD88 positiivisia ja MyD88 negatiivinen, osoittaa, että geenien molempien MyD88 ja nämä MikroRNA liittyvät munasarjasyöpä. Hienovarainen mutta merkittäviä muutoksia MyD88 mRNA: n ilmentymisen havaittiin välillä chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti munasarjojen ja kohdunkaulan syöpäsoluja.