Krooninen sairaus

tiivistelmä

Karyopherin superperheen käsittää ydinvoimalaitosten liikenteen proteiinien mukana sukkuloitua tiettyjen rahdin proteiinien ja pois ytimen. Karyopherin β1 (Kpnβ1) ja Karyopherin α2 (Kpnα2) ovat Importiini proteiineja, jotka toimivat yhdessä kuljettaa lastia tumaan. Olemme aiemmin tunnistettu lisääntyneen ilmentymisen Kpnβ1 ja Kpnα2 kohdunkaulan kasvaimissa verrattuna normaaleihin epiteelin ja transformoiduissa soluissa verrattuna niiden normaaliin kollegansa. Tämä tutkimus siis tavoitteena oli tunnistaa transkription sääntelymekanismeja liittyy korkea Kpnβ1 ja Kpnα2 tasolla syöpäsoluissa. Kpnβ1 (-2013-100) ja Kpnα2 (-1900-69) promoottori fragmentit erikseen kloonattiin toimittaja vektorin pGL3-basic, ja Lusiferaasimäärityksiä paljasti sekä huomattavasti aktiivisempi syövän ja transformoiduissa soluissa verrattuna normaaliin. Sarja deleetiorakenteita tunnistaa -637–271 Kpnβ1 ja -180–24 Kpnα2 promoottorin alueet vastaavat ero promoottorin aktiivisuutta, ja useita erittäin konservoituneita E2F sitoutumiskohdat tunnistettiin näillä alueilla. Mutaatio analyysi vahvisti vaatimusta E2F sivustoja promoottorin aktiivisuutta, ja siru analyysi vahvisti E2F2 /DP1 sitoutumisen Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit

in vivo

. Dp1 inhibitio johti alentuneet vastaavat proteiinit, vahvistaa tehtävän E2F in yli-ilmentyminen Kpnβ1 ja Kpnα2 proteiinien syöpään. E2F aktiivisuus tiedetään vapautettiin kohdunkaulan syöpäsolujen takia esto sen repressorin, Rb, HPV E7. Estyminen E7 käyttäen siRNA alensivat Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorin toimintaa, samoin kuin yliekspressio Rb. Kaiken kaikkiaan tämä tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa, että kohonnut Kpnβ1 ja Kpnα2 ilmentymistä syöpäsoluissa korreloi muuttunut transkription säätelyyn liittyvät säätelemättömään E2F /Rb toiminnan

Citation: van der Watt PJ, Ngarande E, kevyempi VD ( 2011) yli-ilmentyminen Kpnβ1 ja Kpnα2 importiinissa proteiinit Cancer peräisin vapautetuilla E2F Activity. PLoS ONE 6 (11): e27723. doi: 10,1371 /journal.pone.0027723

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 lokakuu 2011; Hyväksytty: 23 lokakuu 2011; Julkaistu: 18 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 van der Watt et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Kapkaupungin yliopisto, Carnegie Corporation New York, CANSA, ja Medical Research Council (SA). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tätä työtä tukivat Kapkaupungin yliopisto /Carnegie Corporation of New York Development avustukset, CANSA, ja Medical Research Council (SA). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Karyopherin proteiinit ovat liukenevia ydin- liikenteen reseptoreja, jotka toimivat kuljettavat rahtia proteiineja ja tietyt RNA: t otetaan ja ulos solun tumassa kautta tumahuokonen kompleksi (NPC) [1]. Karyopherins voivat toimia importins of exportins riippuen niiden suunnan liikenteen. Karyopherin beeta 1 (Kpnβ1, joka tunnetaan myös importiinissa β tai p97) on Importiini proteiini, joka on keskeinen rooli ydinvoiman tuontiprosessin. Nuclear tuonti kautta Kpnβ1 voi tapahtua joko Kpnβ1 toimimalla autonomisena ydinvoiman kuljetus reseptoria, tai sen yhteys sovittimen proteiini, kuten Karyopherin alfa (Kpnα, joka tunnetaan myös importiinissa α), jolloin tuontiprosessin tunnetaan klassisen ydin- tuonti [2]. Klassisessa ydinvoiman tuonnin reitissä tumalokalisaatiosekvenssiai- (NLS) läsnä lasti tunnistaa ja sitoo sovittimen proteiini, Kpnα, joka sitten muodostaa trimeeri kompleksin Kpnβ1. Lasti: Kpnα: Kpnβ1 kompleksi kuljetetaan poikki tumahuokonen kompleksin tumaan, jossa sille on hajotetaan sitoutumisen RanGTP. On kuusi Kpnα isomuodot (Kpnα1-6), joka on määritetty on edullinen sitoutuminen spesifisiä substraatteja [3]. Toimivuus kaikki kuusi isomuodot siten laajentaa alustan välillä tapahtuu kaikkialla NPC.

Olemme äskettäin osoittaneet, että ilmaus Kpnβ1 ja Kpnα proteiini, Kpnα2, on kohonnut kohdunkaulan syövän ja transformoituja soluja sekä mRNA ja proteiinin tasot [4]. Huomasimme myös, että esto Kpnβ1 ilmentymisen kohdunkaulan syöpäsolujen johtaa solun kuolemaan apoptoosin kautta, mikä viittaa siihen, että kohdunkaulan syövän solut tulevat funktionaalisesti riippuvainen Kpnβ1 yliekspressio, korostetaan Kpnβ1 säätelyyn ylöspäin ylläpitämiseen syövän biologian. Tutkimuksessamme Kpnα2 inhibitio ei ollut vaikutusta kohdunkaulan syövän solujen elinkelpoisuuteen [4]; on mahdollista, että sen esto johtivat toiminnallinen korvaus muiden Kpnα perheenjäseniä. Noetzel et ai. [5] osoitti, että rintasyövän soluja koki apoptoottisen solukuoleman kun Kpnα2 estyi [5], mikä viittaa siihen, että joillakin solulinjoilla se saattaa olla toiminnallisesti tarpeeton, kun taas toisissa se on toiminnallisesti merkitystä. Lisäksi, monet viimeaikaiset tutkimukset ovat tunnistaneet korkea Kpnα2 tuumorikudoksessa, mikä viittaa siihen, että säätelyä Kpnα2 assosioituu syövän kehittymisen. Tällaisista syövistä ovat melanooma [6], rintasyöpä [7]; [8], ruokatorven syöpä [9], munasarjasyöpä [10], ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [11], eturauhassyöpä [12], virtsarakon syöpä [13] ja maksasyövän [14]. Mielenkiintoista on, Wang et ai. [11] osoittivat, että Kpnα2 erittyy seerumissa, mikä viittaa siihen, että on mahdollista kliinistä käyttökelpoisuutta syövän biomarkkerina. Lisäksi useat tutkimukset ovat raportoineet, että korkea Kpnα2 ilmaisu kumppaniaan huono elossaololuku [6] – [10]; [12]; [13], mikä viittaa mahdolliseen ennustetekijöitä rooli Kpnα2.

Vaikka yli-ilmentyminen Kpnβ1 ja Kpnα2 syöpäsoluissa näyttävät olevan merkittäviä tapahtumia, vähän tiedetään koskien niiden transkription säätelyyn ja tekijöistä, jotka ohjaavat niiden ilmaisun ja lyijy niiden säätelyyn ylöspäin syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa me siis kloonattiin ja analysoitiin Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit, ja tunnistaa tärkeä rooli transkriptiotekijä, E2F, induktio Kpnβ1 ja Kpnα2 ilmentymistä syöpäsoluissa.

Tulokset

lisääntynyt Kpnβ1 ja Kpnα2 proteiinin ilmentyminen transformoiduissa ja syöpäsolujen korreloi lisääntynyt promoottorin aktiivisuus

Koska meillä aiempia havaintoja osoittaa koholla Kpnβ1 ja Kpnα2 ilmentymistä kohdunkaulan syövän solujen ja transformoitujen solujen verrattuna normaaliin, tutkimme Kpnβ1 ja Kpnα2 proteiinin ilmentymistä edustaja normaali, muunnettava ja kohdunkaulan syövän solulinja. Näihin sisältyvät normaaliin fibroblastisolulinjan, WI38-, SV40-transformoitu fibroblastisolulinja, SVWI38, ja kohdunkaulan syövän solulinja, CaSki. Western Blot-analyysi osoitti, kohonnut Kpnβ1 ja Kpnα2 ilmentyminen transformoiduissa ja syöpäsolujen, verrattuna normaaliin WI38- solut (Fig. 1A). Määrittää transkription säätelyalue mekanismit, jotka yhdistävät koholla Kpnβ1 ja Kpnα2 ilmentymistä syövän ja transformoituja soluja, noin 2 kb: n alueen ylävirtaan transkription aloituskohdasta ja Kpnβ1 ja Kpnα2 geenit, yhdessä noin 100 bp 5′-transloimattomat alueet ( alavirtaan transkription aloituskohdasta), otettiin erikseen kloonattiin pGL3-Basic for promoottori analyysiä. -2013-100 Kpnβ1 ja -1990-69 Kpnα2 promoottorin rakentaa molemmat osoittivat merkittävästi suurempi aktiivisuus transformoiduissa ja syöpäsolujen verrattuna normaaliin WI38- solut (Fig. 1 B ja C).

. Western Blot-analyysi Kpnβ1 ja Kpnα2 proteiinin tasot normaaleissa WI38-, muunnettava SVWI38, ja kohdunkaulan syövän CaSki solujen paljastaa kohonneen ekspression syövän ja transformoidut solut. B, C. -2013-100 Kpnβ1 promoottorin aktiivisuutta (B) ja -1900-69 Kpnα2 promoottorin aktiivisuus (C) mitattiin solulysaateista valmistettiin transfektoiduista WI38-, SVWI38 ja CaSki-solujen, ja sen havaittiin olevan merkittävästi korkeampi transformoitujen ja syöpäsolujen verrattuna normaaleihin soluihin (* p 0,05). TK-Renilla-Luc käytettiin kontrollina transfektion tehokkuuden ja lusiferaasin aktiivisuus ilmaistaan ​​suhteessa Renilla lusiferaasi. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SD kokeita suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kaksi kertaa.

Differential Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottoriaktiivisuuksien normaalissa, muuntuvat ja syöpäsolujen johtuvat -637–271 ja -180–24 alueiden Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit, vastaavasti

jotta voidaan määrittää alueet vastaavat ero aktiivisuuden Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit normaaleissa ja transformoitiin /syöpäsolujen, sarja deleetiorakenteita oli tuotettu ja niistä määritettiin aktiivisuus WI38-, SVWI38 ja CaSki soluja. Kaikki poistomuodosteet Kpnβ1 promoottorin näytetään merkittävästi enemmän aktiivisuutta SVWI38 soluissa verrattuna WI38- soluihin (Fig. 2A). Erityisesti SVWI38 solujen peräkkäisellä poistetaan -2013–637 alueella ei vaikuta promoottorin aktiivisuutta, kuitenkin, poistetaan -637–271 alueella merkittävästi vähentynyt Kpnβ1 promoottorin aktiivisuutta (noin viisi kertaa) (Fig. 2A). Vuonna WI38- soluja, poistetaan tämä alue oli vain vähän vaikutusta promoottorin aktiivisuutta. Vuonna CaSki-soluja vastaavia havaintoja tehtiin kuin SVWI38 soluissa, joissa poistetaan alueen -637–271 muuttunut merkittävästi Kpnβ1 promoottorin aktiivisuutta (Fig. 2B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että merkittäviä toiminnallisia elementtejä, välttämätön korkea Kpnβ1 promoottorin aktiivisuus transformoiduissa ja kohdunkaulan syöpäsolut, todennäköisesti oleskella -637–271 alueelle Kpnβ1 promoottori. Suhteen Kpnα2, poistetaan alueen 1900–180 oli vähän vaikutusta Kpnα2 promoottorin aktiivisuus missä tahansa solulinjoista (Fig. 2C, D), mikä viittaa siihen, että alue ylävirtaan -180 että Kpnα2 promoottori ei anneta transkriptionaalista aktiivisuutta. Kuitenkin deleetio alueella -180–24, johti merkittävästi vähentynyt promoottorin aktiivisuutta, lähes tasolle tyhjän vektorin, jossa aktiivisuuden aleneminen on voimakkaampaa SVWI38 ja CaSki-solujen, verrattuna WI38- (Fig. 2C, D). Tämä viittaa siihen, että merkittäviä toiminnallisia elementtejä tarpeen suuren pohjapinta Kpnα2 promoottorin aktiivisuutta transformoiduissa ja kohdunkaulan syöpäsolujen asuvat -180–24 alueelle promoottorin.

. Lusiferaasireportteri- konstruktit sisältävät poistetaan fragmentteja ihmisen Kpnβ1 promoottorin, transfektoitiin väliaikaisesti WI38- ja SVWI38 soluja, vastaavasti. Lusiferaasin aktiivisuus oli huomattavasti korkeampi SVWI38 soluissa verrattuna normaaleihin WI38- solujen kaikkien konstrukteja testataan. -637-100 Kpnβ1 promoottori fragmentti sisälsi merkittävästi enemmän promoottorin aktiivisuutta kuin -271-100 fragmentti transformoiduissa soluissa (* p 0,05). B. aktiivisuus Kpnβ1 promoottorin deleetiorakenteita sisään CaSki soluissa. C. lusiferaasireporttiterilla konstrukteja, jotka sisältävät poistetaan fragmentteja ihmisen Kpnα2 promoottorin, transfektoitiin väliaikaisesti WI38- ja SVWI38 soluja, vastaavasti. Poistetaan -180–24 promoottorialue johti merkittävästi vähentynyt promoottorin aktiivisuutta. D. aktiivisuus Kpnα2 promoottorin deleetiorakenteita sisään CaSki soluissa.

Euroopan Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit sisältävät funktionaalisia E2F sivustoja

bioinformatiikka analyysin alueen -637–271 että Kpnβ1 promoottori ja -180–24 että Kpnα2 promoottorin (käyttäen Matlnspector ja Conreal ohjelmat) yksilöitiin otaksutun sitoutumiskohtia E2F. Vapautettiin E2F aktiivisuus tiedetään avainasemassa syövän kehittymisessä; joten toimivuus näiden oletettujen E2F sivustoja tutkittiin. Viisi oletetun E2F sitoutumiskohdat tunnistettiin Kpnβ1 (-637–271) promoottorialueen, ja käyttämällä kohdennettua mutageneesiä (ja muuntumista ainakin kolme tukiasemaa sisällä konsensus sitoutumiskohdat), mutantti-konstruktit tuotetaan. Kolme E2F sivustoja todettiin toimivaksi, koska niiden mutaatio johti merkittävästi vähentynyt Kpnβ1 promoottorin aktiivisuutta (Fig. 3A). Tähän sisältyi mahdollista aluetta merkitty E2F (a), E2F (b) ja E2F (c). Mielenkiintoista, mutaatio näistä kolmesta sivustoja samanaikaisesti ei anneta enää väheneminen promoottorin aktiivisuuden verrattuna mutaatio E2F sivustoja yksitellen, mikä viittaa siihen, että ne voivat työskennellä toimiessaan säätelevät Kpnβ1 geeniekspressiota (Fig. 3A). Huomattavaa on, että liian, oli havainto, että mutaatio E2F sivustoja johti promoottorin aktiivisuus verrattavissa on -271-100 konstruktio, mikä viittaa siihen, että se on E2F sivustoja, jotka ovat vastuussa kasvun promoottorin aktiivisuuden alue -271–637. Mutaatio kolmesta E2F sivustoja Kpnβ1 promoottori oli selvempi vaikutus promoottorin aktiivisuutta SVWI38 ja CaSki solujen verrattuna, että WI38- soluissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että on lisääntynyt riippuvuus E2F sivustoja transformoiduissa ja syöpäsolujen, verrattuna normaaliin (Fig. 3B).

. Mutaatio viiden oletetun E2F sivustoja Kpnβ1 (-637-100) promoottori suoritettiin kohdennetulla mutageneesillä. Mutaatio kolmesta distaalisen E2F sivustoja johtaa laski merkittävästi Kpnβ1 (-637-100) promoottorin aktiivisuus, kuten on osoitettu Lusiferaasimäärityksiä. Mutaatio kolme toiminnallista E2F sivustoja samanaikaisesti ei aiheuttanut enempää väheneminen promoottorin aktiivisuutta. B. Mutaatio kolmesta E2F sivustoja SVWI38 ja CaSki soluja oli enemmän syvällinen vaikutus Kpnβ1 promoottorin aktiivisuus verrattuna että WI38- soluissa (numerot osoittavat kertainen tukahduttaminen). C. mutaatio yksittäisen E2F sivusto Kpnα2 promoottori poistaa kokonaan promoottorin aktiivisuutta. D. mutaatio E2F sivuston SVWI38 ja CaSki soluja oli enemmän syvällinen vaikutus Kpnα2 promoottorin aktiivisuus verrattuna että WI38- soluissa. Kokeet on esitetty keskiarvo ± SE kokeiden neljänä suoritettiin vähintään kaksi kertaa (* p 0,05).

bioinformatiikka- analyysi Kpnα2 promoottorin, toisaalta, paljasti, että läsnä on vain yksi otaksuttu E2F sivusto -180–24 alueelle. Mielenkiintoista, toisin kuin E2F sivustoja Kpnβ1 promoottori, mutaatio Tämän yksittäisen E2F alueen kokonaan poistaneet Kpnα2 promoottorin aktiivisuutta (Fig. 3C). Mutaatio E2F sivuston SVWI38 ja CaSki solut johti 84- ja 57-kertainen tukahduttaminen promoottorin aktiivisuuden, tässä järjestyksessä, kun taas sen mutaatio WI38- soluissa johti vain 4-kertainen tukahduttamisesta promoottori (Fig. 3d).

Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Kpnβ1 promoottori sisältää E2F sivustoja, jotka toimivat parantaa promoottorin aktiivisuutta, kun taas Kpnα2 promoottori sisältää E2F sivusto, joka on mukana pohjapinta promoottoriaktivoinnilla. Lisäksi E2F aktivointi Hankkeenedistäjät on voimakkaampi transformoiduissa ja syöpäsolujen verrattuna normaaliin.

E2F /DP1 heterodimeerejä sitoa ja aktivoida Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit

in vivo

E2F toimii heterodimeerinen transkriptiotekijä, joka koostuu kahdesta alayksiköstä: E2F perheenjäsen ja Dp perheenjäsen. Vaikka on olemassa useita E2F perheenjäseniä, joiden uskotaan sitoutuvan samaan konsensussekvenssi (5′-TTTSSCGS-3 ’; S tarkoittaa C tai G), E2F1, E2F2 ja E2F3 on osoitettu sisältävän vahvan onkogeenisen kapasiteetti [15], siten sitoutuminen E2F on Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit tutkittiin käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​E2F2 että rajat reagoi E2F1, E2F2 ja E2F3. DP proteiini perhe sisältää proteiineja Dp1-3, jossa DP1 joilla on aikaisemmin yhdistetty syöpään. Arvioida E2F2 /DP1 sitova

in vivo

, siru määritykset suoritettiin käyttäen chromatin valmistettu SVWI38 ja CaSki soluja. DNA immunosaostettiin käyttäen α-E2F2 tai α-DP1-vasta-aineita, ja käytettiin PCR-alukkeiden kanssa, ulottuu E2F sivustoja Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit (Fig. 4A, B). Positiivinen vahvistus sekä SVWI38 ja CaSki solulinjoissa vahvistettiin yhdistyksen välillä E2F2 /DP1 ja E2F sivustoja sekä Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit (Fig. 4A, B).

, B. Näytteet sonikoitiin chromatin oli immunosaostettiin α-E2F2-vasta-aine, joka on α-DP1-vasta-ainetta, tai ei lainkaan vasta-ainetta, kuten on osoitettu. DNA eristettiin Immunopresipitoidun materiaalia monistettiin PCR: llä käyttäen alukkeita, jotka kattavat E2F sivustoja läsnä Kpnβ1 (A) tai Kpnα2 (B) promoottorit. Monistetut fragmentit analysoitiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelissä. Kokeet suoritettiin sekä SVWI38 ja CaSki solulinjat. C. Western Blot osoittaa Kpnβ1 ja Kpnα2 proteiinin tasot jälkeen DP1 inhibition avulla siRNA. β-tubuliinia käytettiin kontrollina proteiinimäärän. D, E Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottoriaktiivisuuksien jälkeen DP1 esto. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SE kokeiden neljänä suoritettiin vähintään kaksi kertaa (* p 0,05).

Lisäksi, onko sitoutuminen E2F /DP1 on Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit vastuussa kohonneet sekä Kpnβ1 ja Kpnα2 proteiinit

in vivo

, E2F aktiivisuus estyi hiljentäminen ilmentymistä DP1, jota ilman E2F eivät enää voi toimia. Kpnβ1 ja Kpnα2 proteiinin tasot mitattiin Western blot -analyysi sen jälkeen, kun DP1 knock-down käyttäen siRNA, ja havaittiin vähenevän, kun DP1 inhibition (Fig. 4C). Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottoriaktiivisuuksien olivat samalla tukahdutettu upon DP1 esto (Fig. 4D, E).

HPV E7 säätelee Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottoriaktiivisuuksien kohdunkaulan syöpäsolujen kautta tukahduttaminen Rb

kohdunkaulan syöpäsolut HPV E7-proteiinin tiedetään sitoa retinoblastooma (Rb) -proteiinia, mikä sen fosforylaation ja lopulta hajoamiseen. Se on tästä syystä E2F kohdegeenien usein yliekspressoituvat kohdunkaulan syöpää, koska E2F ei enää tukahdutettu Rb ja on siten vapaa aktivoimaan sen kohdegeenien. Siksi me arveltu, että esto HPV E7 kohdunkaulan syöpäsolut johtaisi palautettu Rb toiminto, joka aiheuttaa vähennetään E2F aktiivisuutta, ja täten vähentynyt Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottoriaktiivisuuksien. Tämän hypoteesin testaamiseksi, CaSki- soluja transfektoitiin HPV16 E7 siRNA (Kuva. 5A), ja vahvistuksen jälkeen palauttamisen Rb (merkitty kuvioon. 5B jonka alenemiset fosforyloidun Rb ja siihen liittyvän lisääntynyt fosforyloitumaton Rb), Kpnβ1 (-637-100) ja Kpnα2 (-180-+69) promoottoriaktiivisuuksien mitattiin. Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottoriaktiivisuuksien vähensi merkittävästi E7 knock-down soluja verrattuna hallita soluihin, tosin eri tavoin (kuvio. 5C ja D). Vahvistamaan, että vähentynyt Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottoriaktiivisuuksien olivat kautta palauttaminen Rb toiminto, Rb yliekspressoitiin CaSki- kohdunkaulan syövän solujen ja Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottoriaktiivisuuksien mitattuna. Tulokset osoittivat, että Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottoriaktiivisuuksien olivat molemmat merkittävästi alennetaan yli-ilmentyminen Rb (Fig. 5E ja F). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että korkea Kpnβ1 ja Kpnα2 ekspressiotasot kohdunkaulan syöpäsoluja johtuu osittain E7 estoa Rb, ja sen tuomaan aktivointi Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit mukaan E2F.

B. HPV16 E7 siRNA käytettiin estämään E7 ilmentyminen CaSki- soluissa ja Western blot-analyysi suoritettiin analysoida HPV E7 (A) ja Rb (B) tasot jälkeen HPV E7 knock-down. C, D. Kpnβ1 (C) ja Kpnα2 (D) promoottorin aktiivisuudet mitattiin sen jälkeen, kun E7 siRNA transfektion, ja todettiin merkittävästi estyy sen jälkeen, kun HPV E7 inhibition. E, F. Rb on yli-ilmennetään CaSki-soluissa ja Kpnβ1 (E) ja Kpnα2 (F) promoottorin toiminta havaittiin merkittävästi estyy. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SE kokeiden neljänä suoritettava vähintään kaksi kertaa (* p 0,05).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa kloonattiin ja analysoitiin Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit jonka tavoitteena on tunnistaa mahdolliset sääntelymekanismeja, jotka voisivat ajaa niiden voimakasta ilmentymistä syöpäsoluissa. Tämä tutkimus on uutta, että se on ensimmäinen tietomme, joka kuvaa E2F tärkeä transkription säätelijä Kpnβ1 ja Kpnα2 ilmentymistä syöpäsoluissa. E2F on merkitystä monipuolisia solun prosesseja ja on raportoitu säätelemään geenien mukana erilaistumiseen, kehittämiseen, lisääntymistä ja apoptoosin [16]. Aiemmin raportoitu, että E2F on rooli sääntelyn RanBP1 geenin [17], on merkittävä kumppani Ran GTPaasina ja olennainen osa ydin- kuljetusprosessia, ja Tutkimuksessamme kuvataan E2F-säätely Kpnβ1 ja Kpnα2 ydin- maahantuoja proteiineja edelleen implicates E2F sääntelyssä liittyvien geenien ydinvoiman kuljetukseen.

E2F toimintaa ohjataan Rb-reitti, jolloin normaalitilanteessa rb sitoutuminen E2F tukahduttaa E2F toimintaa, kunnes G1 /S-vaiheen solun sykli, jolloin Rb tulee fosforyloituu cdk4 /sykliini D komplekseja, ja E2F vapautuu aktivoimaan sen kohdegeenien. Kuitenkin E2F aktiivisuus on usein vapautettiin syövän, seurauksena usein häiriöitä Rb-reitti [18] – [21]. Rb mutaatioita on havaittu laaja kasvaimia, mukaan lukien osteosarkoomat, pienisoluinen keuhkosyöpä karsinoomat, rintasyövät, ja muut. Lisäksi monissa syövissä p16

INK4a cdk estäjä on mutatoitunut tai sen toiminta on menetys. Tämä johtaa kohonnut cdk4 /sykliini D aktiivisuutta, mikä lisää Rb fosforylaatioon ja siten E2F kertymistä. Lopuksi, sääntelemättömään ilmentymiseen ja /tai vahvistusta sykliini D ja CDK4 geenit on havaittu myös monissa syövissä. Tämä johtaa tehostettuun cdk4 /sykliini D aktiivisuutta ja siten samalla vapauttaminen E2F-reitin [21]. Kohdunkaulan syövän, inaktivointi E2F-repressorin, Rb, HPV E7, mikä johtaa lisääntyneeseen E2F toimintaa. Seurauksena usein häiriöitä, joka säätelee E2F-toiminto, E2F kohdegeenien usein yli-ilmennetään syöpäsolujen takia parannettu E2F transaktivaatiota [22].

osoittavat, että overexpresion on Kpnβ1 ja Kpnα2 syövän johtuu ja osittain aktivoitunut niiden promoottorien mukaan E2F. Hiiren tutkimus Ishida et al. [23] tunnistanut mahdollinen rooli E2F säätelyssä Kpnα2 geenin ilmentymisen solusyklin aikana. Tutkimuksemme laajennetaan tämä havainto osoittaa rooli E2F säätelyssä ihmisen Kpnα2 kautta tietty E2F sivusto sijaitsee asemassa -34–27 on Kpnα2 promoottori. Tämä E2F sivusto näkyy välttämättömiä sekä perus- ja aktivoitu Kpnα2 geeniekspressiota. Lisäksi tunnistimme kolme toiminnallista E2F sivustoja Kpnβ1 promoottori jotka näyttävät vaikuttavan toimiessaan säätelevät Kpnβ1 ilme. On raportoitu, että useita E2F sivustot voivat esiintyä promoottorialueen geenin, ja että nämä sivustot usein yhteistyötä säätelemään geeniekspressiota [24].

Havainto, että Kpnβ1 ja Kpnα2 geenit säätelevät E2F viittaa siihen, että ne säännellään solusykliä riippuvaisella tavalla. Aiemmin on raportoitu, että ydinvoiman tuonti karyopherin α /β-alustoille on tehokkaampi tietyissä vaiheissa solusyklin [25], kanssa meidän data osoittaa E2F-säätely Kpnβ1 ja Kpnα2. Kaiken kaikkiaan meidän havaintojen mukaan sääntelemätön toiminta E2F syöpäsoluissa aiheuttaa kasvavia aktivointi Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottorit, mikä johtaa kohonneet näiden proteiinien, ja lopulta vaikuttavat syövän fenotyyppi.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

WI38- normaalin keuhkojen fibroblasteista, SVWI38 transformoitu WI38- fibroblasteissa ja CaSki kohdunkaulan syövän solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). Soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), jota oli täydennetty penisilliinillä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml) ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco, Paisley, Skotlanti). Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

Protein sadonkorjuun ja Western blot -analyysi

Solut viljelmässä kasvatettiin 80% konfluenssiin ja hajotettiin jäällä RIPA-puskurissa (10 mM Tris-Cl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% deoksikolaatti, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1 X Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Basel, Sveitsi)). Western Blot-analyysit suoritettiin käyttäen kanin anti-Kpnβ1 (H-300) (sc-11367, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), vuohen anti-Kpnα2 (C-20) (sc-6917), kanin anti- -Dp1 (K-20) (sc-610), hiiren anti-HPV16 E7 (ED17) (sc-6981), hiiren anti-Rb (4H1) (# 9309, Cell Signaling), ja kanin anti-β-tubuliinia ( H-235) (sc-9104, Santa Cruz Biotechnology), vasta-aineita.

PCR-monistus Kpnβ1 (-2013-100) promoottori

Alukkeet suunniteltiin, joka monistaa alue – 2013-100 on Kpnβ1 geenin (GenBank: NC_000017): Kpnβ1F 5 ’AGGCTAGCCCAGCTACATCCAATTACCC 3’ ja Kpnβ1R 5 ’AGAAGCTTCTGGGGGCAGCTCAGA 3’ (Nhel on alleviivattu ja Hindlll- on lihavoitu), ja -1992-69 n Kpnα2 geeni (GenBank: NC_000017): Kpnα2F 5 ’AGTT

CCCGGG

GCAAAAGAAACTCAACTTGGC 3′ ja Kpnα2R 5 ’AGAAGCTTGGGAATCAGCGGCTGTAG 3’ (SmaI on kursiivilla ja Hindlll- on lihavoitu). PCR suoritettiin käyttäen 100 ng normaali veren DNA: ta templaattina, ja hifi Laajenna Plus DNA -polymeraasia (Roche). 5% DMSO sisällytettiin PCR Kpnβ1 parantaa spesifisyyttä. Promoottorin PCR-tuotteet subkloonattiin vektoriin pGEM-T Easy (Promega) ja Kpnβ1 (-2013-100) -fragmentti leikattiin Nhel: llä ja HindIII-restriktioentsyymeillä, ja Kpnα2 (-1992-69) -fragmentti leikattiin Smal: llä ja HindIII: lla restriktioentsyymejä, subkloonaamista lusiferaasi, pGL3 Basic-vektoriin (Promega). Oli vaikeuksia SmaI sulatella, joten Sacl sijasta, koska Sacl oli läsnä asemassa -1900 on Kpnα2 promoottori. Subkloonaamista pGL3 Basic sijoitettu Kpnβ1 (-2013-100) ja Kpnα2 (-1990-69) promoottorifragmenttien ylävirtaan promoottori-vähemmän lusiferaasi geenin promoottorin aktiivisuuden analyysiä. Konstruktit varmistettiin sekvensoimalla käyttäen UCT Human Genetics Sequencing Unit.

Generation of Kpnβ1 ja Kpnα2 promoottori deleetiorakenteita

Promoottori deleetiorakenteita varten Kpnβ1 luotiin käyttäen joko restriktiokohtia yhteinen sekä kloonatun promoottorin fragmentti ja pGL3-Basic moninkertaisen kloonauskohdan (Kpnl, että -637-100 konstrukti, Sacl, että -271-100 konstrukti), tai geeni-spesifisten eteenpäin-alukkeita (5 ’AGGCTAGCGCCGTCAGGAGAGCTTGA 3’ varten -861-100 rakentaa; 5 ’AGGCTAGCAGCGCCTGGCCAGTTAG 3’ varten -108-100 konstrukti, Nhel-restriktiokohta on alleviivattu) ja Kpnβ1 R-aluketta. -180-69 Deleetiorakenteen varten Kpnα2 luotiin käyttäen Nrul ja Sacl: llä restriktioentsyymeillä, joka julkaistiin -1900–180 fragmentti, kun taas -24-69 Deleetiorakenteen luotiin käyttäen Swal ja Sacl: llä restriktioentsyymeillä, joka julkaistiin -1900–24 fragmentti.

Lusiferaasimäärityksiä

100 ng kutakin promoottorin konstrukti transfektoitiin 30 000 CaSki kohdunkaulan syövän solua /kuoppa 24-kuoppaisella levyllä käyttäen 0,3 ui Transfectin ( Bio-Rad). Normalisoimaan transfektiotehokkuuden solut kotransfektoitiin 10 ng PRL-TK-plasmidia (joka koodaa Renilla lusiferaasi). Yhteensä solulysaatteja valmistettiin soluista 24 tuntia transfektion jälkeen käyttäen 1 X Passive Lysis Buffer (Promega) ja tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus määritettiin käyttäen Dual Luciferase Kit (Promega). Luminesenssi seurattiin käyttäen Glomax 96 mikrolevyn luminometrillä (Promega). Aktiivisuus normalisoitiin Renilla lusiferaasi aktiivisuus PRL-TK samaa uutetta.

mutageneesiä oletettujen E2F sivustoja

Mutaatiot E2F sitoutumiskohdat Kpnβ1 promoottorin valmistettiin kohdennettu mutageneesi käyttämällä mutageenisia alukkeita: E2Fa: F: 5 ’CGCTCAGGCCCGCtAgcACCTCGCGCAACAC 3’; E2Fa: R: 5 ’GTGTTGCGCGAGGTgcTaGCGGGCCTGAGCG 3’; E2Fb: F: 5 ’GAACCCAGCTCCGCCTCTTgCtaGcGGCGTCCCATCGTGCCCC 3’; E2Fb: R: 5 ’GGGGCACGATGGGACGCCgCtaGcAAGAGGCGGAGCTGGGTTC 3’; E2Fc: F: 5 ’GCTCCTAGGGTTGCtaGcCACCTCCCGCCTTCC 3’; E2Fc: R: 5 ’GGAAGGCGGGAGGTGgCtaGCAACCCTAGGAGC 3’; E2Fd: F: 5 ’CGGGCACCTCCCGCCTgCtaGCGCCCCGACCCCGAAC 3’; E2Fd: R: 5 ’GTTCGGGGTCGGGGCGCtaGcAGGCGGGAGGTGCCCG 3’; E2Fe: F: 5 ’CTCCTCTCCTTAGTTCTCgCtaGCACCCTATCCTATCAAC 3’; E2Fe: R: 5 ’GTTGATAGGATAGGGTGCtaGcGAGAACTAAGGAGAGGAG 3’ (mutatoitunut emäkset on merkitty pienillä; NheI-restriktiokohtaan on alleviivattu). Mutaatio E2F sitoutumiskohdan on Kpnα2 promoottori suoritettiin käyttäen mutageenisia alukkeita: F 5 ’CAATCGGAATGCGGAGTCgCtaGcAAATTTAAATCGCGCCGGGC 3’ ja R 5 ’GCCCGGCGCGATTTAAATTTgCtaGcGACTCCGCATTCCGATTG 3’. PCR suoritettiin käyttäen seuraavia olosuhteita: 95 ° C 30 sekuntia, jota seurasi 18 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 61 ° C: ssa 1 minuutti ja 72 ° C: ssa 6 minuutin ajan, minkä jälkeen lopullinen laajennus vaihe 72 ° C: ssa 20 minuutin ajan. PCR-monistuksen jälkeen 10 U Dpnl (Promega) lisättiin ja digestio suoritettiin 37 ° C: ssa 90 minuuttia, ennen kuin transformaatio JM109 erittäin kompetentteja soluja (Promega). Restriktiodigestioanalyysillä käytettiin kloonien tunnistamiseksi on mutaatio.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritys

Solut kasvatettiin noin 90%: n konfluenssiin ja proteiini-DNA-kompleksit silloitettu 1% formaldehydiä 10 minuuttia, minkä jälkeen lisättiin 0,125 M glysiiniä, pH 2,5. Solut kerättiin, hajotettiin hajotuspuskurissa (1% SDS: ää, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-Cl, pH 8,1, 1 X Complete Protease Inhibitor (Roche)), ja sonikoitiin pituudet välillä 400 ja 1000 bp. Solulysaatit laimennettiin laimennuspuskuriin (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl, pH 8,1, 1 X Complete-proteaasi-inhibiittori), ja sitten esikirkastettiin proteiini-A-agaroosi-helmiä (Merck, NJ, USA) 2 tuntia. Helmet oli aiemmin estetty 100 ug /ml lohen sperma-DNA: ta ja 5% BSA: ta. Kromatiinin inkuboitiin 2 ug vasta-ainetta (α-E2F 2 (C-20 X, sc-633 X, Santa Cruz Biotechnology), a-DP1 (K-20, sc-610, Santa Cruz Biotechnology) tai ei-vasta negatiivisen kontrollin ) 4 ° C: ssa yön yli. Proteiini-A-agaroosi-helmet lisättiin vielä 2 tuntia 4 ° C: ssa, ja immunokompleksit sitovat helmiä talteen sentrifugoimalla ja pestiin kahdesti peräkkäin TSE I (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,1, 150 mM NaCl), TSE II (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,1, 500 mM NaCl), puskuri III (0,25 M LiCI: n, 1% NP-40, 1% natriumdeoksikolaatti, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8,1) ja TE, pH 7,4.