Krooninen sairaus

tiivistelmä

β-kateniinin näyttelee kaksoisrooli tarttuvuus kompleksin muodostumiseen ja Wnt-signalointireitin . Vaikka β-kateniinin ilmentymistä näyttää voimistuvan ja Wnt-signalointireitin aktivoituu useimmissa syöpien, sen ekspressiotaso tuntuu olevan menetetty ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Olemme aiemmin raportoitu, että promoottori β-kateniinin oli hypermetyloitunut kaksi NSCLC solulinjoissa. Nykyisessä tutkimuksessa, laajensimme analyysi metylaatiotilan β-kateniinin promoottorialueen ja sen proteiinin ilmentyminen seitsemän NSCLC solulinjoissa ja sarjan 143 primaarisen ihmisen keuhkosyövän viereisten ei-neoplastisia kudoksia. Kvantitatiivinen metylaatio PCR (qMSP) analyysi osoitti, metylaatio β-kateniinin promoottorialueen viiden NSCLC solulinjoissa, lisääntynyt β-kateniinin proteiinin tasot, kun 5′-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) hoitoon. Metylointi asema SPC (metyloitu) ja A549 (metyloitumaton) varmistettiin bisulfiitti sekvensoimalla PCR. 5-atsa-dC hoito esti invasiivisuus SPC muttei A549. Immunofluoresenssianalyysi osoitti membranous β-kateniinin ilmentymistä hävisi SPC ja voitaisiin uudelleen käyttöön 5-atsa-dC, kun taas Wnt3a hoito johti tumaansiirtymiseen of β-kateniinin sekä SPC ja A549. Dual-Lusiferaasimäärityksiä osoitti, että 5-atsa-dC hoito ei aiheuttanut merkittävää kasvua Wnt signalointiaktiivisuuteen verrattuna Wnt3a hoitoon. Vaikutus demetylaatio aineen SPC voidaan kumota β-kateniinin ehtyminen mutta ei E-kadheriinin ehtyminen, joka osoitti, että metylointi välittämä β-kateniinin hiljentäminen saattaisi vahvistaa NSCLC hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden E-kadheriinin riippumattomalla tavalla. Myöhemmät immunohistokemia tulokset vahvistivat lisäksi, että β-kateniinin promoottori hypermetylaation korreloi menetyksen immunoreaktiivisia proteiinin ilmentymisen, positiivinen imusolmuke etäpesäke, korkea TNM ja huonon ennusteen. Esillä olevassa tutkimuksessa implicates β-kateniinin promoottorin hypermetylaatio mekanismiin epigeneettiset muutosten taustalla NSCLC etäpesäke ja etenemiseen, mikä osoittaa potentiaalista β-kateniinin uutena epigeneettisiä kohde hoitoon pienisoluista keuhkosyöpää.

Citation: Miao Y, Wang L, Zhang X, Xu X, Jiang G, Fan C, et al. (2014) Promoottori Metylointi välittämää vaiennettu β-kateniinin Parantaa invaasiokyvyssä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja ennustaa haitalliset ennuste. PLoS ONE 9 (11): e112258. doi: 10,1371 /journal.pone.0112258

Editor: Pier Giorgio Petronini, University of Parma, Italia

vastaanotettu: 17 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 09 lokakuu 2014; Julkaistu: 14 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Miao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 81000942 Yuan Miao ja nro 30900562 Yang Liu) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on edelleen suuri kliininen haaste, koska sen huonon ennusteen ja rajoitettu hoitovaihtoehdot [1]. Korkea kuolleisuus keuhkosyöpään on pääosin peräisin epäonnistumiseen varhaisen diagnoosin ja etäpesäkkeiden havaitaan usein aikaan diagnoosi [2]. Analyysi biologiset muutokset taustalla patogeneesin tämän maligniteetin, tunnistaminen alkuvaiheessa, ja ehkäisy etäpesäkkeiden vuoksi voi olla ensisijainen vaihtoehtoja parantaa yleistä synkkä ennuste tämän syövän.

kasvain hyökkäyksen ja etäpesäke esiintyy, kun kasvainsoluja saavat mahdollisuuden irrottautua primaarikasvaimen ja tehdä ympäröivään kudokseen tai lymphovascular kanavia, prosessi, joka on kriittisesti riippuvainen häiriöitä tartunta liittymien välillä kasvainsolujen [3]. β-kateniinin on erityisen kiinnostava tämän prosessin aikana, koska se ei vain osallistuu tähän tarttumista monimutkainen, mutta myös kiinteä osa Wnt-signalointireitin [4] – [6]. Valtaosa syöpiä, kuten peräsuolen, hepatosellulaarinen, kilpirauhasen, ja munasarjasyövät, satama β-kateniinin mutaatioiden ja muutoksia muissa geeneissä, kuten APC-geeni, joka johtaa ydin- kertyminen β-kateniinin ja aktivointi Wnt-signalointireitin [ ,,,0],4], [7], [8]. Kuitenkin todisteet osoittavat, että ydinvoiman ilmentyminen β-kateniinin on harvinainen ja Wnt signalointia aktiivisuus vaimentua keuhkosyövässä [5], [9] – [11]. Yhä useammat tutkimukset ovat esittäneet ja arvioineet yhdistyksen välillä menetys β-kateniinin ilmaisun ja kliinis parametrit keuhkosyöpäpotilaita [9], [11]. Kuitenkin taustalla olevien mekanismien pysyvät kiistelty. Tuore raportti osoitti, että taso β-kateniinin proteiini ei vaikuttanut E-kadheriinin ehtyminen [12]. Siksi täytyy olla muita mekanismeja vastuussa vaimentua β-kateniinin ilmentymistä NSCLC.

Aberrant promoottori metylaatio voi johtaa geenien eri pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien keuhkosyöpä [13], [14]. Vaikka Wnt signaloinnin aktivoitiin ja β-kateniinin ilmentymistä säädellään ylöspäin ensisijainen mahalaukun karsinooma, Ebert

et al.

Osoitti, että promoottori β-kateniinin on hypermetyloitunut mikä johti menetykseen β-kateniinin ilmentymistä solussa joka on peräisin maksan etäpesäkkeen mahalaukun syövän, mutta ei niitä, primaarisyöpien [15]. Yhdessä me arveltu, että metylointi β-kateniinin promoottorit voivat olla rooli säätelyssä invasiivisuus syöpäsolujen. Tuoreimmassa raportissa todettiin, että hypermetylaatiota β-kateniinin promoottorit nähtiin kaksi ensisijaista NSCLC solulinjoissa, joka poikkesi mahasyövän [16]. Koska toiminta Wnt-signalointireitin oli pienempi NSCLC kuin mitä muissa syövissä, me arveltu, että hypermetylaatiota β-kateniinin promoottorit NSCLC voi selittää suuren etäpesäkkeitä taajuus ja huonon ennusteen pienisoluista keuhkosyöpää.

Täällä tutkimme vaikutus β-kateniinin promoottori metylaatio statuson syövän etenemiseen ja invaasio, käyttäen sekä keuhkosyövän solulinjoja ja potilaiden näytteitä meidän kokeellisissa malleissa.

Materiaalit ja menetelmät

Human kudosnäytteiden ja solulinjat

tutkimus suoritettiin hyväksyntää Institutional Review board China Medical University (Shenyang, Kiina). Kirjallinen suostumus antoivat osallistujien tietonsa tallennetaan sairaalan tietokantaan niiden yksilöitä voidaan käyttää tässä tutkimuksessa. Kaikki kliiniset tutkinnan suorittamisen periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Yksi neljäkymmentä kolme tapausta ensisijainen ihmisen keuhkosyövän vastaavien viereisten ei-neoplastisia kudoksia, joille tehtiin kirurginen resektio kanssa parantava tarkoitus, kerättiin ensimmäisen Affiliated sairaala China Medical University välillä lokakuussa 2004 ja heinäkuussa 2006. Potilaiden eloonjääminen määriteltiin koska aika päivästä leikkauksen loppuun seurannan tai kuolinpäivä vuoksi uusiutuminen tai etäpesäkkeitä. Kukaan potilaista ei saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen kirurgista resektion, ja kaikki potilaat saivat normaalin kemoterapian leikkauksen jälkeen. Tutkimus potilasryhmässä on raportoitu edellisessä kirjallisuudessa [17]. Histologinen diagnoosi ja erilaistumista laatu arvioitiin hematoksyliinillä ja eosiini värjätään osat, mukaan vuoden 2004 WHO: n luokituksen suuntaviivat [18]. Kaikki 143 näytteet reevaluated suhteen histologinen alatyyppi, erilaistumista ja kasvaimen vaiheessa. Tuumorin luokitus oli määräytyy seitsemäs painos International Union syöpää vastaan ​​(UICC) TNM Välivarastointi System Lung Cancer [19]. Näytteet ovat 44 tapausta okasolusyöpä keuhkosyöpä ja 99 tapausta keuhkoadenokarsinooma. Viisikymmentäyksi kasvaimia suuria eroja ja 92 kasvainten kohtalaisesti tai huonosti eriytetty. Imusolmukemetastaaseja oli läsnä 70 tapauksessa ja poissa 73 tapauksessa. Kasvaimet sisältyi 81 tapausta vaiheen I-II tauti ja 62 tapausta vaiheen III

A-III

B tauti.

Seven NSCLC solulinjoja, joita käytetään meidän lab, valittiin solun kokeissa. HBE, A549 ja H1299 solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PG-BE1 (BE1), PG-LH7 (LH7), SPC-A-1 (SPC), ja LTEP-A-2 (LTE) solulinjat saatiin Shanghai Cell Bank (Shanghai, Kiina). Kaikki solut viljeltiin RPMI 1640: ssä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (Invitrogen), 100 IU /ml penisilliiniä (Sigma, St. Louis, MO, USA), ja 100 ug /ml streptomysiiniä ( Sigma). Soluja kasvatettiin steriiliin viljelyastioihin ja siirrostettiin joka 2 päivää käyttäen 0,25% trypsiiniä (Invitrogen).

DNA: n uutto ja kvantitatiivisen tosiaikaisen metylaatiospesifinen polymeraasiketjureaktio

Genominen DNA uutettiin solulinjoista ja 10 um: n paksuisia leikkeitä ja 10% neutraaleja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettujen kasvainkudoksen estää käyttämällä QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Saksa). Genomi-DNA: ta käsiteltiin natriumbisulfiitin käyttämällä EZ DNA: n metylaatio kit (D5005, Zymo Research, Orange, CA, USA). Metylaatiospesifistä reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) määritykset suoritettiin ABI 7900HT Fast Reaaliaikainen PCR -järjestelmää (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alukeparit olivat seuraavat: β-kateniinin eteenpäin, 5′-GGAAAGGCGCGTCGAGT-3 ’ja reverse, 5′-TCCCCTATCCCAAACCCG-3′, jossa TaqMan-koettimella on 5’-6FAM- CGCGCGTTTCCCGAACCG-TAMRA-3 ’; p-aktiini eteenpäin, 5’-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3 ’ja reverse, 5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′, jossa TaqMan koetin 5’-6FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-TAMRA-3 ’. Housekeeping β-aktiini-geeni (ACTB) käytettiin normalisoimaan metylaation riippumaton valvonta reaktion. Kvantitoimiseksi, määrät metyloitua DNA: ta (prosentteina metyloitu viite) kanssa β-kateniinin promoottorialueen normalisoitiin metylointi arvo kalibraattorin, joka määriteltiin 100%. Universal metyloitu DNA (Qiagen) käytettiin kalibraattori. Prosenttiosuus metyloitua viite määriteltiin 100 x 2

(sampleACTB (ct) – sampleβ-kateniini (ct)) /2

(calibratorACTB (ct) – calibratorβ-kateniini (ct)) [20]. Erotella yksittäisten metylaatiotasoilla, sulku arvo 4% tai suurempi määriteltiin ”metyloidut” ja sulku-arvo on alle 4% ”metyloimaton” perustuu aikaisemmin tutkimuksen [21].

bisulfiittimodifiointi sekvensointi PCR (BSP) ja β-kateniinin promoottorit

Käytimme metyyli Primer Express v1.0 ohjelmisto (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) analysoimaan

CTNNB1

geenin promoottorialue -1,124-11,114 kp. DNA keuhkosyövän solut uutettiin ja sitten käsiteltiin natriumbisulfiitin käyttämällä EZ DNA: n metylaatio kit (Zymo Research) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Β-kateniinin promoottori-spesifisiä alukkeita bisulfiitti sekvensointia konstruoitiin käyttäen promoottorisekvenssin tietojen ja alukkeen suunnittelun ohjelmistot (Primer Premier 5; Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA); alukkeen sekvenssit on esitetty taulukossa 1. Alukkeet suunniteltiin monistamaan CpG-rikkaan alueen promoottorin ulottuu 189 CpG sivustoja (19 CpGCpG sites). PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä monikäyttöinen DNA: n puhdistusta uuttamalla Kit (DP1501, BioTeke Corporation, Peking, Kiina) ja liitettiin pum-T yksinkertainen vektori (DP6803, BioTeke Corporation, Peking, Kiina), ja ainakin viisi erillistä klooneja kukin olivat valitaan sekvenssin analyysi BiQ Analyzer.

hoito 5-atsa-dC ja Wnt3a

Viljellyt keuhkosyövän soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) (Sigma) liuotettuna viljelyväliaineessa 24 tunnin välein. Käyttämällä q-MSP ja MTT määrityksissä, lääkeaineen pitoisuus tarvittava β-kateniinin promoottori CpG-saarekkeen demetylaatio ilman merkittävää vaikutusta solujen kasvuun valittiin (7 uM) ja solut kerättiin sen jälkeen jatkuu kulttuuri 48 tuntia (kuvio S1).

Soluja käsiteltiin 500 ng /ml rekombinanttia Wnt3a (R Santa Cruz Biotechnology), β-kateniinin (610154, 1: 500, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA ) tai GAPDH (sc-365062, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology). Inkuboinnin jälkeen peroksidaasiin kytketty anti-hiiri-IgG (Santa Cruz Biotechnology), 37 ° C: ssa 2 h, sitoutuneet proteiinit tehtiin näkyviksi käyttämällä ECL (Pierce) ja detektoitiin käyttämällä Bioimaging Systems (UVP Inc., Ontario, CA, USA). Suhteellinen proteiinin tasot laskettiin perustuen GAPDH-proteiinin latauskontrollina.

Matrigel invaasiomääritys.

Cell invasion analyysit suoritettiin käyttäen 24-kuoppaista transwell kammio, jonka huokoskoko on 8 um (Corning Costar Transwell, Cambridge, MA, USA), ja insertit päällystettiin 20 ul: n kanssa Matrigeliä (1:03 laimennus, BD Biosciences). Sitten, 48 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin trypsiinillä ja siirrettiin ylempään Matrigel kammioon 100 ui seerumia, joka sisälsi 3 x 10

5-soluihin ja inkuboitiin 16 tunnin ajan. Väliaineessa, jota täydensi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon, kuten kemoatrak-. Numerot hyökkäävän solut laskettiin 10 satunnaisesti valittua suuritehoisia mikroskooppikenttää. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

immunofluoresenssivärjäyksellä.

solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, salvattiin 1% BSA: ta ja inkuboitiin sitten β-kateniinin monoklonaalinen vasta-aine (610154, 1 : 400; BD Transduction Laboratories) yön yli 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua sekundaarista vasta-aineilla (1: 200, Zhongshan Golden Bridge, Peking, Kiina) 37 ° C: ssa. Tumat vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI). Epifluorescent mikroskopia tehtiin käyttämällä käännettyä Nikon TE300 mikroskoopilla (Melville, NY, USA) ja konfokaalimikroskopialla suoritettiin käyttäen Radiance 2000 laserskannaus konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).

Dual-lusiferaasi määrityksiä.

Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut maljattiin 24-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen transfektiota pGL3-OT tai pGL3-OF (0,5 mg) reportterigeeni plasmidit, yhdessä ohjaus-plasmidin PRL-TK (50 ng). Kun oli inkuboitu 30 tuntia 37 ° C: ssa, reportterigeenin ilmentyminen havaittiin Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). TCF-välitteistä geenin transkription aktiivisuus määritettiin suhde pGL3-OT pGL3-lusiferaasiaktiivisuuden, joka normalisoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus ohjauspaneelista plasmidista PRL-TK. Kaikki kokeet suoritettiin kahtena kappaleena vähintään kolme kertaa. Analysoimaan vaikutuksia 5-atsa-dC ja β-kateniinin siRNA on Wnt signalointia, 5-atsa-dC lisättiin ja β-kateniinin siRNA oli kotransfektoitiin pGL3-OT tai pGL3-OF varten Lusiferaasimäärityksiä.

immunohistokemia (IHC) B

immunohistokemiallinen analyysi β-kateniinin ilmentymistä suoritettiin käyttäen β-kateniinin-spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta (610154, 1: 200, BD Transduction Laboratories), kuten aiemmin on kuvattu, ja sen arvioitu edellisessä raportissa [17], [22].

tilastollinen analyysi.

SPSS versio 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) käytettiin kaikissa analyyseissä. Chi-neliö ja Spearmanin korrelaatio testejä käytettiin tutkimaan mahdollisia korrelaatioita β-kateniinin metylaatiostatuksen NSCLC sen metylaatiostatuksen viereisissä normaalissa keuhkokudoksessa ja ennusteeseen viittaavia tekijöitä. Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin analysoimaan tuloksia q-MSP, Western blot, matrigeelin invasiivisia määritykset ja Dual-Lusiferaasimäärityksiä. Kaplan-Meier menetelmää käytettiin arvioimaan todennäköisyys potilaan eloonjäämisen, ja erot selviytymisen potilasalaryhmissä verrattiin käyttämällä Mantel n log-rank-testi. Tulokset esitettiin keskiarvo kokeista suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

P

0,05 katsottiin osoittavan tilastollisesti merkitseviä eroja.

Tulokset

Analyysi metylaatiostatuksen promoottorin alueen β-kateniinin geenin keuhkosyöpäsoluissa

β-kateniinin promoottori metylaatiotasoilla testattiin keuhkosyövän solulinjoissa. Kuten kuviossa 1A, viisi solulinjat (LH7, BE1, SPC, LTE ja H1299) osoitti korkeaa metylaation, kun taas kaksi solulinjaa (HBE ja A549) olivat metyloimaton. Analyysi CTNNB1 geenin promoottorialue -1124 – 11114 bp NSCLC solulinjoissa paljasti, että läsnä on kaksi CpG-saarekkeiden asemissa -1124-876 ja 10676 – 11114, vastaavasti. Nämä sekvenssit sisälsivät 189 yhden CG sivustoja, joista 19 oli CG-dinukleotidien. Käyttämällä natriumbisulfiitti genomista sekvensointia menetelmä, suunnittelimme alukkeet analysoida ensimmäistä CpG saaria 1331 emäsparin alue (-614-717), joka sisältää osan β-kateniinin promoottorialueen koko sen transkription aloituspaikan valmisteyhteenvedon ja A549-solulinjoja . Useita metylaatiokohtia havaittiin SPC soluissa, kun taas vain muutama 5-metyylisytosiinin jäämiä todettiin useissa sekvensoitiin kloonit on johdettu A549-solut (Fig. 1 B ja 1 C).

(A) kvantitatiivinen MSP analyysi β kateniinin promoottorialue NSCLC solulinjoissa. (B) Promoottori alueella β-kateniinin geeni: kanta CpG-saarekkeiden ja alukesuunnittelu on merkitty viivoja ja nuolia. (C) metylointi yksi 19 CG-dinukleotidien alueella -614 bp -270 bp sekä A549 ja SPC. Täytetyt ympyrät edustavat metyloitu CG sivustoja, täyttämättömiä ympyrät edustavat metyloitumattomien CG sivustoja.

Hoitoon soluja 5-atsa-dC palautettu β-kateniinin ilmaisun ja estivät keuhkosyöpäsolua invasiivisuus kautta uudelleen käyttöön membranous β-kateniinin ilmaisun sijaan aktivoimalla Wnt-signalointireitin

kemiallinen 5-atsa-dC on käytetty sekä in vitro että in vivo inhiboimaan DNA-metylaatio. Tässä tutkimuksessa kaikki seitsemän solulinjoissa (HBE, LH7, BE1, SPC, A549, LTE ja H1299) käsiteltiin 5-atsa-dC (Fig. 2A, 2B). Expression of β-kateniinin palautettiin viiden solulinjoissa (LH7, BE1, SPC, LTE ja H1299), jossa β-kateniinin promoottori metylaatio todettu aikaisemmin. Ei kuitenkaan ole merkittäviä muutoksia nähtiin HBE ja A549-solulinjoja (metyloimaton). Tutkimme lisäksi vaikutukset 5-atsa-dC kohtelu hyökkäystä kapasiteettia keuhkojen solulinjoissa. Kuten kuvioissa 2C ja 2D, 5-atsa-dC hoito johti huomattavan estymisen invaasiokyvyn SPC soluissa, kun taas ei ollut mitattavaa vaikutusta A549-soluissa (kuva S2 Matrigel tuloksia muilla solulinjoilla). Sen jälkeen, kyky 5-atsa-dC aktivoida Wnt-signalointireitin tutkittiin käyttäen Wnt3a proteiinia simuloitu soluja positiivisena kontrollina. Verrattuna Wnt3a käsiteltyjä soluja, dual-Lusiferaasimäärityksiä paljasti, että 5-atsa-dC hoito ei johtanut merkittäviin muutoksiin Wnt signalointi toimintaan (Fig. 2E). Immunofluoresenssianalyysi paljasti, että hoito 5-atsa-dC kunnostettu membranous β-kateniinin ilmentymistä SPC, mutta ei A549-soluja. Lisäksi β-kateniinin ilmentymistä havaittiin tumaan Wnt3a-käsitellyissä soluissa, kun taas, kalvomainen jakautuminen havaittiin käsittelemättömillä soluilla (kuvio. 2F). Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että, toisin kuin muut syövät, metylaatio β-kateniinin promoottori oli yleinen ilmiö NSCLC, ja ne voivat olla vastuussa downregulation β-kateniinin ilmentymistä parantava invasiivisuus keuhkosyövän solu.

(A) Protein tasot β-kateniinin jälkeen 5-atsa-dC hoito (7 uM) NSCLC solulinjoissa. (B) kvantifiointi proteiinin ilmentymisen jälkeen 5-atsa-dC hoitoon. (C) edustaja kuvia solujen pohjalle Transwell kalvot osoittavat muutoksia invasiivisia solujen lukumäärän (x 400, Mittakaava = 50 um). (D) määrä soluja valtaavat alapinnalle suodattimen laskettiin, kukin suorittaa kolmena kappaleena. (Pylväät edustavat SD. *

P

0,05 verrattuna kontrolliin). (E) Dual-lusiferaasianalyysissä tulokset osoittavat, että 5-atsa-dC hoito ei johtanut merkittäviin muutoksiin Wnt signalointia toimintaan verrattuna Wnt3a käsiteltyihin soluihin. Kukin kokeita toistettiin kolmena kappaleena. (D) immunofluoresenssivärjäyksellä osoittaa, että β-kateniinin ensisijaisesti paikallistaa kalvon SPC ja A549 solulinjoissa. Hoito 5-atsa-dC muuttanut määriä membranous β-kateniinin ilme. Kuitenkin β-kateniinin on translokaatio tumaan seuraavat Wnt3a hoidon (Mittakaava = 20 um, β-kateniinin vasta-aine korvattiin normaali hiiri-IgG-negatiivisena kontrollina).

5-atsa-dC käsittely palauttaa β-kateniinin ilmentymistä E-kadheriinin riippumattomalla tavalla

jotta voitaisiin edelleen vahvistaa, että funktio-promoottorin metylaation β-kateniinin, β-kateniinin-spesifisten siRNA otettiin SPC ja A549-soluja. Verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus salattu siRNA, transfektoidut solut β-kateniinin siRNA oli vähemmän β-kateniinin ja E-kadheriinin ilmentymisen, jota ei voida palauttaa 5-atsa-dC hoidon (Fig. 3A, B). Seuraavaksi pudotti E-kadheriinin kanssa E-kadheriinin-erityisiä siRNA näissä kahdessa solulinjassa. E-kadheriinin ilmentyminen laski sekä SPC ja A549-soluja, kun taas β-kateniinin ilmentymistä ei näkyvästi pieneni E-kadheriinin ehtyminen kontrolliin verrattuna. 5-atsa-dC hoitoon, β-kateniinin ilmentymistä merkittävästi yläreguloituja SPC-soluissa riippumatta ilmentyminen E-kadheriinin (kuvio. 3C, D). Tutkimme lisäksi vaikutukset 5-atsa-dC kohtelun otettu käyttöön β-kateniinin-siRNA ja E-kadheriinin-siRNA on hyökkäys kapasiteettia keuhkojen solulinjoissa. Kuten kuvioissa 3E ja 3F joko β-kateniinin tai E-kadheriinin ehtyminen johti merkittävään kasvuun invasiivisia kapasiteetti sekä SPC ja A549-soluja. 5-atsa-dC hoidon määrä vaeltavia solujen pieneni merkitsevästi E-kadheriinin-köyhdytettyä SPC soluja, jotka ei havaittu A549-soluja. Kuitenkin invasiivisia valmiuksia β-kateniinin-köyhdytettyä SPC ja A549-solut eivät ilmeisesti inhiboi 5-atsa-dC hoitoon. Lisäksi dual-Lusiferaasimäärityksiä paljasti, että ei ole 5-atsa-dC hoitoa eikä β-kateniinin-ehtyminen johti merkittäviin muutoksiin Wnt signalointia toimintaan verrattuna Wnt3a-käsitellyt solut (Fig. 3G). Näin ollen estämällä β-kateniinin ilmentymistä sen promoottorin metylaation näyttää vähen- tämisessä invasiivisuus keuhkosyövän solu E-kadheriinin riippumattomalla tavalla. Immunofluoresenssivärjäyksellä osoitti, että kalvomainen β-kateniinin on parannettu 5-atsa-dC käsittely ainoastaan ​​SPC solulinjassa, mutta ei A549 solulinjassa. Ehtyminen β-kateniinin vaimentaa membranous β-kateniinin sekä SPC ja A549 solulinjoissa, mutta ehtyminen E-kadheriinin ei ole vaikutusta membranous ilmaus β-kateniinin joko SPC tai A549-solulinja. Hoito 5-atsa-dC hieman muuttanut määriä membranous β-kateniinin ilmentymisen jälkeen β-kateniinin tai E-kadheriinin ehtyminen SPC solulinjassa, mutta ei A549 solulinjassa.

Kun knockdovvn β-kateniinin ( A) tai E-kadheriinin (C), proteiinin ekspressio SPC ja A549-solulinjoja tutkittiin 48 tunnin kuluttua 5-atsa-dC hoitoon käytetään mainituilla vasta-aineilla. (B, D) Kuvaajat osoittavat kvantifiointia proteiinin ilmentymisen jälkeen 5-atsa-dC hoito ja siRNA transfektio. GAPDH: ta käytettiin kontrollina. (E) edustaja kuvia solujen pohjalle Transwell kalvot osoittavat muutoksia invasiivisia solujen lukumäärän (x 400, Mittakaava = 50 um). (F) määrä soluja valtaavat alapinnalle suodattimen laskettiin, kukin suorittaa kolmena kappaleena. (Pylväät edustavat SD. *

P

0,05 verrattuna kontrolliin). (G) Dual-lusiferaasianalyysissä tulokset osoittavat, että sekä 5-atsa-dC hoitoa ja β-kateniinin ehtyminen ei johtanut merkittäviin muutoksiin Wnt signalointia toimintaan verrattuna Wnt3a käsiteltyihin soluihin. Kukin kokeita toistettiin kolmena kappaleena. (H) immunofluoresenssivärjäyksellä osoittaa, että kalvomainen β-kateniinin on parannettu 5-atsa-dC käsittely ainoastaan ​​SPC solulinjassa, mutta ei A549 solulinjassa. Ehtyminen β-kateniinin vaimentaa membranous β-kateniinin sekä SPC ja A549 solulinjoissa, mutta ehtyminen E-kadheriinin ei ole vaikutusta membranous ilmaus β-kateniinin joko SPC tai A549-solulinja. Hoito 5-atsa-dC hieman muuttanut määriä membranous β-kateniinin ilmentymisen jälkeen β-kateniinin tai E-kadheriinin ehtyminen SPC solulinjassa, mutta ei A549 solulinjassa. (Asteikko bar = 20 um, β-kateniinin vasta-aine korvattiin normaalin hiiren IgG negatiivisena kontrolli).

hypermetylaatiota β-kateniinin promoottori korreloi sen menetys kalvo ilmaisun NSCLC näytteessä

tutkimme seuraavaksi metylaatiostatuksen β-kateniinin promoottorin kliinisissä kudosnäytteistä. p-kateniinin ilmentyi pääasiassa solukalvoon normaalissa keuhkokudoksessa näytettä (83,9%, 120/143, Fig. 4A), joilla on alentunut kalvo ilmentymisen NSCLC kudoksissa (18,9%, 27/143, Fig. 4B, C). Tämän jälkeen β-kateniinin promoottorin metylaatiotasoilla kvantifioitiin reaaliaikaisella metylaatiospesifinen PCR. Käyttäen hypermetylaation arvo on suurempi kuin 4% kun sulku, hypermetylaatiota β-kateniinin (keskiarvo ± SD, 8,60% ± 11,41%; alue, 0-100%) todettiin 74 (51,7%) ja 143 NSCLC yksilöitä, joka oli huomattavasti korkeampi kuin viereisillä normaalissa keuhkokudoksessa (13,3%, 19/143, keskiarvo ± SD, 2,66% ± 2,63%, alue, 0-100%;

P

0,001; Fig. 4D ). Yhdessä meidän tutkimuksessa todettiin, että β-kateniinin metylaatio korreloi merkitsevästi menetys kalvo β-kateniinin ilmentymistä (

P

= 0,001).

(A) β-kateniinin ilmentymistä normaalissa keuhkojen epiteelin vahvojen kalvomainen värjäystä. Membranous β-kateniinin ilmentymistä hävisi keuhkojen okasolusyöpä (B) ja keuhkon adenokarsinooma (C). Mittakaava = 20 um. (D) kvantitatiivinen metylaatio tulokset q-MSP. Data edustaa keskiarvoa ± SD. Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi. **

P

0,001. (E) Eloonjäämiskäyrät potilaiden kanssa tai ilman β-kateniinin promoottorin metylaation. Mantel n log-rank-testi määrittämiseen käytettiin tilastollista merkittävyyttä.

korrelaatio β-kateniinin promoottorin metylaation ja kliinis tekijät

kliiniset ja patologiset ominaisuudet potilasta NSCLC analysoitiin mukaan niiden metylaatiostatuksen. Kuten taulukosta 2, β-kateniinin hypermetylaation korreloi positiivisesti imusolmuke etäpesäke ja TNM vaiheessa 143 tapauksessa NSCLC (

P

= 0,001 ja

P

= 0,046, tässä järjestyksessä). Ei ollut merkittävää yhdistyksen välillä β-kateniinin metylaatio ja sukupuoli, ikä, histologinen tyyppi, tai erilaistumista NSCLC. Kaplan-Meier paljasti, että yleinen elinaika NSCLC potilaiden oli lyhyempi potilailla, joilla on β-kateniinin-metyloituja kasvaimia kuin niillä, joilla β-kateniinin-metyloitumattomia kasvaimet (

P

0,001, Fig. 4E).

keskustelu

β-kateniinin, joka on tärkeä osatekijä sekä vyöliitos ja Wnt-signalointireitin, uskottiin olla kuljetettu osaksi tumaan sen eksoni mutaation ja /tai APC-mutaatio erilaisissa kasvaimen paitsi, keuhkosyöpä [4], [7], [8]. Kuitenkin kertynyt todisteita osoittavat, että keuhkosyöpä, β-kateniinin menetetään ja Wnt signalointia aktiivisuus vaimentua. Taustalla mekanismi pysyy unelucidated [5], [9] – [11]. Tuoreimmassa tutkimuksessa todettiin, että promoottori β-kateniinin geeni aina metyloitavaa keuhkosyövän solulinjoissa [16]. Sen selventämiseksi toimintoja β-kateniinin NSCLC, laajensimme tutkimus promoottorin metylaatiostatus seitsemässä keuhkosyövän solulinjat. Huomasimme, että demetylaation aine 5-atsa-dC kunnostettu β-kateniinin proteiinin tasot viidessä seitsemästä solulinjoja, jotka oli vahvistettu metyloitavaa tässä tutkimuksessa. Näistä metylaatiotilan SPC ja A549 vahvistettiin edelleen bisulfiitti genomista sekvensointia. On hyvin tunnettua, että tulo β-kateniinin tumaan voisivat tehostaa Wnt signalointia aktiivisuutta, mikä edistää invasiivisuus useiden ihmisen syövissä. Kuitenkin β-kateniinin ilmentymistä menetetty etäispesäkkeitä mahalaukun syöpä ja menetys β-kateniinin ilmentymistä voi johtua hypermetylaatiota β-kateniinin promoottorin, huolimatta että β-kateniinin ilmentyminen säädeltiin ja Wnt-signalointireitin aktivoitiin useimmat ensisijainen mahasyövän [15]. Me arveltu, että menetys β-kateniinin voivat laukaista muita signalointiryöpyn (t) vahvempi kuin Wnt aktivaatiota valvoa invasiivisuus syöpäsoluja. Koska keuhkosyöpä on matalammalla perustason Wnt signalointiaktiivisuuteen kuin mahasyövän, tärkein mekanismi säätelyssä invasiivisuus voi olla riippumaton Wnt-signalointireitin. aktivaatio Wnt-signalointireitin aktivaatio, hyökkäyksen kapasiteettia, ja subcelluar jakelu β-kateniinin keuhkojen solulinjoissa. Tulokset osoittivat, että demetylaatio 5-atsa-dC voisi palauttaa β-kateniinin ilmaisun ja estivät keuhkosyöpäsolua invasiivisuus kautta uudelleen käyttöön membranous β-kateniinin ilmaisun sijaan aktivoimalla Wnt-signalointireitin. Tämä tutkimus tarjosi uuden selitys sille, miksi β-kateniinin ilmentymistä vaimentua NSCLC ja osoitti, että promoottori metyloinnin β-kateniinin voi säädellä invasiivisuus läpi reitin riippumaton Wnt signalointia keuhkojen syöpäsoluja. Kuten catenins yhdessä kadheriineja ja muodostivat vyöliitos, tuloksemme osoittivat, että menetys β-kateniinin ilme saattaisi tuhoutuu vyöliitos sen pienentää membranous ilme.

E-kadheriinin keskeinen rooli vyöliitos. Kautta intrasellulaarinen domeeni, E-kadheriinin liittyi β-kateniinin. Vaikka metylaatio E-kadheriinin geenin metylaatio havaittiin erilaisissa syövissä, se on edelleen kiistanalainen kuin on keuhkosyöpä [23] – [25]. Russo

et al

.