Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä /Kives (CT) antigeeniperheen geenien transkriptionaalisesti tukahdutettu useimmissa ihmisen kudoksissa mutta ovat epätavallisen uudelleen ilmaistaan ​​monissa pahanlaatuinen kasvain tyyppejä. Rajoitusvyöhykkeistään mentymisprofiili tekee CT antigeenejä ihanteellinen tavoitteet syövän immunoterapiaa. Kuten tiedetään vähän siitä, CT antigeenejä voidaan säännellä translaation jälkeistä prosessointia, tutkimme mekanismit hajoamista NY-ESO-1 ja MAGE-C1 valituilla syöpäsolun linjat. Inhibiittorit proteasomeja välittämän hajoamisen aiheuttama eristämiseen NY-ESO-1 ja MAGE-C1 osaksi pesuainetta liukenemattomaan fraktioon. Lisäksi tämä käsittely myös lisännyt lokalisaatio NY-ESO-1 ja MAGE-C1 on sentrosomimäärän. Huolimatta niiden vuorovaikutusta, siirtäminen joko NY-ESO-1 tai MAGE-C1 että sentrosomin voi tapahtua toisistaan ​​riippumattomasti. Käyttämällä useita katkaistun fragmentteja, alueita vastaavat NY-ESO-1

91-150 ja MAGE-C1

900-1116 perustettiin tärkeiksi ohjaukseen sekä vakautta ja lokalisointi näiden CT antigeenejä. Meidän havainnot osoittavat, että vakaan tilan tasoja NY-ESO-1 ja MAGE-C1 säätelevät proteasomaalisten hajoamista ja että sekä käyttäytyä kuin aggregaatiota-altis proteiinien upon kertymistä. Jossa proteasomiestäjät yhä useammin etulinjan hoito syövän, nämä tiedot herättää kysymyksiä CT antigeenin käsittely antigeeniesittelyä ja siksi immunogeenisyys syöpäpotilailla.

Citation: Pagotto A, Caballero OL, Volkmar N, Devalle S, Simpson AJG, Lu X, et al. (2013) Centrosomal lokalisointi Cancer /Kives (CT) antigeenit NY-ESO-1 ja MAGE-C1 säätelevät proteasomiaktiivisuus Syöpäsolut. PLoS ONE 8 (12): e83212. doi: 10,1371 /journal.pone.0083212

Editor: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 08 elokuu 2013; Hyväksytty: 31 lokakuu 2013; Julkaistu: 10 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Pagotto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat rahoituksella Ludwig Cancer Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kytkentä immuunijärjestelmä tunnistaa ja eliminoida kasvaimet /syöpäsolut edelleen lupaava terapeuttinen strategia syövän hoitoon. Lähestymistapa luonnostaan ​​perustuu tunnistamiseen molekyylien allekirjoitusten pystyy tehokkaasti ja johdonmukaisesti erotella pahanlaatuinen väestöstä. Syövän /Kives (CT) antigeenejä ovat kokoelma yli 100 geeniä perheet useita jäseniä ja silmukointivariantit [1-3], että on tunnistettu monenlaisia ​​tekniikoita, kuten: T-soluepitoopin kloonaus [4-7] ; serologinen analyysi cDNA-ekspressiokirjastoja (Serex) [1], ero geenin ilmentymisen analyysi [8,9]; ja bioinformatiikan menetelmät [10,11]. Niiden ilme on yleensä rajoittunut sukusoluissa kiveksissä [12-15] ja joskus munasarja [16] ja trofoblastit [17]. Kuitenkin eri kasvaintyypeissä (esim. Melanooma, pienisoluinen keuhkosyöpä, sarkooma, jne …) epätyypilliset ilmentymisen yhden tai useamman CT antigeenejä voidaan havaita [3,18,19]. Fysiologinen seuraukset CT-antigeenin ilmentymisen syövän etenemisen ei täysin tunneta, mutta useat CT antigeenejä on osoitettu olevan modulaattoreita ubikitinaation kautta komplekseja, jotka on muodostettu RING-tyypin ubikitiinipromoottori ligaasit [20].

CT antigeeni NY-ESO-1 /CTAG1 /CT6 ensin tunnistaa Serex sisään ruokatorven okasolusyöpä [1,21]. NY-ESO-1 esittelee melko ainutlaatuinen arkkitehtuuri, jossa on PCC-1 domeenin C-päähän (aa 89-164), joka on homologinen hiivan transkriptiotekijän mukana solusyklin etenemisen ja polarisoitunut kasvua [22], on sen ainoa konservoituneita ominaisuus. Lopullinen biologinen rooli NY-ESO-1 säilyy määrittämätön, mutta sen on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa spesifisesti toinen CT-antigeeni, MAGE-C1 [23]. MAGE-C1 on osa laajempaa

MAGE

(melanooma-antigeeni Genes) perhe, joka koostuu yli 50 geenin useita subfamilies (

MAGE-A -L

). Hallitseva piirre näiden perheiden on osuvasti nimetty MAGE homologiadomeeni (MHD), iso keskialueella säilyneitä kaikkien jäsentensä [24-26]. MHD on läsnä useimmissa metazoan MAGE-proteiinit, mutta varsinkin poissa

C. elegans

sekä yksisoluisia eukaryooteissa. Merkitty Serex ja edustuksellisen ero analyysi (RDA) [8], MAGE-C1 /CT7 on lähes kolme kertaa suurempi kuin mikään muu MAGE perheenjäsen (1142 aa). Sen laajennettu N-pään ei juurikaan ole merkittävää ennustettu verkkotunnuksen arkkitehtuuri, lukuun ottamatta useita toistosekvenssit 14, 16 ja 21 aa [8]. MAGE-C1 on yleisesti ilmaistu multippelin myelooman (MM) [27], sekä sarkooma, melanooma ja virtsarakon syöpä [3,18]. Toiminto MAGE-C1 on vielä määritettävä, mutta useat tutkimukset ovat sidoksissa sen apoptoosin MM [28,29].

joukossa CT-antigeenin geenin perheitä, vähintään 19 jäsentä, on havaittu saavan aikaan humoraalisen ja /tai soluvälitteistä immuunivastetta syöpäpotilailla [19,30]. CT antigeeni proteiinit prosessoidaan peptideiksi proteasomista ja esitellään solun pinnalla MHC-molekyylejä, tunnistetaan autologisten sytotoksisten T-lymfosyyttien. Kasvaimen vapaata ilmaisua ja korkea immunogeenisyys on tehnyt CT antigeenejä houkuttelevia kohteita immunoterapeuttiseen strategioita hoidossa valittujen syöpien [19,31-36]. NY-ESO-1 pidetään yksi immunogeenisen CT antigeenejä ja on ollut painopiste tutkimuksen varten terapeuttisten rokotteiden [37]. Toisin kuin muut antigeenit, on tavallisesti todettavissa, samanaikaisesti vasta-aineen ja T-soluvasteen NY-ESO-1, joka pystyy saamaan aikaan vahva integroitu CD4

+ ja CD8

+ T-solujen immuunivastetta [38-40] . Systemaattinen analyysi on tunnistettu epitooppi ”hot spot” varten T-soluvaste on keskeinen osa NY-ESO-1-proteiinin aminohappojen 80-110 [41-44].

Vaikka transkription säätely CT-antigeenin ilmentymisen on kerännyt paljon huomiota, ymmärtää niiden translaation jälkeinen sääntely ja biologinen toiminta on otettava huomioon myös hahmotella niiden roolista syövässä. Kuten houkuttelevia rokote tavoitteet, määritetään solumekanismeja jotka kontrolloivat NY-ESO-1 ja MAGE-C1 vakaan tilan proteiini tasoilla on tärkeää, koska se voi tarjota käsityksen keinot, jotka voisivat moduloida niiden ilmaisua tai käsittelyä varten antigeenin esittelyä ja näin ollen immuunivastetta kasvainta vastaan ​​soluja, jotka ilmentävät näitä CT antigeenejä. Täällä tarjoamme todisteita siitä, että vakaan tason, liukoisuutta ja lokalisoinnin CT-antigeenejä NY-ESO-1 ja MAGE-C1 säätelee hajoamisen kautta proteasomin. Erityinen verkkotunnuksia kunkin proteiinin mukana säätelyssä nämä puolia ovat myös yksilöity ja keskusteltiin.

Tulokset

Proteasome esto indusoi liukenemattomuus ja centrosomal rikastaminen NY-ESO-1

Voit selvittää hajoamisen kautta ubikitiinistä proteasomin järjestelmä (UPS) voi olla mukana post -translational CT antigeeni asetuksen mukaan ekspressiotasot NY-ESO-1 ja MAGE-C1 ensin määritettiin paneelissa syöpäsolun linjat. Havaitsimme, että SK-MEL-37 melanooma ja H146 pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) solulinjoissa, ilmentävät suuria määriä NY-ESO-1 (kuvio 1A ja S1A, vastaavasti). Molemmat solulinjat käsitellään myöhemmin proteasomin inhibiittoria MG132. Solulysaatit erotettiin liukoisen (SOL) ja liukenemattomia (INSOL) fraktiot RIPA lyysipuskuria, kerättiin ja erotettiin SDS-PAGE: lla. Vaikka ei kvantitatiivinen, western blotit tutkittiin varten NY-ESO-1 havaittu kohonneita pitoisuuksia RIPA liukenemattomat jakeet kaksi solulinjojen seuraavat MG132 hoitoa verrattuna hoitamattomiin (kuvio 1 B, S1B), joka heijastaa vähentynyt liukoisuus menetys proteasomiaktiivisuus . Tämän muutoksen liukoisuus, epäiltiin, että NY-ESO-1 lokalisointi on saattanut myös muutettu. Sekä SK-MEL-37 ja H146-soluissa, NY-ESO-1 havaittiin immunofluoresenssilla kerääntyä yhden puncta seuraavat MG132 hoidon lisäksi pääasiassa sytoplasman sijaintia nähdään käsittelemättömissä soluissa. Muistuttaa sentrosomimäärän, NY-ESO-1: n läsnä tämän elimen vahvistettiin colocalisation NY-ESO-1 pericentrin, hyvin tunnettu proteiini, joka merkitsee tämä rakenne (kuvio 1 C, S1C). Lisäksi ubikitiini puncta, tunnusmerkki aggresome muodostumista, havaittiin myös colocalise kanssa NY-ESO-1 tällä rakenne (kuvio 1 D). Joissakin taajuus, sentrosomimäärän-lokalisoitu NY-ESO-1 voidaan jopa havaita hoitamattomilla H146-soluissa (kuvio S1C, top, 2D), nostaa mahdollisuus bona fide fysiologista toimintaa tällä kehon normaaleissa olosuhteissa. Nämä tiedot osoittavat, NY-ESO-1 voi paikallistaa sen sentrosomimäärän ja että se edellyttää UPS tehokkaan hajoamista.

) Detection endogeenisen MAGE-C1 ja NY-ESO-1 Western blot (CT7.33 ja NY-41-vasta-aineita, vastaavasti). Solulysaatit valmistettiin SK-MEL-37, U2OS ja H1299-solujen ja erotettiin SDS-PAGE: lla. β-tubuliinia toimi latauskontrollina. B) Detection of NY-ESO-1 SK-MEL-37-solut käsiteltiin DMSO (negatiivinen kontrolli) ja MG132 (40 uM, 4 tuntia). Yhtä suuret määrät RIPA-liukoisen (SOL) ja -insoluble (INSOL) materiaali (20pg) havaittiin. C) Immunofluoresenssi micrographs endogeenisen NY-ESO-1 (vihreä) ja pericentrin (punainen) SK-MEL-37-solut on esitetty, yhdessä niiden sulautuneen kuvia. D) Immunofluoresenssi micrographs endogeenisen NY-ESO-1 (vihreä) ja ubikitiinipromoottori (punainen) SK-MEL-37-solut on esitetty, yhdessä niiden sulautuneen kuvia. Valkoinen nuolet osoittavat sentrosomien ja mittakaavan baareja = 20 gm.

NY-ESO-1 ja MAGE-C1 colocalise klo sentrosomimäärän kun proteasomin esto

NY-ESO-1 on usein koekspressoitiin MAGE-C1 syöpäsoluissa, joissa ne voivat olla vuorovaikutuksessa. Sen määrittämiseksi, ovatko muutokset NY-ESO-1 liukoisuutta ja solunosasijaintia aiheuttama MG132 hoito vaikuttaa myös MAGE-C1, SK-MEL-37-soluja, jotka ilmentävät endogeenisesti sekä MAGE-C1 ja NY-ESO-1 (kuvio 1A) käsiteltiin MG132. Kuten NY-ESO-1, inhiboivat proteasomiaktiivisuuden huomattavasti koholla MAGE-C1-proteiinin tasot RIPA-liukenematon fraktio, jossa on hyvin vähän muutosta havaittiin RIPA-liukoinen fraktio (kuvio 2A). Colocalisation kanssa pericentrin osoitettu, että kuten NY-ESO-1, MAGE-C1 kerääntyy sentrosomien kun proteasomiaktiivisuuden on heikentynyt (kuvio 2B) ja colocalisation MAGE-C1 ja NY-ESO-1 in samanlaisia ​​puncta tukee niiden samanaikaista läsnäoloa (kuvio 2C). Colocalisation kanssa pericentrin kasvoi merkittävästi SK-MEL-37-soluja käsiteltiin MG132, päästä ylöspäin 75% sekä MAGE-C1 (p = 0,00222, 2-tailed t-testi) ja NY-ESO-1 (p = 0,00013) ( Kuvio 2D) ja osoittaa vankka vaste proteasomin esto. NY-ESO-1 colocalisation kanssa ubikitiinillä puncta osoitti merkittävä ero SK-MEL-37-solut (p = 0,01139), mutta ei H146s, jolla oli vähemmän johdonmukaista muodostumiseen (kuvio 2E). SK-MEL-37-solut käsiteltiin joko epoxomicin, valikoidumpaa proteasomin estäjä (kuvio S2A), tai alentaa MG132 pitoisuuksia (kuvio S2B) tuotti vertailukelpoisia tuloksia. Kertyminen joko MAGE-C1 tai NY-ESO-1 puncta ja RIPA liukenemattomia fraktioita oli palautuva, heijastuu paluu hajallaan lokalisointi ja pesuaineen liukoisuutta seuraava MG132 huuhtoutumista (kuvio S2C, S2D). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että sekä NY-ESO-1 ja MAGE-C1 väliaikaisesti kerääntyä sentrosomien vastauksena heikentynyt hajoamisen kautta.

A) Western blot MAGE-C1 lysaateista SK-MEL-37 soluja käsiteltiin DMSO (negatiivinen kontrolli) ja MG132 (40 uM, 4 tuntia). RIPA liukeneva (SOL) ja -insoluble (INSOL) jakeet on esitetty. B) Immunofluoresenssi micrographs endogeenisen MAGE-C1 (vihreä) ja pericentrin (punainen) SK-MEL-37-soluihin. Sulautuneen kuvia on myös esitetty. Mittaviivat = 20 gm C) Immunofluoresenssi micrographs endogeenisen MAGE-C1 (vihreä) ja NY-ESO-1 (punainen) SK-MEL-37-soluihin. Mittaviivat = 10 pm. Kaikissa kuvien, valkoiset nuolet osoittavat sentrosomien. D) Pylväsdiagrammit esittelee prosenttiosuus NY-ESO-1 ja MAGE-C1 puncta colocalised kanssa pericentrin SK-MEL-37 (MAGE-C1 /pericentrin – DMSO: 0,42 ± 0,72 ja MG132: 76,94 ± 6,61, p = 0,00222; NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 5,77 ± 3,74 ja MG132: 75,77 ± 1,73, p = 0,00013), U2OS (MAGE-C1 /pericentrin – DMSO: 2,75 ± 1,74 ja MG132: 69,28 ± 6,79, p = 0,00212), HC33 (NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 21,32 ± 2,39 ja MG132: 70,23 ± 6,86, p = 0,00312) ja H146 (NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 57,86 ± 18,53 ja MG132: 80,95 ± 1,80, p = 0,16289) soluja. Vaikka H146-solut ilmentävät MAGE-C1, sitä ei sisällytetty tähän analyysiin. E) Pylväsdiagrammit esittelee prosenttiosuus colocalised NY-ESO-1 ja ubikitiinipromoottori puncta SK-MEL-37 (DMSO: 0,65 ± 1,12 ja MG132: 30.81 ± 6.09, p = 0,01139), HC33 (DMSO: 4,09 ± 2,52 ja MG132 : 23,06 ± 6,70, p = 0,02739), ja H146 (DMSO: 2,14 ± 1,43 ja MG132: 20,00 ± 18,03, p = 0,22733) soluja. Keskiarvo, keskihajonta ja merkitys on esitetty.

Independent lokalisoinnin CT antigeenejä klo sentrosomimäärän

Koska NY-ESO-1 ja MAGE-C1 muodostavat komplekseja, me seuraavaksi testataan onko vuorovaikutus edellytettiin antaa eristämiseen on RIPA liukenematon jae tai lokalisointi on sentrosomimäärän kun proteasomin esto. U2OS luusarkoomasoluissa ilmentävät MAGE-C1 mutta ei NY-ESO-1, kun taas HC33 SCLC ilmentävät NY-ESO-1, mutta ei MAGE-C1 (kuvio 1A, S1A). Käsittelemällä MG132, kukin CT antigeeni havaittiin itsenäisesti kerääntyä RIPA liukenemattomia fraktioita (kuvio 3A, 3C) ja paikallistaa sen sentrosomien (kuvio 3B, 3D). Nämä tiedot tukivat siRNA-välitteinen geenien joko antigeenin SK-MEL-37-soluja, jotka osoittivat, että ehtyminen NY-ESO-1 ei vaikuttanut centrosomal lokalisaatio MAGE-C1 (kuvio S3, vasemmalla) ja päinvastoin ( Kuva S3, oikealla). Sekä MAGE-C1 ja NY-ESO-1 muodostettu puncta että colocalised kanssa pericentrin in U2OS (p = 0,00212) ja HC33 (p = 0,00312) soluja, tässä järjestyksessä, jossa tasot lähellä 70% ja merkittävästi suurempi kuin DMSO käsiteltyjä soluja (kuvio 2D ). Kuten H146s korkeampi pohjapinta tasoja NY-ESO-1 puncta myös havaittu HC33 solulinjassa. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että NY-ESO-1 ja MAGE-C1 voi kerääntyä ja paikallistaa sen sentrosomin toisistaan ​​riippumatta aikoina heikentynyt proteasomiaktiivisuuden.

) Detection endogeenisen NY-ESO-1 western blot välillä HC33 SCLC soluista käsiteltiin DMSO ja MG132 (40 uM, 4 tuntia). RIPA liukeneva (SOL) ja -insoluble (INSOL) jakeet on esitetty. B) Immunofluoresenssi micrographs endogeenisen NY-ESO-1 (vihreä) ja pericentrin (punainen) in HC33 käsiteltyjä soluja DMSO ja MG132, kuten kuviossa 1C C) havaitseminen endogeenisen MAGE-C1 päässä U2OS luusarkoomasoluissa samoissa olosuhteissa kuin Kuvio 2A. D) Immunofluoresenssi micrographs endogeenisen MAGE-C1 (vihreä) ja pericentrin (punainen) in U2OS käsiteltyjä soluja DMSO ja MG132, kuten kuviossa 2B. Valkoinen nuolet osoittavat sentrosomien. Mittaviivat = 20 gm.

NY-ESO-1

91-150 edistää yleistä vakautta

Olemme osoittaneet, että NY-ESO-1 on substraatti Proteasomin mutta joka alueet vaikuttavat sen hajoamista ei tiedetä. Tunnistaa verkkotunnuksia vastuussa eristämistä RIPA liukenemattomia fraktioita ja sentrosomimäärän lokalisointi, rakensimme fragmentteja NY-ESO-1 (NY-ESO-1

1-90, NY-ESO-1

91-180 ja NY-ESO-1

50-150, kuvio 4A) ja ilmaisi ne yksitellen yhdessä täyspitkä muoto (NY-ESO-1

FL) in hiiriperäisillä NIH3T3-solut, jotka ilmentävät ei MAGE-C1 eikä NY-ESO-1. Jälkeen MG132 hoito ja liukenemisen-ohjelma edellä kuvatun, suhteellinen ilmaisu ja solunosasijaintia analysoitiin Western blot ja immunofluoresenssilla, vastaavasti. Sekä RIPA-liukeneva ja -insoluble fraktioita NY-ESO-1

FL, NY-ESO-1

91-180 ja NY-ESO-1

50-150 stabiloitiin MG132, kun taas NY- ESO-1

1-90 vain kertynyt RIPA-liukoinen fraktio (kuva 4B). Merkitty kertyminen NY-ESO-1

91-180 fragmentti MG132 syytöksiä UPS fragmentti nopea vaihtuvuus ja ehdottaa NY-ESO-1 stabiliteetti on peräisin alueelta ulkopuolelta PCC1 verkkotunnus. NY-ESO-1

1-90 fragmentti ilmestyi keskittynyt tumassa, kun taas NY-ESO-1

91-180 ja NY-ESO-1

50-150 lokalisoitu sekä ydin- ja sytoplasman alueet riippumatta siitä, onko endogeenisen NY-ESO-1 ja MAGE-C1 olivat läsnä (SK-MEL-37, kuvio 4C) tai (NIH3T3, kuva S4). Solunosasijaintia joko NY-ESO-1 lyhentymisiä ilmaistaan ​​NIH3T3s (kuva S4) tai NY-ESO-1

1-90 SK-MEL-37s (kuvio 4C) ei merkittävästi muuttunut MG132. Silti, kuten endogeeninen NY-ESO-1, sekä NY-ESO-1

91-180 ja NY-ESO-1

50-150 kertynyt sentrosomien SK-MEL-37-soluihin (kuvio 4C). Yhdessä nämä tiedot korostavat alueen välillä aa 91-150 vaikuttanut yhtä NY-ESO-1 vakautta ja lokalisointi on sentrosomimäärän.

A) Kaavamainen esitys V5 /His6 epitooppihäntäisille täyspitkä ja katkaisu rakenteina NY-ESO-1. NY-ESO-1

1-90, NY-ESO-1

91-180 ja NY-ESO-1

50-150 esitetään yhdessä säilytetty PCC1 verkkotunnus. B) Detection of NY-ESO-1 konstruktioita ilmennettiin lyhytaikaisesti NIH3T3-soluissa Western blot anti-V5 ja anti-β-tubuliinia (latauskontrollina). Soluja käsiteltiin MG132 ja jakeet kerättiin kuten kuviossa 1B. C) Immunofluoresenssi mikroskooppikuvia SK-MEL-37-soluja (± MG132) ekspressoivat väliaikaisesti NY-ESO-1-fragmenttia (anti-V5, vihreä) ja pericentrin (punainen), jossa ytimet tunnistetaan DAPI-värjäyksellä (sininen). Valkoinen nuolet osoittavat sentrosomien. Mittaviivat = 20 gm.

MHD myötävaikuttaa MAGE-C1 vakaus

Kuten NY-ESO-1, näkökohdat vaikuttavat MAGE-C1 vakaan tilan tasot eivät ole hyvin ominaista. Määrittää alueen /s MAGE-C1 vaikuttavien vakautta, me tuotti useita fragmentteja, mukaan lukien: MAGE-C1

1-138, MAGE-C1

600-901, MAGE-C1

902- 1029 ja MAGE-C1

1030-1142 (kuvio 5A). Emme kyenneet rakentamaan fragmentit kattavat koko pituudeltaan MAGE-C1, koska suuri määrä GC-rikas toistojen aminohappojen 139 ja 600 esti vahvistusta tämän alueen. Kun transfektoitiin lyhytaikaisesti sekä NIH3T3 (kuvio 5B) ja H1299 soluja (kuvio S5), MAGE-C1

1-138 ja MAGE-C1

600-901 näkyy korkeampia vakaan tilan tasot pääasiassa yhden bändejä, verrattuna muut katkaisut. Lisäksi jokainen näytti siirtää molekyyli- paino, joka oli suurempi kuin odotettiin. Tämä voisi edustaa muodostumista MAGE-C1 oligomeerit tai voisi heijastaa jälkeenjäänyt muuttoliikkeen vuoksi Polypeptidikoostumus. Sitä vastoin sekä C-terminaaliset fragmentit (MAGE-C1

902-1029 ja MAGE-C1

1030-1142) oli vähemmän RIPA-liukoinen vakaan tason, jossa kaksi erillistä vyöhykkeet havaittiin. Odotettua suurempi bändejä saattaa kuvastaa translaation jälkeisen modifikaation (esim ubikitinaa-) tai mahdollisesti oligomeerisen laji. Fragmentteja, jotka sisältävät osia MHD (MAGE-C1

902-1029, MAGE-C1

1030-1142) kertynyt sekä RIPA liukenevia ja -insoluble jakeet lisäämällä MG132. Toisaalta, MAGE-C1

600-901 on vain vähän stabiloitu MG132, kun taas N-terminaalinen fragmentti (MAGE-C1

1-138) näytti olevan juurikaan vaikuta (kuvio 5B). NIH3T3-soluissa, MAGE-C1

1-138 ja MAGE-C1

600-901 esiintyi sekä tumassa ja sytoplasmassa, kun MHD sisältäviä fragmentteja (MAGE-C1

902-1029 ja MAGE- C1

1030-1142) on kokonaan suljettu pois nucleus (kuvio 5C). Lokalisointi MAGE-C1 fragmentteja NIH3T3-soluissa ei merkittävästi muuttunut annettaessa MG132 hoitoa. Sen määrittämiseksi, oliko MHD yksinään riitti MAGE-C1 eristämiseen ja lokalisointi, eristetyn domain (MAGE-C1

900-1116) ilmennettiin H1299-soluissa, ihmisen keuhkokarsinooma solulinjaa, joka ilmentää NY-ESO-1, mutta ei MAGE-C1. Kuten fragmentit, jotka sisälsivät osia MHD, MAGE-C1

900-1116 kertynyt sekä RIPA liukenevia ja liukenemattomia fraktioita kanssa MG132 kahtena immunoreaktiivisia bändejä havaitaan western blot (kuvio 5D). Yhdenmukainen liittyviä fragmentteja, MAGE-C1

900-1116 oli pääasiassa sytoplasmista vuonna H1299 soluissa ja MG132 ei erityisesti muuta tätä lokalisointi (kuvio 5E). Nämä tiedot syytöstä erittäin konservoituneen MAGE homologiadomeeni in proteasomista riippuvia käsittely ja sytoplasman lokalisaation MAGE-C1.

A) Kaavamainen esityksiä V5 /His6 epitooppihäntäisille täyspitkä ja katkaisu konstruktioita MAGE-C1. MAGE-C1

1-138, MAGE-C1

600-901, MAGE-C1

902-1029, MAGE-C1

1030-1142 ja MAGE-C1

900-1116 ovat esitetty ja MAGE homologiadomeeni (MHD) on merkitty. B) Ohimenevä ilmentyminen MAGE-C1 fragmenttien NIH3T3 hiiren fibroblasteissa havaitaan western blot anti-V5 ja anti-β-tubuliinia (latauskontrollina). Soluja käsiteltiin ja hajotettiin kuten kuviossa 1B. Tähdet osoittavat mahdollisia oligomeerimuodoista. C) Immunofluoresenssi micrographs NIH3T3 hiiren fibroblasteissa ilmentävät MAGE-C1-fragmentteja (anti-V5, vihreä), jossa TOPRO sisällytettiin tahraa ytimet (punainen). Soluja käsiteltiin MG132 (40 uM, 4 h) tai DMSO: ta (negatiivinen kontrolli). D) Ohimenevä ilmentyminen MAGE-C1

900-1116 vuonna H1299 NSCLC soluissa ja havainneet käytetyissä olosuhteissa kuviossa 5B. Tähti osoittaa mahdollista oligomeerinen muoto. E) Immunofluoresenssi micrographs H1299 soluja, jotka ilmentävät MAGE-C1

900-1116 kuten kuviossa 5C. Kaikkien kuvien, mittakaava baareja = 20 gm.

Keskustelu

Immunoterapeuttiset strategioita syövän hoitoon luottaa tehokkaasti erotteleva normaalin ja pahanlaatuisia soluja perustuvat ero ekspressiomalleja solunpintaproteiinit tai esittelyyn antigeenejä. Syövän /Kives (CT) antigeeni geeniperheellä on yli 100 erilaista jäsentä, joiden yleensä rajoitettu ilmentyminen ituradan soluissa kiveksen tulee väärin säädellystä monissa syövissä, tehokkaasti erottaa ne normaalista, ympäröivään kudokseen. CT antigeeni geenit normaalisti vaiennetaan metylaatio niiden CpG rikas promoottorien ja niin demetylaatio näiden alueiden sekä histoni asetylaatio, on osittain vastuussa heidän poikkeavalle uudelleen ilmentyminen syövän (tarkistetaan 19). Nämä mekanismit eivät pysty täysin selittämään puute ilmentymisen CT antigeenejä joissakin kasvaintyypeissä ominaista maailmanlaajuinen hypometylaatio (esim paksusuolensyöpä) [45,46] eikä heterogeenisyys usein havaittu Tuumorinäytteissä [47]. Tällainen monimutkainen ilme kuviot vaativat useita tasoja asetuksen, jotka eivät todennäköisesti johtuisi ainoastaan ​​eri transkription mekanismeja. Tästä syystä tutkimme tutkittu ilmiö translaation jälkeisen sääntelyn CT antigeenejä. Tässä esittelemme data syytetään hajoamisen kautta 26S-proteasomin, tärkeänä säätelijänä CT antigeenin vakaan tilan tasoja ja osoittaa, että kun se on heikentynyt, liukoisuutta ja solunosasijaintia molempien NY-ESO-1 ja MAGE-C1 muuttuu dramaattisesti.

ubikitiinistä proteasomin järjestelmä (UPS) on pääasiallinen mekanismi säänneltyjen proteiinien hajoaminen eukaryooteissa (tarkistetaan 48). Selvittää, miten hajoamisen kautta UPS vaikutti vakaan tilan tasoja NY-ESO-1 ja MAGE-C1 syöpäsolulinjoissa, käsittelimme solut proteasomiestäjät samalla seuraten muutoksia liukoisuutta ja lokalisointi kunkin proteiinin. Proteasomiestäjät aiheutti endogeenisesti ilmaistuna NY-ESO-1 ja MAGE-C1 kerääntyä, joko yksin (HC33, U2OS), kun molemmat CT antigeenejä oli läsnä (SK-MEL-37), tai kun kukin ilmennettiin väliaikaisesti solulinjoissa, joista joko puuttui ( NIH3T3). Huomattavaa on, että kertyminen oli pääasiassa havaittu lisääntymiseen pesuaine liukenematon osa solulysaatin. Vaikka kumpikaan NY-ESO-1 eikä MAGE-C1 on raportoitu aikaisemmin olevan aggregaatiota-altis, taipumusta CT antigeenejä tulla liukenemattomia viittaa siihen, että kapasiteettia on saattaja (ja hajoaminen) verkon /s on ylitetty. Sekä MAGE-C1 ja NY-ESO-1 havaittiin kerääntyä sentrosomimäärän samoissa olosuhteissa. Tämä malli muistuttaa muiden aggregaatiota altis proteiineja, kuten CFTRΔF508 [49] ja huntingtin [50], joiden kerääntyminen sentrosomien pahentaa kanssa proteasomin esto (tarkistetaan 51,52). Sentrosomien toimii ensisijaisena mikrotubulusten järjestävän keskus (MTOC) ja niillä on tärkeä rooli säätelijänä solusyklin etenemisen [53]. MTOC tulee myös solmukohta komponentteja sekä sytosolin chaperones (esim Hsp40, Hsp70) ja UPS (esim ubikitiinin 19S ja 20S alayksiköiden) [49,54,55], jotka kerääntyvät vastauksena väärin laskostuneet proteiinit toimitetaan sinne suoraan liikenteen on mikrotubuluksia muodostavat solunsisäisen elin kutsutaan aggresome [49,56,57]. Tässä roolissa sentrosomien toimia triage alustat proteiinin laadunvalvonnan päätöksiä. On näyttöä siitä, että sentrosomimäärän-lokalisoitu UPS komponentit kykenevät sitoutumaan aktiiviseen hajoamiseen [54,58,59]. Liukenematon osioinnin ja kerääntyminen sentrosomien sekä NY-ESO-1 ja MAGE-C1 ehdottaa taipumusta näistä CT antigeenejä koota yhteen, ominaisuus pahentaa kun proteasomiaktiivisuus vaarantuu.

kertyminen sekä NY-ESO-1 ja MAGE-C1 klo sentrosomien puuttuessa proteasomiaktiivisuus todennäköisesti heijastaa erottelua väärin laskostuneen proteiineja (mahdollisesti liukenemattomia aggregaatteja) keskeiseen paikkaan, jossa ne odottavat korjaaminen. Havaitsemiseksi väkevää ubikitiinipromoottori klustereita sentrosomien (kuvio 1 D) ja kerääntyy polyubiquitinated aineiden INSOL osa (kuvio S2D) tukevat tätä mallia. Korkeammalla NY-ESO-1 puncta klo sentrosomien käsittelemättömissä H146-soluissa (ja vähäisemmässä määrin HC33s) versus SK-MEL-37s voi myös heijastaa eroja niiden chaperoniproteiiniin ja hajoaminen verkkoja, joten yhdistäminen yleisempiä soluissa teho alentunut. Vaihtoehtoinen selitys tälle voisi olla, että joko NY-ESO-1 tai MAGE-C1 (tai molemmat) on bona fide toiminnallista roolia tällä sentrosomimäärän (eli NY-ESO-1 in H146-soluissa, kuvio S1C, 2D). Esimerkiksi proteasomiestäjät heikentää liikevaihdon centrosomal proteiineja, jotka vaikuttavat sekä mikrotubulusten ydintymis ja organisaatio [60,61]. Läsnäolo joko MAGE-C1- tai NY-ESO-1 (tai molemmat) on sentrosomien voisi moduloida heikentyä ja /tai vakautta olennaisia ​​tekijöitä siellä. MHDS Useiden MAGE perheenjäsenten vuorovaikutuksessa RING-tyypin E3 ubikitiinipromoottori ligaasit (esim TRIM28) ja moduloida ubikitinaatio [20]. MM, jossa MAGE-C1 ja NY-ESO-1 ovat usein yli-ilmennetään, sentrosomin vahvistus on löydetty noin 30%: ssa tapauksista ja on liittynyt yliekspressio CT geenien MAGE-perheen [62]. Täten voitto toiminnon vaikutuksen NY-ESO-1 ja /tai MAGE-C1 on sentrosomimäärän ei voida sulkea pois.

dokumentoitu kompleksin NY-ESO-1 ja MAGE-C1 tarkoitti sitä, että lokalisointi kukin CT antigeenin sentrosomien tai niiden liukenemattomuus voinut olla riippuvainen vuorovaikutuksesta. Silti koska jotka ilmentävät yhden CT antigeenejä vielä kertynyt sentrosomien jälkeen MG132 hoidon, vuorovaikutus ei näytä olevan edellytys. Tämä vahvistettiin käyttäen SK-MEL-37-soluissa ja CT antigeenin kohdennettuja RNAi erikseen (kuva S3) ja tukee mallia, jossa sekä NY-ESO-1 ja MAGE-C1 ovat luonnostaan ​​kykenee itsenäiseen centrosomal lokalisointi. Lisäksi alueet säätelevän lokalisointi voitaisiin kuvata aa 91-150 NY-ESO-1 ja aa 900-1116 MAGE-C1. Tämä alue NY-ESO-1 on osa ”hot spot”, jonka tunnuksena karkeasti aminohappojen 80-110, että solujen immuunivasteen NY-ESO-1 in cancer [37,63]. Koska nämä MHC-luokka I esitetään epitoopit ovat sivutuotteita proteasomaalisten hajoamista, tunnistaminen tällä alueella tärkeä liikevaihdon ja lokalisointi kun MG132 hoito on johdonmukainen. MHD (aa 908-1106) MAGE-C1 on konservoitunut MAGE-perheen mutta osoittaa vain vähän homologiaa muiden tunnettujen verkkotunnuksia. Vaikka sen toiminta ei vieläkään tunneta hyvin, MHD joidenkin MAGE edustaa sivuston proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen [20,23]. Itse asiassa, MAGE-C1 näyttää sitoutuvan NY-ESO-1 kautta MHD [19,23,30]. Kaksi MAGE-C1-epitooppien esittelyyn MHC-I-molekyylien MM-solut kykenevät indusoimaan CD8 + T-soluvastetta [64], ja niillä peptideillä, jotka ovat peräisin MHD (aa 959-968 ja 1083-1091). Yhteinen läsnäolo MHD kaikissa MAGE perheenjäsenet ehdottaa, että tämä ominaisuus MAGE-C1 voi olla merkitystä ymmärtämiseksi immuunivasteen muihin MAGE proteiinit.

Kaiken meidän havainnot korostavat translaation jälkeistä tasoa sääntely NY-ESO-1 ja MAGE-C1, jotka voivat vaikuttaa immuunivasteen CT antigeeniä ilmentäviä tuumorisoluja. Nämä havainnot ovat erityisen merkityksellisiä MM. Valikoivia proteasomiestäjät (esim Velcade /bortetsomibi) on ollut merkittävä edistysaskel hoidossa MM. Olemme osoittaneet, että proteasomin inhibiittorit ovat todennäköisesti aiheuttaa centrosomal lokalisointi ja kertymistä liukenemattomia MAGE-C1 ja NY-ESO-1 osana aggresomes MM soluissa. Mikä fysiologinen seuraus CT antigeeni kertyminen saattaa olla MM ei ole vielä selvä. Sekä MAGE-C1 ja NY-ESO-1 ilmaistaan ​​usein MM (66% ja 22% tapauksista vastaavasti), jossa on 93% MAGE-C1-positiivisia myeloomat saamaan aikaan havaittavan humoraalisen ja soluvälitteisen immuunivasteen tätä antigeenia [65, 66]. Kertyminen joko CT-antigeenin (tai molemmat) voivat olla sytotoksisia ja pahentaa tuloksena apoptoottinen ohjelma indusoi proteasomiestäjät [67]. Meillä ei noudata alennetussa MAGE-C1 värjäytymisen tumaan, kun soluja käsiteltiin MG132. Myeloomat kanssa ydin–sytoplasmista tai ydinaseiden vain MAGE-C1 on huonompi ennuste verrattuna niihin, joilla MAGE-C1 ainoastaan ​​sytoplasmassa [27]. Vaikka antigeenin esittelyä vaarantuisi, rajoitetulla CT antigeeni lokalisointi, joka johtuu proteasomin esto voi itse asiassa positiivisesti osaltaan parantaa ennustetta. Tämä mahdollinen hyöty on kuitenkin verrattava hyvin dokumentoitu dalmatialaistäpläisiä olennaisiin solutoiminnoille joka syntyy proteasomin esto. Keskeinen rooli UPS kaikissa soluissa, mukaan lukien kasvainsolut, tekee määrittävät terapeuttinen ikkuna avain hyödyllisyyttä näiden yhdisteiden. Lisätutkimuksia tarvitaan määrittämään fysiologiset roolit CT antigeenejä ja mahdolliset seuraukset tehoon immunoterapian vastaan ​​kasvaimia, jotka usein ilmaista niitä, kuten melanooman, keuhkosyöpä ja multippeli myelooma.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, vasta-aineet ja reagenssit

Ihmisen melanooma (SK-MEL-37) [1] ja pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) solulinjoissa (H146, HC33, H69, H209, H524, H889, ja