Krooninen sairaus

tiivistelmä

tsoledronihappo, joka on voimakas typpeä sisältävää bisfosfonaatti käytetään hoitoon patologisen luun menetys, erittyy unmetabolized munuaisten kautta, jos ei ole sitoutunut luun. Syöpäpotilailla, jotka saavat suuria yhdisteen munuaiseritystä voi liittyä akuuttiin tubulusnekroosi. Kysymys siitä, miten tsoledronihapon sisäistää munuaistiehyiden solujen ei ole vastattu ennen kuin nyt. Nykyisessä työssä, käyttämällä esi- ihmisen putkimainen soluviljelmässä, polulla soluunottoa Tsoledronihapon (fluoresoivasti /radioleimattu) ja sen sytotoksisuutta tutkittiin. Aiemmat tutkimukset laboratoriossamme ovat osoittaneet, että tämä ensisijainen soluviljelymalli johdonmukaisesti jäljittelee fysiologisista ominaisuuksista molekyyli sisäänoton /kuljetus epiteelin

in vivo

. Tsoledronihappo todettiin tarttunut tubulussoluihin kautta neste-vaihe-endosytoosin (peräisin apikaalisella ja basolateraalisessa puolella) kuten sen kolokalisaation kanssa dekstraani. Cellular otto ja tuloksena solunsisäinen taso oli kaksinkertainen alkaen apikaalisella puolelta verrattuna basolateraalisessa puolelle. Lisäksi solunsisäinen tsoledronihapon tason havaittiin olevan riippuvainen annettiin keskittymää eikä kyllästyvän. Sytotoksiset vaikutukset olivat kuitenkin todettu vain suurempia hallinto annoksina ja /tai jälkeen pidemmän inkubaation kertaa. Vaikka tsoledronihapon tarttunut tubulussoluihin, ei net putkimainen liikenne voitaisiin mitata. Voidaan päätellä, että neste-vaihe-endosytoosin tsoledronihapon ja solujen kerääntyminen suurina annoksina voi olla vastuussa akuutti tubulusnekroosi havaittu joillakin syöpäpotilailla saavat suuria annoksia yhdistettä.

Citation: Verhulst A, Sun S, McKenna CE, D’Haese PC (2015) endosytoottiselle Uptake tsoledronihapon mukaan tubulussoluihin saattaa selittää sen Munuaisvaikutukset syöpäpotilailla saavat suuria yhdisteen. PLoS ONE 10 (3): e0121861. doi: 10,1371 /journal.pone.0121861

Academic Editor: Franziska Theilig, anatomia, SVEITSI

vastaanotettu: 28 elokuu 2014; Hyväksytty: 16 helmikuu 2015; Julkaistu: 10 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Verhulst et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: AV on post doc-tutkijana että tieteellisen tutkimuksen rahasto Flanders (www.fwo.be). PD sai tutkimus Grant Novartis. Henkilöstöön kuuluvat Novartis luki käsikirjoituksen ja antoi luvan tietojen julkaisemista, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen keruun ja analysoinnin tai valmisteen käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: Tämä työ oli rahoittama tutkimus Grant Novartis. SS on varatoimitusjohtaja BioVinc LLC alkaen 1. tammikuuta 2014. CMK on perustajajäsen ja puheenjohtaja tieteellisen hallituksen BioVinc LLC ja omistaa patentin US8431714 B2 lisensoitu BioVinc, LLC. US8431714 B2 lisensoitu BioVinc, LLC. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Tsoledronihappo tai tsoledronaattia (Zometa; Novartis Pharma AG , Basel, Sveitsi) on kolmannen sukupolven, erittäin tehokkaita typen (N) sisältävä bisfosfonaatti, joka on osoittanut hyödyllisiä vaikutuksia hoidettaessa pahanlaatuinen hyperkalsemia ja luuston etäpesäkkeet potilailla, joilla on multippeli myelooma, keuhko-, rinta-, ja eturauhassyövän [1- 3].

N-sisältävä bisfosfonaatteja kuten tsoledronihappoa, kaikki suurelta affiniteetti luun mineraalien hydroksiapatiitista (HAP). Siksi näitä lääkkeitä, kun veressä osastoon, nopeasti sitoutuvat luukudosta, (± 60% annoksesta tsoledronihapon säilyy luu) [4] ja oletettavasti siitä vapautuvien prosessin aikana luun resorption. Kun adsorboitu luuhun mineraali, N-sisältävät bisfosfonaatteja sisäistetään kautta nestefaasiin endosytoosin osteoklastien jossa ne uskotaan estävän farnesyylidifosfaatin syntaasia, The isoprenoid biosynteettiset entsyymi kolesterolin biosynteesireitillä [5]. Häiriöt sivuliikkeen polun kolesterolin biosynteesireitillä eli isoprenylation sitten johtaa farmakologisen aktiivisuuden N-sisältävien bisfosfonaattien [6]. Isoprenylation kuuluu kovalenttinen sidos farnesyylidifosfaatin tai geranyyligeranyyli difosfaatista karboksipään säätelyproteiinien, mukaan lukien pienet GTPaasit Ras, Rac, Rho ja Cdc42. Jälkimmäinen kolme, samoin kuin monet muut, ovat geranylgeranylated ja pelata nopeutta rajoittava rooli Resorptiivinen aktiivisuus osteoklastien [7-9].

Tsoledronihappo ei sitoudu mineralisoidusta luuta erittyy, unmetabolized by munuainen, pääasiassa ensimmäisten tunnin kuluttua lääkkeen antamisesta [4, 10]. Syöpäpotilaat usein saavat kuukausittain annoksen 4 mg tsoledronihappoa laskimoinfuusiona 100 ml nestettä 15 minuutin aikana. Joillakin näistä potilaista munuaiseritykseen korkea verenkierrossa määriä voi liittyä akuutti tubulusnekroosi, tunnettu putkimainen solurappeuma menetys harjareunusten, ja apoptoosin [11]. Välillä on yhteys huipputasoon tsoledronihapon veressä ja munuaistoksisuus koska munuaisvaurion heikkenee, kun annosta pienennetään tai infuusio pitenee [1]. Lisäksi se, että munuaistoksisuutta ei ole havaittu postmenopausaalisilla naisilla, jotka saivat vain vuosittain 5 mg tsoledronihappoa aikana osteoporoosin hoitoon on linjassa täten [12].

Vielä ei ymmärrä mikä polku tsoledronihapon on tarttunut munuaistubuluksissa solut. Toisaalta tiedetään, että aste jolla tsoledronihappoa ja muut N-sisältävien bisfosfonaattien otetaan käyttöön eri solutyyppejä on suhteessa niiden kyky nestefaasin endosytoosin [13-15]. Lisäksi on myös mahdollista, että tsoledronihapon käyttää polkuja transsellulaarinen orgaanisten anionien kuljetuksen mukana munuaiseritystä monien muiden huumeiden [16-18].

soluviljelmässä primaaristen ihmisen putkimainen munuaissolut on kehitetty laboratoriossamme. In vitro mallissa leimasi laajasti sekä fysiologisia ja patofysiologisia taso ja todisteet esitettiin näille kulttuurien johdonmukaisesti matkia tärkeimpiä fysiologisia ominaisuuksia molekyyli sisäänoton /kuljetus jonka epiteelissä

in vivo

[19-23 ]. Kuten aiemmin on kuvattu, näitä viljelmiä näyttää sekä nestefaasin ja reseptori endosytoottista ottoa molekyylien [22; 24]. Lisäksi heillä koko kapasiteetti kontrolloitua kuljettamista molekyyleistä, sekä anionisia että kationisia kuljettaja molekyylejä epiteelin läpi [18], koska ne ilmaisevat laaja paletti transportterien mRNA ja proteiini tasolla. Tällä toiminnallisella tasolla, ensisijainen ihmisen putkimainen yksisolukerroksiin säilytettävä tarvittava koneiston välittävän verkon eritystä prototyyppinä substraattien eli orgaaninen kationi, para-amino- hippurihapon (PAH), ja orgaaninen anioni kreatiniini.

jotta voidaan paremmin ymmärtää havaittu munuaistoksisuutta tsoledronihapon, tavoitteena nykyisen oli tutkia mahdollisia otto reittejä ja farmakologinen käsittely tsoledronihapon putkimaisella epiteelisolujen käyttäen edellä kuvattua ensisijaista ihmisen soluviljelymalli.

Materiaalit ja menetelmät

Ensisijainen ihmisen putkimainen munuaisen soluviljelmissä

ihmisen putkimainen epiteelisolujen eristettiin normaalista ihmisen munuainen kudosta, joka tuli saataville kautta nephrectomy suoritetaan onkologisiin osoitus. Käyttämällä tätä kudosta varten soluviljelmää hyväksyttiin (P2013 /268), jonka eettisen komitean Erasmen Hospital (Bryssel, Belgia) mukana kudoksessa kokoelma. Kirjallinen suostumus saatiin. Makroskooppisesti normaali kudos kerätään ja käsitellään steriilisti. Cortex ja ulompi raita ulomman ytimen leikeltiin, decapsulated ja leikataan paloiksi noin 1 mm

3. Tämän jälkeen kudos fragmentit digestoitiin kollagenaasin D-liuosta (Roche, Ottweiler, Saksa) 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa voimakkaasti ravistellen, ja seulottiin 120μm seulan. Saatu solususpensio pantiin päälle jatkuvalle Percoll (GE Healthcare, Diegem, Belgia), gradientilla, jossa tiheys 1,04 ja 1,07 g /ml. Sentrifugoinnin (25min, 1620 RCF), soluja risteyksessä oli huolellisesti pois, pestään ja saatetaan kulttuurin sekapopulaatioon proksimaalisten tubulusten, distaalisen putkimainen ja keräämällä tiehytsoluja. Putkimainen soluja kasvatettiin konfluenssiin asti (10-14 päivä) on läpäisevä, polykarbonaattisuodatin tuet (Costar, Corning, NY, USA) tiheydellä 50,000 solua /suodatin, in a-MEM (Life Technologies, Gent, Belgia) mukaisesti muunnetun Gibson d’Ambrosio [25], johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS). Soluviljelmät kasvatettiin 6,5 mm läpäisevä (0.4μm huokoskoko) suodattimen tuet (Costar) sallitaan polarisoida ja on erotettu apikaalisella ja basolateraaliseen laatikolla.

välttämiseksi käytön vuotavat (ei-konfluentteja) kulttuurien yhtymäkohta soluviljelmien arvioitiin mittaamalla epiteelin vastus (TER) on yksisolukerrosten. Yksikerroksia ei käytetty lisäkokeita jos epiteelin resistanssia yksikerroksista korjattuna vastus suodattimen, oli alle 55 Ω.cm

2 ( 2 x SD alle keskiarvon TER alussa kokeiden). TER mitattiin käyttämällä epiteelin voltohmmeter varustettu Stx2 elektrodi (World Precision Instruments, Hitchin, Iso-Britannia). FCS sisältävä väliaine korvattiin seerumittomalla alustalla tai Krebs liuokseen ennen kokeita kuvataan seuraavissa kappaleissa

mittaukset solujen elinkelpoisuuden /yksikerroksista eheyden

TER mitattiin ennen ja jälkeen 2h itämisaika eri tsoledronihappoa pitoisuuksilla (0, 0,1, 1, 10 ja 100 uM). Solujen elinkelpoisuus arvioitiin sitten käyttämällä MTT perustuva määritys (Easy teille, Biomedica Gruppe, Wien, Itävalta), mukaan valmistajan ohjeiden. Solujen elinkelpoisuus myös muistiin 4, 24 ja 48 tuntia sen jälkeen, kun 2 tunnin itämisajan eri tsoledronihappo annoksia (0, 1, 5 ja 100 uM) ja seuraavat 4, 24 ja 48 tunnin inkubaation tsoledronihapolla (0, 1, 5 ja 100 uM). Kokeet mittaamalla solujen elinkelpoisuuden /yksikerroksista eheyden tehtiin yksikerroksisissa peräisin 4 eri munuaisten yksilöitä. Kutakin koetta vähintään 4 yksisolukerroksiin /kunto käytettiin.

otto fluoresoivasti leimattuja tsoledronihapon ensisijainen ihmisen putkimainen munuaisen soluviljelmissä

Tsoledronihappo oli fluoresoivasti leimattu 5-karboksifluoreseiinia [5-FAM ] tai Alexa Fluor 647 [AF647]. 5-FAM ja AF647 saatiin Invitrogen. Fluoresoiva leimaus suoritettiin vakaa konjugoimalla sukkinimidyyliesteriä Fluoroforin imidatsolitypelle tsoledronihapon linkkerin välityksellä strategiaa, kuten on kuvattu aiemmin McKenna [26, 27]. Leimattu tsoledronihappo puhdistettiin HPLC: llä ja karakterisoitiin UV-fluoresenssi,

1 H ja

31P-NMR ja MS kuten aiemmin on kuvattu [26, 27], ja sen jälkeen liuotetaan PBS: ään.

Confluent yksisolukerrokset ihmisen primäärisen putkimaisen munuaisen soluja inkuboitiin joko apikaalisella tai basolateraaliseen puolelta 5-FAM /AF647 merkitty tsoledronihappo (50 uM) 1 tunnin ajan joko 37 tai 4 ° C: ssa. Yksisolukerrokset jälkeen formaliinilla ja vastavärjättiin Hoechst 33258. Tämä koe suoritettiin yksikerroksisissa peräisin kahdesta eri munuaisten yksilöitä.

Jotta tarkistaa, että tsoledronihapon signaali todellakin paikallistettiin sisällä Solujen solukalvon proksimaalisten tubulussoluihin leimattiin inkuboinnin jälkeen tsoledronihapolla ja fomalin kiinnitys. Tätä tarkoitusta varten yksisolukerroksia inkuboitiin 20 min normaalin aasi seerumia (20%), ja 2 tunnin ajan hiiren monoklonaalisella vasta-aineella ihmisen leusiiniaminopeptidaasi, tietyn proksimaalisten tubulusten solumarkkerille [19, 28, 29]. Myöhemmin niistä AF488-leimattua aasin anti-hiiri-vasta-ainetta (Life Technologies, Gent, Belgia) käytettiin ja yksisolukerrokset vastavärjättiin Hoechst 33258.

Fluoresoivat signaalit arvioitiin käyttäen konfokaalimikroskopialla (Perkin Elmer, Zaventem, Belgia) ja soveltaminen Volocity ohjelmisto (Perkin Elmer).

tunnistaminen tsoledronihapon sisältävien solunsisäisten rakkuloiden

tutkiakseen, onko ottoa solun sisään tsoledronihapon tapahtui nesteen vaihe endosytoosin ja /tai reseptorin endosytoosin avulla, konfluentteja yksittäiskerrokset yhteistyössä inkuboitiin AF647-leimatun tsoledronihappo (50 uM) ja FITC-leimatun dekstraanin tai FITC-leimattua albumiinia, joko apikaalisella tai basolateraaliseen puolella 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. FITC- leimatun dekstraanin ja FITC-leimatun albumiinin perustetaan markkereita nestefaasin ja reseptorivälitteisen endosytoosin avulla, vastaavasti [14, 30, 31]. Tämä koe suoritettiin yksikerroksisissa peräisin kahdesta eri munuaisten näytteet.

Lisäksi, konfluentteja yksisoluisia kerroksia ihmisen putkimaisen munuaisen soluja inkuboitiin sytokalasiini B (45 min, 30 uM), ennen kuin altistamalla solut AF647-leimatun tsoledronihapon, tai FITC-leimattu dekstraani tai FITC-leimattua albumiinia. Sytokalasiini B, solun läpäisevä mykotoksiini joka estää voimakkaasti verkko muodostuksen aktiinisäikeiden, tunnustetaan yleisesti estäjänä endosytoosin. Kuitenkin sytokalasiini B ei vaikuta [32-34] oton FITC-dekstraanin nesteen vaihe endosytoosin.

Fluoresoivat signaalit arvioitiin käyttämällä konfokaalimikroskopia (Perkin Elmer, Zaventem, Belgia) ja soveltaminen Volocity ohjelmisto ( Perkin Elmer).

Measurement solunsisäisten tasojen radioleimatun tsoledronihapon

solunsisäinen tsoledronihappopitoisuudesta kvantitoitiin luomisen jälkeen vakaassa tilassa. Vakaissa oloissa saatiin aikaisemmin kuvatulla tavalla (Simmons, 1990), lisäämällä samalla pitoisuudet (5 uM) tsoledronihapon ennalta lämmitettyä Krebs-puskurissa sekä apikaalisella ja basolateraaliseen puolella polarisoidun soluviljelmissä. 1 tunnin inkuboinnin

14C-merkittyä tsoledronihappo (spesifinen aktiivisuus 2,04 GBq /mmol, toimittanut Novartis Pharma AG, Basel), lisättiin konsentraatiossa 1μCi /ml solun viljelyalustaan, joko apikaalisella tai basolateraaliseen puolella yksikerroksisen. Vielä inkuboitu 1 tunnin ajan läpäisevän tukee leikattiin pois ja määrän hajoamisia per minuutti mitattiin tuikelaskimella. Solunsisäisiä tasoja tsoledronihapon esitetään pmol /cm

2. Koe suoritettiin 4 kertaa yksikerrosviljelmiin peräisin 4 eri munuaisten yksilöitä. Jokaista koetta vähintään 5 yksikerrokset /kunto käytettiin.

Vertailu solunsisäisten radioleimatun tsoledronihapon tasoilla happo solunsisäisiin radioleimattuja mannitoli tasoilla

yksikerroksiset 1 munuaisen (5 yksikerroksia /kunto), solunsisäiset tasot tsoledronihapon verrattiin mannitolin, molekyyli, joka ei ole sisäistää tubulussoluihin [18, 35]. Cellular kertymistä mannitolia tutkittiin kokeen suorittamista sama kuin on kuvattu tsoledronihappo rinnakkaista yksisolukerrosten saman munuaisissa.

3H-leimattua mannitolia saatiin Perkin Elmer (spesifinen aktiivisuus 432,9 GBq /mmol).

vaikutus ylimäärän para-ammino hippurihappo, estroni-3-sulfaatin tai pamidronaatti solunsisäisiin tasot radioleimattujen tsoledronihapon

vaikutus orgaanisten anionien kuljettajaproteiini alustoille (PAH ja estroni-3-sulfaatin (E-3S), ja lisäksi N-sisältävä bisfosfonaatti (pamidronaatti) on soluunottoa tsoledronihapon tutkittiin yhteistyössä inkuboimalla

14C-merkittyä-tsoledronihapon ylimäärällä näistä molekyyleistä (50 uM) kuten aiemmin on kuvattu [18, 35]. koe suoritettiin yksikerrosviljelmiin peräisin 2 eri munuaisten yksilöitä, joilla on vähintään 5 yksikerroksia /kunto.

mittaus transepiteelinen kuljetuksen radioleimattujen tsoledronihappoa ja verrattuna epiteelin kuljetukseen radioleimattujen mannitolia

mittaamiseksi kuljetusta tsoledronihapon kautta yksikerroksiset ihmisen putkimainen epiteelisolujen jatkuvuustilan luotiin inkuboimalla yksisolukerroksia 1 h kanssa 5uM molekyylin ennalta lämmitettyä Krebs-puskurissa sekä apikaalisella ja basolateraalisessa puolella. Apikaalisella basolateraaliseen ja basolateraalisessa on apikaalisella vuot mitattiin sitten eri monolayers. Siksi

14C-leimattu molekyyli lisättiin joko apikaalisella tai basolateraalisessa puolelle kulttuureissa. Näyte otettiin sitten vastakkaisella puolella 1 tunnin inkuboinnin jälkeen (ellei toisin ole mainittu). Koe suoritettiin 4 kertaa yksikerrosviljelmiin peräisin 4 eri munuaisten yksilöitä. Jokaista koetta vähintään 5 yksisolukerroksiin /kunto käytettiin.

Liikenne Tsoledronihapon verrattuna mannitolia yksikerrosviljelmiin peräisin 2 munuaisia ​​(kunkin kokeessa vähintään 5 yksikerroksia /kunto). Apikaalisella basolateraaliseen ja basolateraalisessa on apikaalisella mannitolia vuot mitattiin kokeen suorittamista, joka oli identtinen varten tsoledronihappo rinnakkaisvalmisteiden yksisolukerrosten saman munuaisen.

3H-mannitolia oli Perkin Elmer (ominaisaktiivisuus 432,9 GBq /mmol).

vaikutus annettuna keskittymiseen solunsisäisiä tasoja ja epiteelin kuljetusta tsoledronihapon

Vaikutus annetusta tsoledronihappo keskittyminen solunsisäisiä tasoja ja epiteelin kuljetus yhdisteen tutkittiin käyttäen vakaan tilan perustamiseen kuvatulla vastaavissa kohdissa yllä. Tsoledronihapon ylläpitäjä seuraavina pitoisuuksina 0,25, 1, 5, 25 ja 100 uM. Tämä koe suoritettiin kahdesti yksikerroksisissa originiating 2 eri munuaisten yksilöitä ja kutakin koetta vähintään 5 yksikerroksia /kunto).

Tilastot

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen IBM SPSS tilastojen 20. Tiedot analysoitiin epäparametrinen tilastoista (U-testi), jossa Bonferronin-korjaus monimuuttujille.

tulokset

Epithelial eheys ja solujen elinkelpoisuus

inkubointi yksisolukerrosten 2 tuntia erilaisilla pitoisuuksilla tsoledronihapon (0,1 100gM) ei ole suoraa vaikutusta epiteelin eheys (Fig. 1A) tai solujen elinkelpoisuus (Fig. 1 B). Ylläpito epiteelin eheys on kriittinen tutkia transsellulaarinen kuljetukseen erityisesti yhdisteiden kanssa liian vuotavat yksikerroksia kukaan ei pysty määrällisesti transsellulaarinen kuljetus, koska se peittyy paljon suurempi parasellulaarisen kuljetuksen.

(A) ja elinkelpoisuus (arvioitiin mittaamalla MTT: n tuotantoa) (B) konfluentteja yksisoluisia kerroksia primäärisistä ihmisen putkimaisen soluja. TER mitattiin ennen ja jälkeen 2 tunnin inkubointijakson jälkeen tsoledronihapolla (0 100 uM), minkä jälkeen elinkelpoisuus mitattiin. Kukin datapiste edustaa keskiarvoa ± SD 4 kokeissa, suoritettiin soluviljelmissä peräisin 4 eri munuaisten näytteet. Aikana kukin neljästä kokeesta, vähintään 4 yksisolukerroksia /olosuhteita käytettiin. (C ja D) vaikutus tsoledronihappo inkubaation elinkelpoisuudesta konfluentteja yksisolukerrosten primaaristen ihmisen tubulussoluihin pidemmällä aikavälillä. Konfluentteja yksisoluisia kerroksia primaaristen ihmisen putkimaisen soluja inkuboitiin eri (0 100 uM) pitoisuudet tsoledronihappo 2 tunnin ajan, ja solujen elinkyky mitattiin 4, 24 ja 48 tuntia myöhemmin (C). Konfluentteja yksisoluisia kerroksia primaaristen ihmisen putkimaisen soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien kanssa tsoledronihapon 4, 24 tai 48 tuntia, jonka jälkeen solujen elinkelpoisuus mitattiin (D). Kukin datapiste edustaa keskiarvo ± SD 2 kokeissa, suoritettiin soluviljelmissä peräisin 2 eri munuaisten yksilöitä. Kunkin matkan aikana 2 kokeissa vähintään 4 yksisolukerroksiin /kunto käytettiin. * P 0,05 vs 0 uM.

mittaus solujen elinkelpoisuutta 4h, 24 h ja 48 h sen jälkeen, kun 2 tunnin inkuboinnin eri pitoisuuksilla tsoledronihapon (0-100 uM), paljasti merkittävästi vähentynyt elinkelpoisuuden korkeimman tsoledronihappoa pitoisuus (100gM), 48 h inkubaation (p 0,0005) (Fig. 1 C). Kun soluja inkuboitiin 4 h, 24 h tai 48 h samoina pitoisuuksina tsoledronihapon merkittävä, annoksesta riippuvainen väheneminen elinkelpoisuutta havaittiin 48 tunnin kuluttua (Fig. 1 D).

sisäänotto soluihin tsoledronihapon

inkubointi primaaristen ihmisen putkimaisen yksisolukerroksia 37 ° C: fluoresoivasti (joko 5 (6) -FAM tai AF647) leimattu tsoledronihappo on apikaalisen kalvon johti selvä vesicular fluoresoiva signaali solujen sisällä (Fig. 2). Solunsisäinen lokalisaatio yhdisteen lisäksi osoituksena co-immunovärjäyksellä ja proksimaalisten tubulusten solukalvon kanssa leusiiniaminopeptidaasi (Fig. 3). Eroa oli havaittavissa lokalisoinnin fluoresoivan signaalin, kun fluoresoivasti leimattu tsoledronihapon annettiin basolateraalisessa sijasta apikaalisella puolella yksisolukerrosten. Lisäksi, mitään signaalia ei voitu havaita silloin, kun soluja inkuboitiin 4 ° C: ssa (Fig. 2C-D).

Yksikerroksinen A ja B inkuboitiin 37 ° C: ssa, Cand D 4 ° C: ssa.

tutkiakseen, jolla reitin tsoledronihapon otetaan soluihin, solujen yksittäiskerrokset yhteistyössä inkuboitiin joko FITC leimattu dekstraani (perustettu markkeri nestefaasin endosytoosin tai FITC merkityn albumiinin (perustettu merkkiaine reseptorin endosytoosin) ja AF647 merkitty tsoledronihapon annos annetaan apikaalisella tai basolateraalisessa puolelle. Kuten esitetty Fig. 4 (otto maasta apikaalisella puolelta), tsoledronihappo ja dekstraani ovat selvästi yhteistyössä lokalisoitu solunsisäisessä rakkulat todistetaan sisäänottoon nesteen vaihe endosytoosin. samanlainen kuva nähtiin jälkeen koinkubaation fluoresoivasti leimattuja tsoledronihappoa ja dekstraania basolateraalisessa puolella. Kuten näkyy kuvassa. 5 (otto maasta apikaalisella puolelta), tsoledronihappo sisältäviä rakkulat eivät yhteistyössä paikantamaan ja rakkulat sisältää albumiinia , syytetään että tsoledronihappo ei ottanut huomioon reseptorivälitteisen endosytoosin avulla, joka osoittaa myös se, että, toisin kuin tsoledronihappo, albumiini on lähes ole otettu ylös basolateraaliseen puolelta (tuloksia ei ole esitetty).

Nuolet osoittavat selvästi kolokalisaation tsoledronihapon (punainen merkkivalo) ja dekstraania (vihreä signaali) samassa rakkulat, värjäys keltainen yhdistetyssä kuvassa.

tsoledronihappo (punainen merkkivalo) ja albumiiniin (vihreä signaali) ei selvästikään colocalized.

Lisäksi saadut tulokset inkuboinnin jälkeen solut sytokalasiini B edelleen vahvistaa yhteinen otto koulutusjakson tsoledronihappoa ja dekstraani. Vaikka Sytokalasiini B johti selvästi eston albumiinin oton vaikutusta ei ollut nähtävissä dekstraanin /tsoledronihappoa (Fig. 6). Seuraavat sytokalasiini B inkuboinnin vihreä leimatun albumiinin sijaitsee pitkin solukalvon eikä rakkuloiden solujen sisällä. Nämä tulokset osoittavat, että dekstraani ja tsoledronihapon otetaan käyttöön yhteinen, otto reitti, eli neste vaihe endosytoosin aikana albumiinia otetaan erilaisella (reseptorivälitteisen) endosytoottiselle prosessi, estyy sytokalasiini B.

kvantitointi soluunottoa /solunsisäisiä tasoja tsoledronihapon

Kuva. Kuvio 7 esittää solunsisäisiä tasoja

14C-leimattu-tsoledronihapon primääriset soluviljelmät, jotka ovat peräisin 4 eri munuaisten näytteet. Jälleen nämä kokeet osoittavat, että tsoledronihapon otetaan sekä apikaali- ja basolateraalisessa puolella ja lisäksi osoittavat, että solunsisäiset tasot tulevat merkittävästi (p 0,0005) korkeampi annettuna apikaalisella puolella (28,7 ± 11,8 pmol /cm

2 ) verrattuna basolateraalisessa puolelle (13,2 ± 5,9 pmol /cm

2). Vertailun solunsisäisiä tasoja mannitolia olivat vain 3,3 ja 4,0 ± 1,0 pmol /cm

2, kun niitä annetaan joko apikaalisella tai basolateraaliseen puolelle, vastaavasti.

Tässä kuviossa esitetään tulokset 4 kokeita yksikerroksia peräisin 4 eri munuaisten näytteet (kutakin koetta vähintään 5 yksikerroksia /kunto). Solunsisäinen laskettiin pmol /cm

2

vaikutus orgaanisten anionien kuljettajaproteiini alustoille pamidronaattia solunsisäisiin tasoilla tsoledronihapon

ylimäärä orgaanisten anionien kuljettajaproteiini substraatit PAH /E-3S käytettiin, jotta voitaisiin tutkia, tsoledronihappo sisäänottoa munuaistiehyiden soluihin välittävät orgaanisten anionien kuljettajat. Ylimäärä Pamidronaatin, toinen N-sisältävä bisfosfonaatti, käytettiin sen tarkistamiseksi yhteisen oton reitin molempien bisfosfonaattien molekyylejä. Koska solunsisäisiä tasoja tsoledronihapon ei muuttunut, kun läsnä on ylimäärä orgaanisen anionin kuljettajaa substraatit PAH ja E-3S (Fig. 8), ja ei hallinnon pamidronaatin kohdistaa mitään vaikutusta solunsisäisiä tasoja tsoledronihapon (kuvio . 8) ilman argumentteja saatiin tsoledronihappo ottoa orgaanisten anionien kuljettajat eikä yhteistä oton reitin molempien bisfosfonaatteja.

Jokainen luku ilmoittaa tulokset yhdessä edustavassa kokeessa soluilla on peräisin munuaisten (vähintään 5 yksikerroksia /kunto). Solunsisäinen tsoledronihappo pitoisuus laskettiin pmol /cm

2.

Epiteelinläpäisevää kuljetus tsoledronihapon

tutkimme seuraavaksi solujen kertyminen tsoledronihapon jatkoimme net transsellulaarinen tsole- happo virtaamista. Vuot johdetaan joko apikaalisesta basolateraalisessa puolelle (Ja-bl) tai basolateraaliseen kuin apikaaliseen puolelle (JBL-a) mitattiin yksikerrosviljelmiin peräisin 4 eri munuaisten näytteet. Tulokset osoittivat, valovirran molempiin suuntiin olla lähes yhtä suuri kuin toisiaan (Fig. 9), mikä viittaa siihen, että tsoledronihappo kuljetus tapahtuu parasellulaarista reittiä. Tämä varmistettiin edelleen havainto, että epiteelin vuot tsoledronihapon eivät olleet korkeampia kuin mannitolin (Fig. 10).

Tässä kuviossa esitetään tulokset 4 kokeita yksisolukerrosten peräisin 4 eri munuaisten yksilöt ( kunkin kokeen vähintään 5 yksikerroksia /kunto). Transepiteelinen valovirran kumpaankin suuntaan eivät merkittävästi poikkea toisistaan.

Tämä luku edustaa tuloksia yhdessä edustavassa kokeessa soluilla on peräisin munuaisten (vähintään 5 yksikerroksia /kunto).

keskittyminen riippuvuus putkimainen käsittelyn tsoledronihapon

Voit tarkistaa mahdollisen vaikutuksen tsoledronihapon keskittyminen kuljetus- ja kertymiseen solun soluviljelmiä inkuboitiin eri pitoisuuksia yhdistettä vaihtelee 0,25-100 uM (Fig. 11). Tulokset kuvassa. 10A osoittavat, että vuot päässä apikaalisesta basolateraalisessa puolelle (Ja-bl) ja basolateraalisessa apikaaliseen puolelle (JBL-a) ei eronnut toisistaan ​​koko konsentraatioalueella. Lisäksi havainto, että tasapainotilaa ei saavuteta, tarjoaa lisäksi osoitus siitä, että kuljetus tapahtuu yksinomaan parasellulaarisella tavalla.

vaikutus tsoledronihapon keskittyminen sen solunsisäisen taso näkyy kuvassa. 11B. Jälleen kertymiseen solun ei tasaantua sisällä laajalla konsentraatioalueella tutkittu. Jälkimmäinen havainto on osoitus siitä, että solujen kerääntyminen tsoledronihapon ei säännellä kalvo- proteiini kuljettavien molekyylien, sillä ne olisivat kohtuullisen kyllästyä klo suurina pitoisuuksina sovellettu tässä kokeessa.

(A) ja solunsisäinen tsoledronihappo pitoisuus (B). Tsoledronihappoa liikenne ja solunsisäinen kerääntyminen mitattiin konfluenteissa yksisolukerroksissa primaaristen ihmisen tubulussoluihin käyttämällä vakaan tilan perustamiseen. Tämä luku edustaa tuloksia yhdessä edustavassa kokeessa soluilla on peräisin munuaisten (vähintään 5 yksikerroksia /kunto).

Keskustelu

Tsoledronihappo on tunnettu terapeuttinen aine käytetään laskevan luuresorptiota osteoporoosipotilaalla (Reid

et el

., 2002). Lisäksi yhdiste käytetään myös suhteellisen suuremmat annokset potilailla, joilla on useita myelooma, keuhko-, rinta-, ja eturauhassyövän [1-3]. Koska sen korkea affiniteetti hydroksiapatiittiin, suurin osa annettu tsoledronihappo oletetaan kerääntyä luun. Tsoledronihappo joka ei sitoudu luuhun erittyy, unmetabolized munuaisten kautta, pääasiassa ensimmäisten tunnin kuluttua lääkkeen antamisesta [4, 10]. Koska suuret annokset Tsoledronihapon voi liittyä akuutti tubulusnekroosi useilla potilailla [11], tsoledronihappo otto /kerääntyminen tubulussoluihin todennäköisesti tapahtuu. Todellakin, fluoresoivasti leimattuja risedronaatti, joka rakenteellisesti on samanlainen tsoledronihappo, on havaittu luun vaan myös munuaisten kudoksen annon jälkeen hiirillä [14].

Käyttäen edellä kuvattuja primaaristen ihmisen putkimaisen soluviljelmässä perustaa , tärkeitä näkökohtia putkimainen tsoledronihapon käsittelyyn tutkittiin. Tsoledronihappo pitoisuusalueella 0,0, 0,25, 1,0, 5,0, 25 ja 100 uM (vastaten 0, 67,5, 270, 1350, 6750 ja 27,000 ng /ml) käytettiin. Koska seerumin tsoledronihapon Cmax tasot potilailla kuluttua 15 min infuusiona laskimoon 4 mg tsoledronihappo ovat noin 300 ng /ml [10], alin pitoisuudet käytetty meidän koejärjestelyistä siis täysin vastaavat seerumin tsoledronihappopitoisuutta hoidetuilla potilailla. Käyttämällä suurempia tsoledronihappoa pitoisuudet (25 ja 100 uM) pystyimme osoittamaan, että tsoledronihapon sisäänotto /kuljetus ei ollut satiable.

Se voidaan selvästi osoittaneet, että tsoledronihapon sisäänotto tubulussoluihin tapahtuu nestefaasin endosytoosin . Tämä on linjassa havainto Roelofs et al. osoittaa, että soluunottoa tsoledronihapon ja analogisen risedronaatilla ensisijaisesti tapahtuu solutyyppejä, joilla on korkea nestefaasin endosytoottiselle kapasiteetin kuten osteoklasteina ja monosyytit /makrofagit [13; 14].

sulje pois mahdollista vaikutusta suuri kromofori on leimatun tsoledronihappo, kaksi erilaista fluoresoivat leimat valittiin, joka osoitti yhdenmukaisia ​​tuloksia täten osoittaa, että otto tsoledronihapon jonka tubulussoluihin määritettiin pääasiallisesti kantalääkkeestä sijaan konjugoidun fluoresoivia väriaineita. Tätä tukee lisäksi se, että radioleimatun tsoledronihapon myös otetaan ylös ensisijainen ihmisen tubulussoluihin. Kvantifiointi ottoa radioaktiivisesti tsoledronihapon paljasti merkittävästi korkeampi (± 2-kertainen) talteenoton apikaalisella puolella verrattuna basolateraaliseen yksi.