Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Sylki (suun nesteiden) on syntymässä biofluid valmis ja taudin kliinisten sairauksien. Vaikka perustelut suusairauksien sovellukset (esim suullinen syöpä) on intuitiivinen, perusteet ja suhde systeemisiä sairauksia ja sylki biomarkkerit ovat epäselviä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa käytimme hiirimalleissa melanooman ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja verrattiin transcriptome biomarkkereiden profiilit kasvainta kantavien hiirten kuin kontrollihiirten. Microarray-analyysi osoitti, että syljen transcriptomes merkittävästi muuttunut kasvaimen kantavien hiirten kontrolleja vastaan. Merkittävä päällekkäisiä joukossa transcriptomes hiiren kasvaimia, seerumi, sylkirauhaset ja sylki viittaa siihen, että syljen biomarkkerit on useita alkuperää. Lisäksi olemme havainneet, että ilmaisu kahden ryhmän muuttunut merkittävästi transkriptiotekijöiden (TF: t) Runx1, Mlxipl, Trim30 ja Egr1, Tbx1, Nr1d1 in sylkirauhasen kudoksessa melanooman kantavien hiirten voi mahdollisesti olla vastuussa 82,6%: n sääteli geenien ilmentyminen ja 62,5%: n alassäädetty geeniekspression, tässä järjestyksessä, syljessä melanooman kantavien hiirten. Osoitimme myös, että kohdunulkoisen tuotanto hermokasvutekijän (NGF) on melanoomakasvainta kudosta kasvaimen julkaissut sovittelija voi aiheuttaa ilmentymisen TF Egr-1 sylkirauhasen.

Johtopäätökset

Yhteenvetona tietomme tukevat päätelmää, kun systeeminen sairauksien kehittymisestä, merkittäviä muutoksia voi tapahtua syljen biomarkkereiden profiilin. Vaikka alkuperä taudin aiheuttama syljen biomarkkerit voivat olla sekä systeeminen ja paikallinen stimulaatio sylkirauhasten välittäjäaineiden vapautuu kauko kasvaimista on tärkeä rooli säätelyssä syljen korvike biomarkkereiden profiileja.

Citation: Gao K, Zhou H, Zhang L, Lee JW Zhou Q, Hu S, et ai. (2009) Systeeminen Taudista aiheuttama Syljen biomarkkereiden Profiilit Mouse mallit melanoomaa ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 4 (6): e5875. doi: 10,1371 /journal.pone.0005875

Editor: Benjamin Rich, Harvard Institute of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 tammikuu 2009; Hyväksytty: 16 toukokuu 2009; Julkaistu: 11 kesäkuu 2009

Copyright: © 2009 Gao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat NIH myöntää RO1 DE017170 ja R21 CA126733 DTW. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Sylki satamat monenlaisia ​​proteiineja /peptidejä, nukleiinihappoja, elektrolyyttejä, ja hormoneja, jotka ovat peräisin useita paikallisia ja systeemisiä lähteistä. Biokemiallisia ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet sylki tukevat sen tärkeitä tehtäviä suun terveyteen kuten ruoansulatukseen, antibakteerista aktiivisuutta, ja eheyden säilymisen hampaiden [1], [2]. Esimerkiksi Kserostomia on suun kautta aiheuttama sairaus toimintahäiriöstä sylkirauhaset, johon liittyy pieni tai puuttuva eritystä syljen ja on syynä kariesta ja mukosiitti.

diagnostisesti, useita toteamukset viimeisen vuosikymmenen aikana ovat herättäneet mielenkiintoa käyttää sylkeä lähteenä biomarkkereita. Liukoinen fragmentti c-erbB-2 oli havaittavissa syljessä rintasyöpäpotilaiden mutta ei terveillä verrokeilla tai potilaille varustettujen hyvänlaatuisia kasvaimia [3]. Hormonien (esim. Kortisoli, oksitosiini) ja lääkkeet (esim. Sisplatiini, nikotiini, metadoni) syljessä kuvastavat niiden pitoisuus seerumissa [4], [5], [6]. Vuonna 2004 sylki perustuva HIV tunnistus hyväksyttiin US Food and Drug Administration (FDA).

Merkittävä sysäys tieteellisen perustan ja infrastruktuurin syljen diagnostiikan tutkimus tuli kuusi vuotta sitten, kun National Institute of Dental Kallon Research (NIDCR) teki merkittävän investoinnin kohti käytön kehittäminen syljen diagnostisena välineenä. Sylki on sittemmin tullut biofluid joka on valmis ja translaation ja kliinisiä sovelluksia. Huomattavaa on kypsymisen syljen proteomin, ensimmäinen toteuttaa diagnostisen keinovalikoiman sylki-diagnostiikan. Tiedämme nyt on 1166 proteiineja ihmisen syljessä, joiden tehtävät vaihtelevat rakenteellisista sitovia osallistumista erilaisten biologisten prosessien [7]. Toinen diagnostinen resurssi syljessä on sittemmin syntynyt, syljen transcriptome. Käyttämällä syljen transcriptome diagnostiikkatyökaluna, joukko 185 mRNA: ita todettiin ”normaali syljen ydin selostukset” (NSCT) [8]. Lisäksi syljen transcriptome on osoitettu olevan kliinisesti syrjivä havaitsemiseksi suun syöpä ja Sjögrenin syndrooma (SS). Yhdistelmä seitsemän syljen transkriptien biomarkkerit (

IL8, IL1B, DUSP1, HA3, OAZ1, S100P, ja SAT

) voidaan käyttää erottamaan syljen potilailla, joilla on suun kautta okasolusyöpä (OSCC) ja että säätimet 91% herkkyys ja spesifisyys [9]; kun taas viisi syljen proteomic markkereita (M2BP, CD59, katalaasi, MRP-14 ja profiliiniin) kollektiivisesti osoittavat 93% herkkyys ja spesifisyys vastaavasti havaita suusyövän käyttäen sylki [10]. Toinen tutkimus osoitti, että 27-mRNA: ja 16 peptidien sylkinäytteellä SS potilaat olivat huomattavasti ylä- tai alassäädetty [11]. Tekniikka syljen transcriptome on hiljattain edennyt eksonin tasolle kyky kattavasti profiloida syljen transcriptome käyttämällä eksoni-pohjainen tekniikka [12].

On olemassa monia etuja käyttää sylki kliinisenä diagnostinen biofluid . Näytteiden kerääminen on yksinkertainen, ei-invasiivisia, ja aiheuttaa vähän ahdistusta puolelta potilaista. Käyttö sylki tarjoaa myös kustannustehokas lähestymistapa laajamittainen näytöt [6].

käyttö sylki havaitsemiseksi suun sairauksien on vahvistettu, mutta sen käyttö systeeminen sairaus on pitkälti epäselvä. Vaikka raportit ovat kuvanneet havaitsemiseen biomarkkerit systeemisen syövän syljessä (esim. C-erb2 syöpäpotilaista), mekanismeista ilmiön jäävät toteen. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia tieteellistä näyttöä ja antaa perustelut käytön sylki systeemistä tautia havaitsemiseen. Käytimme syngeenisiä hiiren kasvainmalleissa kehittää kasvaimia etäällä suuontelon ja käyttää syljen transcriptome kuin biomarkkerina profiilin lukeman (Fig. 1). Syljen transcriptome on validoitu tieteellisesti uskottavaa ja perusteltua biomarkkereiden lähde sylki [8], [9], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17 ], joka mahdollistaa suuren suoritustehon analysoi ja lukemisen tarvittavat tutkimukset.

hiiret (joko C57BL /6-hiiriä tai DBA /2-hiiret), jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään seuraavasti: kontrolliryhmä (kontrollihiiriin ) ja kasvaimen ryhmä (kasvain hiiret) (15 eläintä ryhmää kohti). PBS injektoitiin kontrolli hiiriin, kun taas hiiret kasvaimen ryhmässä ruiskutettiin syöpäsoluja. Kasvaimet perustaminen kesti ~ 3 viikkoa. Sylki, sylkirauhasten, seerumin ja kasvaimen kudokset kerättiin kustakin hiirestä. Viisi hiirtä kussakin yhdistettiin yhdeksi ryhmäksi ja käsitellään profiloida transcriptome ilmaisu mikrosiruja.

Tulokset

Merkittävät taudin aiheuttama erot syljen transcriptome biomarkkereiden profiileja kasvain ja kontrollihiiret

kun arvioidaan syljen transcriptome biomarkkereiden profiili muuttuu, kun kehitystä kauko kasvain, suoritimme mikrosiruanalyysi verrata transcriptome biomarkkereiden profiilit syljessä hiirien (kolme ryhmää, 5 hiirtä kussakin ryhmässä) kanssa kasvain (melanooma tai keuhkojen) hiiriä (kolme ryhmää, 5 hiirtä kussakin ryhmässä) (Fig. 1). On välttämätöntä saada viisi hiirtä kussakin kasvaimen tai kontrolliryhmään, jotta koota riittävä sylki varten RNA: n eristämistä. Biomarkkereiden valintakriteerit asetettiin kertaluokkamuutos 2 ja

P

0,05. Havaitsimme 152 merkittävästi säädelty tunnettuja geenejä ja 359 merkitsevästi alassäädetty tunnettujen geenien (Fig. 2A, taulukko S3 ja S4) syljessä melanooman kantavien hiirten verrattuna kontrollihiiriin. Samoin löysimme 290 huomattavasti sääteli selostukset ja 784 merkitsevästi alassäädetty transkriptien (Fig. 2B, .table S5 ja S6) syljessä keuhkosyövän kantavien hiirten verrattuna kontrollihiiriin.

, Cluster analyysi 152 sääteli tunnettuja geenejä (jotka edustavat 225 probsets, vasen paneeli) ja 359 alassäädetty tunnettuja geenejä (jotka edustavat 403 probsets, oikea paneeli) ilmennetty eri syljessä melanooman hiirillä vs. kontrolli hiiret (P-arvo 0,05; kertainen muutos ≥2). Ilmaisu profiilit standardoitu on nolla keskiarvo ja yksikön keskihajonta. Punainen ja vihreä ovat korkean ja matalan ekspressiotasot jälkeen standardointia, vastaavasti.

B

, Cluster analyysi 290 säädelty ja 784 alassäädetty probesets differentiaalisesti ilmaistut syljessä keuhkosyöpä hiirillä vs. kontrolli hiiret (P-arvo 0,05; kertainen muutos ≥2).

C

ja

D

, päällekkäisyys eriytetty geenin ilmentymisen välillä melanoomamalii ja keuhkosyöpää malli.

C

, päällekkäisyys 225 säädelty geenien melanoomamalii ja 290 säädelty geenien keuhkosyövän mallia.

D

päällekkäisyydellä 403 alassäädetty geenien melanoomamalii ja 784 alassäädetty geenien keuhkosyövän malli.

Myös päällekkäin eriytetty geeniekspression syljessä melanooman hiirillä kanssa keuhkosyöpää hiirillä. Vertaamalla säädelty tai alassäädetty syljen geenien kaksi mallia, vastaavasti, löysimme 11 sääteli (Fig. 2C) ja 17 alassäädetty (Fig. 2D) transkriptien olemassa molemmissa malleissa. Kun kuitenkin otetaan huomioon erilaiset perimän ja syöpäsolun linjat kahden hiiren tilaa, se ei ole yllättynyt, että vain murto-osa koko muuttunut geenien päällekkäin (4,8% (11/225) eli 3,8% (11/290) sääteli geenejä melanoomamalii tai keuhkosyöpä mallin, vastaavasti, 4,2% (17/403) eli 2,1% (17/784) alassäädetty transkriptien kaksi mallia, vastaavasti).

Eri lähteitä osaltaan kasvain indusoimaan syljen mRNA profiilin muutos

tarkastella mahdollisia lähteet, jotka vaikuttavat syljen transcriptome muutokset hiirissä vastauksena systeeminen sairaus, me suodatetaan ilmaus profilointitiedot melanooman kantavien hiirten (kasvain, seerumi, sylkirauhasten ja sylki) valitse ”läsnä” mRNA kanssa

P

arvo 0,001 ja intensiteetin arvo 200. In melanooma mallissa, 20175, 5493, 19904, ja 306 transkriptit havaittiin kasvaimen, seerumin, sylkirauhasen ja syljen, vastaavasti (Fig. 3A). Sen jälkeen kun päällekkäisiä kaikki esillä geenit kasvain, seerumista, sylkirauhasten ja syljen, Fig. 3B osoitti, että on 306 transkriptien läsnä syljessä, 67,6% esiintyvät myös melanooman-kasvainkudoksessa, 51,6% ovat myös läsnä seerumissa ja 69,6% ovat myös läsnä sylkirauhasten. Nämä tiedot osoittavat, että alkuperä nykyisen transcriptome syljessä voi liittyä erilaisiin lokeroihin koko kehon muodostavat täysin ~75.2%: n 306 syljen selostukset. Lisäksi 24,8%: n 306 selostukset eivät ole päällekkäisiä geenejä kasvain, sylkirauhasten ja seerumi, mikä viittaa siihen, että ne voivat olla peräisin suuontelon.

, päällekkäiset selostukset esittää vuonna sylki, sylkirauhasten, seerumi ja kasvain melanooman kantavien hiirten.

B

, Niistä 306 syljen selostukset, 69,6% oli läsnä sylkirauhasen, 51,6% läsnä seerumissa, 67,6% läsnä kasvain (melanooman), ja 24,8% voi olla peräisin suuontelon (paikallinen).

Altered ilmaus transkriptiotekijöiden (TF: t) sylkirauhasiin melanooman kantavien hiirten korreloi muuttunut transkriptiotekijä välittämän geeniekspression muutoksia hiiren syljen

Koska syljen transcriptome oli selvästi muuttunut in kasvain vs. kontrolli hiiriä, me arveltu, että kasvaimia käyttäytyvät kuin umpierityselinten että ne erittävät välittäjien (hormonit, lymfokiinit, sytokiinit), jotka voivat vaikuttaa aktiivisuuteen TF sylkirauhasten ja sen avulla saa ylös tai alas-säätely transkriptien tasot sylki.

Vaikka kaksi hiiren syöpä mallia tässä tutkimuksessa ovat vakiintuneita [34], [35], melanooma hiirimallissa jäljittelee ihmisen melanooma parempi kuin keuhkosyöpä malli teoriassa ja patologisesti koska sekä ihmisen melanooman ja tämä hiiri melanoomaa esiintyy ihon alle. Siksi käytimme melanooman kantavien C57BL /6-hiirten toimiva malli testata hypoteesia.

Ensin verrataan geeniekspressioprofiilien sylkirauhasten kudosten melanooman kantavien hiirten kanssa ohjaus hiirillä ja yksilöinyt joukon 46 merkitsevästi sääteli TF: iä (fold muutos 2 ja

P

0,05) (taulukko S1). Sitten laskettiin korrelaatiokertoimet välillä ilmentymisen profiilien näiden muuttaa merkittävästi TF: ien ja differentiaalisesti ilmentyvien geenien (sekä ylös- ja alas-säännelty) syljen melanooman-hiirille. TF: ien sitten paremmuusjärjestykseen useita erittäin koekspressoi geenejä, joiden korrelaatio TF ilme on 0,5. 6 sääteli TF: ien kanssa korkein olivat RunX1 (runt liittyvä transkriptiotekijä 1), MLXIPL (musculus MLX vuorovaikutuksessa proteiini-kaltainen) ja TRIM30 (kolmikanta motiivi proteiinia 30) ilmen- tymisen lisääntymisen syljen geenien ja Egr1 (Early kasvutekijä-1), Tbx1 (T-box 1) ja Nr1d1 (musculus tumareseptoriin subfamily 1, ryhmä D, jäsen 1) varten säädeltiin syljen geenejä (Fig. 4A, E, F).

, 6-TF: iä (

Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, Nr1d1, TBX1

) ilmentyvät merkittävästi korkeampi sylkirauhasen melanooma kantavien hiirten vs. kontrolli hiiret (P 0,05, taulukko S1).

B

, mRNA: n ilmentymisen tasoja näissä 6 TF: ien (

Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, Nr1d1, TBX1

) sylkirauhasessa melanooman hiirillä vs., että normaaleissa hiirissä validoitu qRCR . Vaakasuora katkoviiva osoittaa geeni-ilmentymisen verrokkihiirten joka on mielivaltaisesti asetettu 1. Pylväät edustavat geenin ilmentymisen tasoa sylkirauhasen melanooman hiirillä suhteessa kontrollihiiriin. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena; baareja, SD.

C

, ilmentymismäärät viisi TF: ien (Runx1, Mlxipl, Egr1, Nr1d1, ja TBX1) sylkirauhasessa kudosten hiirien ja melanooma hiiret mitattiin immunoblottauksella. (C1, C2, C3 ja T1, T2, T3 on sama erän kudosten käytetään microarray-analyysi). Huomaa, että kaupallinen vasta-aine ei ollut saatavilla hiiren Trim30.

D

, Suhteellinen proteiinin ekspressiotasot edellä viisi TF: iä melanooman hiirillä vs. kontrollihiiriin. Signaalin voimakkuuden blot kuvassa 4

C

kvantifioitiin Image J ohjelmisto (NIH). Vaakasuora katkoviiva osoittaa ilmentymisen määriä näitä 5 TF: iä verrokkihiirten joka on mielivaltaisesti asetettu 1. Pylväät osoittavat, että suhteellinen proteiinin tasot 5 TF: ien kasvaimia omaavilla hiirillä verrataan verrokkihiiriin; baareja, SD.

E

ja

F

, ilmentyminen 6 TF: ien (

Runx1, Trim30, Mlxipl, Egr1, Nr1d1, TBX1

) on sylkirauhaskipu melanooman hiiriä korreloivat eriytetty geenin ilmentyminen hiiren sylkeä. Kolme heistä (Runx1, Trim30 ja

Mlxipl

) voi olla mahdollisesti vastuussa 180, 35 ja 16 säädelty syljen transkriptien melanooman hiirillä (

P

0,05), vastaavasti , kun taas muut 3-TF: (

Egr1, Tbx1 ja Nr1d1

) on mahdollisesti korreloivat 119, 116 ja 77 alassäädetty syljen transkriptien (

P

0,05).

G

, ilmentäminen 3 TF: ien (Runx1, Trim30 ja Mlxipl) täysin korreloi 82,6% ((180 + 5 + 1) /225 = 82,6%) sääteli geeniekspression melanooman hiiren syljen by päällekkäisiä kaikki syljen geenit, jotka korreloivat näiden 3 TF: ien kuviosta. 4

E

.

H

, ilmentymistä muiden 3 TF: ien (Egr1, TBX1 ja Nr1d1) täysin korreloi 62,5% ((119 + 58 + 2 + 73) /403 = 62,5%) alassäädetty geenin ilmentymistä sylki melanooman hiirillä päällekkäisten kaikki syljen geenit, jotka korreloivat näiden 3 TF: ien kuviosta. 4

F

.

Seuraavaksi muuttuneen ilmentymisen malleja näistä sylkirauhasten TF: iä validoitiin sekä transkription ja proteiinin tasot qPCR ja immunoblottauksella. Kuva 4

B

osoittaa, että mRNA-tasot kuudesta TF: ille kasvavat 3- ja 16-kertainen sylkirauhaset melanooma kantavien hiirten verrattuna kontrollihiiriin. Immunoblottauksella havaitseminen käyttäen 5 kaupallisesti saatavilla hiiren TF: ien vasta-aineita, paljasti 1,5-3,5 kertaa korkeampi näiden TF: ien ilmentymisen sylkirauhaset melanooma kantavien hiirten kuin kontrollihiirillä (kuvio 4

C ja 4D

). Sitten kuva 4

E ja F

osoittavat, että yli 6-TF: liittyi useita eriytetty geeniekspressioiden hiiren syljen. Sen jälkeen, kun limittäin liittyvät geenit jokaisen TF, se voidaan nähdä, että muuttuneen toiminnan kolmen TF: ien (RunX1, MLXIPL ja TRIM30) voivat olla mahdollisesti vastuussa 83%: n säädelty mRNA syljen (Fig. 4

G

), kun taas kollektiivinen muuttunut toimintaa Egr1, Tbx1 ja Nr1d1 voi mahdollisesti selittää 63% alassäädetty ilmentymä syljen mRNA: iden (Fig. 4

H

).

EGR-1 signaalireitin ja havaitseminen hermokasvutekijän (NGF) melanooman kasvainkudoksessa ja seerumin

Sen tutkimiseksi, kehittyneissä kasvaimia voi välittää muuttuneen ilmentymisen ien sylkirauhaset kasvainta kantavien hiirten, selvitimme NGF /Egr1 signaalireitin koska Egr1 otettiin esimerkiksi säädelty TF sylkirauhaskipu melanooma-kasvain hiirillä. On hyvin tunnettua, että Egr-1 on TF: n NGF-signalointireitin [18], [19] (Fig. 5A). Siksi hypoteesina, että NGF: n erittyy kiertoon melanooma, kiertää sen sylkirauhasen, jossa se aktivoi reseptorivälitteisen signalointikaskadin, joka johtaa Egr-1 ylössäätely ja spesifisten geenin transkription ja proteiinin translaation. Kuvio 5B esittää, että NGF tuotetaan melanoomakudoksesta on huomattavasti korkeampi kuin normaalissa ihossa (

P

0,001). Kuvio 5C esittää, että NGF on myös huomattavasti korkeampi seerumissa melanooman kantavien hiirten verrattuna kontrollihiiriin (

P

0,05). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että melanooma voi tuottaa NGF ja erittyy sen verenkiertoon. Päästyään sylkirauhaset, lisääntynyt NGF veren voisi stimuloida lisääntyneen ilmentymisen TF: istä, kuten Egr-1 johtaa muuttunut geenien ilmentymistä ja proteiiniprofiileja syljessä melanooman kantavien hiirten.

, polku johon transkriptiotekijän Egr1. Hermokasvutekijä (NGF) voi olla ylävirtaan tekijä Egr1.

B

, ilmentäminen NGF hiirillä ihon ja melanooma kudoksia mitattiin ELISA. Pylväät ovat absoluuttisia keskiarvoja NGF pitoisuus kudoksissa viidestä melanooman hiirillä. ***,

P

0,001.

C

, Expression of NGF seerumissa hiirien ja kasvain hiirillä. Pylväät ovat absoluuttisia keskiarvoja NGF seerumissa viidestä ohjaus hiirillä ja viisi melanooma hiirillä. Bar, SD. **,

P

0,05

Keskustelu

Tutkimukset ovat osoittaneet hyödyntämismahdollisuudet syljen diagnostisena biofluid translaatiotutkimuksessa ja kliinisissä sovelluksissa. Biologinen näyte, sylki on edullinen ja helposti ei-invasiivisia keinoin. Kattava tietopohjaa syljen diagnostinen koostumus tarjoaa arvokasta ja informatiivinen voimavara biomarkkereiden löytö (www.skb.ucla.edu). Syrjivä syljen biomarkkereita kaksi suun sairaudet: suun syöpä ja Sjögrenin oireyhtymä on tunnistettu ja validoitu [9], [11]. Kuitenkin yhteys systeemisiä sairauksia ja sylki biomarkkerit on vielä epäselvä. Tässä tutkimuksessa käytimme hiiri malleja syövän onko syljen biomarkkereiden profiilit vaikuttavat distaalinen sairauksien kehittymisestä. Tuloksemme osoittivat, että syljen transcriptome profiileja muutu merkitsevästi hiirillä jommallakummalla kasvaimia: melanooma ja keuhkosyöpä (Fig. 2). Jokainen kasvain-tyyppinen liittyi toiseen syljen transcriptome profiilin. Lisäksi, analyysimme NGF tuotannon ja TF Egr1 viittaavat siihen, että kasvutekijöiden tuumorikudokseen edustaa yhtä mekanismia, jonka kaukainen kasvain voi muuttaa transcriptome ja sylkirauhasten ja siten sylkeä. Nämä havainnot osoittavat myös, että sylkirauhaset voi olla avainasemassa välittämisessä kasvaimen aiheuttama muutoksia syljen transcriptome biomarkkereiden profiilin. Sen lisäksi, jotka osoittavat, että sairauden aiheuttama kiertävä biomarkkerit voivat löytää tiensä syljen, nämä havainnot viittaavat siihen, että tauti aiheuttama sylkirauhasten korvike biomarkkerit voi olla diagnostista arvoa havaitsemiseen tai valvontaan systeemiset sairaudet.

Koska meidän ensimmäinen raportti syljen transcriptome [8], [9], olemme tutkia alkuperää syljen mRNA, joka näyttää olevan erilainen kuin mRNA: ista löytyy muiden kehon nesteiden. Nukleiinihapot seerumin syöpäpotilaiden arvellaan irtoa suoraan syöpäsolujen tai vapautetaan seurauksena solulyysin vahingoittuneen elimissä, kun nukleiinihapot virtsassa voi tulla verestä mRNA: n tai DNA: n [20], [21 ]. Eräässä tutkimuksessa ihmisen syljen transkriptien syljen transcriptome voidaan havaita kaikki lähteet sylkeä lukien korvasylkirauhasessa, submandibular ja kielen alle rauhaset, ikenen ientaskujen nesteet ja suun epiteelisolut [16]. Äskettäin on osoitettu, että suurin osa mRNA: iden sylki transcriptome on AU-rikas elementti (ARE) niiden 3’UTR joka antaa vakautta komplekseja ARE sitovia proteiineja [17]. Esillä olevassa tutkimuksessa vertasimme transcriptomes kasvain, seerumin, sylkirauhaset ja sylki ja löysi syljen transcriptome tuumoria kantavissa hiirissä erittäin päällekkäin suuressa määrin kanssa transcriptomes sylkirauhasten, seerumin ja kasvain. Nämä analyysit viittaavat siihen, että voi olla useita alkuperää syljen mRNA ja /tai että monimutkainen systeeminen suhde voi olla välillä suuontelon ja terveysriskiä.

Tutkimme mahdollisia mekanismeja, joilla distaalinen kasvaimia välittäjänä muutoksia syljen biomarkkereiden profiileja tuumoreita kantavaa hiirtä. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että systeemiset sairaudet tai hoidot voivat vaikuttaa funktio sylkirauhasen tuloksena koostumuksen muutoksia syljen [22], [23], [24]. Syljen natriumin ja proteiinin tasot olivat koholla jälkeen interleukiini-2 (IL-2) potilailla. Yksi tutkimus käyttäen hiirimallissa osoitti myös, että tasot tulehduksellisten tekijöiden, kuten IL-1-beeta lisääntynyt syljen jälkeen kauko tulehdus itse [24]. Koska sylkirauhasen on merkittävä lähde syljen, me arveltu, että sylkirauhaset voi olla vastuussa syljen erityisiä biomarkkerina muutokset liittyvät distaalisen kasvaimia. Koska meidän koe suoritettiin kolmena kappaleena, Bayes menetelmää voidaan soveltaa. Kuitenkin tämä menetelmä vaatii erityistä mallioletuksiin datalle. Lopuksi Expression konsolin (Affymetrix, Inc.) ja Dchip (https://biosun1.harvard.edu/complab/dchip/) ohjelmisto on sovellettu tässä tutkimuksessa. Sillä melanooma syngeeninen malli tunnistimme 46 TF: t ovat merkittävästi säädellään ylöspäin sylkirauhaset melanooman kantavien hiirten, jotka voivat johtaa suoraan induktion tai suppressio geeniekspression. Suhteellinen kertainen muutokset TF ilmaisu kuten Egr1 ja Nr1d1 ovat erilaiset mRNA-tasoja ja proteiini tasoilla, jotka voivat heikentää translaation muuttaminen tai proteasomaalisten hajoaminen [25]. Sitten todettiin, että nämä muuttuneet ilmentyminen ien liittyy melanoomaan aiheuttama transcriptome syljessä. Olemme havainneet, että noin 83% merkittävästi säädelty transkriptien syljessä voidaan selittää kolmella TF: ille (Runx1, Trim30 ja Mlxipl) (Fig. 4G) ja 63% merkittävästi alassäädetty syljen transkriptien voidaan selittää toinen kolme TF: ien (Egr1, TBX1 ja Nr1d1) (Fig. 4 H). Yhdessä nämä löydökset antavat meille mahdollisuuden päätellä, että sylkirauhaset palvella aikaisemmin unappreciated rooli elimen seuranta systeeminen sairaus indusoimalla tautikohtaisia ​​TF: ien ja muuttamalla spesifisten geenien ja käännös vastaavien proteiinien. Nämä muuttuneet syljen mRNA: t ja proteiinit ovat sairauteen liittyvän korvike biomarkkerit, jotka erittyvät glandulaarinen nesteiden ja anna suuontelossa koko syljestä.

Koska induktio TF: ien ilmentymisen sylkirauhaset tapahtui hiirillä, joilla on distaalinen kasvaimen olemme edelleen hypoteesi on kasvain erityisiä välittäjiä, jotka voivat vaikuttaa muuttuneen TG ilmaisua sylkirauhaset. On hyvin tunnettua, että tuumorit ekspressoida ektooppisesti välittäjäaineita, joilla on systeemisiä vaikutuksia distaaliseen elimiin ja helpottaa etäpesäke syöpäsolujen [26], [27]. Melanoomat tiedetään ekspressoida ektooppisesti TGF-beeta-[28], kun keuhkokasvaimia ektooppisesti ilmaista gonadotropiinien ja muut hormonit [29], [30]. Olemme tutkineet jos yksi tällainen signalointireitin voi liittyvät johonkin tunnistettu TF: ille, joka voi olla vastuussa induktion tai tukahduttaminen syljen transcriptome hiiren melanooman mallia. Todellakin, NGF: n tiedetään stimuloivan ilmentymisen TF Egr-1: stä hyvin tutkittu signalointireittiä (Fig. 5A). Käyttämällä NGF ELISA-määrityksessä, havaitsimme, että NGF: n konsentraatiosta melanooman kudosta ja seerumi on huomattavasti korkeampi kuin vastine kontrollisilkkipaperia (Fig. 5B, C). Nämä tiedot viittaavat siihen, biologinen skenaario, ja logiikka, jossa kehitetään hiiren kasvain erittää NGF verenkiertoon, jossa se kiertää veressä sylkirauhaset ja sitoutuu NGF-reseptoreihin ilmaistaan ​​syljen asinussolut, aktivoimalla signalointireitin, joka johtaa säätely of Egr-1-mRNA ja proteiini tasoilla. On huomattava, että melanoomasolujen ovat peräisin melanosyyttejä, jotka kulkeutuvat hermostopienasta alkionkehityksen aikana. NGF voi stimuloida ja etäpesäkkeiden melanoomasolujen [31]. Toisaalta, NGF ja sen reseptori (TrkA IR ja TrkC IR) on löydetty sylkirauhasen [32], [33]. Siksi on kohtuullista ehdottaa, että NGF erittämä melanoomakasvain siirrettiin veren välityksellä ja sitoutuu sen sukulais reseptoreihin sylkirauhasen, johtaa lopulta stimulaation useiden TF: ien ilmentymisen lukien Egr-1 (Fig. 6).

Välittäjät kuten NGF erittävät kauko kasvaimet siirtyvät sylkirauhasten kautta veren stimuloida TF: ille ilmaisun ja muuttaa syljen mRNA profiilin.

mitataan myös NGF tasot kasvain lysaatin hiiren keuhkoissa syöpä malli. Vaikka NGF oli havaittavissa, se oli huomattavasti alhaisempi kuin melanoomakasvainta lysaattia (20,9 ± 4,3 pg /mg keuhkojen kasvain vs. 75,73 ± 24 pg /mg melanoomakudoksesta, P 0,05, tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi ainoastaan ​​11 säädelty ja 17 alassäädetty transkriptit päällekkäin kun vertasimme sylki mRNA profiilia melanooman mallia keuhkosyöpä malli (225 säädelty tai 403 alassäädetty geenien melanoomamalii vs. 290 up-säännellään tai 784 alassäädetty transkriptien keuhkosyöpä mallia vastaavasti Fig. 2C ja D). Ja 2 näiden 17 päällekkäin alas-geenien korreloivat Egr1 lauseke (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tiedot antavat meille mahdollisuuden päätellä, että melanooma-johdettu NGF on potentiaalisesti tärkeä välittäjänä downregulation spesifisiä sylki transcriptome ainoastaan ​​melanooman kantavien hiirten.

Vaikka meidän raportissa ei kattavasti osoittaa mekanistinen yhteys systeeminen sairauksien kehittymisestä ja syljen biologisten merkkiaineiden muutoksista, se alkaa maalata kuvan käsitteen systeeminen verkkoja olemassa meidän elin, joka yhdistää distaalisen sairaudet ja sylkirauhasten. Signaalit välitetään tällaisia ​​verkkoja voi aiheuttaa liittyvä signalointi polkuja, jotka johtavat muuttuneeseen geenin ilmentyminen ja proteiinin translaation ja siten tuottaa taudin aiheuttama syljen biomarkkereiden profiileja. Oletamme, että tällaisen taudin aiheuttama sylkirauhasten välittämää transcriptomes ja translaation tuotteet voivat olla arvokkaita indikaattoreita sairauden puhkeamista ja /tai etenemistä. Siksi sylkirauhasen voidaan pitää reaktiivinen elin seuranta systeemisiin sairauksiin ja sylki voidaan tutkia biomarkkerina rikastettu taudin heijastava biofluid. Paikallinen tuotanto ja eritys sylkeä yhdestä anatominen lähteestä (sylkirauhaset), ja se, että se voidaan hyödyntää helposti ja ei-invasiivisesti sekä suhteellisen vähän epämukavuutta potilaille, voimakas kannustin jatkuvalle tutkinnassa salvia mahdollisena diagnostinen indikaattori systeemiset sairaudet.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

Kuudesta kahdeksaan viikon ikäiset DBA /2-hiirten ja C57BL /6-hiiriä hankittiin Jackson laboratorio (Bar Harbor, ME) ja sijoitettu Division Laboratory Animal Medicine (DLAM) at University of California at Los Angeles. Kokeelliset protokollat ​​hyväksyi kanslerin Animal tutkimuskomitea (ARC), University of California at Los Angeles (UCLA).

Solulinjat

hiirisolulinjoja KLN-205 ja B16-F1 saatiin American Type Culture Collection (ATCC). KLN-205 on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinja perin vuonna DBA /2-hiirissä. Soluja viljeltiin MEM (GIBCO). Ja B16-F1, joka on C57BL /6-johdetut melanoomasolulinja, pidettiin DMEM: ssä (GIBCO) [34]. Kaikki solut pidettiin ilmakehässä 5% CO2, 37 ° C: ssa.

In vivo

kasvainmalleissa

Melanooma hiirimallissa indusoitiin ihonalaisella (sc) injektiolla 1 x 10

5 B16-F1 solua 0,1 ml: aan PBS alempaan oikeaan kylkeen C57BL /6 hiirillä. Keuhkosyöpä kautta luotiin s.c. injektio 2 x 10

5 KLN-205 soluja DBA /2-hiiri [34], [35]. Kontrollieläimiin injektoitiin pelkkää PBS: ää. Olevien kasvainten havaittiin jälkeen 2-3 viikkoa (Fig. 1).

kokoelma hiiren syljen, veren ja kasvainkudoksen

Kun kasvaimet saavuttivat 15 mm halkaisijaltaan sylkeä kerättiin ja hiiret uhrattu. Lievä indusoitiin lihakseen (IM) injektion 1 ul /painokilo liuosta, joka sisältää 60 mg /ml ketamiinia (Phoenix Scientific, St. Joseph, MO) ja 8 mg /ml ksylatsiinia (Phoenix Scientific). Hiiret injektoidaan subku- pilokarpiini (0,05 mg pilokarpiini /100 g ruumiinpainoa) välillä korvat stimuloidun syljen eritystä. Sylki saatiin suuontelon mikropipetillä ja laitettiin välittömästi ennalta jäähdytetty 1,5 ml: n mikrosentrifugiputkiin.