Krooninen sairaus

tiivistelmä

Anemia syöpä (AC) voi myötävaikuttaa syöpään liittyvien väsymys ja heikentää elämänlaatua. Parempi ymmärrys patogeneesin AC voisi helpottaa parempaa hoitoa, mutta eläinmalleja tutkia AC puuttuvat. Olemme tunnettu neljä syngeneeisissä C57BL /6 hiiri syöpiä, jotka aiheuttavat AC. Hiiret kahdella erilaisella nopeasti kasvava metastaattinen keuhkosyövässä kehittänyt ominaisuus havainnot anemia tulehduksen (AI), jossa on dramaattisesti eriasteisia anemia. Hiiret, joissa nopeasti kasvava metastaattinen melanooma myös kehittänyt vakava anemia 14 päivää, ja hematologinen ja tulehduksellinen samanlaisia ​​parametrejä AI. Hiiret, joissa on hitaasti kasvava vatsakalvon munasarjasyöpään kehittänyt raudanpuutosanemiaa, todennäköisesti pitkään kroonisesti heikentynyt ravitsemukseen ja verenvuotoa vatsaonteloon. Neljästä mallia, hepcidin mRNA kohoamiseen vain mietojen keuhkosyövän malli. Toisin kuin mallimme systeemisen tulehduksen aiheuttama lämmöllä tapettuja

Brucella abortus

, ablaatio hepcidin että munasarjasyöpä ja miedompi keuhkosyöpä hiirimalleihin ei vaikuttanut vakavuus anemia. Hepcidin-riippumattomien mekanismien tärkeä rooli näissä hiirimalleissa AC.

Citation: Kim A, Rivera S, Shprung D, Limbrick D, Gabayan V, Nemeth E, et al. (2014) Mouse mallit Anemia of Cancer. PLoS ONE 9 (3): e93283. doi: 10,1371 /journal.pone.0093283

Editor: Kostas Pantopoulos, Lady Davis instituutti Medical Research /McGill University, Kanada

vastaanotettu: 20 joulukuu 2013; Hyväksytty: 28 helmikuu 2014; Julkaistu: 28 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH Pulmonary Critical Care Institutional Training Grant T32 (HL072752) AK, 09/2008 – 06/2011; ja Roche Foundation for Anemia Research TG. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: T.G. ja E.N. ovat cofounders, osakkeenomistajia ja virkamiehet Luonnostaan ​​LifeSciences, kehittävä yritys hepcidin diagnostiikkaa. E.N. ja T.G. patentteja, jotka liittyvät terapeuttiseen käyttöön hepcidin ja sen sääntelyviranomaisten. Katso alta patentteja yksityiskohdat, mukaan lukien nimet ja numerot: 1) Kilpailukykyinen asetus Hepcidin mRNA Liukoinen ja Cell-Associated Hemojuvelin (Ganz, Lin, Goldberg) US-patentti no. 7534764, julkaisuhetken 19 toukokuu 2009 2) Mini-Hepcidin peptidit ja menetelmät käyttäminen sen (Ganz, Nemeth, Preza, Ruchala) US-patentti no. 8435941, julkaisuhetken 07 toukokuu 2013 3) Ennen: Erythroferrone ja ERFE Polypeptidit ja menetelmät Regulating Iron Metabolism (Ganz, Nemeth) PCT-patenttihakemus nro PCT /US2013 /67771. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Anemia on hämmästyttävän yleinen komplikaatio syöpä, esiintyy 30% hoitamattomista potilaista [ ,,,0],1]. Anemian esiintymistiheys on edelleen kasvanut syövän hoidossa, mukaan lukien kemoterapia ja säteily. Anemia syöpä (AC) korreloi huonon WHO suorituskykyluokan ja elämänlaatua [2], [3]. Tehokas hoito AC vähentää subjektiivinen väsymystä syöpäpotilailla [4]. Sen lisäksi, että vaikutukset elämänlaatuun, läsnäolo AC voi olla itsenäinen negatiivinen ennustetekijä [5].

etiologia AC on monitekijäinen ja todennäköisesti vaihtelee alkuperän primaarikasvaimen, samoin koska kroonisuusaste taudin prosessia. Tärkeitä vaikuttavia tekijöitä ovat raudanpuute toissijainen verenvuotoa tai ravitsemukselliset puutteet [6], hemolyysi takia immuuni ilmiöitä, aktivointi hyytymistä laskeutuu tai epänormaali kasvaimeen liittyvää verisuonistossa [7], heikentynyt erytropoieesin toissijainen välttävä erytropoietiinin tuotantoa tai masentunut vaste erytroidiydintä erytropoietiinialtistus [8], ja suora hyökkäys luuytimen kasvainsolujen kanssa häiriöitä erytropoieettisten ympäristön. Erityisen tärkeä tekijä AC on tulehdus, AC on monia samoja ominaisuuksia anemia tulehduksen (AI). AI on normocytic, normochromic anemian lyhennetty punasolujen elinikä ja masentunut erytropoieesia. AI on myös ominaista häiriintyneisyys systeemisen raudan homeostaasin ominaista hypoferremia ehjät rautavarastojen [9] ja laski saatavuus raudan punasolujen tuotantoa.

Hepcidin, 25 aminohapon peptidi hormoni pääasiassa maksasolujen [ ,,,0],10], on ensisijainen säätelijä raudan homeostaasin terveys- ja tulehduksen aikana [11]. Hepcidin toimii sitoutumalla ferroportin, ainoa tiedossa solu rauta viejä, näkyy solujen pinnalla, jotka toimittavat rauta plasman: makrofagien, maksasoluissa ja enterosyyttien. Hepcidin sitoutuminen ferroportin johtaa ferroportin endosytoosin ja hajoaminen [12], liikkumisen rajoittamisessa raudan plasmaan ja siten vähentää raudan saatavuutta erytropoieesia. Tulehduksen aikana, hepcidin ilmentyminen indusoituu voimakkaasti, suurelta osin IL-6 [13] kautta, JAK-STAT-reitin [14] – [16], ja tämä hepcidin ylimäärä ajatellaan edistää AI. Mielenkiintoista on, että IL-6 on todettu lisättävä useita kasvaimen tyypit, mukaan lukien keuhkosyöpä, [17] ja munasarjasyöpä [18]. Se, missä määrin lisääntynyt hepcidin tuotanto edistää AC ei ole suoraan testattu geneettinen ablaatio hepcidin, osittain koska vähäisyys hiirimalleissa AC.

Huolimatta korkea esiintyvyys AC sen kielteisiä vaikutuksia laatuun elämän ja selviytymisen, harvat eläin on kehitetty sen tutkimusta. Olemme tunnettu neljä syngeenisiin C567BL /6 hiiren mallia syövän: kaksi nopeasti kasvava malleja keuhkosyöpä, yksi nopeasti kasvava malli melanooma, ja yksi hitaasti kasvava malli munasarjasyöpää. Jälkeen kattava tarkastelu hematologisia, rautaa, ja tulehduksellinen parametrit näiden mallien, tutkimme laajuus hepcidin osallistumista kehittämiseen AC kahdessa näistä malleista vertaamalla C57BL /6-hiiriin hepcidin hiirten saman kannan taustalla.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläin työ ja hoito tehtiin suuntaviivojen mukaisesti ja University of California, Los Angeles (UCLA) kanslerin animal tutkimuskomitea (ARC) . Erityisellä hyväksynnällä hiiren kokeiluja saatiin protokollan # 2008-129-12 otsikolla ”rooli IL-6 ja hepcidin anemia syövän.” Kaikki kohtuullisin pyrittiin parantamaan kärsimystä, mukaan lukien anestesia kivuliaita menettelyjä.

eläinmallit anemia syövän

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin animal tutkimuskomitea Kalifornian yliopistossa, Los Angeles (UCLA). 6 viikon ikäisiin C57BL /6J-hiiret saatiin Charles River Laboratories (Wilmington, MA) tai Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Kolmen nopeasti kasvava syöpä malleja, uros ja naaras villityypin (WT) hiiret pantiin rauta-riittävä ruokavalio (20 ppm rautaa, Harlan Teklad, Indianapolis, IN) 2 viikkoa ennen injektiota kasvainsolujen tai suolaliuosta. Samaa ruokavaliota käytettiin läpi kokeen loppuajan. Tämä ruokavalion ilmastointi sovellettiin koska korkea rautapitoisuus standardin chow (noin 7-8 kertaa päivässä vaatimus) lisää merkittävästi hepcidin ilme ja tekee sen reagoimatta tulehduksellisten ärsykkeiden [19]. Lisäksi ravinnon raudan imeytymistä hiirillä osuus peräti 50% päivittäisestä raudan valovirran hiirillä ruokitaan standardin Chow, mutta vain ~5-10% ihmisellä [20]. Tämä lisääntynyt ravinnon raudan imeytymistä hiirillä voi vähentää suhteellinen osuus raudan kierrätys makrofagien [21] ja johtaa progressiivinen rauta lastaus. Näin ollen, vähentää ravinnon rautapitoisuus hiiren Chow on suunniteltu mallintamaan rauta virtaamista ihmisen homeostaasin. Sillä hitaasti kasvava malli munasarjasyövän, naispuolinen hiiriä ylläpidettiin rauta-riittävä ruokavaliossa joko 20 ppm rautaa tai 50 ppm rautaa.

Voit luoda metastasoitunut keuhkosyöpään malli, eläimiin injektoitiin intraperitoneaalisesti (IP ), jossa on 0,1 x 10

6-0,5 x 10

6 hiiren TC-1 tai Lewis-keuhkokarsinooma (LLC) soluihin (ATCC, Manassas, VA). Koska nämä ovat etäpesäkekasvainten soluja, ja tutkivat systeemisen näitä syöpiä, päätimme suorittaa vatsaonteloon injektioita sijaan inkuboimalla kasvainsoluja niiden ensisijainen elin. LLC-soluja viljeltiin, kuten tarttuneet solut Dulbeccon modifioidussa Eagle Media (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini G-streptomysiiniä, ja TC-1-soluja viljeltiin, kuten tarttuneet solut RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini G-streptomysiiniä. Päivänä hoidon, kasvaimen solut suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), laskettiin hematosytometrillä, ja injektoidaan tilavuudessa 500 ui PBS: ää. Verrokkihiiret injektoitiin IP 500 ui PBS: ää. Hiiret lopetettiin klo 13-15 päivä, ja veri, maksa ja perna kerättiin ruumiinavauksen yhteydessä.

hiirimallissa metastaattisen melanooman, eläimiin injektoitiin IP 0,1 x 10

6-0,3 x 10

6 B16-F10-solut (ATCC, Manassas, VA). B16-F10-soluja viljeltiin, kuten kiinnittyneitä soluja DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini G-streptomysiiniä. Päivänä hoidon, kasvaimen solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään, laskettiin hematosytometrillä, ja injektoidaan tilavuudessa 500 ui PBS: ää. Verrokkihiiret injektoitiin IP 500 ui PBS: ää. Hiiret lopetettiin 14. päivänä, ja veren ja maksan kerättiin ruumiinavauksen yhteydessä.

vatsakalvonsisäisesti levitetään munasarjasyöpä, eläimiin injektoitiin IP 1 x 10

6 ID8 soluja, jotka oli jalomielinen lahjoitus tohtori Oliver Dorigo. Metastaattista ID8 solulinja oli peräisin spontaanista pahanlaatuisiksi C57BL /6 hiiren munasarjojen pinnan epiteelisolujen

in vitro

[22]. Soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini G-streptomysiiniä. Päivänä hoidon, kasvaimen solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään, laskettiin hematosytometrillä, ja injektoidaan tilavuudessa 500 ui PBS: ää. Verrokkihiiret injektoitiin IP 500 ui PBS: ää. Hiiret lopetettiin 18,5 viikkoa.

roolin tutkimiseksi hepcidin anemiaan syövän, käytimme uros ja naaras hepcidin-1 Knockout (HKO) hiirien TC-1 malli, ja naisen HKO hiirien ID8 malli. HKO hiiret alunperin laboratorioomme Dr. Sophie Vaulont [23] ja olivat takaisinristeytettiin päälle C57BL /6 taustalla kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Tämän osan tutkimuksen HKO hiirillä tehtiin ravinnon ilmastointi kehittymisen estämiseksi raudan ylikuormitus ja ylläpitää raudan tasoja, jotka ovat verrattavissa WT-hiirissä. Tällä vieroitettaessa, HKO hiiret aloitettiin alennettu-rauta ruokavaliot (4 ppm tai 20 ppm) noin 2 viikkoa estää massiivinen rauta lastaus ominaisuus tämän hiiressä. Siitä lähtien, kun injektion jälkeen hiiret pidettiin yllä 20 ppm rautaa ruokavalioon tutkimuksen loppuajan. Varten TC-1 malli, HKO hiiriin injektoitiin ja lopetettiin kuten edellä on kuvattu, että WT-hiirissä. Sillä ID8 malli, HKO hiiret lopetettiin klo +16,5viikko.

mittaus rautaparametrit ja erytropoietiinin

Seerumin rauta ja maksan ei-hemin raudan pitoisuudet mitattiin kolorimetristä määritystä varten rauta (Sekisui Diagnostiikka, Lexington, MA) kuten aiemmin on kuvattu [20].

hematologinen tutkimukset

Täydellinen verenkuva saatiin kanssa HemaVet verianalysaattoria (Drew Scientific, Waterbury, CT). Arvioida rauta-rajoitettu erytropoieesin sinkkiprotoporfyriini (ZPP) mitattiin käyttämällä hematofluorometer (AVIV, Lakewood, NJ). Retikulosyyttien laskettiin virtaussytometrialla. Blood (5 ui) lisättiin 1 ml: aan tiatsolioranssi PBS: ssä, jossa oli 0,1% natriumatsidia (PBS-atsidi, BD Bioscience, San Jose, CA) ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1-3 tuntia. Kuten värjäämätön ohjaus, verta lisättiin PBS-atsidi ilman tiatsolioranssi. Prosenttiosuus puna-fluoresoiva retikulosyyttien (retic%), mitattiin virtaussytometrillä UCLA Jonsson Kattava Cancer Center (JCCC) ja Center for AIDS Research virtaussytometria Core Facility joka tukee National Institutes of Health palkintoja CA-16042 ja AI -28697, ja jonka JCCC, UCLA aIDS Institute, ja David Geffen School of Medicine UCLA. Unstained valvonta käytettiin luomaan portti jättää taustan fluoresenssi. Tulokset ilmaistaan ​​retikulosyyttien tuote index: RPI = retic% × Hgb /lähtötilanteessa Hgb.

RNA: n eristys ja reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

Yhteensä RNA eristettiin maksasta ja analysoitiin real -aika RT-PCR, kuten aiemmin on kuvattu [25].

Hiiren β-aktiini käytettiin housekeeping mRNA ohjaus. Alukkeita luetellaan taulukossa S1.

Histocytopathology

Perifeerisen veren tahroja tehtiin käyttämällä 10 ui kokoverta aikaan ruumiinavauksessa, ja valmistettu Wright-Giemsa tahra (Fisher, Hampton, NH) .

tilastot

SigmaStat käytettiin kaikkiin tilastolliset analyysit (Systat Ohjelmistoa, Richmond, CA). Sillä melanooma, keuhkosyöpä, ja hepcidin KO malleja, normaalijakaumaa tietoja verrattiin käyttämällä Student

t

-testi. Mittauksia, jotka eivät normaalisti jakautunut verrattiin jonka nonparametric Mann-Whitney Rank Sum testi. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. ID8 villityypin hiiren data analysoitiin aluksi käyttäen Kaksisuuntainen ANOVA, jossa ID8 /fysiologista suolaliuosta ja ruokavalio rautaa kuin kaksi muuttujaa, jotka vaikuttavat lopputulokseen. Tämä tilastollinen analyysi ei osoittanut merkittävää vuorovaikutusta näiden kahden tekijän välillä muuttujien. ID8 Villityypin tiedot esitetään käyttämällä Student

t

-testi parametrisissa datan, ja Mann-Whitneyn rank sum testi epäparametrisia tietoja. Korrelaatio mittaukset saatiin Pearson korrelaatio.

Sekä mies- WT ja HKO hiiriä käytettiin kolmen nopeasti kasvava syövän hiirimalleissa. Analyysi keskeisten hematologisista parametrit, mukaan lukien hemoglobiini ja seerumin rauta, osoitti, että ei ollut merkitsevää eroa uros- ja naarashiirillä. Siten esitämme yhdistetyn miehen ja naisen tiedot.

Tulokset

Hiiret metastasoitunutta keuhkosyövässä kehittää anemian retikulosytoosi ja raudan rajoitus

syntyy kaksi mallia metastaattisen keuhkosyövän ruiskuttamalla syngeenisiä syöpäsolulinjoissa, TC-1 ja LLC, osaksi vatsaonteloissa hiirillä. Kontrollihiiret saivat PBS: ää. Ennen eutanasiaa 14 d injektion jälkeen kaikki kasvain hiirillä näkyy oireita systeemisiä sairauksia toissijainen kasvain kuormaa, kuten uneliaisuus, huono hoito, ja askites. Ruumiinavaus paljasti vatsaonteloon massat useimmissa hiirillä. Hemoglobiini oli pienempi kasvain hiirillä verrattuna kontrolleihin (Kuva. 1 A) (LLC 7,8 g /dl vs. PBS 15,6 g /dl, P 0,001, TC-1 14,2 g /dl vs. PBS 15,6 g /dl, P = 0,029). Aneeminen kasvain hiirillä oli lisääntynyt retikulosytoosi verrattuna kontrolleihin (Kuva. 1 B) (RPI LLC 10,7 vs. PBS 2,4, P 0,001, TC-1 6.1 vs. PBS 2,4, P 0,001). On huomioitava, että LLC hiirillä oli pienempi hemoglobiiniarvot kuin TC-1-hiiret (P 0,001) ja suurempi retikulosytoosi (P = 0,006).

C57BL /6-hiiriin ruiskutettiin intraperitoneaalisesti 0,1 × 10

6 -0,5 x 10

6 hiiren TC-1 tai Lewis-keuhkokarsinooma (LLC) solut ja lopetettiin sen jälkeen, kun 14 päivää. Verrokkeihin verrattuna, joilla oli kasvain hiirillä on: (A) vähentynyt hemoglobiini; (B) kasvoi retikulosytoosi. N = 8-19 hiirtä per käsittely ja kontrolliryhmään. * P 0,05, ** P 0,001; P Mann-Whitneyn rank sum testi. Baarit ja virhepalkkeja ovat mediaani ± 75

th /25

persentiili.

Kun riittävästi rautaa on saatavilla erytropoieesia, kohonneeseen sinkki sisällytetään protoporfyriinien rengas. Siksi sinkkiprotoporfyriini (ZPP) tasot ovat hyvä indikaattori rauta-rajoitettu erytropoieesin [26]. ZPP tasot tuumoreita kantavaa hiirtä lisättiin kontrolleihin verrattuna, mikä osoittaa, rauta-rajoitettu erytropoieesia (Fig. 2A) (LLC 160 vs. PBS 84, P 0,001, TC-1 136 vs. PBS 84, P 0,001). LLC hiirillä oli trendi kohti korkeampia ZPP tasoa kuin vähemmän aneeminen TC-1 hiirissä (p = 0,129). Kasvain hiirillä oli hypoferremia kuten on osoitettu seerumin raudan määritys (Fig. 2B) (LLC 11,5 umol /l vs. PBS 39,8 umol /L, P = 0,004, TC-1 20,8 umol /l vs. PBS 39,8 umol /L , P = 0,031). Sen määrittämiseksi, onko tämä johtui raudan sitomiseen, kuten olisi nähtävissä anemia tulehduksen sijasta raudanpuutosanemiaa toissijainen aliravitsemuksen tai verenvuotoa, yhteensä rautavarannot arvioitiin käyttäen maksan ja pernan kudosta rauta mittaukset. Molemmat keuhkojen kasvain malleissa oli suurempi maksan nonheme rautapitoisuus kuin valvonta (Fig. 2C) (LLC 8,9 umol Fe /g vs. PBS 1,5 umol Fe /g, P 0,001, TC-1 3.9 umol Fe /g vs. PBS 1,5 umoolia Fe /g, P = 0,002). LLC hiirillä oli myös korkeampi perna nonheme rautapitoisuus kuin valvontaa, ja TC-1 hiirillä oli verrattavissa perna rautapitoisuus (Fig. 2D) (LLC 15,9 umol Fe /g vs. PBS 10,4 umol Fe /g, P = 0,039).

C57BL /6-hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti TC-1 tai LLC-solut ja lopetettiin sen jälkeen, kun 14 päivää. Sekä kasvain hiiri mallit osoittavat: (A) kohonneita ZPP tasoja kontrolleihin verrattuna, mikä osoittaa rauta-rajoitettu Hemi synteesiä; (B) hypoferremia; (C) lisääntynyt maksan rauta. (D) LLC-kantavien hiirten ovat lisääntyneet perna rautaa, ja TC-1-hiirille on lisääntymässä perna rauta, TC-1 vs. PBS, P = 0,381. N = 8-19 hiirtä per käsittely ja kontrolliryhmään. * P 0,05, ** P 0,001; P Mann-Whitneyn rank sum testi. Baarit ja virhepalkkeja ovat mediaani ± 75

th /25

persentiili.

Hiiret metastasoitunutta keuhkosyövässä ilmeinen tulehdus, mutta hepcidin lisääntyy vain lievempiä malli

jotta voitaisiin arvioida osuus tulehduksen ja hepcidin toiminnan kehittämiseen anemian meidän syövän malleista, mittasimme maksan mRNA pitoisuudet SAA-1 ja hepcidin. SAA:-1 on maksan akuutin faasin reaktantti, jonka tiedetään lisätään vasteena tulehduksen ja tiettyjen sytokiinien, erityisesti IL-6 [27]. Kuten IL-6 uskotaan olevan tärkeä syy anemian tulehdusta indusoimalla hepcidin ilmaisun [19], käytimme SAA-1 mittausta indikaattorina IL-6: n aktiivisuuden. Päivänä 14, sekä TC-1 ja LLC-hiirissä oli kohonneet maksan VAS:-1-mRNA: n tasoja kontrolleihin verrattuna (Fig. 3A). LLC hiirillä oli 75-kertainen lisäys yli PBS-hiiret (P = 0,001), ja TC-1-hiirissä oli 340-kertainen nousu (P = 0,002). Päivänä 14, lievästi aneeminen TC-1-hiirissä oli lievästi kohonneita maksan hepcidin mRNA-tasot verrattuna kontrolleihin ( 2 x, P = 0,012) (kuvio 3B), kun taas voimakkaammin aneemisten LLC hiirillä oli pienempi hepcidin tasoa (P = 0.022), ehkä koska counterregulatory vaikutus hepcidin kohtalainen anemia ja tuloksena erytropoieettiset ärsyke [28]. Arvioida vaikutuksen tulehduksen hepcidin mRNA: n ekspression, arvioimme korrelaation SAA-1-mRNA: n ja vastaavat hepcidin mRNA-tasot yksittäisissä hiirissä, mutta korrelaatio oli heikko [tietoja ei näytetty]. Huolimatta paljon korkeampi SAA-1 tasot on kasvain kuin verrokeilla, mikä viittaa kasvaimen aiheuttama tulehdus, hepcidin mRNA pitoisuudet eivät nousseet suhteellisesti TC-1-kantavaa hiirtä ja olivat jopa väheni LLC kantavien hiirten. Nämä tiedot viittaavat siihen, että muut tekijät voivat vaikutusten lieventämiseksi tulehdusta hepcidin synteesiin, ja nämä voivat sisältää anemia ja runsas punasolujen.

Päivään 14, (A) sekä kasvainmuodoista ovat kohonneeseen maksa SAA-1 mRNA ; (B) TC-1-hiirille on lisääntynyt maksan hepcidin mRNA-tasot verrattuna kontrolleihin, ja LLC-hiirissä, on vähentynyt hepcidin. N = 8-19 hiirtä per käsittely ja kontrolliryhmään. * P 0,05; P Mann-Whitneyn rank sum testi. Baarit ja virhepalkkeja ovat mediaani ± 75

th /25

persentiili.

Hepcidin mRNA mitattiin myös kasvaimissa onko kasvain hepcidin ilmaisua voidaan edesauttamaan anemian syövän. Kumpikaan TC-1 eikä LLC kasvaimia oli havaittavissa hepcidin ilmaus, mikä osoittaa, että nämä kasvaimet eivät suoraan osaltaan systeemisiä hepcidin tasolle.

Hiiret melanooma kehittyy anemia rauta-rajoitettu punasolujen ja tulehdus

seuraavaksi syntyy hiirimallissa metastaattisen melanooman ruiskuttamalla melanoomasolulinjaa, B16-F10, osaksi vatsaonteloissa hiirillä. Kontrollihiiret saivat PBS: ää. Ennen eutanasiaa 14 d injektion jälkeen kasvain hiirillä näkyy oireita systeemisen sairauden ja kasvaintaakkaa, kuten uneliaisuus ja askites. Täydellinen verenkuva analyysi paljasti selvästi anemiaa melanooman hiirillä verrattuna kontrolleihin (Kuva. 4A) (B16-F10 Hgb 8,2 g /dl vs. PBS Hgb 15,6 g /dl, P 0,001). Kasvain hiirille kehittyi vankka retikulosytoosi 4 × että heidän valvonnassaan kollegansa (Fig. 4B). Melanooma hiiret osoittivat merkittäviä rauta-rajoitettu punasolujen kanssa 2-kertainen nousu ZPP arvoja verrattuna kontrolleihin (Kuva. 4C).

C57BL /6-hiiriin ruiskutettiin intraperitoneaalisesti 0,1 × 10

6 -0,3 x 10

6 B16-F10-solut, ja lopetettiin 14 päivän jälkeen. Melanooma-hiirille kehittyy: (A) merkittävä anemia; (B) nousi retikulosytoosi kontrolleihin verrattuna; (C) kohonnut sinkkiprotoporfyriini (ZPP) tasot kontrolleihin verrattuna, mikä osoittaa rauta-rajoitettu Hemi synteesiä; (D) kohonnut maksan VAS:-1-mRNA: n, joka on tulehduksen ja IL-6: n aktiivisuuden; (E) alhaisempi hepcidin mRNA. N = 8-11 hiirtä per käsittely ja kontrolliryhmään. * P 0,05, ** P 0,001; P Mann-Whitneyn rank sum testi. Baarit ja virhepalkkeja ovat mediaani ± 75

th /25

persentiili.

Päivänä 14, melanooma hiirillä oli dramaattinen kasvu ( 600-kertaisesti) SAA- 1-mRNA verrattuna kontrolleihin, osoittaen vankka tulehdus (Fig. 4D). Hepcidin mRNA-tasot vaimennetaan kasvaimen hiirissä verrattuna kontrolleihin (Kuva. 4E). Koska tämä kasvain aikaansai anemian hyvin samankaltainen aiheuttama metastasoitunut LLC keuhkosyöpä, sen vaikutus rauta homeostaasiin ei luonnehdittu edelleen.

Hiiret munasarjasyövän kehittää raudan puute anemia

Analysoimme myös anemian kehittymisen hiirillä, joilla on hitaasti kasvava munasarjasyövän ruiskuttamalla syngeenisiä munasarjasyövän solulinja ID8 osaksi vatsaonteloissa hiirillä. ID8 suihkutuksella ja PBS-ruiskutetaan ohjaus hiiret tapettiin 18,5 viikkoa kuluttua injektion. Tällä hetkellä kaikki on kasvain näkyy oireita systeemisiä sairauksia, kuten uneliaisuus, huono hoito, ja askites. Ruumiinavaus paljasti näkyvä vatsaonteloon massat suurin osa hiirten verinen askiitteina monia. Hemoglobiini oli alhaisempi kasvaimen kantavien hiirten verrattuna kontrolleihin (Fig. 5A) (ID8 10,4 g /dl vs. PBS 11,25 g /dl, P = 0,040). PBS hiiret itse oli kohtalaisen hemoglobiiniarvojen aleneminen, todennäköisesti seurauksena jolla ruokittu alennetuin rauta ruokavalio 18 viikon ajan. Kasvainta kantavissa hiirissä oli kohonneet ZPP tasoja kontrolleihin verrattuna, mikä osoittaa, rauta-rajoitettu erytropoieesia (Fig. 5B) (ID8 162 vs. PBS 129, P = 0,008). Yhteensä rautavarannot arvioitiin käyttäen maksan ja pernan kudosta rauta mittaukset. ID8 kantavien hiirten oli alhaisemmat maksan ja pernan rautapitoisuus kuin valvonta (Fig. 5C, D) (ID8 maksa rauta 8,1 umol Fe /g vs. PBS maksan rauta 14,9 umol Fe /g, P = 0,041; ID8 perna rauta 63,1 umol Fe /g vs. PBS perna rauta 138,5 umol Fe /g, P = 0,011). Siten tämä munasarjakasvain malli kehittyy anemia Frank raudanpuute, todennäköisesti osittain toissijainen verenvuotoa vatsaonteloon ja heikentynyt ravinto.

C57BL /6-hiiriin ruiskutettiin intraperitoneaalisesti 1 x 10

6 ID8 soluja ja eutanasia jälkeen 18,5 viikkoa. Verrokkeihin verrattuna, ID8 kantavien hiirten: (A) ovat aneeminen; (B) ovat kohonneet ZPP tasolla; (C, D) on pienempi maksan ja pernan rauta tasolla. N = 10-16 hiirtä per käsittely ja kontrolliryhmään. * P 0,05, ** P 0,001; P Mann-Whitneyn rank-sum test (A, B) tai opiskelija

t

-testi (C, D). Baarit ja virhepalkkeja ovat mediaani ± mediaani ± 75

th /25

persentiili (A, B) tai keskiarvo ± SD (C, D).

Hiiret munasarjasyövän on tukahdutetaan hepcidin tasot vasteena maksan rautavarastojen

18,5 viikkoa, ID8 hiirillä oli masentunut maksan hepcidin mRNA-tasot verrattuna kontrolleihin (Fig. 6A) (ID8 0,20 vs. PBS 14,08, P = 0,013), samoin vertailukelpoisina SAA-1 tasot kontrolleihin (Kuva. S1) (P = 0,361), mikä osoittaa, että tulehdus ja hepcidin ei pelata merkittävä rooli kehittämistä tämän anemia. Lisäksi kuvio 6B esittää merkittävä positiivinen korrelaatio hepcidin ja maksan rauta tasoja, mikä osoittaa asianmukaisen hepcidin tukahduttaminen kehittämisen kanssa raudanpuutosanemiaa tässä munasarjakasvain malli (ID8 hepcidin vs. maksan rauta, R

2 = 0,64 , P = 0,017).

18,5 viikkoa, ID8 kantavien hiirten kontrolleihin verrattuna ovat (A) tukahdutetaan hepcidin mRNA; (B) merkittävä positiivinen korrelaatio maksan rautavarastojen ja hepcidin mRNA: n ilmentymisen. N = 11-16 hiirtä per käsittely ja kontrolliryhmään. * P 0,05; P Mann-Whitney Rank Sum -testi (A), ja Pearson korrelaatio in (B). Baarit ja virhepalkkeja ovat mediaani ± 75

th /25

persentiili.

kehitys anemian hiiren kasvain malleja ei ole toissijainen mikroangiopaattinen hemolyysin

luettelo mahdollisista syistä anemiaa syövän malleissa sisältää mikroangiopaattinen hemolyysiä tai leikkaamista punasolujen, mikä näkyy myös tulehdussairauksien anemias [6]. Perifeerisen veren tahroja kasvaimen kantavien hiirten ei osoittanut schistocytes tai punasolujen fragmentteja. Kuvio 7B esittää lähes normaali verisivelyvalmisteeseen TC-1 malli, minimaalisella kalvo väärinkäytöksiä. Kuviot 7C ja 7D osoittavat, että mitä enemmän aneeminen LLC ja ID8 malleissa ei ole ankarampaa punasolujen poikkeavuudet, kuten pisaran solut ja keskus- kalpeus, mutta jälleen ilman merkittävä määrä schistocytes jotka tarkoittavat, mikroangiopaattinen hemolyysin anemiaa. [29]

(A) PBS (B) TC-1 (C) LLC (D) ID8.

Anemia ei heikennetty hepcidin-ablatoitu TC-1- tai ID8 kantavien hiirten

sen testaamiseksi, onko hepcidin mukana kehittämässä anemian kasvaimen kantavien hiirten, me injektoitiin kaksi kasvainsolulinjojen osaksi hepcidin hiirien. 14. päivänä sen jälkeen, TC-1 injektio, ei ollut merkittävää eroa hemoglobiinin lasku villityypin ja hepcidin poistogeenisiä hiiriä (Fig. 8A) (WT TC-1 -1,08 g /dl vs. HKO TC-1 -0,99 g /dl, P = 0,908). Vaikka TC-1-hiirissä oli lievästi kohonnut hepcidin, hepcidin ei selvästikään ole välttämätöntä kehittämistä tämän anemia. Yhdessä kasvaessa VAS-1 tasot, nämä tiedot viittaavat siihen, että hepcidin riippumattoman tulehduksellinen mekanismi anemia.

(A) Päivään 14, ei ole merkittävää eroa hemoglobiinin muutosten TC-1 -pitoista villityypin ja hepcidin hiirten (P = 0,908). (B) Absoluuttinen hemoglobiinitasot hiirten esitetyn A. (C) 18,5 viikkoina ei ole merkittävää eroa hemoglobiinin muutosten ID8 kantavien villin tyypin ja hepcidin hiirten (P = 0,739). (D) Absoluuttinen hemoglobiinitasot hiirten esitetty C. N = 4-19 hiirtä per käsittely ja kontrolliryhmään. P t-testillä. Baareja ja virhepalkit ovat keskiarvoja ± SD.

tutkia hepcidin ilmentyminen on kehittämiseen tarvittava raudan puutteen enemmän kroonisia malli, vertasimme kehitystä anemian WT ja hepcidin hiirten, joissa ID8 munasarjasyöpä. Tällä 18,5viikko, ei ollut merkitsevää eroa hemoglobiinin lasku villityypin ja hepcidin hiirten käsiteltiin ID8 (Fig. 8C) (WT ID8 -5,26 g /dl vs. HKO ID8 -4,50 g /dl, P = 0,739 ). Nämä tiedot vahvistavat havaintomme että ID8 kantavien hiiret kehittävät anemia vastauksena verenvuodon ja ravitsemukselliset raudanpuute sijasta hepcidin tulehdukselli- mekanismi.

Keskustelu

Anemia syöpä (AC) on usein unohdetaan mutta tärkeä osoitus pahanlaatuisuuden. Jopa lievä anemia on osoitettu vaikuttavan haitallisesti potilaiden raportoimaa elämänlaatu (QOL) parametrit [30]. Vaikka hemoglobiiniarvon lasku on vain yksi tekijä kehitettäessä masentunut QOL mittausten syöpäpotilailla, parantamista anemiaa on osoitettu olevan merkittävä ja suora korrelaatio yleisten QOL [31]. Paraneminen QOL anemiaa hoidossa säilyi riippumatta osittainen tai täydellinen vaste jollekin solunsalpaajahoito. Lisäksi AC on osoitettu olevan itsenäinen negatiivinen ennustetekijä varten elinaika syöpäpotilaiden [32].

Huolimatta haittavaikutusten AC, se on alle tunnustettu ja alihoidettuja lääkärit [33] , osittain siksi, ettei turvallisia ja tehokkaita hoitoja. Potentiaalisten hoitoja, punasolujen verensiirtoja liittyy immunosuppressiiviset vaikutukset, infektio siirto, ja verensiirtoon reaktioita [34]. Erytropoieesia stimuloivia aineita, kuten rekombinantti ihmisen erytropoietiini, on liittynyt korkeampi kuolleisuus potilailla, joilla pään ja kaulan alueen syöpä, rintasyöpä, ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [35]. Prekliinisissä pitäisi helpottaa kehittää turvallisempia ja tehokkaampia hoitoja.

harva kirjallisuudessa roolista hepcidin AC, on jonkin verran näyttöä siitä, että tulehdus ja lisääntynyt hepcidin pitoisuudet voisivat edistää AC. Butterfield et al. osoittivat, että seerumin hepcidin tasot olivat huomattavasti koholla ihmisen potilailla, joilla hematologisen tai ei-hematologinen syöpien, kuten melanooman ja keuhkosyövässä [36]. Toinen tutkimus aneemisten syöpäpotilaiden Ukarma et al. [37] osoitti käänteinen suhde hepcidin tasojen ja hemoglobiinin vaste epoetiini hoitoa. Tämä suhde epoetiini vastus ja lisääntynyt hepcidin osoittaa mahdollista roolia hepcidin mekanismiin AC kehitystä. Sasu et ai. edelleen kerrostunut aneeminen syöpäpotilaiden noihin on tulehduksellinen, sekoitetaan, ja rauta-puutos anemias käyttäen hematologiset parametrit ja C-reaktiivisen proteiinin tasot [38]. Tämä kerrostuminen osoitti, että tulehtunut potilailla oli korkeimmat seerumin hepcidin, jonka jälkeen potilailla, joilla on sekoitettu anemia. Myös suora korrelaatio tulehdus- markkereita (ferritiini ja CRP) ja hepcidin AC potilailla, mikä viittaa rooliin tulehduksen indusoiman hepcidin kasvu patogeneesissä AC osajoukko syövän potilaille, joilla on merkittävä tulehdus.

Olemme hiljattain julkaisi yksityiskohtaisen karakterisoinnin hiirimallissa, joka auttoi määrittelemään osuus hepcidin anemiaan tulehduksen (AI) [39].