Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kertyvät todisteet tukevat että kasvaimen kasvua ja syövän uusiutumisen ohjaavat syövän kantasoluja. Meidän edellinen työ on osoittanut, että on olemassa CD90

+ maksasyövän kantasoluja (CSCS) maksasolukarsinoomassa (HCC). Kuitenkin, ominaisuudet näiden solujen tunnetaan edelleen huonosti. Tässä tutkimuksessa käytimme herkempää RNA-sekvensoinnin (RNA-Seq) vertaamaan geeniekspressioprofilointi of CD90

+ solut lajiteltiin kasvain (CD90

+ CSCS) rinnakkaisella ei-tuumori- maksan kudoksissa (CD90

+ NTSCs) ja selventämään roolit otaksuttu kohdegeenien hepatokarsinogeneesin.

Menetelmät /Principal havainnot

CD90

+ solut lajiteltiin vastaavasti kasvain ja viereisen ei-tuumori- ihmisen maksakudoksissa fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelua. Vahvistetut RNA: t CD90:

+ soluja 3 HCC potilasta altistettiin RNA-Seq analyysi. Differentiaalinen geeniekspressioprofiili välille perustettiin CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs, ja validoitu kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) on samoja monistettu RNA: iden, ja edelleen varmistetaan erillisellä kohortin 12 HCC potilaista. Viisisataa geenit ilmentyvät differentiaalisesti (119 säädelty ja 381 alas geenien) välillä CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs. Gene ontologian analyysi osoitti, että yli-ilmentynyt geenien CD90

+ CSCS oli tulehdukseen, lääkeresistenssin ja rasva-aineenvaihduntaan. Niistä differentiaalisesti ilmentyvien geenien, glypikaani-3 (GPC3), jäsen glypikaaniperheen, oli merkittävästi koholla CD90

+ CSCS verrattuna CD90

+ NTSCs. Immunohistokemia osoitti, että GPC3 voimakkaasti ilmaistu neljäkymmentä kaksi ihmisen maksan tuumorikudoksista mutta puuttuu viereisen ei-tumorous maksan kudoksissa. Virtaussytometria osoitti, että GPC3 voimakkaasti ilmaistu maksassa CD90

+ CSCS ja kypsät syöpäsolujen maksasyövän solulinjoissa ja ihmisen maksan kasvain kudoksissa. Lisäksi GPC3 ilmentyminen korreloi positiivisesti määrä CD90

+ CSCS maksan tuumorikudoksissa.

Johtopäätökset /merkitys

Tunnistetut geenejä, kuten GPC3 jotka selvästi ilmaistu maksassa CD90

+ CSCS voidaan lupaavia geenin ehdokkaita HCC terapiassa aiheuttamatta vahinkoja normaalia maksan kantasoluja.

Citation: Ho DWY, Yang ZF, Yi K, Lam CT, Ng MNP, Yu WC, et ai. (2012) geeniekspressioprofilointi maksasyövän Stem Cells RNA-sekvensointi. PLoS ONE 7 (5): e37159. doi: 10,1371 /journal.pone.0037159

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 1. syyskuuta 2011; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2012; Julkaistu: toukokuu 14, 2012

Copyright: © 2012 Ho et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat rouva Li Ka Shing Fund of The University of Hong Kong, Hong Kong, Kiina. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Jotkut kirjoittajat työskentelevät kaupalliset yhtiöt. Zhen Fan Yang työskentelee AstraZeneca Global R Kang Yi, Zhixiang Yan, Hang Liu ja Yong Zhang ovat työntekijöitä BGI-Shenzhen. Tämä ei muuta kirjoittajat noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on viidenneksi yleisin syöpä maailmassa, joilla on korkea kuolleisuus korko [1]. Useimmat HCC potilaat läsnä edennyt pitkälle, mikä on tulenkestävä kemoterapiaa ja sädehoitoa [2], [3]. Lisäksi uusiutui tämä sairaus on erittäin korkea, kun parantavaa hoitoa [4]. Ymmärtäminen mekanismi syövän on keskeinen hallintaan HCC [5].

Lines todisteet ovat paljastaneet ja merkityksen syövän kantasoluja (CSCS) karsinogeneesis- viime vuosikymmeninä. CSCS pidetään juuri syöpien, ja ovat vastuussa kasvaimen kasvua ja erilaistumista heterogeeninen solupopulaatioiden kasvaimiin [6]. Lisäksi niiden on osoitettu olevan solunsalpaajaresistentti [7] ja säteilyresistenteille [8]. Edellisessä tutkimuksessa käyttäen pintamerkkiaine CD90 (Thy-1, ilmaistu maksan kantasoluja /esisolut), maksa CSCS tunnistettiin HCC solulinjoissa, kasvain näytteet ja ääreisverenkierron näytteitä HCC potilaiden ja nämä CD90

+ CSCS näyttöön tuumorigeenistä kapasiteetti [9].

Koska kapasiteetin kasvaimien, erilaistumista itseuudistumisen ja chemoresistance maksan CD90

+ CSCS säätelevät niiden erottavat geneettinen meikkiä ja joukko geenin ilmentymisen muutoksia biologisissa prosesseja, selvittäminen niiden molekyyliprofiilin on tärkeää ymmärtää ominaisuudet näiden solujen. Kuitenkin kattava geeniekspressioprofilointi maksan CSCS on vielä määrittämättä.

Viimeisten vuosikymmenten aikana, cDNA mikrosiru on laajasti käytetty tunnistamaan ero geeniekspressioprofiilien monissa syövissä seulontaan, ennusteen ja kasvaimen Luokitusten [10] – [13]. Kuitenkin cDNA microarray kärsii luontaisista rajoituksista, kuten alhainen herkkyys, alhainen dynaaminen vaihtelee [14], ja hybridisaatio esineitä [15]. Itse asiassa suurin osa geenien biologisissa prosesseissa, kuten ne, jotka koodaavat transkriptiotekijöiden ja signaalimuuntajia, yleensä ilmentävät alhaisella tasolla [16]. Näin ollen, cDNA microarray ei voi olla ihanteellinen työkalu hahmotella molekyyli polkuja. Tässä tutkimuksessa käytimme seuraavan sukupolven RNA sekvensointi (RNA-Seq), hyödyntää sen erinomaisen herkkyyden ja kyettävä havaitsemaan silmukointivarianteista, sekvensoida koko transcriptomes maksan CD90

+ CSCS ja CD90

+ non -tumorous kantasolut (NTSCs) kolmen HCC potilaista. Differentiaalinen geenien ilmentymistä tutkittiin näiden kahden ryhmän CD90

+ solujen ja tulokset todensi kvantitatiivisen RT-PCR (qRT-PCR). Lihavien tulokset ilmoitetaan välillä alustojen RNA-Seq ja qRT-PCR, ja suurin osa todettiin kopioiden alhaisilla ekspressiotasot RNA-Seq. Sitä paitsi, lisää rakenteellisia isoformeja maksassa CD90

+ CSCS kuin CD90

+ NTSCs. Edelleen, Gene ontologia (GO) analyysi osoitti, että jopa geenien liittyi lääkeainemetaboliaa, rasva-aineenvaihduntaan ja tulehdus, joka voi selittää lääkeresistenssin, solujen lisääntymistä, ja kasvaimen edistymistä. Niistä up geenien tunnistettu, Glypikaani-3 (GPC3), jäsen glypikaani perheen heparaanisulfaattiproteoglykaanit, oli yli-ilmentynyt CD90

+ CSCS. Immunohistokemiallisella värjäyksellä, GPC3 havaittiin useimmissa maksakasvaimien kudoksissa, mutta se puuttuu viereisen ei-tuumori- kudoksiin. Mielenkiintoista on, että GPC3: n ekspressiotaso korreloi positiivisesti lukumäärän CD90

+ CSCS maksan tuumorikudoksissa. Lisätutkimuksia virtaussytometrillä osoitti, että GPC3 huomattavan ilmaistu CD90

+ CSCS ihmisen maksan kasvain yksilöitä. Perustuvat tämänhetkiseen havainnoista riippumatta epäselvä rooleja GPC3 on maksasyövän kantasoluja, GPC3 voisi olla lupaava kohdegeenin HCC immunoterapiaa koska sen spesifisyys on maksasyövän kantasoluja, ja sen puuttuminen normaalissa maksan kantasoluja.

Materiaalit ja menetelmät

potilaille ja näytteiden keräämistä

Kaikki potilaat allekirjoittaneet kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen, sekä tiedot ja näytteet analysoitiin anonyymisti. Tämä tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of The University of Hong Kong. Kaikkiaan 15 potilasta rekrytoitiin RNA-sekvensointi ja validointi tässä tutkimuksessa (taulukko 1). Keski-ikä näistä potilaista oli 57. Siellä oli 14 miestä ja 1 nainen. Kolmetoista näistä potilaista oli positiivinen seerumi hepatiitti B pinta-antigeenin ja 1 hepatiitti C vasta-aineen. Kahdeksankymmentäseitsemän prosenttia näistä potilaista esitetään kasvain-solmu-etäpesäke (TNM) vaihe III tai IV, jonka keskimääräinen kasvaimen kokoa 9,3 cm. Kolme HCC potilaat, joiden näytteet tutkittiin RNA-Seq oli miehiä, iältään 55: stä 61. Kaikki olivat hepatiitti B-viruksen kantajia. Kaksi oli TNM III syöpä ja yksi oli TNM II syöpä. Patologinen diagnoosi tehtiin mukaisesti histologia kasvain näytteet tutkitaan kokenut patologia.

Kasvain ja rinnakkain ei-tuumori- maksakudoksissa kerättiin aikaan toiminnassa. Solun eristys menettely maksakudoksissa suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu joitakin muutoksia [9]. Lyhyesti, pilkkomisen jälkeen 100 yksikköä /ml: n tyypin IV kollagenaasi (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, kudokset jauhettiin ja solususpensio johdettiin 100 um: n nailonverkon poistaa kudosjäte. Punasoluja (RBC) hajotettiin sitten RBC hajotuspuskuria ja solususpensio pestiin uudelleen, lopulta läpi 40 um: n nailonverkon. Solut suspendoitiin uudelleen puskuriin ja HetaSep (Stem Cell Technology, Vancouver, BC, Kanada) lisättiin sitten soluun suspension poistamiseksi jäljellä roskia. Jälkeen kuolleiden solujen poistamisen jälkeen solut lopulta suspendoitiin värjäyspuskuriin (2% BSA: ta, 2 mM EDTA PBS: ssä), laskettiin ja alistettiin virtaussytometria-analyysi ja solujen lajittelu. Solut myös lajiteltu päälle lasilevyllä, vastavärjättiin DAPI ja tutkitaan fluoresenssimikroskoopilla.

Solulinjat

PLC ja MHCC97L solulinjat [9] ylläpidettiin yksikerrosviljelmään runsaasti glukoosia DMEM 10 % naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ilmassa.

Fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) ja CD90

+ solujen

eristetty solujen kasvain ja ei-kasvainkudoksista leimattiin PE-konjugoidulla anti-humaani-CD90 ja APC-konjugoidun anti-humaani-CD45-vasta-aineita (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA). Sen jälkeen, CD45

-CD90

+ solut eristettiin käyttäen BD FACSAria II Cell Sorter (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Alikvoottia CD90

+ solut tarkastettiin puhtauden. Eristettyjä soluja käsiteltiin lisäksi RNA ™ turvallisempi RNA stabilointi reagenssia (SABiosciences, Frederick, MA, USA) ja solupelletit säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempää RNA: n eristämistä.

virtaussytometria analyysi HCC solun linjat ja ihmisen maksan kasvain kudosten GPC3 ja CD90

Aluksi elinkelpoinen PLC ja MHCC97L solut ja elinkelpoisten solujen ihmisen maksakasvain kudoksissa pilkkomisen jälkeen lajiteltiin käyttäen Sytox Blue (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden, sitten solut olivat kiinteät ja läpäiseviksi kiinnitykseen /läpäiseväksi kit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Pesun jälkeen solut värjättiin PE-konjugoidulla anti-CD90 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) ja anti-GPC3-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), joissa on Zenon® Alexa Fluor ® 488 hiiren IgG1 Labeling Kit (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Inkuboinnin ja pesun jälkeen värjätään solut havaittiin ja laskettiin BD FACSAria II (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Tarvittaessa isotyyppejä käytettiin kontrolleina.

RNA: n eristys ja RNA: n monistusta

Yhteensä solun RNA: t uutettiin eristetty CD45

-CD90

+ solupelletti käyttäen RNAqueous-Micro RNA eristyspakkausta (Ambion, Austin, TX, USA). RNA-näytteet (~ 50 ng) monistettiin sitten kanssa MessageAmp II arna Amplification Kit (Ambion) mukaisesti valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, kaksijuosteinen cDNA syntetisoitiin käänteis- transkriptiota RNA: T7-promoottorin aluketta. Puhdistuksen jälkeen kaksijuosteinen cDNA toimi templaattina in vitro transkriptio tuottaa useita kopioita monistettiin RNA (Arna). Seuraavat RNA-monistuksen jälkeen Arna suoritettiin toisen kierroksen monistuksen samaa menetelmää kuin ensimmäisen vahvistusasteen, paitsi että käytetään eri aluketta valmistajan toimittamia. Kontrolli Hela-RNA ajettiin myös rinnakkain RNA-näytteet aikana amplifikaatiomenetelmän. Päättymisen jälkeen monistamisen, pitoisuus Arna mitattiin käyttäen Nanodrop ND-1000 ja laadun Arna analysoitiin Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

RNA kirjasto valmistelu ja sekvensointi

RNA-kirjasto valmiste suoritettiin valmistajan suositusten. Lyhyesti, poly-A, joka sisältää Årnäs puhdistettiin, jonka jälkeen pirstoutuminen RNA pieniksi paloiksi. Katkaistun RNA-fragmentit syntetisoida yhden juosteen cDNA käyttäen standardi II käänteistranskriptaasia (Invitrogen) ja satunnaisia ​​heksa-alukkeita (IDT, Coralville, Iowa, USA), ja sen jälkeen toisen juosteen synteesin DNA-polymeraasilla I (Invitrogen), ja E. coli RNaasi H: ta (Invitrogen). Sen jälkeen toisen juosteen synteesi, jossa pää korjaus- ja A-pyrstön, syntetisoitu kaksijuosteinen cDNA-fragmentit alistettiin puhdistukseen, ligatoitiin sitten Illumina sovittimia pika ligation TM Kit (NEB) ja DNA-ligaasia. Saatu cDNA-adapteri-modifioitu cDNA-kirjastojen fraktioitiin agaroosigeelillä, 200-bp: n fragmentit leikattiin irti ja monistettiin 15 sykliä polymeraasiketjureaktiota. Puhdistuksen jälkeen laatu cDNA-kirjastojen tarkastettiin Bioanalyzer 2100 (Agilent). Pitoisuus cDNA-kirjastojen mitattiin ja laimennettiin 10 nM Tris-HCl-puskurissa ennen klusterin sukupolven. Ryppäiden muodostumista, alukkeen hybridisaatio- ja sekvensoimalla reaktiot suoritettiin peräkkäin mukaisesti valmistajan suosittelemaa menetelmää. Tässä tutkimuksessa käytimme pari-end yhdistelmätila Illumina Genome Analyzer II (Illumina, San Diego, CA, USA) kanssa 76 kierrosta. Yksi kaista virtauksen solun käytettiin kullekin näytteelle. Raaka lyhyt sekvenssifragmentista hyväksyttiin, jos ne läpäissyt laadun suodatusta käytetyt parametrit Illumina GA Pipeline GERALD vaiheessa.

Lue kartoitus ja geenien ilmentymisen

Korkea laatu lukee linjattu ihmisen viittaus genomin (NCBI Build 36,1) käyttäen NextGENe® ohjelmistoa (Softgenetics, State College, PA, USA). Sovitetun lukee linjattu Human Refseq mRNA (NCBI). Lukee lyhyempi kuin 20 bps ja ne, joilla laatu pisteet alle 14 suljettiin pois. Sekvenssit linjassa yksittäisten transkriptio laskettiin digitaalisesti. Ilmaus tasot kutakin geeniä normalisoitiin lukee per ke eksonin mallin miljoonasosaa kartoitettu lukee (RPKM) helpottaa vertailua selostukset keskuudessa näytteitä. Tophat ohjelmistoa käytettiin tunnistamaan silmukoitumisvarianttia kunkin näytteen [17].

RNA-Seq data mining ja määrittelemällä mis-geenien poikki potilaat

suuri tietokanta, joka sisältää kaikki geenin transkriptien tunnistaa RNA-Seq varten näytteet CD90

+ solujen pariksi kasvain ja ei-tuumori- kudoksissa 3 potilasta koottiin. Keskiarvonilmaisimella log

2 kertainen muutos [RPKM of CD90

+ CSCS /RPKM of CD90

+ NTSCs] Kunkin geenin laskettiin kaikissa 3 potilasta. Väärä löytö määrä (FDR, eli todennäköisyys väärin hyväksymällä ero näiden kahden testattiin CD90

+ solu ryhmät) kunkin geenin määritettiin standardin Storeyn menetelmä [18]. Geenit katsottiin ilmentyvät eri kun niiden FDR oli alle 0,05. Lisäksi geenit luokiteltiin sääteli kun niiden log-keskiarvo

2 kertainen muutos suhde oli suurempi kuin 1 tai alassäädetty kun niiden log

2 kertainen muutos suhde oli pienempi kuin -1.

Fluidigm mikrofluidinen sirut qRT-PCR

vahvistaa luotettavuutta RNA-Seq data aluksi suoritimme qRT-PCR: llä käyttämällä samoja monistettu RNA-aineiden sisäisenä validointi, jonka jälkeen alkuperäinen, vahvistamattoman RNA peräisin itsenäinen HCC potilas kohortti mahdollisena validointi. BioMark® Real-Time PCR System 48,48 Dynamic Array (Fluidigm, South San Francisco, CA, USA) käytettiin suorittamaan qRT-PCR mukaan valmistajan protokollia.

EvaGreen ja TaqMan määritykset tehtiin mukaisesti valmistajan protokollia. Alukkeet valittujen geenien suunniteltiin käyttäen Primer 3 ohjelmistoa (taulukko S1). TaqMan Universal Master Mix, TaqMan Esivahvistustaso Master Mix ja koettimet hankkia Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA, USA). Näytteet ajettiin ainakin kahtena kappaleena. Geeni ilmentymistaso normalisoitui vähentämällä syklin kynnys (Ct) olevan runsaasti-ilmaisi ohjaus geenin Ct kunkin valitun kiinnostavan geenin. Suhteellinen geenien ilmentyminen arvot ilmaistaan ​​kertainen muutos oli myöhemmin määritetään käyttämällä 2

-ΔΔCT menetelmällä. GAPDH käytettiin vertailuohjaussignaalit geenin ja CD90

+ NTSCs otettiin vertailunäytteet. Tiedot analysoitiin käyttämällä Biomark Real-Time PCR Analysis Software versio 2 (Fluidigm).

Kun määritellään geenin ilmentymisen GPC3 suoritettiin Fluidigm Digital Array. Määritys suoritettiin valmistajan protokollan ja analysoitiin käyttämällä Biomark Digital PCR-analyysi ohjelmisto (Fluidigm).

kvantifiointi CD90

+ soluja ihmisen maksan kasvain näytteissä virtaussytometrialla

Kasvaimen ja rinnakkain ei-tuumori- maksakudoksissa saatiin toisesta neljäkymmentä kaksi HCC potilailla aikaan hepatektomian. Osa kunkin resektoitiin kudosten fiksoitiin 10% formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Jäljellä oleva osa tehtiin samat toimenpiteet FACS CD90

+ soluja, kuten edellä on kuvattu, ja määrä CD90:

+ solut analysoitiin ja kvantitoitiin BD FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton Dickinson Immunocytometry Systems).

immunohistokemiallinen värjäys GPC3 ihmisen maksan kasvainnäytteestä

sulautettu kudokset leikattiin 5 um: n paksuisia leikkeitä immunohistokemiallista värjäystä GPC3. Leikkeet perin parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin kautta etanolia vedessä. Sitten leikkeet käsiteltiin 3% vetyperoksidilla metanolissa 20 minuuttia poistamaan endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus. Antigeenin haku, osat kuumennettiin 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0), jossa painekattila 5 minuutin ajan 120 ° C: ssa. Leikkeet jälkeen peitettiin 1:1000 laimennus hiiren anti-GPC3-monoklonaalinen vasta-aine PBS: ssa (Santa Cruz Biotechnology, Kalifornia, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kun oli pesty TBS-Tween 20, kohdat inkuboitiin kuvitella Polymer-piparjuuriperoksidaasi (DakoCytomation, Carpenteria, CA, USA), jota käytettiin sekundaarisena vasta-aineella 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Värin signaali GPC3 kunkin osan kehitettiin lisäämällä 3, 3 diaminobenzidene tetrahydrochloride (DakoCytomation), jota seurasi 2 minuutin inkuboinnin. Lopuksi leikkeet pestiin tislatulla vedellä ja vastavärjättiin varten ytimet 10% hematoksyliinillä ja kuivattu. Analyysi Immunohistokemian suoritettiin riippumattomien tutkijoiden. GPC3 ilmentyminen arvioitiin käyttäen ”H pisteet” järjestelmä, joka saatiin seuraavan kaavan avulla:

3 x prosenttiosuus vahva värjäytyminen + 2X prosenttiosuus kohtalainen värjäytyminen + prosenttiosuus heikkoa värjäytymistä [19].

sirna (siRNA) transfektion in vitro

erityinen GPC3-siRNA ja salatun siRNA ohjaus (SSC) ostettiin Ambion (Austin, TX). CD90

+ GPC3

+ solut lajiteltiin PLC soluista myöhempää funktionaalisia määrityksiä kuten PLC-solut ilmentävät suhteellisen korkea CD90 ja GPC3-. GPC3 pudotus saatiin aikaan transfektoimalla siRNA oligoa lajitellut solut käyttämällä käänteinen transfektion Lipofectamine RNAiMAX reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden lopulliseen konsentraatioon 20 nM siRNA. Nämä transfektoidut solut vastedes selityksin PLC CD90

+ GPC3

+ (GPC3-). Samanaikaisesti PLC CD90

+ GPC3

+ soluja transfektoitiin salattu siRNA valvonta loppupitoisuuteen 20 nM, joita vastedes selityksin PLC CD90

+ GPC3

+

( SSC).

soluproleferaatiomäärityksessä

PLC CD90

+ GPC3

+ (GPC3-) ja CD90

+ GPC3

+

(SSC) -solut ympättiin 96-kuoppalevylle tiheydellä 4000 solua /kuoppa DMEM: ssä /10% FBS: ää. Osoitetuissa aikapisteissä, 10 ui WST-1-reagenssia (Roche Applied Science, Madison, WI, USA) lisättiin kuhunkin kaivoon, joka sisälsi 100 ul väliainetta. Levyä inkuboitiin 2 tuntia, minkä jälkeen 1 minuutin ravistellen. Solujen kasvua arvioitiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) päivänä 1, 2, 3 ja 4. Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena, ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Vähintään kaksi itsenäistä koetta suoritettiin.

Kantasolujen pesäkemuodostusta

klonogeeninen kapasiteetti syövän kantasoluja arvioitiin kantasolujen pesäkemuodostusta. CD90

+ GPC3

+ solut eristettiin PLC-solut, minkä jälkeen transfektointi GPC3 siRNA ja sekoitetun siRNA ohjaus, vastaavasti. CD90

+ GPC3

+ (GPC3-) ja CD90

+ GPC3

+

(SSC) ympättiin puolikiinteä agar materiaalille StemTAG TM 96-kantasolujen pesäkemuodostusta kit (Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 50 ui Base agar Matrix Layer jaettiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle ja jähmettynyt 4 ° C: ssa. Seitsemänkymmentä viisi ul solususpensiota /agarmatriisin sisältävä suspensio 5000-soluja jaettiin jokaiseen kuoppaan. Kiinteytymisen jälkeen, 50 ui elatusainetta kasvutekijöiden lisättiin kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin 8 päivä vuonna kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Siirtomaa muodostuminen kyky tutkittiin mikroskoopilla, ja tulokset määritettiin sitten mittaamalla alkaalifosfataasin solujen hajoamisen jälkeen.

Tilastollinen

jatkuvia muuttujia ilmaistiin keskiarvona ± SD tai mediaani . Vertailuja kertainen muutos geenien ja silmukointivariantit kahden ryhmän välillä suoritettiin Studentin t-testiä. Korrelaatio mitatun geenien välillä RNA-Seq ja qRT-PCR mitattiin Spearmanin korrelaatiokertoimen. Kaikki analyysit suoritettiin GraphPad Prism 5 ohjelmisto (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

P

arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

eristäminen CD90

+ solujen kasvain ja ei-kasvain näytteet

sekä anti-humaani-CD90 ja anti-humaani-CD45-vasta-aineita käytettiin eristämiseen menettelyjä. Kuten CD90 ilmaistiin myös joidenkin lymfosyyttien, yhdistelmä CD45

-CD90

+ käytettiin määrittämään nonlymphatic CD90

+ soluja potilaan maksan kudoksissa (kuva S1). BD soluerottelupusku- lajiteltu CD90

+ soluja, joiden keskimääräinen puhtaus oli 86,6%. Mediaani määrä 3,4 x 10

4 CD90

+ CSCS kasvaimen kudoksista ja 8,9 × 10

3 solujen CD90

+ NTSCs ei-syöpäkudoksissa saatiin. Määrä CD90

+ CSCS oli huomattavasti korkeampi kuin CD90

+ NTSCs (

P

= 0,0008). Lajitellut CD90

+ solut lisävahvistusta immunofluoresenssivärjäyksen ennen RNA.

RNA ja vahvistusta

saanto RNA lajiteltu CD90

+ solut vaihtelivat 12 ng 200 ng (10

3 -10

4 solut). Vuoksi riittämätön määrä RNA: ta RNA-Seq, kaksi kierrosta RNA-monistus suoritettiin mukaisesti valmistajan menettelyjä. Monistamisen jälkeen keskimäärin 114 ug monistettua RNA: ta (arna) saatiin. Koot olivat välillä 200-2000 nukleotidia, pääosan ollessa noin 500, mikä on yhdenmukaiset spesifikaatioiden koot Arna valmistajan ilmoittamaa, mikä osoittaa, että Arna näytteet olivat hyvälaatuisia.

Mitä bias RNA vahvistus RNA-Seq tekniikka, ei vertailutiedot on koskaan löydetty kirjallisuudessa vielä. Tästä huolimatta on osoitettu, että yksi tai kaksi kierrosta RNA vahvistus syntyy toistettavissa microarray data menettämättä merkittävää geenin havaitseminen [20]. Lisäksi tutkimus osoitti, että 75% enemmän geenejä havaittiin mRNA sekvensoinnilla verrattuna mikrosirujen jälkeen cDNA monistuksella yhden solun [21]. Näin ollen meidän uskotaan, että tuotettu Årnäs voitaisiin käyttää myös RNA-sekvenssi.

Sequencing synteesi-monistettua RNA eristettiin CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs on Illumina Genome Analyzer II

Vahvistetut RNA: t rakentamisen jälkeen cDNA-kirjaston tehtiin RNA-Seq on Illumina genomista Analyzer II (pari-end sekvensointi). Päätyttyä, 14900000-20500000 75-emäsparin sekvenssin lukee per näyte syntyi, ja ne vastasivat keskimäärin 1,30 Gb raaka järjestyksessä tiedot. Tasaus mRNA Reference Sequence (NCBI) oli 39,4 ± 7% ja suurempi osa lukee tasataan viite ihmisen genomin (70,3 ± 8%) (taulukko 2), mikä viittaa siihen, että unaligned sekvenssit RefSeq johtui todennäköisesti epätäydellinen merkintään mRNA isomuotojen Homo sapiens [22], [23]. Muita syitä voisi johtua niiden alkuperää ulkopuolelle viite ihmisen genomin tai alhainenkin laatu [24]. Kuitenkin keskimäärin selostukset havaittu CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs oli 31407 ± 2202, ja 31444 ± 479, vastaavasti, mikä vastasi noin 74% ihmisen RefSeq selostukset merkinnät. Koska mitään merkittävää eroa määrä transkriptien välillä havaittiin kahden CD90

+ soluja, geenin vertailua pidettiin voimassa (

P

= 0,7).

Vaihtoehtoinen esiaste lähetti-RNA: ta (pre-mRNA: n) silmukointi on merkittäviä rooleja sukupolven toiminnallisen monimuotoisuuden genomin. Varaamiseen tulokset ovat osoittaneet, että poikkeava liitos vaikuttaa neoplasia, syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [25] – [27]. Silmukointitapahtumilla lukien vaihtoehtoiset 3 ’tai 5’ silmukoitumiskohta, vaihtoehtoiset ensimmäinen eksoni, vaihtoehtoiset viime eksonin, intronin säilyttäminen, ja eksonin ohitus verrattiin toisiinsa CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs (taulukko 3). Keskimääräinen määrä vaihtoehtoisen silmukoinnin CD90

+ CSCS todettiin 383, kun taas niille CD90

+ NTSCs olivat 245 (

P

0,05). Enemmän rakenteellisia variantteja löydettiin CD90

+ CSCS verrattuna CD90

+ NTSCs, mikä osoittaa, että enemmän sääntelyä ja toiminnallista monimuotoisuutta transcriptomes tapahtui maksan CSCS.

jakautuminen transkriptien CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs näytteillä samankaltainen (kuvio 1). Havaitsimme, että 80% selostukset oli vähemmän kuin 10 RPKM vuonna CD90

+ CSCS tai CD90

+ NTSCs, mutta vain noin 0,1% ilmaistuna transkriptien oli yli 1000 RPKM. Tämä merkitsi sitä, että suurin osa transkriptien ilmaistiin alhaisella tasolla ja ehkä ole helppo tunnistaa cDNA microarray. Samanlainen transkripti jakautumiskuvion todettiin tutkimuksessa geeniekspressioprofilointi glioblastoma käyttäen seuraavan sukupolven sekvensointi teknologia [28]. Tämä osoittaa jälleen herkkä RNA-Seq havaitsemisessa nöyrä ilmaistu selostukset syöpäsoluissa [29].

Y-akseli, useita lukee; X-akseli, siiloihin ekspressiotasoja (roskakorit 5 RPKM, 5-10 RPKM, 11-100 RPKM, 100-1000 RPKM ja 1000 RPKM). Suurin osa transkriptien ilmaistiin matalalla tasolla (alle 5 RPKM). RPKM, lukee per kiloemästä miljoonasosaa lukee.

Analyysi geeniekspressioprofiilien of CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs

Poistettaessa päällekkäisiä geenien jälkeen kohdistamalla selostukset Human RNA referenssisekvenssissä, geeni-ilmentymisen profiilit 24609 geenien analysoitiin. Viisisataa geenejä ilmentyvät differentiaalisesti, joista 119 geeniä säädellään ylöspäin, ja 381 olivat alassäädetty.

Aiemmassa ja läsnä tutkimuksissa käytimme anti-ihmisen CD90-vasta-aineen eristämiseksi CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs potilaasta kasvainkudoksista koska CD90 on pinta markkeri maksan kantasoluja (ovaali solut) [30]. Nämä kaksi ryhmää soluja, osoittivat samanlaisia ​​kantasolujen ominaisuuksia, kuten heijastuu osallistuvia geenejä pluripotenssia ja erilaistumiseen (taulukko 4), joka ilmaisee samalla tasolla, mikä viittaa siihen, niiden peräisin maksan kantasoluja.

Tarjolla geenien ilmaistiin vertailukelpoisilla tasoilla CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs, mikä osoittaa, että ilmentyminen muuttuu muiden geenien voisi kohtuudella verrata näiden kahden ryhmän (taulukko 4).

edustaja piirteitä ilmennetty eri geenien CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs tiivistetysti (taulukko 5, säädelty ja taulukko 6, alassäädetty). Ylös geenien liittyivät biologisiin toimintoihin myös huumeiden liikenne (ABCC5), rasva-aineenvaihduntaan (APOE, APOC1), angiogeneesin (COL15A1, Plau, PLVAP), solujen lisääntymistä (ESM-1, FGL1, GPC3, IGFBP5), liikenne ( AMBP), akuutti tulehdusreaktio (APOA2, ORM1), sytokiinien tuotanto (FABP4), solusyklin (PLK2), signaalitransduktion (RAP2A), ja MAPK /ERK-reitin (CXCR4). Down-geenien olivat mukana useissa biologisissa prosesseissa kuten urut kehittäminen (ADAMTS1, ALDH1A2), vaste hypoksia (ANGPTL4, EDN1, SOCS3, VEGFA), nukleotidin sitovat (ATP2A3, RAN, RPLP2), käännös venymä aktiivisuus (EEF1D), ja kemotaksista (IL8, CXCL1).

validointi RNA-Seq tietoja qRT-PCR

Jos haluat varmistaa RNA-Seq data, kuuden alkuperäisen monistettu RNA-näytteet käytetään RNA-Seq testattiin uudelleen qRT-PCR paneelin 47 ero ilmaistuna geenejä. Valitut geenit sisältyvät 28 ylös geenien ja 19 alas geenien. Log

2-kertainen muutos geenien qRT-PCR verrattiin RNA-sekvenssi. Nämä kaksi geenien ilmentymisen analyysi alustoilla osoitti yhtäpitävät tulokset (Spearmanin = 0,88,

P

0,001; kuva 2). Lisäksi kulmakerroin regressiosuoran oli 0,73, mikä viittaa siihen, että RNA-Seq oli samanlainen dynaaminen alue havaitsemista kuin qRT-PCR, ja siksi meidän RNA-Seq menetelmää voitaisiin luotettavasti mitata geeniekspressiota eroja, erityisesti niille nöyrä ilmaisseet geenien CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs.

Korrelaatio qRT-PCR ja RNA-Seq tietoja 47 valitun geenin: 28 up-geenien ja 19 alas geenien in 3 paria monistettiin RNA-näytteet. Spearmanin kerroin = 0,88 (

P

0,001) ja kulmakerroin = 0,73.

Vahvistus RNA-Seq tietoja qRT-PCR: llä käyttämällä näytteet riippumaton potilaan kohortin

poistaa mahdolliset harhaa seurauksena ennalta vahvistusta ja edelleen vahvistaa RNA-Seq tuloksiin, qRT-PCR 27. up-geenien ja 15 alas geenien suoritettiin 12 paria RNA-näytteet valmistetaan alkaen CD90

+ CSCS ja CD90

+ NTSCs johdettu itsenäisen erän kasvain ja rinnakkain ei-kasvain kudosten, vastaavasti.