Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epäilemättä munasarjasyöpä on Kiusallinen, parantumaton sairaus potilaille, joilla on toistuvia syöpää ja hoitovaihtoehdot ovat rajalliset. Vaikka Polycomb ryhmä geeni,

BMI-1

joka säätelee itseuudistumisen normaalin kanta- ja progenitorisolujen on patogeneesiin moniin ihmisen maligniteettien, mutta rooli BMI-1 vaikuttamassa kemoterapiaa vastauksena on ei ole käsitelty aikaisemmin. Täällä osoittavat, että hiljentäminen BMI-1 vähentää solunsisäisiä GSH tasoilla ja siten herkistää solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä soluja kemoterapeuttiset kuten sisplatiinin. By pahentaa ROS tuotanto vastauksena sisplatiinin, BMI-1 hiljentäminen aktivoi DNA-vaurioita vastaus koulutusjakso, kaspaaseiksi ja pilkkoo PARP johtaa induktion apoptoosin munasarjasyöpäsoluja. Eräässä

in vivo

potilaalle tehdä hiirimallissa solunsalpaajaresistentti munasarjasyövän, knockdown BMI-1 nanoliposomal toimitus merkittävästi kasvaimen kasvu estyy. Vaikka sisplatiinin monoterapiaan oli aktiivinen, yhdistelmä BMI-1 hiljentäminen yhdessä sisplatiinin kumosi melkein täysin munasarjojen kasvaimen kasvua. Yhdessä nämä havainnot vahvistaa BMI-1 on tärkeä uusi tavoite hoidon solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä.

Citation: Wang E, Bhattacharyya S, Szabolcs A Rodriguez-Aguayo C, Jennings NB, Lopez-Berestein G, et al. (2011) parantaminen Kemoterapia Response BMI-1 hiljentäminen munasarjasyövässä. PLoS ONE 6 (3): e17918. doi: 10,1371 /journal.pone.0017918

Editor: Sujit Basu, Ohio State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21. 2011; Hyväksytty: 15 helmikuu 2011; Julkaistu: 21 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Marsha Rivkin Pilot Award (RB), CA136494, CA135011 (PM) ja P50 CA083639, U54 CA151668 (AS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on korkein kuolleisuus kaikista gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia [1]. Huolimatta ensimmäisen vastauksen kirurgisten debulking ja etulinjan platina /taksaani kemoterapiaa, useimmat kasvaimet lopulta kehittää lääkkeille vastustuskykyiset uusiutumisen [2], [3]. Todisteet viittaavat siihen, että sisplatiini resistenssi voisi johtua viallisen apoptoottisen ohjelman. Tällöin kohonneeseen DNA-vaurioita vaadittaisiin aiheuttavan signaalin aloittamista apoptoosin [4], [5].

BMI-1

, Polycomb ryhmä geeni säätelee proliferatiivinen aktiivisuus normaalin kanta- ja progenitorisolujen [6]. On myös välttämätöntä itseuudistumisen hermo [7], [8] ja hematopoieettisia kantasoluja [9]. Bmi-1 on usein säädelty eri syöpiä, kuten munasarjasyövän, ja sen korrelaatio kliinisen laadun /vaihe, imusolmukkeen etäpesäke, ja huono ennuste, on raportoitu [10], [11], [12], [13], [14 ], [15], [16], [17], [18], [19].

BMI-1

aiheuttaa neoplastisen transformaation lymfosyyttien ja toimii yhteistyössä H-Ras synnyttää metastaattisen rintasyövän hiirillä [20], [21], [22], kaikki viittaa vahvasti siihen onkogeenisessä rooli epiteelin syöpäsairauksia. Lisäksi eristetty munasarjasyövän kantasolujen osoittavat paljon suurempi Bmi-1-tasot verrattuna Vaihtelevan tai vanhempien irtotavarana kasvainsolujen ja on kasvanut vastustuskyky sisplatiinin ja paklitakselin verrattuna kasvaimen soluihin [23]. Myös lisääntynyt ilmentyminen BMI-1 oli yksi keskeisistä sääntelyn tekijöistä solun fenotyypin vangiksi ilmaus kuolema-from-syövän allekirjoitus laajan kirjon hoito vastustuskykyisten kliinisesti tappava syöpäsairauksia [24]. Tästä huolimatta runsaasti tietoa mahdollisesta roolista BMI-1 vaikuttamassa kemoterapiaa vastausta ei ole käsitelty aikaisemmin. Tässä yhteydessä määritetään mekanismi, jonka BMI-1 hiljentäminen herkistää syöpäsolut sisplatiiniin olisi tärkeää kehittää uusia hoitostrategioita torjumiseksi munasarjasyöpään.

Aktiivisimmat solunsalpaajiin munasarjasyövän ovat platina analogit, sisplatiini ja karboplatiini. Antituumorivaikutuksen sisplatiinin (cis-diamminedichloroplatinum (II) löysi Rosenberg ja kollegat vuonna 1961 [25]. Sisplatiini on aktiivisin lääke hoitoon munasarjasyöpä viimeiset 4 vuosikymmeninä ja ennusteen naisten munasarjasyövän voidaan määritellä kasvaimen vaste sisplatiinin [26]. Vaikka suurin osa munasarjasyöpäpotilaalle vastata etulinjan platina yhdistelmä kemoterapiaa enemmistö kehittyy sairaus, joka tulee vastustuskykyinen sisplatiiniin ja lopulta periksi tauti [26]. täten menetelmät estää tai voittaa vastustuskyvyn sisplatiinin voisi olla suuri vaikutus tämän sairauden torjunnassa.

tässä osoitamme, että

BMI-1

tärkeä rooli herkistymiseen solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä solujen sisplatiinia. myös osoittavat, että tämä herkistyminen on uuden reitin kautta, moduloidaan Bmi-1, nimittäin reaktiivisen hapen (ROS) induktio aiheuttaa sitoutuminen DNA-vaurion vaste (DDR) johtava väylä apoptoosin. Olemme myös perustaa BMI-1 kelvolliseksi terapeuttinen tavoite

in vivo

käyttäen helposti käännettävissä lähestymistapa nanoliposomal toimituksen siRNA osaksi potilaalle tehdä hiirimallissa munasarjasyöpä.

Tulokset

knockdown BMI-1 lisää sisplatiinin herkkyyttä in vitro

Olemme aiemmin osoittaneet, että vähennys BMI-1-proteiinin tasot munasarjasyöpäsoluja käyttäen microRNA 15a /16 vähenee klonaalinen kasvua ja lisääntymistä [27]. Täällä, halusimme testata, jos pudotus BMI-1 vaikuttaa sisplatiinia välittämän apoptoosin munasarjasyöpäsoluja. Tehokas Knockdown BMI-1 A-2780 ja CP-70-soluissa varmistettiin vertaamalla salattu ohjaus transfektoitujen solujen 48 tunnin jälkeen (Fig. 1). SiRNA transfektoituja soluja käsiteltiin sisplatiinin kanssa 48 tuntia ja apoptoosi määritettiin anneksiini /FITC menetelmällä. Apoptoosin chemosensitive A-2780-ohjaus siRNA transfektoituja soluja oli ~35 ja 55%, kun hoidettiin 5 tai 10 uM sisplatiinia yksin vastaavasti. Sen sijaan, apoptoosin solunsalpaajaresistentti CP-70 oli on noin 17 ja 40%, kun hoidettiin 10 tai 20 uM sisplatiinia yksin Tämä osoittaa vastus näiden solujen kohti sisplatiinin aiheuttamaa apoptoosia (kuvio. 1). Tärkeää käsittelemällä BMI-1 vaientaa soluja sisplatiinin johdonmukaisesti parannettu apoptoosia sekä solulinjoissa mukaan ~15-20% (Fig. 1). Sekä solulinjat, pohjapinta apoptoosin taso määritetään ilman hoitoa oli -10%. Apoptoosi kokeet kolme ylimääräistä solulinjojen, kuten OVCAR-5, OV-202 ja OV-167 tuotti samanlaiset tulokset (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot vahvistivat, että knockdown BMI-1 voisi herkistää munasarjasyöpä soluja sisplatiini solukuolema.

Päälliseinämä osoittaa tehokas knockdown BMI-1 siRNA että munasarjasyövän solulinjoissa (SC = salattu ohjaus siRNA ), kuten määritettiin Western blot. Alapaneelissa osoittaa prosenttia apoptoosin määritettynä anneksiini /FITC-PI värjäystä. Munasarjasyöpä, jotka oli transfektoitu sekoitetun ohjaus- tai Bmi-1 siRNA käsiteltiin kanssa tai ilman sisplatiinia 48 tuntia. NAC esikäsittely tehtiin 1 h ennen kuin lisättiin sisplatiinia tarvittaessa.

Viime aikoina on raportoitu, että neuronien, tymosyyttejä ja luuytimen solut eristettiin Bmi-1 null hiirillä on lisääntynyt ROS tasoilla kuin niiden villityypin kollegansa [28], [29]. Lisäksi tutkimuksissa on raportoitu osallistumista ROS sukupolven sisplatiini-välitteisen apoptoosin [30], [31]. Siis myös päättää miten vaiennettu BMI-1 herkistää lääkeresistenttiä munasarjojen syöpäsolujen sisplatiini aiheuttaman apoptoosin, tutkimme mahdollista osallistumista ROS. Näin ollen BMI-1 tai sekoitetun-ohjaus siRNA transfektoidut munasarjasyövän soluja esi-käsiteltiin N-asetyyli-kysteiini (NAC), 1 mg /ml, 1 tunnin ja sen jälkeen sisplatiinihoitoon 48 tuntia. Merkittävä inhibitio sisplatiinin välittämää apoptoosia sekä ohjaus- ja Bmi-1 pudotus-solujen havaittiin läsnä ROS scavenger NAC (Fig. 1). Nämä tiedot osoittavat, että täydennetty apoptoosin havaittu sisplatiinin käsitelty BMI-1 vaiennetaan solujen johtui osallistumisesta ROS ja sai meidät määrittämään ROS tuotanto kuin seuraava looginen askel.

Knockdown BMI-1 lisää sisplatiinin -välitteisen ROS tuotanto

seuraava määräytyy ROS tuotanto salattu ohjaus tai BMI-1 siRNA transfektoituja soluja käsiteltiin tai ilman sisplatiinia mittaamalla fluoresenssi käyttämällä DCFDA. Sisplatiinihoitoon yksin merkittävästi lisääntynyt ROS 10 uM A-2780-soluissa ja 10 ja 20 uM CP-70 soluihin. Molemmissa solulinjoissa, pudotus ja Bmi-1, jonka jälkeen mitä tahansa sisplatiinihoitoon huomattavasti ROS (Fig. 2). Nämä tiedot vahvistavat aiemmat havainnot apoptoosiin ja arvelee ROS ensisijaisena syynä tehostetun herkistymistä munasarjasyöpäsoluja sisplatiinia. Sen määrittämiseksi syy varten pahensi ROS välittämää apoptoosia havaita me seuraavaksi määritellään totaalisoluproteiinia glutationin (GSH) tasoja.

munasarjasyöpäsoluja transfektoitu salattu ohjaus tai BMI-1 siRNA hoidettiin tai ilman sisplatiinia 24 h. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 5 uM karboksi-H2DCFDA tuoreen HBSS 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut otettiin talteen trypsiinillä ja fluoresenssi leimattujen solujen mitattiin eksitaatioaallonpituudella 485 nm ja emissio aallonpituudella 530 nm käyttämällä Fluorolog 3 (Jobin-Yvon Horiba). Suhde fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) suhteessa käsittelemättömän salattu kontrolli edustaa.

BMI-1 säätelee GSH tuotanto

Alennettu GSH on kriittinen osa solun antioksidanttiverkostoa , osallistu suoraan huuhteluilman ROS ja ylläpitämisessä tioli proteiineja niiden pelkistetyssä tilassa [32], [33], [34]. Siten määrittää syy lisääntynyt ROS välittämää apoptoosia havaita BMI-1 vaiennetaan soluissa, me seuraavaksi määritellään yhteensä solunsisäisiä GSH tasoilla. Lysaatit valmistettiin salattu ohjaus tai BMI-1 siRNA transfektoituja soluja käsiteltiin tai ilman sisplatiinia. Knockdown BMI-1 yksin merkittävästi vähentynyt solun GSH tason (-30% A-2780 ja -40% CP-70), ja tämä väheni edelleen yhdistettynä sisplatiinihoitoon (~45% A-2780 ja ~56% CP-70) (Fig. 3). Sisplatiinihoitoon yksinään kuitenkaan ollut vaikutusta GSH tasoilla. Nämä tiedot viittaavat siihen, että ainakin osa oksidatiivisen stressin välittämiä vaikutuksia havaittiin Bmi-1 pudotus munasarjasyöpäsoluja on alentuneen solunsisäisiä GSH tasoilla.

yläpaneelin edustaa solun kokonais-GSH mitattu (Materiaalit ja menetelmät) munasarjasyövän transfektoiduissa soluissa sekoitetun ohjaus- tai Bmi-1 siRNA käsitelty tai ilman sisplatiinia 24 tunnin ajan. Alapaneeli esittää kertainen muutos geenien ilmentyminen (normalisoitu beeta aktiini ja verrattuna salattu valvonta), kuten määritettiin kvantitatiivisella RT-PCR munasarjasyövän transfektoitujen solujen sekoitetun ohjaus- tai Bmi-1 siRNA 48 tuntia.

tutkimiseksi edelleen heikentyneen GSH pitoisuus BMI-1 vaiennetaan solujen me seuraavaksi määrittää, ovatko ekspressiotasot avaimen osallistuvien entsyymien GSH biosynteesipolun muutettiin. Suoritimme kvantitatiivinen RT-PCR määrittää geenin ilmentymisen taso glutamaatti-kysteiinin ligaasia (GCLM) ja glutationi syntaasi (GSS), BMI-1 siRNA transfektoitujen munasarjasyövän solulinjoissa. Glutamaatti-kysteiini-ligaasia (GCLM) on ensimmäinen nopeutta rajoittava entsyymi glutationi biosynteesireitillä [35]. Toisessa vaiheessa, glutationi-syntaasi (GSS), muuntaa gamma-L-glutamyyli-L-kysteiini glutationi [35]. Vaikka mRNA: n ilmentymisen BMI-1 väheni odotetusti BMI-1 vaiennetaan soluissa, mielenkiintoisesti mRNA ilmaus GCLM merkittävästi vähentynyt kun taas GSS lisääntynyt (Fig. 3). Kehitys oli samanlainen molemmissa munasarjasyövän solulinjoissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että häiriön GCLM, nopeutta rajoittava entsyymi on riittävä vähentämään totaalisoluproteiinia GSH tasoilla ja myöhempien kertainen lisäys GSS mRNA-tasojen todennäköisesti edustavat puolustusmekanismi soluille yrittää lievittää oksidatiivisen stressin.

BMI -1 moduloi DDR koulutusjakson

tutkimiseksi edelleen mekanismi ROS välittämän tehostetun apoptoosin sisplatiinia BMI-1 vaiennetaan munasarjasyöpäsoluja halusimme testata osallistumisen DNA-vaurio ja korjaus (DDR) kautta. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että oksidatiivinen stressi voi laukaista aktivointi DDR-reitin [36]. Jotta testata tätä määritimme fosforylaation tasoja Chk2 ja H2AX kaksi tärkeää biomarkkereita DNA-vaurioita ja aktivoitumisen DDR-reitin [37]. Sisplatiinihoitoon yksin indusoi fosforylaatiota Chk2 ja H2AX pitoisuutena riippuvaisella tavalla ja knockdown BMI-1 pahentaa tätä vaikutusta (Fig. 4A). Vuonna vahvistus, lisääntynyt ydinvoiman pesäkkeitä muodostusta havaittiin 53 BP1 immunoflourescence CP-70 BMI-1 Knockdown soluissa sisplatiinia (Fig. 4B). Nämä tulokset osoittavat, että jatkuva tasot ROS syntyy kun BMI-1 Knockdown yhdistettynä sisplatiinihoitoon riittävät suoraan vahingoittaa DNA: ta ja kytke DDR-reitin. Suuri määrä kirjallisuutta tukee tätä DNA-vaurioita voivat aiheuttaa apoptoosin kautta kaspaasien aktivaatio [38], [39]. Siksi seuraava eteni selvittää aktivaatio caspases BMI-1 vaiennetaan munasarjasyöpäsoluja käsitelty tai ilman sisplatiinia.

(A) munasarjasyöpäsoluja transfektoitu salattu ohjaus tai BMI-1 siRNA hoidettiin tai ilman sisplatiinia 48 h. Western blot suoritettiin fosfo Chk-2, yhteensä Chk-2, fosfo-H2AX yhteensä H2AX ja beta aktiini käytetään kunkin vasta-aineita. (B) Salattu ohjaus tai BMI-1 siRNA transfektoitujen CP-70-soluja altistettiin konfokaalimikroskopia käyttäen 53BP1 vasta-ainetta (punainen) ja DAPI (sininen tumavärjäystä) osoittaa ydinvoiman pesäkkeitä muodostumista.

Bmi- 1 säätelee efektorit apoptoosin

Perustettu välittäjiä apoptoosin kuuluvat caspases [40]. Me seuraavaksi määrittää pilkkominen kaspaasin 8 ja kaspaasi 9 hallita salattu tai BMI-1 siRNA transfektoituja soluja käsiteltiin tai ilman sisplatiinia. Sisplatiinihoitoon yksin aiheutti pilkkominen kaspaasin 8, mutta ei kaspaasi 9. On todennäköistä, että suuremmilla sisplatiinin pilkkomisen kaspaasi 9 voitiin havaita. Tärkeää on kuitenkin, yhdistelmä BMI-1 Knockdown ja sisplatiinihoitoon merkittävästi annosriippuvaisesti lisäsi pilkkominen kaspaasin 8 ja kaspaasi 9 sekä solulinjoissa (Fig. 5).

munasarjasyöpäsoluja transfektoitu salattu ohjaus tai BMI -1 siRNA käsiteltiin kanssa tai ilman sisplatiinia 48 tuntia. Western blot suoritettiin kaspaasi-8, kaspaasi-9 ja PARP käyttämällä vastaavia vasta-aineita.

PARP on yksi tärkeimmistä katkaisun tavoitteet aktivoitu kaspaasien ja pilkotaan PARP helpottaa solun purkamisen ja toimii markkerina apoptoosin alaisten solujen [40]. BMI-1 pudotus soluja, selkeä lohkaisu PARP havaittiin sisplatiinilla annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio. 5). Kaikki nämä

in vitro

tulokset osoittavat, että sisplatiinihoitoon BMI-1 Knockdown solujen parantaa apoptoosin lisäämällä ROS tuotantoa, mikä sitoutuminen DDR reitin ja aktivoimalla kaspaaseiksi. Seuraavaksi me eteni määrittää terapeuttista tehoa hiljentäminen BMI-1 käytettäessä potilaalle tehdä solunsalpaajaresistentti hiirimallissa munasarjasyöpä.

Knockdown BMI-1 lisää sisplatiinin herkkyyttä in vivo

Seuraava terapeuttista potentiaalia bMI-1 testattiin

in vivo

toimitus bMI-1 siRNA käyttäen DOPC (1,2-dioleoyyli-sn-glysero-3-fosfatidyylikoliini) nanoliposomes että potilaalle tehdä CP-20 hiirimallissa. Tämä menetelmä toimitus on laajasti tunnettu aikaisemmin ajaksi pudotus ja sen on osoitettu puuttuvan epäspesifisen tulehdusreaktioita [41], [42]. Simuloida edenneen pienten määrien, hoitoon aloitettiin 1 viikko sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion jälkeen. Hiiret jaettiin seuraaviin neljään ryhmään (n = 10 hiirtä ryhmässä): (a) ohjaamaan siRNA-DOPC (150 ug /kg ip kahdesti viikossa), (b) hallita siRNA-DOPC + sisplatiini (160 ug /hiiri ip viikoittain), (c) Bmi-1 siRNA-DOPC (150 ug /kg ip kahdesti viikossa), ja (d) Bmi-1 siRNA-DOPC + sisplatiini (annokset sama kuin yksittäisten käsittelyjen). Kaikki eläimet tapettiin 4 viikkoa hoidon jälkeen. Tehokas pudotus BMI-1 (-85%) on ensin varmistettiin RT-PCR: llä (Fig. 6A). Hoito BMI-1 siRNA yksin aiheutti merkittäviä (-60%) vähennys kasvaimen painoa kontrolliryhmään verrattuna siRNA ryhmä. Yhdistelmähoito BMI-1 siRNA ja sisplatiinin johti vielä suurempi (-80%) vähennys kasvaimen painoa verrattuna sisplatiiniin vain hoidetussa ryhmässä (kuvio. 6B). Arvioida enempää vaikutuksen määrä kasvaimen kyhmyjä muodostuu kussakin ryhmässä oli päättänyt. Jälleen yhdistelmähoito osoitti suurin vaikutus -70% vähemmän kasvaimen kyhmyjä verrattuna sisplatiiniin vain hoidetussa ryhmässä (kuvio. 6B). Ei ilmeistä toksisuutta havaittiin eläinten hoidon aikana kokeita arvioituna käyttäytymisen muutoksia, ruokinta tottumukset, ja liikkuvuutta. Keskimääräinen kehon paino oli myös samanlainen hoitoryhmien välillä (tuloksia ei ole esitetty).

vaikutusten arvioimiseksi siRNA hoidon kasvaimen kasvua, hoito aloitettiin 1 vk jälkeen i.p. injektio (1,0 x 10

6 CP20) syöpäsolujen. Hiiret jaettiin neljään ryhmään (n = 10 hiirtä ryhmää kohti): (a) ohjaamaan siRNA-DOPC (150 ug /kg ip kahdesti viikossa), (b) ohjaamaan siRNA-DOPC + sisplatiini (160 ug /hiiri ip kerran viikossa), (c) Bmi-1 siRNA-DOPC (150 ug /kg ip kahdesti viikossa), ja (d) Bmi-1 siRNA-DOPC + sisplatiini (annokset sama kuin yksittäisten käsittelyjen). Hoitoa jatkettiin kunnes 4 viikon kuluttua tuumorin istuttamisen ennen tappamista. (A) Kokonais-RNA eristettiin osasta kasvainkudoksessa ja alistettiin RT-PCR: llä käyttäen alukkeita Bmi-1 ja beeta-aktiini. Vertaileva C

t menetelmää käytettiin lasketaan suhteellinen runsaus mRNA verrattiin beta aktiinin ilmaisua. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja merkitys määritettiin käyttämällä kaksipuolista Studentin t-testiä, P 0,05 katsottiin merkitseväksi. (B) Hiiren ja kasvaimen painot ja (C) määrä kasvaimen kyhmyjä kussakin ryhmässä verrattiin käyttäen Studentin t-testiä (vertailtaessa kaksi ryhmää). Kahden pyrstö P≤0.05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Effect BMI-1 Knockdown proliferaatioon ja apoptoosiin in vivo

vahvistaa meidän

in vitro

data me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus BMI-1 knockdown on

in vivo

kasvainsoluproliferaation ja apoptoosin avulla Ki67 ja TUNEL värjäys. Yhdistelmähoito BMI-1 siRNA ja sisplatiinin osoitti suurin vaikutus -50% laskun proliferaatiossa verrattuna kontrolliryhmään käsittelemättömän ryhmän (Fig. 7). Vastaavasti, noin 80% apoptoosin lisääntyminen havaittiin yhdistelmähoitoa saaneiden ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään hoidetussa ryhmässä (Fig. 7). Siksi osoittavat, että hiljentäminen BMI-1 in munasarjasyöpäsoluja onko

in vitro

tai

in vivo

kasvattaa apoptoosin vasteena sisplatiinin.

(A) immunohistokemiallinen värjäys Ki67 ja (B) TUNEL suoritettiin arvioimiseksi soluproliferaation ja apoptoosin. Alkuperäinen suurennus 200X. Kvantifiointi on esitetty graafisesti oikealla. Hoitoryhmissä verrattiin käyttäen Studentin t-testiä ja P≤0.05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Keskustelu

Epäilemättä munasarjasyöpä on Kiusallinen, parantumaton sairaus potilaille, joilla on toistuvia syöpää ja hoitovaihtoehtoja on rajoitettu [1], [43]. Tässä osoitamme BMI-1 geenien tehokas vaihtoehto, joka sisplatiiniin yhdistettynä parantaa terapeuttista tehoa entisestään. Lisäksi me hahmotella mekanismia lisääntynyt herkkyys on pääasiassa ROS tuotanto. Etulinjan kemoterapiaa munasarjasyövän liittyy käytön platina /taksaanin hoito, joiden tiedetään aiheuttavan ROS. Me posit että knockdown BMI-1 osoittautuu tehokkaaksi yhdistelmähoidossa tämän hoito. Tässä yhteydessä tuoreessa raportissa on osoittanut BMI-1 rekrytoidaan aikaista kaksinkertaisen lohkon murtuma laitoksen alue ionisoivan säteilyn vahinkoa [44]. Tuloksemme tukevat ja laajentaa tätä ajatusta ja osoittaa

in vitro

ja

in vivo

että BMI-1 hiljentäminen synergizes lisääntynyt oksidatiivinen stressi, joka johtaa kertyminen DNA-vaurioita ja apoptoosin.

ainakin kaksi aikaisemmin julkaistu havaittu olevan ROS tasoilla neuronien tymosyyteissä ja luuytimen solut eristettiin BMI-1 null hiirillä [28], [29]. Kuitenkin syy tähän ROS tuotanto on vaihtelevasti katsoneet p53 riippuvainen ja riippumaton tukahduttaminen antioksidanttia geenin ilmentymistä tai heikentynyt mitokondrion energetics [28], [29]. Osoitamme tässä, että näiden lisäksi reitit BMI-1 valvoo myös solun GSH tasoilla säätelemällä transkription osallistuvien entsyymien GSH biosynteesipolun. Erityisesti transkriptio GCLM säätää positiivisesti transkription tekijöitä, kuten Nrf-1 ja NFKB. Yhteydessä Bmi-1 pudotus, nämä molemmat transkriptiotekijöitä on vaimentua neuronien ja gliooma soluissa [28], [45]. Näin ollen on mahdollista, että Bmi-1 hiljentäminen johtaa downregulation Nrf-1 ja tai NFKB munasarjan syöpäsolujen, mikä vähentää transkription GCLM mikä vähentää GSH synteesissä. Tärkeää tässä osoitamme, että BMI-1 säätelemällä ROS ja GSH tasoilla suojaa munasarjojen syöpäsolujen kemoterapeuttisten loukkauksista.

DNA-vaurioita vastaus koulutusjakso voidaan aktivoida genotoksisten stressin kaltaisia ​​aiheuttamat kemoterapeuttisten ja oksidatiivisen DNA-vaurioita . Itse aktivointi DDR voi johtaa tauon solusyklin etenemisen, vanhenemista tai apoptoosin. Mukaisesti huomaamme, että dual loukkaus oksidatiivisen aiheuttamien vahinkojen BMI-1 Knockdown ja sisplatiinihoitoon, jonka tiedetään aiheuttavan kaksinkertaisen säikeen katkoksia DNA yhdessä ROS tuotanto vihjeitä kynnystä munasarjasyöpäsoluja kohti apoptoosia indusoimalla fosfory- i ) Chk2 ja H2AX, ii) aiheuttaa ydin- pesäkkeitä muodostusta 53BP1 ja pilkkominen apoptoottisten markkereita, kuten iii) kaspaaseiksi ja PARP.

kuten olemme osoittaneet meidän

in vivo

kokeissa knockdovvn bMI-1 voisi olla käyttökelpoinen kliinisissä yhteyksissä johtuen seuraavista syistä; a) downregulation BMI-1 tehostaa sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin munasarjasyöpäsoluja. b) BMI-1 vaaditaan itseuudistumisen ja ylläpito kantasolujen kuten munasarjasyövän kantasoluja, jotka määritelmän mukaan ovat resistenttejä kemoterapeuttisia [23]. c) BMI-1 säätelee useita eri reittejä pitkin, joista tärkein on induktio telomeraasin johtaa kuolemattomaksi maitorauhasen epiteelisolujen [46]. d) alassäätely BMI-1 johtaa de-tukahduttamisen INK4a, joka koodaa tuumorisuppressorit p16Ink ja p19Arf säätelevien vanhenemista ja apoptoosia [47]. Aktivointi näistä reiteistä on vedottu tärkeä kasvaimia estävä este, koska nämä reitit toimivat proliferaation tehokkaita inhibiittoreita tai etenemisen vaurioituneita soluja. e) Lisäksi olemme posit että sisplatiini ja BMI-1 Laki samankaltaisia ​​polkuja vaikuttaa mitokondrioiden toimintaa ja /tai lisäämällä ROS sukupolvi aiheuttaa DNA-vaurioita johtaa tehokkaaseen apoptoosin induktioon. Kohonnut DNA-vaurion jälkeen lisätä signaalin aloittamista apoptoosin. Täten BMI-1 on tärkeä uusi tavoite hoitoa paitsi solunsalpaajaresistentti munasarjasyövän lisäksi myös muiden pahanlaatuisten kasvainten ominaista yliekspressio BMI-1.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Bmi-1-vasta-aine oli peräisin Zymed, CA, USA. Bmi-1 ja sekoitetun ohjaus siRNA olivat Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Fosfo-H2AX, fosfo-Chk-2, 53 BP1 lohkaista kaspaasin 8, kaspaasi-9 ja PARP-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technologies Inc., MA. Anneksiini /FITC-PI apoptoosin pakki oli peräisin BioVision Inc.

Cell Culture

A-2780 ja CP-70-soluja kasvatettiin RPMI 10% FBS ja 1% antibioottia (penisilliini /streptomysiiniä ) mukaan palveluntarjoajan suositusta. CP-20-solulinjoja kasvatettiin mukaan meidän aiemmin julkaistujen menetelmien [48].

siRNA transfektion

munasarjojen solut A2780 tai CP-70 kasvatettiin niiden väliaineessa yhden päivän ennen transfektiota. Käyttämällä Oligofectamine solut transfektoitiin 25 nM salattu ohjaus tai BMI-1 siRNA. 48 h kuluttua solut käsitellään western blot tai apoptoosin määrityksiä [49].

Western Blot

Korjattu munasarjasyöpäsoluja, sekä käsitellään ja ei-käsiteltyjen, pestiin PBS: ssä ja hajotettiin jääkylmää radioimmunosaostuksella (RIPA-puskuri) kanssa juuri lisätty 0,01% proteaasiestäjäseostabletit (Sigma) ja inkuboitiin jäillä 30 min. Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla 13000 rpm: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti (30-50 ug proteiinia) ajettiin SDS-Page [49].

ROS määritys

<