Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on yksi tappavan syövät. Lisääntyvä ilmaantuvuutta ja kuolleisuutta osoittaa, että paljon on vielä puuttuu havaitsemista ja hallintaa taudin. Tämä johtuu osittain puutteen erityisiä oireita aikana alkuvaiheessa tauti. Useat kasvutekijän reseptoreita on liittynyt haimasyöpä. Täällä olemme tutkineet jos RNA-interferenssi lähestymistapa suunnattu IGF-IR voisi olla tehokas ja toimiva vastaan ​​haimasyövän kasvua ja etäpesäkkeiden. Siihen me arvioitiin vaikutuksia IGF-1 R eston käyttäen Sirna (siRNA: t) kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden LVI ja PANC-1 haimasyövän solulinjoissa. Huomasimme, että hiljentäminen IGF-1 R estää haimasyövän kasvua ja etäpesäkkeiden estämällä avain signalointi polkuja kuten AKT /PI3K, MAPK, JAK /STAT ja EMT. Hiljentäminen IGF-1 R johti anti-proliferatiivinen vaikutus PANC-1 ja LVI haimasyövän solulinjoissa. Matrigel invaasio, siirtokuoppaan muuttoliike ja haavan määritykset paljasti myös rooli IGF-1 R metastasoitunutta ominaisuuksien haimasyövän. Nämä tulokset vahvistettiin lisäksi käyttämällä Western blotting-analyysi keskeisten välituotteiden mukana leviämisen, epiteelin mesenkymaalitransitioon, muuttoliike, ja hyökkäystä. Lisäksi pehmeä agar määritykset osoittivat, että hiljentäminen IGF-1 R on myös estää pesäkkeitä muodostavien ominaisuuksia haimasyöpäsoluissa

in vitro.

Western blotit, sekä, virtaussytometria-analyysi paljasti apoptoosin induktion IGF-1 R: vaiennetaan soluja. Mielenkiintoista, hiljentäminen IGF-1 R tukahdutti myös ilmaus insuliinin reseptorin β. Kaikki nämä vaikutukset yhdessä merkittävästi kontrolloida haimasyövän solujen kasvua ja etäpesäkkeitä. Lopuksi tuloksemme osoittavat merkitys IGF-1 R haimasyövän.

Citation: Subramani R, Lopez-Valdez R, Arumugam A, Nandy S, Boopalan T, Lakshmanaswamy R (2014) Targeting insuliinikaltaiset kasvutekijä 1 -reseptorin Estää Haimasyöpä kasvua ja Metastasis. PLoS ONE 9 (5): e97016. doi: 10,1371 /journal.pone.0097016

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 tammikuu 2014; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2014; Julkaistu: 08 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Subramani et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat Texas Tech University Health Sciences Centerin Paul L. Foster School of Medicine varoja. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvän kuoleman, vaikka se on vain kolmastoista yleisin maligniteetti maailmassa [1]. 5 vuoden elossaolo potilailla, joilla on haimasyöpä alhaisin raportoitu syöpä, joka on vähemmän kuin 1% [2]. Tämä johtuu pääasiassa siitä haimasyöpä on vaikea havaita varhaisessa vaiheessa puutteessa ennakkovaroituksen oireita tai merkkejä [1]. Haiman adenokarsinooma (PDAC), joka on yleisin muoto tämän erittäin aggressiivinen syöpä, on erittäin invasiivinen ja metastaattinen ja on erittäin vastustuskykyinen kaikenlaista olemassa oleviin hoitomuotoihin [3]. Potilaat, jotka ovat diagnosoitu PDAC at vaiheissa on vain vähän toivoa tehokas kirurginen resektio [1] ja muita hoitoja, kuten säteily, kemoterapiaa (gemsitabiini, 5-fluorourasiili, sisplatiini, paklitakseli, dosetakseli, jne.) Tai kohdennettuja hoitoja (Erlotinibi-Tarceva) [4] eivät tällä hetkellä tarjoa paljon hyötyä joko. Oireettoman taudin luonne alkuvaiheessa on varmistettu, että PDAC edelleen tappava ja lähes mahdotonta hoitaa syöpää huolimatta useita yrittää löytää parempia hoitostrategioita [5]. Mukaan viimeisimmän raportin, noin 280000 uutta haimasyöpä tapausta diagnosoidaan maailmanlaajuisesti ilmaantuvuus haimasyövän kasvaa [6], [7]. Lisääntyvä ilmaantuvuutta ja kuolleisuutta osoittaa, että paljon on vielä puuttuu havaitsemista ja hallintaa taudin. Sen vuoksi on ehdottoman välttämätöntä löytää parempia diagnostisia ja terapeuttisia strategioita tämän taudin hoitamiseksi.

Useat kasvutekijän reseptoreita, kuten insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF-1 R), epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) jne, on poikkeavasti ilmaistu monia syöpätyyppejä, mukaan lukien haimasyövän [8]. Lisääntynyt IGF-1 R ekspressiotasot liittyy suurempi riski kehittää erilaisten kasvainten [9]. IGF-1 R signalointi akseli on erittäin aktivoidaan alkuvaiheessa keuhkojen karsinogeneesin, jossa rooli IGF-1 R signalointi osoitettiin, ei ainoastaan ​​primaarikasvaimen muodostumiseen, mutta myös etenemisen aggressiivisempia keuhkoadenokarsinooma [10]. Jie Tang et al., 2013 raportoitiin korkeat ekspressiotasot IGF-1 R kasvain kudosnäytteitä 25 36 potilailla, joilla on munasarjojen epiteelin syövän. He myös raportoitu johdonmukaisesti korkeampi IGF-1: primaarisen syövän hoidossa soluviljelmissä (230 ng /ml) verrattuna normaaliin munasarjakudoksen soluviljelmissä (101,9 ng /ml) [11]. IGF-1 R signalointi aktivoi solunsisäisen signa-, jotka sisältävät inositoli-3-kinaasi (PI3K), AKT, Ras ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) [12], [13]. Nämä reitit säätelevät keskeiset geenien solujen eri toimintoja, kuten lisääntymistä, eloonjääntiä, erilaistumista, transformaatio ja apoptoosin [10]. Lisäksi, IGF-1 R tavoitteet 70-100% ytimen metaboliareitit, jotka ovat usein muuttuneet PDAC synnyssä [14]. Kohdistaminen IGF-1 R on jo osoitettu lisäävän terapeuttisia vaikutuksia mTOR-inhibiittoreiden metastasoituneen munuaissolukarsinooman, [15]. Samoin ihmisen epiteelin munasarjasyöpä, kohdistaminen IGF-1 R antisense nukleotidin vähennetään lisääntymistä 70% ja kyky muodostaa klooneja 10-kertainen [11]. Sekä in vitro ja in vivo järjestelmissä, IGF-1 R-antagonisti (monoklonaalinen vasta-aine MK-0646) on osoitettu merkittävästi alas säädellä X-linked apoptoosi-inhibiittori (XIAP) proteiini, jonka on osoitettu olevan osallisena solujen eloonjäämistä ja inhibition solukuoleman kolorektaalisyövässä [16]. Lisäksi IGF-1 R kohdistettuja hoitomuotoja on jo siirtynyt eteenpäin vaiheen I kliinisissä kokeissa eturauhasen, rinnan, kolorektaalisen, maksa, nivelkalvon sarkooma, jne., [12], [17] – [19] lupaavia alustavia tuloksia. Kuitenkin mahdollinen hyöty käyttämällä IGF-1 R täsmähoitoihin haimasyövän ei ole täysin tutkittu. Lisäksi on vielä riittävästi yksityiskohtaista tietoa koskien tarkkaa molekyylitason mekanismeja, joilla IGF-1 R säätelee haiman syövän syntymistä.

Siksi perustuu yhä enemmän näyttöä varten tehosta kohdistaminen IGF-1 R on laaja syöpiä olemme määrittäneet vaikutukset kohdistuvat IGF-1 R haimasyövän tässä tutkimuksessa. Lopullinen tavoite Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää, onko IGF-1 R signalointi on tehokas terapeuttinen kohde haimasyövän, joilla on potentiaalia kääntää nopeasti kliiniseen käyttöön. Täällä osoittavat selvästi, että esto IGF-1 R ilmentyminen lisää apoptoosia ja estää solujen invaasiota, muuttoliike ja etäpesäkkeiden kautta modulaatio PI3K /AKT, MAPK ja JAK /STAT signalointireitteihin haiman syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki kokeet suoritettiin hyväksyttiin ja suorittaa ohjeiden institutionaalisten bioturvallisuuspöytäkirjan komitean Texas Tech University Health Sciences Centerissä.

Solulinjat ja reagenssit

Ihmisen haiman adenokarsinooma solulinjat, PANC-1 (epithelioid karsinooma), MIA PaCa-2 (karsinooma) ja LVI (adenokarsinooma) hankittiin American Type Culture Collection, ja niitä pidettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10 % FBS, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% hiilidioksidia.

kauttakulkuliikennettä siQUEST transfektioreagenssia hankittiin Mirus Bio (Madison, WI, USA). 6,5 mm: n Transwell 8,0 um huokoskoko polykarbonaattikalvon insertit saatiin Corning Incorporated (Corning, NY, USA). BD Matrigel (Bedford, MA, USA) ja BD Pharmingen anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit I (San Diego, CA, USA) saatiin BD Biosciences. BSA ostettiin Sigma-Aldrich Corporation (St Louis, MO, USA). siRNA kohdistaminen IGF-1 R hankittiin Origene (Rockville, MD, USA). MTS-reagenssia [3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetrazolium] saatiin Promegalta (Madison, WI, USA). Nisäkkään proteiini uuttoreagenssin (MPER) hankittiin Thermo Scientific (Rockford, IL, USA).

Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa: Pakt (sc-101629), AKT (5298), Bcl- 2 (sc-783), Perk, (sc-101760), ERK (sc-94) ja STAT3 (H-190) (sc-7179) (Santa Cruz, CA, USA); IGF-1 R (3027), Notch 2 (4530P), Snail (3879), E-kadheriinin (3195), N-kadheriinin (4061), Zeb (3396), vimentiinistä (5741), Slug (9585), Bax (2772 ), Caspase3 (9661), PARP (9542), pPI3K p85 (4228), PI3K p85 (4292), IR-β (3024), Pirs-1 (2388), IRS-1 (2382), pSTAT3 (ser727) ( 4113), COX-2 (4842), pPTEN (9549), pmTOR (2974), mTOR (4517), p-p70s6kinase (9206) ja p70s6kinase (9202) (Cell Signaling Technology, (Boston, MA); Caspase8 (ab 25901) (Abcam, Cambridge, MA, USA), β-aktiini (Sigma Aldrich, (St.Louis, MO, USA). asianmukaiset toissijainen vasta saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).

haima adenokarsinooma Tissue Array

haima adenokarsinooma kudoksen mikrosiru (TMA) saatiin US Biomax, Inc, Rockville, MD TMA sisältävät formaliinilla kiinnitetyt parafiiniin upotettu näytteitä haiman adenokarsinooma ja normaalin haiman kudoksista tehtiin immunohistokemia (IHC) määrittää IGF-1 R ekspressiotasot. Institutional Review Board hyväksyntä ei tarvinnut käyttää TMA.

immunohistokemia (IHC) B

IHC IGF-1 R-antigeenin suoritettiin käyttäen haima adenocarcionma TMA. TMA inkuboitiin ensin uunissa 58 ° C: ssa 2 tunnin ajan parantaa kudoksen tarttumisen ladattu lasilevyille. Deparaffinization suoritettiin sitten poistaa upotettu väliaineessa käyttäen ksyleeniä inkubaatio 20 minuutin. TMA vähitellen niihin lisätään sarja alkoholia kylpyammeet (100, 95, 70, 50 ja 30%) ja sen jälkeen tislatulla vedellä pestä 5 min. Lämmön epitooppisup- haun kanssa trilogia (Cell Marque, Rocklin, CA) suoritettiin sitten paljastamaan antigeenisten kohtien sisällä kudosleikkeiden. TMA blokattiin TBS, joka sisälsi 1% vasikan sikiön seerumia ja 1% naudan seerumin albumiinia 15 minuuttia. Perox-free-esto-reagenssia (Cell Marque, Rocklin, CA) lisättiin myös 10 min estää ei-spesifisen vasta-aineen sitoutuminen. TMA inkuboitiin IGF-1 R vasta-ainetta (laimennos 1:50) yön yli 4 ° C: ssa. Objektilasit pestiin sitten kolme kertaa PBS: ssä 5 minuutin ajan ja inkuboitiin Ultra Marque polyscan HRP-yhtiö (Cell Marque, Rocklin, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. TMA pestiin sitten kolme kertaa PBS: ssä ja värjättiin kromogeeniliuoksen (Cell Marque, Rocklin, CA) 20 minuutin ajan. Kromogeenin värjäys reaktio pysäytettiin huuhtelemalla tislatulla vedellä. Soluytimet counterstaining suoritettiin hematoksyliinillä inkuboitu 40 sekuntia. TMA huuhdottiin tislatulla vedellä ja kuivattu, joiden sarjanumero etanolilla kylpyjä (30, 50, 70, 95 ja 100%), jonka jälkeen ksyleeni kylpyamme. Lopuksi TMA peitettiin asennuslevyn media (Surgipathilla Medical Industries, Richmond, IL) ja digitaalisten kuvien otettiin käyttäen Nikon Microscope- ECLIPSE 50i.

hiljentäminen IGF-1 R PANC-1 ja LVI Cells

siRNA kohdistaminen IGF-1 R transfektoitiin transientisti PANC-1 ja LVI-soluihin käyttäen Mirus bio TransIT siQUEST transfektioreagenssia. Salattu siRNA (ei-hiljentäminen sekvenssi) käytettiin kontrollina. Lyhyesti, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheytenä 2,5 x 10

5 solua /kuoppa. Solut transfektoitiin eri pitoisuuksina ja eri alatyyppejä (A, B ja C) siRNA vaihtelevat 10-50 nM: ssa 48 tuntia tai 72 tuntia, käyttäen Mirus siQUEST Transfection Reagent. Suhde siRNA ja Transfektio reagenssi ylläpidetään 1:0.5 tehokkaan hiljentäminen ilman toksisuus valmistajan protokollaa. Lopulliset pitoisuudet siRNA valittiin perustuen annos-vaste-tutkimuksissa. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen soluja käytettiin proteiinien eristämiseksi tai kyky muodostaa klooneja, invaasio, ja muuttoliike, tutkimukset. Apoptoosi tutkittiin 48 ja 72 tuntia sen jälkeen, kun hiljentäminen IGF-1 R.

solunelinkykyisyysmääritys

PANC-1 ja LVI-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheytenä 0,3 x 10

4 solua /kaivo ja 0,5 × 10

4 solua /kuoppa, vastaavasti, ja transfektoitu IGF-1 R lopullisessa pitoisuudessa 30 nM alatyypin ”B” ja 50 nM alatyypin ”A” 48 tuntia yhdessä salattu valvontaa. 48 tunnin kuluttua transfektion solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen MTS-määritystä. Absorbanssi luettiin 490 nm, jotta voidaan laskea prosenttiosuuden eläviä soluja.

kyky muodostaa klooneja /pesäkemuodostusta pehmytagarissa

Pesäkkeenmuodostusta määritys suoritettiin, jotta voidaan mitata in vitro selviytymisen kyky yhden solun kasvaa siirtokunnan käynneistä riippumattoman kasvun ympäristössä. Lyhyesti, sen jälkeen, kun transfektoimalla PANC-1 ja LVI-solujen IGF-1 R siRNA tai sekoitetun ohjaus 48 tuntia, näitä transfektoituja soluja siirrostettiin täydelliseen väliaineeseen tiheydellä 2 x 10

4 solut 60 mm maljoille, jotka sisälsivät ylimmän kerros 0,7% agaria, ja pohjakerros 1% agaria. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 3-4 viikkoa, ja sitten värjättiin 0,2% Kristalliviolettiliuos. Siirtomaita yli 20 solusta, laskettiin käsin.

haavan paraneminen Pitoisuus

Solun siirtyvät kyky IGF-1 R vaiennetaan haimasyöpäsoluissa mitattiin käyttämällä scratch määritystä. Lyhyesti, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheytenä 3,5 x 10

5 solua /kuoppa IGF-1 R transfektiota. Tällä tiheys, PANC-1 ja LVI solut saavuttivat yksikerroksista konfluenssin kuluttua 48 × h. Suora haava tai naarmu sitten varovasti luotu yksisolukerrokset steriilillä pipetillä kärjestä. Solut irrotetaan naarmu pestiin kahdesti PBS: llä ja viljelmiä täydennettiin sitten tuoretta alustaa ja tarkkailtiin 96 tunnin ajan 37 ° C: ssa käyttäen bioasema CT (Nikon Instruments Inc. Melville, NY, USA) jatkuvaan havainto. Voon on automaattisesti ohjelmoitu kaapata valokuvia 2 tunnin välein jopa 96 tuntia. Migration kuvat otettiin kiinni ja dokumentoitu eri ajankohtina käyttäen NIS-Element AR ohjelmisto.

Muuttoliike ja invaasiomääritys

vaikutus IGF-1 R siRNA invasiivisista ominaisuuksista haimasyöpäsoluissa arvioitiin käyttämällä siirtokuoppaan muuttoliike ja invaasion määrityksissä. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, PANC-1-soluja ja LVI-solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen FBS-RPMI-1640-väliaine. Migraatiokokeessa, yhteensä 5 x 10

3-solut levytettiin ylä- kammioon siirtokuoppaan kanssa noncoated polykarbonaattimembraanisuoda- (6,5 mm halkaisija insertti, 8,0 ìm huokoskoon, Corning Incorporated). Sillä invaasiomääritys, 2 x 10

4 solut levytettiin yläosassa kammiossa siirtokuoppaan kanssa Matrigel päällystetty (1 mg /ml) polykarbonaattimembraanisuoda-. RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon kemoattraktantti. Kun oli inkuboitu 48 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2, solujen alapinnalle kalvon fiksoitiin 5% formaliinilla ja värjättiin 0,2% kristallivioletilla. Ei-siirretyn solujen ylä- puolella insertin pyyhittiin pois pumpulipuikolla. Kuvia solut, jotka siirtynyt alapinnalle kalvon vangittiin pidennetyn tavalla 5 eri mikroskooppikentäs- 20-kertainen suurennus. Määrä siirtynyt tai tunkeutuu soluihin laskettiin viidestä tai kuudesta satunnaisesti valituilla aloilla pidennetyn tavalla. Kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena tilastollisen merkitsevyyden.

Analyysi Cell Death

vaikutus IGF-1 R hiljentäminen apoptoosiin mitattiin käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit I Solut kerättiin 48 h ja 72 h transfektion jälkeen ja värjättiin sitten anneksiini V-FITC: llä ja propidiumjodidilla mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Prosenttiosuus solukuoleman tai apoptoosin kvantitoitiin käyttäen virtaussytometriä (FACS Accuri C6) [20].

Western-blottaus-analyysi

PANC-1 ja LVI-solut transfektoitiin IGF-1 R siRNA 48 h. Inkuboinnin jälkeen proteiini uutettiin transfektoiduista soluista hajottamalla solukalvon käyttäen nisäkkään Protein Extraction Reagent (MPER) mukaan valmistajan protokollaa. Proteiinikonsentraatio määritettiin kvantitatiivisesti käyttäen BSA standardia metodologiaa. Yhtä suuret määrät proteiinia, ladattiin ja erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvoja. Membraanit blokattiin 5% BSA: lla 1 X TBST 1 h ja tutkittiin paneeli ensisijainen vasta-aineita Pakt, AKT, Bcl-2, Perk, ERK, STAT3, IGF-1 R, Notch 2, Snail, E-kadheriinin , N-kadheriinin, Zeb, vimentiinin, Slug, Bax, Caspase3, PARP, pPI3K p85, PI3K p85, IR-β, Pirs-1, IRS-1, pSTAT3, COX-2, pPTEN, pmTOR, mTOR, pp70s6kinase, p70s6kinase , Caspase8 tai β-aktiini. Kun oli pesty TBS-T, kaivoa inkuboitiin johdetun piparjuuriperoksidaasiin kytketty vasta-aineita ja sitten positiivinen kaistoja visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssia.

Tilastollinen analyysi

ryhmien välisiä eroja analysoitiin parittomalla opiskelijan t-testiä. GraphPad Prism 5 ohjelmistopaketin version 5,03 käytettiin tehdä kaikki tilastollisia laskelmia. Todennäköisyys arvot 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

IGF-1 R ilmentyy voimakkaasti haimasyöpiin

tarkasteltiin ilmentymisen IGF-1 R haiman adenokarsinooma solulinjoissa (LVI, MIA PaCa-2 ja PANC-1) käyttäen western blot. Kaikki kolme solulinjat oli korkea ekspressio IGF-1 R verrattuna normaaliin haima. LVI oli korkein ilmentymä IGF-1 R joukossa kolme haiman solulinjoissa analysoitiin samalla PANC1 oli vähiten ilmentymistä. Joten päätimme käyttää LVI ja PANC1 soluja kaikille kokeisiin perustuen heidän IGF-1 R ilmentyminen (kuvio 1A). Immunohistokemiallinen analyysi IGF-1 R haiman adenokarsinooma kudoksen mikrosiru (TMA) tehtiin edelleen vahvistaa patofysiologista roolia IGF-1 R PDAC synnyssä. PDAC tuumorikudoksista eri vaiheissa osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä IGF-1 R verrattuna normaaliin haiman kudoksista (kuvio 1 B).

(A) Expression IGF-1 R PANC-1, LVI ja MIA PaCa-2 oli verrattuna normaaliin haiman soluja rotan käyttäen western blot. (B) edustaja immunohistokemiallinen analyysi IGF-1 R kasvaimen vaiheesta haiman adenokarsinooma kudoksissa ja normaalin haiman kudosta. (C) PANC-1 ja LVI-solut transfektoitiin kolme valmiista IGF-1 R siRNA: t (A, B ja C) kolme eri pitoisuuksina (10, 30 ja 50 nM) kanssa sekoitetun ohjaus siRNA. Hiljentäminen tehoa IGF-1 R siRNA määritettiin käyttämällä western blot in PANC-1 ja LVI-soluissa. (D) vaikutus IGF-1 R siRNA solujen elinkelpoisuudesta PANC-1 ja LVI. Solut transfektoitiin 30 nM ja 50 nM IGF-1 R siRNA PANC-1 ja LVI-soluissa. Solujen elinkelpoisuus määritettiin 48 tuntia transfektion jälkeen käyttäen MTS määritystä kit. Tulokset esitetty keskiarvona ± keskihajonta (n = 3). (E) inhibitio IGF1 R ilmaisun lohkojen pesäkkeenmuodostuskyvyn valmiuksia haimasyöpäsoluissa, PANC-1 ja LVI. Pehmeä agar määritystä käytettiin tutkimaan pesäkemuodostuksen kykyä PANC-1 ja LVI-soluissa. Neljäkymmentä kahdeksan tunnin kuluttua siRNA transfektion, PANC-1 ja LVI-solujen annettiin kasvaa 0,7%: isessa RPMI-1640-oli täydennetty 10% FBS: ää 16 ja 22 päivää, tässä järjestyksessä. Kuvassa edustavat kuvaa pesäkkeen muodostumisen kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta tehdään kolmena kappaleena. (F) Suhteellinen pesäkkeet sekä PANC-1 ja LVI-solut laskettiin salattu ohjaus (SCR) toimii perustason.

hiljentäminen IGF-1 R käyttämällä siRNA in Haimasyöpä Cell Lines

hiljentää IGF-1 R: ilmaisu, käytimme 3 eri siRNA pitoisuuksina 10-50 nM. Salattu siRNA, joka ei ole kohdistettu mitään geeniä käytettiin kontrollina. siRNA transfektion tehokkuus vaihteli, joka perustuu alatyypin ja pitoisuus siRNA molempien solulinjojen. Näin ollen, IGF-1 R: ekspressiotasot olivat merkittävästi vähentynyt, jonka pitoisuus on 30 nM ”B” ja 50 nM ”A” PANC-1 ja LVI-syöpäsolujen, vastaavasti (kuvio 1C). Näin ollen, nämä kaksi siRNA annokset valittiin kaikissa myöhemmissä tutkimuksissa.

vaimentaminen IGF-1 R indusoi anti-proliferatiivinen vaikutus haimasyövän Cell Lines

Koska IGF-1 R tiedetään stimuloivan solujen lisääntymistä, tutkimme vaikutus hiljentäminen IGF-1 R proliferaatioon haiman adenokarsinooma soluja. Hiljentäminen IGF-1 R laski elinkelpoisuuden haimasyövän soluja 48 tuntia transfektion jälkeen verrattuna sekoitetun siRNA transfektoitujen ohjaus soluja. Vain 45.24% 47.28% soluista oli elinkelpoisia upon IGF-1 R eston PANC1 ja LVI-soluissa, vastaavasti (kuvio 1 D). Anti-proliferatiivista vaikutusta kohdistaminen IGF-1 R on erittäin merkittävä molemmilla erittäin aggressiivinen haimasyövän solulinjoissa. Nämä tulokset viittaavat keskeinen rooli IGF-1 R in leviämisen aggressiivinen haiman syöpäsoluja.

hiljentäminen IGF-1 R Estää Anchorage riippumaton kasvu haimasyöpäsoluissa

Anchorage riippumaton kasvupotentiaalia syöpäsolut on yksi tärkeä ja tunnettu ominaispiirteet transformoitujen solujen. Pehmeä agar määrityksissä PANC-1 ja LVI-soluja suoritettiin sen arvioimiseksi, IGF-1 R Knockdown vaikutteita pesäkkeenmuodostuskyvyn mahdollisuuksia näiden solujen. Hiljentäminen IGF-1 R vähentänyt dramaattisesti pesäkkeitä muodostava määrä kumpaankin haimasyövän solulinjoissa (kuvio 1 E). Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta kvantitoitiin, joka paljastaa 85%: n inhibition pesäkkeitä muodostavaa kykyä IGF-1 R vaiennetaan haimasyövän soluja (kuvio 1 F).

IGF-1 R hiljentäminen suppressio haimasyövän Cell Migration /motiliteettia

(i) Haavan paranemista määrityksessä.

Alennettu pesäkkeenmuodostuskyvyn liittyy yleensä vastaava menetys hyökkäävän valmiuksia syöpäsolujen [20]. Klassinen haavan paranemista määritys suoritettiin testata roolia IGF-1 R säätelyssä leviämiskyky haiman syöpäsoluja. Yksisolukerrokset naarmuuntunut luoda haavan seurata siirtyvät kyky sekä kontrolli- että IGF-1 R tukahdutetaan haimasyövän soluja. IGF-1 R tukahdutetaan PANC-1 ja LVI-solut osoittivat pienentää muuttavien ominaisuuksia verrattuna salattu valvontaa. LVI sekoitetun säätökennoja uudistettu ehjän yksikerroksisen viljelmän 48 h ja PANC-1 sekoitetun säätökennoja uudistettu ehjän yksikerroksisen viljelmän sisällä 96 tuntia. IGF-1 R tukahdutetaan PANC-1 ja LVI-solujen täydellinen yksikerroksinen ei uudistettu vaikka 96 h (kuvio 2A, B B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että hiljentäminen IGF-1 R käyttäminen vähentää maahanmuuttoa kyky, mutta myös invasiivisia ominaisuuksia haiman adenokarsinooma soluissa.

(A) PANC-1 ja LVI soluinvaasiota arvioitiin transwell kammioissa päällystetyn kanssa matrigeeliä. Solut, jotka tunkeutuivat Matrigel päällystettyä insertin kiinnitettiin, värjättiin ja vangiksi 20-kertainen suurennus. (B) määrä hyökkäsi solut laskettiin ja ilmaistiin prosentteina hyökkäystä. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena (C) IGF-1 R hiljentäminen estää ilmentymistä useissa epiteeli- mesenkymaalitransitioon markkereita. Proteiinin kokonaismäärän teissa salattu ohjaus ja IGF-1 R vaiennetaan PANC-1 ja LVI-solut analysoitiin ilmentymisen Notch-2, Snail, E-kadheriinin, N-kadheriini, Zeb, vimentiinin, ja Slug yhdessä sisäisen valvonnan β-aktiini. (D) Densitometic arvot EMT markkereita näkyvät% ilme. PS-PANC-1 Scrambled, PI-PANC-1 IGF-1 R vaiennettu, HS-LVI Scrambled, HI-LVI IGF-1 R vaiennetaan.

hiljentäminen IGF-1 R Blocks epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT ) in haimasyöpäsoluissa

prosessi syöpäsoluinvaasiota on käytössä EMT, joka on aloitteentekijä metastaattisen kaskadin [21]. Solut, jotka käyvät läpi EMT saavuttavat kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia, jotka lisäävät solujen lisääntymistä, etäpesäke, jne. [22]. EMT liittyvät tekijät, kuten Notch-2, Snail, N-kadheriinin, Zeb, vimentiinistä ja Slug vähensi merkittävästi upon hiljentäminen IGF-1 R PANC-1 ja LVI-soluissa (kuvio 3C menetys tämä solu-solunkiinnitysmolekyyli ajatellaan invaasiota ja etäpesäkkeiden [23]. Nämä tiedot osoittavat selvästi, että hiljentäminen IGF-1 R haiman syöpäsoluissa johtaa inhibitioon proteiinien suosimalla haimasyövän EMT.

vaimentaminen IGF-1 R indusoi apoptoosia

asetus apoptoosin haiman syöpäsoluissa analysoitiin upon IGF-1 R hiljentäminen käyttämällä anneksiini V-FITC apoptosis Detection Kit I. virtaussytometrianalyysin osoitti korostunut apoptoosin induktio /solukuoleman IGF-1 R hiljentäminen haiman syöpäsoluissa (45,4%, 55,4% vuonna PANC-1 ja 47,7%, 59,5% vuonna LVI jälkeen havaittiin 48 h ja 72 h transfektion jälkeen, vastaavasti) (kuvio 4A B).

(A) IGF1 R esto indusoi apoptoosin PANC1 LVI soluja. Transfektion jälkeen solut värjättiin anneksiini-V-FITC: llä ja propidiumjodidilla ja sen jälkeen virtaussytometrialla. Prosenttiosuus varhaisen apoptoottisten (alhaalla oikealla neljänneksessä), apoptoottinen (ylhäällä oikealla neljännesympyrä), myöhäinen apoptoottiset ja nekroottinen soluja (ylhäällä vasemmalla neljänneksessä), ja elävät terveitä soluja (alhaalla vasemmalla neljännekseen) esitetään. (B) Osuus apoptoosin ja solukuoleman on tiivistää varten kolmen erillisen kokeen in PANC-1 ja LVI-soluissa. (C) IGF-1 R esto indusoi kuolema reseptorin ja mitokondrioiden välittämän apoptoosin PANC1 LVI soluja. Bax, Bcl-2, kaspaasi 8, kaspaasi 3 ja halkaistut PARP ja β-aktiini ilmentyminen määritettiin käyttäen Western blot IGF-1 R siRNA-transfektoiduissa PANC-1 ja LVI-soluissa. (D) edustaja densitometrian analyysi osoittaa merkittävää voimistumista apoptoosin kautta ulkoisen ja sisäisen polkuja. PS-PANC-1 Scrambled, PI-PANC-1 IGF-1 R vaiennettu, HS-LVI Scrambled, HI-LVI IGF-1 R vaiennetaan.

tunnistamiseksi molekyylimekanismin mukana tässä induktion apoptoosin olemme tutkineet ekspressiokuviota useita apoptoottisten signalointimolekyylien haiman syöpäsoluissa. Solut, jotka oli transfektoitu IGF-1 R siRNA oli merkittävästi lisääntynyt ilmentyminen Bax, kaspaasi 8, Caspase3 ja pilkotaan PARP verrattuna soluihin käsiteltiin salattu siRNA (kuvio 4C F): Densitometri analyysi on myös osoittanut, että oikealle kunkin edustavan kuvan.

AKT on yksi konstitutiivisesti molekyylien moniin syöpiin ja on osoitettu lisäävän pahanlaatuisten soluproliferaatiota [24].