Krooninen sairaus

tiivistelmä

yli-ilmentäminen epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) on tunnusmerkki pään ja kaulan syöpien ja annetaanko lisääntynyt vastus ja huonompi eloonjäämisaste. Huolimatta kohdennettuja aineina EGFR, kuten setuksimabi (C225), lähes puolet hoidetuista potilaista epäonnistuvat tämän terapian, jotka edellyttävät uusia terapeuttisia strategioita. Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) estäjät (PARPi) ovat saaneet viime aikoina huomiota, koska niiden ainutlaatuinen valikoivuus tappaa kasvaimia vialliset DNA: n korjaukseen. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että C225 sytotoksisuutta tehostavan kanssa PARPi ABT-888 UM-SCC1, UM-SCC6, ja Fadu pään ja kaulan alueen syöpä soluja. Mekanismi lisääntynyt alttius C225 ja PARPi käsittää C225-välitteinen väheneminen ei-homologisen end-liittymällä (NHEJ) – ja homologinen rekombinaatio (HR) -välitteisen DNA kaksijuosteisen tauko (DSB) korjaus, myöhemmin pysyvyys DNA-vaurioita, ja aktivointi luontainen apoptoottisen reitin. Tuottamalla DSB korjaus puutos, C225 voi tehdä pään ja kaulan kasvainten solujen herkkiä PARP eston. Yhdistelmä C225 ja PARPi ABT-888 voi siten olla innovatiivinen hoito strategia saattaa parantaa tulosten pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta. Lisäksi tämä strategia voi myös olla mahdollista muita EGFR yli-ilmentävät kasvaimet, mukaan lukien keuhko- ja aivojen syövät.

Citation: Nowsheen S, Bonner JA, LoBuglio AF, Trummell H, Whitley AC, Dobelbower MC, et al. (2011) Setuksimabi täydentää Sytotoksisuus Poly (ADP-riboosi) polymeraasin pilkkoutuminen esto in pään ja kaulan alueen syöpä. PLoS ONE 6 (8): e24148. doi: 10,1371 /journal.pone.0024148

Editor: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Saksa

vastaanotettu: 07 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 05 elokuu 2011; Julkaistu: 30 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Nowsheen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat valtion Alabama Investment Pool toimintaohjelman (IMPACT) palkinnon University of Alabama at Birmingham School of Medicine, Center for Clinical and Translational Science (CCT) ja neuvoston Centerin johtajien (COCD) translaatiotutkimus Intramural Pilot Grant ohjelma (lupanumeroon 5UL1 RR025777-04) NIH National Center for Research Resources, ja kehityshäiriöitä tukea Kattava Cancer Center ja Department of Radiation Oncology yliopiston Alabama at Birmingham School of Medicine (ja ESY). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvutekijän reseptorin (EGFR) on keskeinen rooli syövän synnyssä moduloimalla lisääntymistä, erilaistumista, ja DNA-vaurioita vastaus [1] – [5]. Erityisesti, yli-ilmentäminen ja monistus EGFR on läsnä 80-100% okasolusyöpää pään ja kaulan ja ennakoi huono ennuste, huonompi selviytyminen, radioresistance, ja hoidon epäonnistumisia [3], [6]. Siten EGFR on voimakkaasti kohdistettu syövän terapeuttista strategiaa, ja tämä on parantanut hoitovaste, Paikallista ohjaus, ja kokonaiselossaoloaikaa yhdistettynä säteilyn pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta [2], [7]. Kuitenkin lähes puolet pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta hoidetaan tällä strategialla vielä periksi tätä tautia. Novel strategioita vuoksi tarvitaan tulosten parantamiseksi.

Agents joiden kohteena syöpiä, jotka ovat puutteellisia homologinen rekombinaatio (HR) -välitteisen DNA kaksijuosteisen tauko (DSB) korjausta, kuten poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP ) estäjät (PARPi), ovat saaneet viime aikoina huomiota johtuen niiden erittäin selektiivinen tappaminen BRCA-liittyvä, DNA korjaukseen viallisen kasvaimia säilyttäen vähäinen myrkyllisyys normaaleissa kudoksissa [8] – [10]. Lisäksi PARPi on raportoitu parantaa sytotoksisuutta satunnaista kasvaimissa yhdistettyinä muihin DNA: ta vaurioittavat aineet, kuten platinalla ja syklofosfamidin rintasyövän ja temotsolomidi glioblastoma [11]. Siten paljon vaivaa on tehty laajentaa hyödyllisyyttä PARPi tuolla puolen BRCA liittyvien kasvainten yhdistämällä aineilla, jotka muuttavat DNA-vaurio /korjaus reittejä.

ja muut ovat aikaisemmin raportoitu, että kohdistaminen EGFR polku indusoi DSB korjaus puute [4], [12] – [15]. Näiden havaintojen perusteella, me arveltu, että setuksimabi (C225) estäjä EGFR, voisi lisätä kasvaimen alttiutta PARPi. Tässä tutkimuksessa ja vastaa meidän hypoteesia, osoitamme, että C225 täydentää sytotoksisuus kanssa PARPi ABT-888 UM-SCC1, UM-SCC6, ja Fadu pään ja kaulan syöpäsolut tehostamalla luontainen apoptoottisen reitin. Lisäksi leikkelyn mekanismi solukuolema osoittaa, että C225 vähentää ei-homologisen lopussa liittymällä (NHEJ) – ja HR-välitteinen DNA: n DSB: n korjautumisessa, mikä johtaa pysyvyyteen DNA-vaurion jälkeen, PARPi. Tuottamalla DSB korjaus puutos, C225 voi tehdä pään ja kaulan kasvainten solujen herkkiä PARP eston. Siten yhdistelmä C225 ja PARPi ABT-888 voi olla innovatiivinen hoito strategia saattaa parantaa tulosten pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta. Lisäksi tämä strategia voi myös olla mahdollista muissa EGFR-väärin säädellystä kasvaimia, kuten aivojen ja keuhkojen.

Tulokset

Setuksimabi sytotoksisuutta tehostavan kanssa PARPi

Olemme aiemmin osoittaneet, että C225, anti-EGFR-monoklonaalinen vasta-aine, inhiboi tehokkaasti reseptorin aktiivisuutta estämällä ligandin sitoutumiskohdan [16]. Vaikutus C225 solujen elinkelpoisuuden ja kasvu on myös tutkittu paljon [17]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että EGFR voi antaa lisääntyneen resistenssin DNA-vaurioita tehostamalla solujen DSB korjaus kapasiteetti. Kääntäen, EGFR voi estää DSB korjaus. Näiden havaintojen perusteella, me arveltu, että C225 voivat parantaa sytotoksisuutta kanssa PARPi ABT-888 UM-SCC1, UM-SCC6, ja Fadu soluja, jotka ovat hyvin ominaista, EGFR yli-ilmentävät, edustavat levyepiteelisyövän pään ja kaulan [17 ] – [20].

tämän hypoteesin testaamiseksi, pään ja kaulan alueen syöpä solujen elinkelpoisuuden seuraavat C225 ja ABT-888 tutkittiin käyttäen ATPlite määritystä. Annokset C225 ja ABT-888 valitun on aiemmin raportoitu olevan alueella fysiologinen välillä [2], [7], [9], [21]. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, ero alttius C225 ja ABT-888 havaittiin kaikissa solulinjoissa tutkittiin (50 75% vähennys solujen elinkelpoisuuden yhdistelmähoidon), mikä viittaa siihen, että C225 todellakin kasvaa solukuolemaa kanssa ABT-888. Yllättäen UM-SCC1 solut olivat myös herkkiä PARPi yksin (noin 75% vähennys solujen elinkelpoisuuden 10pM ABT-888).

(A) yhdistelmä C225 ja ABT-888 vähentää elinkelpoisuus UM-SCC1 , UM-SCC6, ja Fadu pään ja kaulan alueen syöpä soluja. Soluja käsiteltiin joko vehikkelillä tai 2,5 ug /ml C225: ssa 16 tuntia ja sen jälkeen altistettu kuljettimelle tai 10 uM ABT-888. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, ABT-888, solujen elinkelpoisuus määritettiin kanssa ATPlite järjestelmän (Perkin Elmer). Kuviossa esitetään edustava data, joka on vähintään 3 itsenäisen kokeen solun elinkelpoisuuden seuraavat erilaisia ​​hoitoja mitattuna suhteessa ATP-tasot (keskiarvo +/- SEM, * p 0,01, ** p 0,001 verrattuna vehikkelikontrolliin). (B-D) yhdistelmä C225 ja ABT-888 vähentää pesäkkeenmuodostuskyvyn (B) UM-SCC1, (C) UM-SCC6, ja (D) Fadu pään ja kaulan alueen syöpäsoluja. Soluja käsiteltiin joko vehikkelillä tai 2,5 ug /ml C225: ssa 16 tuntia. Jälkeen hoitojakson aikana, solut siirrostettiin pesäkkeenmuodostusta varten määrityksiä ja altistettiin eri annoksia ABT-888. Näkyy on keskiarvo hengissäsäilymisosuus (+/- SEM) vähintään 3 riippumatonta pesäkemuodostusta kokeita hoidon (** p 0,001).

Vahvista Näiden havaintojen myös suorittaa pesäkkeitä muodostavien määrityksissä läsnäollessa C225 yhdistettynä eri annoksilla (1-20 uM) ABT-888. Yhdenmukainen solujen elinkykyä tiedot, lisäksi C225 ABT-888 vähensi merkittävästi pesäkkeenmuodostuskyvyn UM-SCC1, UM-SCC6, ja Fadu solujen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 1B-D). Mielenkiintoista, UM-SCC1 solut olivat jälleen erityisen altis ABT-888 yksin. Nämä tulokset osoittavat, että EGFR kanssa C225 voi tehdä soluja herkempiä PARPi ABT-888.

Tehostettu sytotoksisuutta Setuksimabihoitoa ja ABT-888 liittyy aktivaatio sisäisen reaktiotien apoptoosin

selvittämiseksi mekanismi, jolla C225 ja ABT-888 indusoi solun sytotoksisuus, ensin tutkittava aktivoitumista solujen apoptoosin, koska PARPi sytotoksisuus on osoitettu olevan osallisena apoptoottisten reitti [8]. Arvioimme cellular anneksiini V positiivisuus, ensimmäinen merkki apoptoosin induktion. Kuten on esitetty kuviossa. 2A ja 2B, aktivointi apoptoosin oli merkitsevästi suurempi sekä UM-SCC6 ja Fadu solujen C225 ja ABT-888 verrattuna kumpaakin annettaisiin erikseen. Aktivointi apoptoottisten reittien johtaa lopulta pilkkominen kaspaasi 3, joka puolestaan ​​käynnistää kaskadin proteolyysin olennaisena solun proteiinien ja johtaa ohjelmoidun solukuoleman. Sen vahvistamiseksi, että C225 ja ABT-888 apoptoosin pään ja kaulan syöpäsolut, arvioimme veren kokonaiskolesterolia ja pilkkoa kaspaasi 3. Kuten kuviossa. 2C, lisääntynyt katkaistiin kaspaasi 3 kaventumiseen tai kokonaan lohkaisemattoman kaspaasi 3 havaittiin Fadu soluissa 2,5 ug /ml C225 ja 10pM ABT-888. Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien C225 yksin indusoi apoptoosin käsitellyissä soluissa [17], [22]. Samanlainen nousu kaspaasi 3 pilkkominen havaittiin seuraavat C225 ja ABT-888 UM-SCC6 (Fig. 2D).

(A-B)% apoptoottisten solujen seuraavista yhdistelmistä setuksimabi (C225) ja ABT-888 käsittely (A) Fadu ja (B) UM-SCC6 soluissa. Soluja käsiteltiin joko vehikkelillä tai 5 ug /ml C225: ssa 16 tuntia ja sen jälkeen altistettiin 10 uM ABT-888: ssa 24 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut värjättiin sitten ja käsitellään anneksiini V markkerina apoptoosin. Näkyy on% anneksiini V-positiivisten solujen (keskiarvo +/- SEM, * p 0,01, ** p 0,001 verrattuna ajoneuvon ohjaus). Huomattavaa on, että yhdistelmä C225 + PARPi oli tilastollisesti erilainen kuin kummallakaan aineella yksinään (* p 0,01) (C-D) C225 ja ABT-888 nousi apoptoosin (C) Fadu ja (D) UM-SCC6 solujen osoituksena lohkaisemalla kaspaasi 3 (E-F) C225 ja ABT-888 aktivoidaan luontainen apoptoottisen väylän (E) Fadu ja (F) UM-SCC6 solujen osoituksena pilkkomalla kaspaasi 9. solut altistettiin joko ajoneuvoon tai 2,5 ug /ml C225 16 tuntia ja seuraavaksi altistaa ABT-888. 6 ja 24 tunnin kuluttua hoidon aikana, solulysaateista otettiin talteen, ja veren kokonaiskolesterolia ja pilkkoa kaspaasi 3 (24 tuntia) ja 9 (6 tuntia) havaittiin Western blot-analyysi. Dramaattinen samanaikainen väheneminen yhteensä kaspaasi havaittiin myös. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Näkyy on edustava Western blot ainakin 3 itsenäisen kokeen.

On kaksi suurta solujen apoptoottisen prosesseja, jotka koostuvat ulkoisen ja sisäisen reittejä [23]. Ulkoista reitti aktivoidaan proapoptoottiset ligandivälitteinen stimulaatiota solujen kuoleman reseptorien ja puolestaan ​​pilkkominen kaspaasi 8. Sitä vastoin sisäisen reaktiotien laukaisee stressiä signaaleja solun sisällä, mikä johtaa lopulta pilkkominen kaspaasi 9.

Oletimme, että PARPi indusoiman apoptoosin johtuu solunsisäisiä stressiä signaaleja DNA-vauriota, joka johtaa aktivaatioon luontaisia ​​apoptoottisen reitin. Tämän mukaisesti hypoteesin, C225 ja ABT-888 laukaisi lohkaisu kaspaasi 9 Fadu (Fig. 2E) ja UM-SCC6 (Fig. 2F). Nämä tiedot auttaa aktivoimaan luontaisen apoptoottisen reitin seuraava C225 ja ABT-888 käsittelyä.

Setuksimabia homologista yhdistymistä estävä ja ei-homologisen end-liittymällä korjaus

Edellä mainitut tiedot tukevat että C225 sytotoksisuutta tehostavan kanssa ABT-888 ja aktivoi sisäisen reaktiotien apoptoosin. Koska kuolleisuutta kanssa PARPi on raportoitu olevan riippuvainen viallinen DSB korjaus reittejä [8], [10], ja koska EGFR on aiemmin osoitettu muuttavan DNA-vaurioita /vastaus polkuja, me seuraavaksi arveltu, että tehostettu sytotoksisuus kanssa C225 ja ABT -888 johtui C225 muuttaminen DSB korjaus [13].

on 2 suurta DSB korjaus polkuja, HR ja NHEJ välittämä korjaus [24]. HR on hifi mekanismi korjaus ja on edullinen polku kun homologia on läsnä G2 ja S-vaiheen. Useita proteiineja, kuten BRCA1, BRCA2, ja Rad51, ovat mukana tässä monivaiheinen prosessi. Sen sijaan, NHEJ pidetään virhealtista järjestelmää, koska se on rakenteellisesti erilaisia ​​sijoittaa monia erilaisia ​​substraatteja. Se tapahtuu ensi sijassa kun homologia on poissa, ulkopuolella G2 ja S-vaiheen. NHEJ riippuu DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin (DNA-PK) katalyyttinen alayksikkö, The Ku70 /80 heterodimeeri, ja XRCC4-ligaasi-IV monimutkainen.

Voit testata, onko tehostetun sytotoksisuuden C225 ja PARPi käsittää C225-välitteisen esto DSB korjaus, arvioimme vaikutus C225 on HR ja NHEJ välittämä DSB korjaus jälkeen aiheutunut γ-säteilytys (IR), joka on voimakas aktivaattori DNA DSB korjaus. Vaikutusten arvioimiseksi on C225 HR välittämän korjaus, olemme analysoineet kinetiikka IR aiheuttama Rad51 pesäkkeitä, vakiintunut markkereita HR korjaus, eri aikoina Seuraavat 4 Gy IR. Kuten on esitetty kuviossa. 3, IR prosenttiosuus kasvoi solujen Rad51 pesäkkeitä, korkeimmillaan 4-8 tunnin kuluttua IR. Yhdenmukainen hypoteesia, C225 vaimenee HR yli 50% säteilytettyä UM-SCC1 (Fig. 3A), UM-SCC6 (Fig. 3B), ja Fadu (Fig. 3C) pään ja kaulan alueen syöpäsoluja. Nämä tulokset paljastivat, että C225 indusoi HR vaje, että matkapuhelinverkon alttius PARPi seuraavat C225 oli yhdenmukainen PARP esto kohdistaminen soluja, jotka ovat puutteellisia HR välittämän korjaus.

C225 vaimentaa IR aiheuttama Rad51 pesäkkeitä, hyvin tunnettu markkereita homologisen rekombinaation (HR) -välitteisen DNA: n DSB korjaus (A) UM-SCC1, (B) UM-SCC6, ja (C) Fadu soluja. Soluja käsiteltiin ajoneuvon, 2,5 ug /ml C225, tai 5,0 ug /ml C225: ssa 16 tuntia ja sen jälkeen altistettiin pilkkaatte tai 4 Gy säteilytyksellä (IR). Ilmoitettuina ajankohtina IR, solut käsiteltyjen immunofluoresenssivärjäystä Rad51 pesäkkeitä. Näkyy on edustava data 3 itsenäistä kokeissa% soluista (keskiarvo +/- SEM), jossa 10 pesäkkeitä (* p 0,05, ** p 0,01 verrattuna ajoneuvon kussakin vastaavassa ajankohtana). Insertti (A) on edustava kuva UM-SCC1 solujen joilla Rad51 pesäkkeitä seuraavat IR.

PARP esti soluja on myös raportoitu olevan alttiita estäjiä DNA-PK, kriittinen pelaaja in NHEJ [25]. Tämä viittaa siihen, että NHEJ voi olla vaihtoehto DSB korjaukseen liittyvän reitin lisäksi HR ja resistenssiä PARPi. Lisäksi, EGFR on raportoitu olevan vuorovaikutuksessa ja translokoida DNA-Pk tumaan aktivoida NHEJ korjautumisprosessit [13], [26], [27]. Näin ollen on mahdollista, että C225-välitteistä solujen herkkyys PARPi johtuu myös C225 muuttaminen NHEJ kautta.

vaikutusten analysoimiseksi C225 on NHEJ, arvioimme kinetiikka fosfo-treoniini 2609 (Thr2609) DNA-PK pesäkkeitä, vakiintuneita markkereita IR-indusoidun NHEJ-välitteisen korjaus [28], [29], eri ajankohtina seuraavat 4 Gy IR. Kuten odotettua, IR lisäsi merkittävästi solujen lukumäärän fosfo-Thr2609-DNA-PK-pesäkkeitä sekä 30 minuutin ja 1 tunnin kuluttua IR UM-SCC1 (Fig. 4A), UM-SCC6 (Fig. 4B), ja Fadu (Fig. 4C). Mielenkiintoista on, että lisäämällä C225 vaimensi merkittävästi tätä vastetta yli 30% kaikissa solulinjoissa tutkittiin.

C225 vaimentaa säteilytys (IR) aiheuttaman DNA-Pk Thr2609 pesäkkeitä, vakiintunut markkereita ei-homologisen end liittymällä (NHEJ) -välitteisen DNA: n DSB korjaus (A) UM-SCC1, (B) UM-SCC6, ja (C) Fadu pään ja kaulan alueen syöpäsoluja. Soluja käsiteltiin ajoneuvon, 2,5 ug /ml C225, tai 5,0 ug /ml C225: ssa 16 tuntia ja sen jälkeen altistettiin pilkkaatte tai 4 Gy IR. Ilmoitettuina ajankohtina seuraavien IR solut käsiteltyjen immunofluoresenssivärjäyksen DNA-Pk Thr2609 pesäkkeitä. Näkyy on edustava data 3 itsenäistä kokeissa% soluista (keskiarvo +/- SEM), jossa 10 pesäkkeitä (* p 0,05, ** p 0,01 verrattuna soluihin ei altistu C225). (D) C225 vähentää fosfo-Thr2609 DNA-PK-tasot UM-SCC6 pään ja kaulan alueen syöpäsoluja. Soluja käsiteltiin ajoneuvon tai 2,5 ug /ml C225: ssa 16 tuntia ja sen jälkeen altistettiin pilkkaatte tai 4 Gy IR. Tunnin jälkeen, IR, soluja käsiteltiin Western blot analyysi fosfo-Thr2609 DNA Pk tasoilla. Kokonais-DNA Pk analysoitiin myös, ja tubuliinia käytettiin lastaus ohjaus.

EGFR on myös osoitettu fosfory- ja aktivoimaan DNA-Pk [13], [26], [27]. Sen määrittämiseksi, onko inhibitio NHEJ jonka C225 johtuu vähentää fosforylaation DNA-PK, tutkimme seuraavaksi tasoja fosfo-DNA-Pk seuraavat C225. Kuten on esitetty kuviossa. 4D, C225 vähentää DNA-PK-fosforylaation muuttamatta kokonais-DNA-Pk UM-SCC1, UM-SCC6, ja Fadu soluja, joka on johdonmukainen C225-estoa NHEJ-välitteisen korjaus.

Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että C225 indusoi DSB korjaus puutos 2 suurten DSB korjaus polkuja, NHEJ ja HR, ja parannettu sytotoksisuuden C225 kanssa PARPi johtuu eston sekä suuret DSB korjaus polkuja.

EGFR esto lisää DNA vahinko

C225 indusoi DSB korjaus puute pään ja kaulan alueen syöpä soluja (Fig. 3 ja 4). Oletimme, että C225-käsitellyt solut tulisi osoittaa lisääntynyttä markkereita DNA DSB: itä. Arvioida DNA DSB: iden, tutkimme vaikutus C225 on γ-H2AX pesäkkeitä, jotka ovat hyvin dokumentoituja merkkiaineiden DNA DSB: t [30] ja UM-SCC1, UM-SCC6, ja Fadu solulinjat. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, kaikki solulinjat osoittivat huomattavasti DNA-vaurion jälkeen, C225 osoituksena suuremman prosenttiosuuden solujen γ-H2AX pesäkkeitä annoksesta riippuvalla tavalla. Tämä vahvistettiin kautta Western blot -analyysillä, joka paljasti lisääntynyt γ-H2AX tasoille erilaisten annosten C225 UM-SCC1, UM-SCC6, ja Fadu solut (Fig. 3B). Nämä tulokset osoittivat, että EGFR kanssa C225 lisää DNA: n DSB vaurioita käsitellyissä soluissa, mikä on sopusoinnussa C225 inhiboivan vaikutuksen DSB korjaus.

(A) C225 lisää määrä solujen DSB osoituksena γ -H2AX pesäkkeitä, yleisesti käytetty merkkiaine DSB. Näkyy on edustava data 3 itsenäistä kokeissa% soluista (keskiarvo +/- SEM), jossa 10 pesäkkeitä (* p 0,05, ** p 0,01 verrattuna ajoneuvon ohjaus). (B) C225 kasvattaa γ-H2AX proteiinin tasot käsitellyissä soluissa. UM-SCC1, UM-SCC6, ja Fadu soluja käsiteltiin ajoneuvon, 2,5 ug /ml C225, tai 5,0 ug /ml C225: ssa 16 tuntia. Jälkeen hoitojakson aikana, soluja käsitellään (A) immunofluoresenssivärjäystä γ-H2AX pesäkkeitä tai (B) Western blot analyysi γ-H2AX tasoilla. Näkyy on edustava Western blot 3 itsenäisen kokeen.

Yhdistelmä setuksimabin ja ABT-888 tuottaa pysyviä DNA-vaurioita

PARPi estää pohjan Leikkauskorjauksessa koulutusjakson vastuussa päätöslauselman DNA single katkeamisen (SSBs). SSBs joka itsepintaisesti jakamalla solut lopulta muunnetaan DSB: ihin ja korjattu HR välittämän korjaus. Koska C225 vähentää DSB korjaus kapasiteetti ja että C225 sytotoksisuutta tehostavan kanssa ABT-888, me arveltu, että yhdistelmä C225 ja ABT-888 johtaisi edelleen jatkuva DNA: n DSB vaurioita. Arvioida tämän, teimme ajankulku analyysi γ-H2AX pesäkkeitä ajoneuvon, C225 yksin, ABT-888 yksinään tai yhdistelmänä C225 ja ABT-888. Kuten on esitetty kuviossa. 6, verrattuna auton hallinnan C225 yksin odotetusti aiheuttama 2-3 kertainen% solujen lisääntynyt DNA-vaurioita UM-SCC1 (Fig. 6A), UM-SCC6 (Fig. 6B), ja Fadu (Fig. 6C) pään ja kaulan alueen syöpä soluja. Mielenkiintoista, yhdistelmä C225 ja ABT-888 johti huomattavasti suurempi määrä solujen pysyviä DNA-vaurioita kaikissa solulinjoissa tutkittiin (Kuva. 6). Lisäksi UM-SCC1 soluja (Fig. 6A), mikä osoitti hieno herkkyyttä ABT-888 yksin, oli myös pysyviä DNA-vaurioita kanssa ABT-888 yksin. Sen sijaan UM-SCC6 (Fig. 6B) ja Fadu (Fig. 6C) soluja, ABT-888 yksinään ei johtanut merkittävään kasvuun solujen selvää, DNA: n DSB vaurioita. Nämä tulokset osoittavat, että sytotoksisuus päässä C225 ja PARPi voi johtua siitä, ettei käsiteltyjen solujen ratkaista DNA DSB: ihin, kriittisin leesion soluissa.

(A-C) DNA-vaurion 2, 24, ja 48 tunnin seuraavat ajoneuvo, C225, PARPi, tai molemmat C225 + PARPi arvioitiin γ-H2AX pesäkkeitä (A) UM-SCC1, (B) UM-SCC6, ja (C) Fadu soluja. Soluja käsiteltiin ajoneuvon tai erilaisten annosten C225: ssa 16 tuntia ja sen jälkeen altistettu kuljettimelle tai erilaisten annosten ABT-888. Ilmoitettuina aikoina seuraavat PARP esto solut käsiteltyjen immunofluoresenssivärjäystä γ-H2AX pesäkkeitä. Näkyy on edustava data 3 itsenäistä kokeissa% soluista (keskiarvo +/- SEM), jossa 10 pesäkkeitä (* p 0,05, ** p 0,01 verrattuna vehikkelikontrolliin kussakin vastaavassa ajankohtana).

Effects setuksimabin ja ABT-888 DNA vaurioita ja korjaus ei johdu solusyklin uudelleenjako

DNA korjaus reittejä, erityisesti HR, voi olla riippuvainen solusyklin. Lisäksi, EGFR on osallisena solujen lisääntymisen polkuja, ja EGFR on osoitettu indusoivan solusyklin uudelleenjako [4], [31], [32]. On mahdollista, että esto HR by C225 voi olla epäsuora vaikutus lisääntyi solujen kerääntyminen G1 vaiheessa solusyklin. Meillä on siis tutkinut solusyklin jakautumisen käsiteltyjen solujen ajoneuvon tai C225 poissulkemiseksi solusyklin vaikutuksia mahdollisena sekoitin, jonka C225 muuttaa DNA: n DSB korjaus. Kuten on esitetty kuviossa. 7, on se, ettei mitään solukierron uudelleenjaon hoidon jälkeen in UM-SCC1 (Fig. 7A) tai UM-SCC6 (Fig. 7B) tilille C225 välittämää vähentäminen DSB korjaus tuolloin pisteet, joissa HR korjaus oli mitattuna.

Cell cycle jakelu (A) UM-SCC1 tai (B) UM-SCC6 solujen käsittelyn jälkeen ajoneuvon tai C225. (C) Cell cycle jakelu UM-SCC1 soluissa ajoneuvo, C225, ABT-888, tai yhdistelmä C225 ja ABT-888. Soluja käsiteltiin ajoneuvon tai erilaisten annosten C225: ssa 16 tuntia ja sen jälkeen altistettu kuljettimelle tai 5 uM ABT-888. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia seuraavat PARP inhibition, soluja käsitellään solusyklin analyysi virtaussytometrialla. Näkyy on edustava solusyklin jakelu (keskiarvo +/- SEM) vähintään 2 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena.

ABT-888 on myös raportoitu aiheuttavan vanhenemista yhdistettynä säteily rintasyövässä soluihin [33]. Lisäksi muut PARPi voi aiheuttaa G2 /M kertymistä soluihin [34]. Siten voidaan arvioida solusyklin muuttuu toinen mahdollinen tehostetun sytotoksisuuden, solusyklin jakelu seuraavan yhdistelmän C225 ja ABT-888 tehtiin UM-SCC1 soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 7C, ei solukierron uudelleenjako havaittiin. Nämä tulokset osoittivat, että C225 aiheuttama vaimeneminen DSB korjaus reittejä ja myöhemmin parannettu sytotoksisuus kanssa ABT-888 eivät johtuneet solusyklin vaikutuksia.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että C225 , estäjä EGFR, täydentää solujen alttiutta PARPi ABT-888 pään ja kaulan syöpäsoluja. Mekanismi tehostetun sytotoksisuuden mukana C225-välitteisen vaimennus kahden suuren DNA: n DSB korjaus polkuja, NHEJ ja HR, mikä johtaa pysyvyyteen DNA-vaurion jälkeen, PARPi ja myöhemmin aktivoitumisen sisäisen reaktiotien apoptoosin. Siten yhdistelmä C225 ja PARPi ABT-888 voi olla innovatiivinen hoito strategia saattaa parantaa tulosten pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta. Tämä yhdistelmä C225 ja ABT-888 voi olla erityisen jännittävää hoito, jotka sisältävät muita DNA: ta vaurioittavat aineet, kuten säteilyä.

EGFR on liitetty useita soluprosesseja, mukaan lukien solujen lisääntymisen ja eloonjäämisessä, angiogeneesissä, ja DNA-vaurioita vastaus ja korjaus. Erityisesti, mitä tulee DNA-vaurioita vastaus, EGFR on osoitettu tumaan ja vuorovaikutuksessa DNA-Pk aktivoida NHEJ [13], [26], [27]. Aktivoidut EGFR voi myös lisätä Rad51 pesäkkeet ja ekspressiotasoja säädellä HR [35]. Nämä toimet EGFR on katsottu johtuvan vastuksen EGFR monistaa /mutatoitua kasvainten DNA: ta vaurioittavat aineet ja antaa perusteet kohdennettua EGFR.

tueksi rooli EGFR DNA vaurioita ja korjaus polkuja, C225 , joka estää EGFR, vaimentaa kahden suuren DNA: n DSB korjaus polkuja, HR ja NHEJ, muuttamalla Rad51 ja DNA-Pk pesäkkeitä tasoilla, vastaavasti. C225 esti myös DNA-Pk fosforylaatiota. Kuten PARPi on osoitettu kohdistaa HR-vajaiden solujen, toimien C225 HR välittämän korjaus antaa perustelut sille, miksi uuden yhdistelmän C225 ja PARPi sytotoksisuutta tehostavan pään ja kaulan syöpäsolut [8], [9]. Lisäksi PARP esti solujen on osoitettu olevan herkistetty inhibiittorit NHEJ reitin, viittaa siihen, että NHEJ voi olla myös varmuuskopio polku ratkaisemattomia SSBs [25]. Tämä saattaa myös selittää dramaattinen sytotoksisuus havaittiin C225 ja PARPi käsiteltyjä soluja. Lisäksi, kuten C225 indusoi sekä NHEJ ja HR korjaus puute, yhdistelmä C225 kanssa PARPi johtaa suuren osuuden käsiteltyjen solujen pysyviä DSB. Kun otetaan huomioon nämä havainnot, solut altistetaan C225 ja PARPi olisi kauniisti alttiita muiden DNA: ta vaurioittavat aineet, kuten säteilyä. Tämä on alue aktiivisen tutkimuksen laboratoriossamme.

C225 ja PARPi myös parannettu apoptoosin, mikä on yhdenmukaista aikaisempien raporttien PARPi sytotoksisuus [8]. Olemme havainneet, että tämä apoptoosi oli seurausta aktivointi sisäisen reaktiotien. On syytä huomata, että suuruus apoptoosin säätelyyn ei saavuta sytotoksisuudesta mitattuna pesäkkeen muodostumista määrityksiä. Useita eri reittejä pitkin, muut kuin apoptoosin voivat vaikuttaa pesäkkeenmuodostuskykyyn solujen, kuten soluproliferaation inhibointi, solusyklin pysähtymisen mitoosin katastrofin, ja autophagy. Tämä ero voi selittyä myös ajatus, että toisin kuin analyysi pesäkkeitä tai immunoblottauksella, mikä osoittaa vaikutusta snap shot ajoissa, pesäkemuodostusta heijastaa useita mekanismeja solukuoleman aikana 3 viikkoa. Koska useita signalointireittien osallistuvat sääntelyn ja määrittäminen kohtalosta solukuoleman tai eloonjääminen, meidän tietojen mukaan EGFR voi olla yksi osa monimutkaista solusignalointia /DNA-vaurioiden korjaus verkko, ja voi auttaa vain osittain kokonaisvaikutus solun DNA-vaurioiden alttiuden. On siis todennäköistä, että PARPi ja EGFR estäminen saattaa säädellä useita sytotoksisia reittejä. Esimerkiksi, ABT-888 yhdessä säteilyn on myös osoitettu indusoivan autophagic solukuoleman keuhkosyövän soluihin [36]. Näin ollen myös muut mekanismit solukuoleman, kuten autophagy, ei voida sulkea pois.

Koska PARP on SSB DNA korjaus entsyymi, hoidon PARPi ABT-888 odotetaan estävän SSB korjaus- ja siten lisätä pohjapinta tasoilla SSBs. Lisääminen C225 johtaa edelleen DNA-vaurioita. Lisääntynyt DNA-vaurioita havaittiin enää ajankohtina saattaa johtua pysyviä DSB: ihin tai tulos lisä-DNA-palojen seurauksena muuntaminen SSBs että DSB: ihin aikana yritetty DNA korjaukseen tai romahtanut replikointi haarukat. Tämä tukee lisääntynyt% solujen γ-H2AX pesäkkeitä myöhempinä ajankohtina. Vaihtoehtoisesti, aktivaatio solukuoleman prosessien, kuten apoptoosi voi myös aiheuttaa markkereita DNA-vaurion.

Mielenkiintoista, UM-SCC1 pään ja kaulan alueen syövän solut osoittavat alttiuden PARPi yksin. Nämä solut eivät luonnostaan ​​DSB korjaa puutteellinen, arvioituna IR aiheuttama Rad51 ja DNA-Pk pesäkkeitä. Kuitenkin PARPi yksin indusoi pysyviä γ-H2AX pesäkkeitä, viittaavia läsnäolon jatkuva DSB. On kiehtovaa olettaa, että muut molekyyli- determinantit PARPi alttius riippumaton luontaista DNA korjaukseen viat täytyy olla olemassa. Yksi monista mahdollisuuksista on äskettäin raportoitu kasvoi käyttöasteen tukahduttavaa E2F4 /p130 kompleksit BRCA1 ja RAD51 promoottorien läsnä PARPi, mikä lisää solun herkkyyttä hapettumista estämällä varmuuskopio DSB korjaus reittejä [37].

viime vuosien, yhdistyksen välillä ihmisen papilloomavirus (HPV) ja pään ja kaulan alueen syöpä on jähmettynyt [38], [39]. Mielenkiintoista, HPV liittyy pään ja kaulan alueen syövät näytteille parempaa ennustetta ja näyttävät vastata paremmin chemoradiation [40]. Oletetaan, että tämä johtuu HPV onkoproteiineja ja muuttaminen DNA-vaurioita /vaste reitit [41], [42]. Mielenkiintoista on, että E7 ilmentyminen on osoitettu häiritä E2F4 ja p130 tukahduttavaa aktiivisuutta ja estää PARPi-välitteisen downregulation BRCA1 ja Rad51 [37]. Kuitenkin vuorovaikutus kaikkien HPV-onkogeenien ja DNA-vaurioita vastaus voi johtaa erilaisiin alttius DNA-vaurioita. Siten olisi mielenkiintoista arvioida herkkyys HPV: hen liittyvän kasvaimia PARPi.

Tutkimuksemme osoittaa, että EGFR kanssa C225 sytotoksisuutta tehostavan kanssa PARPi ABT-888 pään ja kaulan syöpäsolujen kautta C225- välittämää häiriöitä HR ja NHEJ välittämä DSB korjaus reittejä. Nämä tulokset takaa tulevien tutkimusten verrata tehoa verrattuna perinteiseen kemoterapiaan. Vielä tärkeämpää on, ylläpitämällä elämänlaatu on tullut painopistealueena onkologian käyttöön kohdennettuja, kuten C225 ja ABT-888 voi edelleen parantaa terapeuttista suhdetta. Lopuksi tämä strategia voi myös olla mahdollista muissa kasvaimissa poikkeavaan EGFR signalointi, kuten aivojen ja keuhkosyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen pään ja niskan levy- sinoomasolulinjoja UM-SCC1 ja UM-SCC6 saatiin: Dr. Thomas E Carey (University of Michigan, Ann Arbor, MI). Ne pidettiin DMEM (GIBCO, Invitrogen), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Atlanta Biologicals) ja 1% penisilliiniä /streptomysiiniä (Invitrogen). Ihmisen pään ja kaulan levyepiteelikarsinoomasolu line Fadu (HTB-43) saatiin ATCC: stä (Manassas, VA) ja pidettiin RPMI-1640 (GIBCO, Invitrogen), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. PARP inhibiittori ABT-888 (Enzo Life Sciences) ja setuksimabi (C225, Bristol Myers Squibb) hyödynnettiin tutkimuksessamme.

elinkykyyn

Solujen elävyys mitattiin käyttäen ATP-lite 1 vaiheessa luminesenssi määritys (Perkin Elmer) valmistajan ohjeiden.