Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sulindaakilla on FDA-hyväksytty steroideihin tulehduskipulääke on dokumentoitu syövänvastainen toimintaan. Viimeaikaisten tutkimusten mukaan sulindaakki selektiivisesti parantaa tappaminen syöpäsolujen altistuvat hapettavat aineet kautta reaktiivisten hapen lajien (ROS), mikä johtaa mitokondrioiden. Tämä vaikutus sulindaakin ja oksidatiivisen stressin syöpäsoluihin saattavat liittyä vika hengitykseen syöpäsoluissa, on ensimmäisenä kuvannut Warburgin 50 vuotta sitten, tunnetaan Warburg vaikutus. Me olettaisi, että sulindaakki voisi parantaa valikoivaa tappaminen syöpäsolujen yhdistettynä tahansa yhdiste, joka muuttaa mitokondrion hengitystä. Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme käyttäneet diklooriasetaatti (DCA), joka tunnetaan siirtää pyruvaatti aineenvaihduntaa päässä maitohapon muodostumista hengityksen. Voisi olettaa, että DCA, koska se stimuloi aerobista aineenvaihduntaa, saattavat rasittaa mitokondriaalisen hengityksen syöpäsoluissa, mikä johtaisi tiiviimpään tappaminen läsnäollessa sulindaakin. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että yhdistelmä sulindaakin ja DCA parantaa valikoivaa tappaminen A549 ja SCC25 syöpäsolujen käytetyissä olosuhteissa. Ennustetusti mekanismi tappaminen liittyy ROS tuotanto, mitokondrioiden, JNK signalointi ja kuoleman apoptoosin. Tuloksemme viittaavat siihen, että sulindaakki-DCA lääkeyhdistelmä voi tarjota tehokkaan syövän hoitoon.

Citation: Ayyanathan K, Kesaraju S, Dawson-Scully K, Weissbach H (2012) yhdistelmä Sulindaakilla ja diklooriasetaattia osumalla syöpäsoluja kautta hapettumista. PLoS ONE 7 (7): e39949. doi: 10,1371 /journal.pone.0039949

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 elokuu 2011; Hyväksytty 4. kesäkuuta 2012 Julkaistu: 17 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Ayyanathan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus apu National Institutes of Health KA (avustus 5K01CA95620) ja HW (avustus R15 CA122001) ja Floridan osavaltion HW (SURECAG avustus R94007) suorittamaan tämän työn kiitettävällä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sulindaakilla on FDA-hyväksytty ei-steroidiset anti-inflammatorinen lääkeaine (NSAID), joka on myös osoitettu olevan syövän vastaista aktiivisuutta [1] – [6]. Viimeaikaiset tutkimukset laboratoriossamme ovat osoittaneet, että RKO, A549 ja SCC25 syöpäsolulinjoissa esillä herkkyyttä yhdistelmä sulindaakin ja hapetinta, kuten TBHP tai H

2O

2 [7]. Tiedot osoittivat, että sulindaakki vaikutus ei liittynyt sen NSAID toimintaan mutta sulindaakki tehty syöpäsolujen herkempiä oksidatiivisen stressin seurauksena mitokondrioiden ja elinkelpoisuuden menettämiseen. Sen sijaan normaalit solut eivät osoittaneet parannettu tappaminen samanlaisissa olosuhteissa [7]. Viimeisten 10 vuoden aikana on ollut hajallaan raportteja tehostetun syövän tappaminen käyttämällä sulindaakki yhdessä erilaisia ​​yhdisteitä kuten arseenitrioksidilla bortetsomibi, difluorometyyliornitiini (DFMO) ja suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA) [8] – [14]. Vaikka nämä yhdisteet ovat eri paikoissa toiminnan, yhteinen mekanismi sulindaakki /lääkeyhdistelmä parannettu tappaminen saattaa liittyä hapettumista, kun ilmeni selvästi meidän aikaisempien tutkimusten avulla sulindaakki ja hapetusainetta [7], [15]. Itse asiassa, ROS ovat sekaantuneet tutkimuksissa käyttäen sulindaakki yhdistettynä arseenitrioksidilla bortetsomibi ja SAHA [10], [12], [14].

Aikaisemmat tulokset ehdottivat, että tehostettu tappaminen syöpäsolujen yhdistelmällä sulindaakin ja hapetusainetta voi johtua viasta hengityksen syöpäsoluissa, ensimmäisenä kuvannut Warburgin yli 50 vuotta sitten [16], joka totesi, että syöpäsolut suosivat Glykolyysivaiheen, ei hengitys, saada energiaa, toisin kuin normaalit solut. Jotkut syöpäsolut saadaan jopa 50% niiden energiasta Glykolyysivaiheen, kun taas glykolyysiä normaaleissa soluissa osuus on alle 5%: n energiantarpeesta [16]. Saadakseen lisänäyttöä mahdollisista rooleista muuttuneen hengityksen ja ROS tappaminen syöpäsolujen sulindaakki ja oksidatiivisen stressin, aloitimme tutkimukset natrium dikloorietikkahappoa (DCA). DCA on ihanteellinen ehdokas, koska se on tunnettua inhiboida kinaasia, että alas säätelee toimintaa pyruvaattidehydrogenaasin, jolloin siirtymä pyruvaattia aineenvaihdunnan päässä maitohapon muodostumista kohti hengitys [17], [18]. DCA on käytetty kliinisesti potilaiden hoitoon maitohappoasidoosi [19], ja perustuu sen biokemialliset ominaisuudet DCA on myös testattu syöpälääke. Bonnet et al. 2007 ovat osoittaneet, että DCA kääntää Warburg vaikutus syöpäsoluissa suuntaamalla syöpä solujen aineenvaihduntaa glykolyysistä peräisin oksidatiivisen fosforylaation. Näissä aiemmissa tutkimuksissa on osoitettu, että DCA kohottavat ROS monimutkaisia ​​I. Tämä puolestaan ​​laukaisee ”remodeling” mitokondrioiden aineenvaihduntaa (vähentää ΔΨm, avaa mitokondrioiden siirtyminen pore) syöpäsoluissa työntää niitä kohti apoptoosin. Lisäksi useat viimeaikaiset tutkimukset ovat varmistaneet, että DCA voi lisätä ROS tasoja syöpäsoluissa ja depolarisoi mitokondriot kalvo keuhkojen, kohdun limakalvon, ja glioblastoomasolulinjoissa johtaa apoptoosin sekä

in vitro

ja

in vivo

[18], [20] – [22]. Kiinnostava oli havainto, että käytetyissä olosuhteissa DCA ei näytä merkittävästi vaikuttavan mitokondrioiden aineenvaihduntaan tai elinkelpoisuutta normaaleissa soluissa [18], [23].

Perustuen aikaisemmat huomautukset syövän tappaminen vaikutus sulindaakin ja hapettava aine, joka vaikuttaa mitokondrioiden aineenvaihdunta [7], me arveltu, että yhdistelmä sulindaakin ja DCA voi synergisesti parantaa syövän tappaminen ja on tärkeä terapeuttinen arvo. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutus käyttämällä sulindaakin yhdistettynä DCA elinkelpoisuudesta A549 ja SCC25 syöpäsolun linjat. Olemme myös tutkineet rooli mitokondrioiden toimintaa ja apoptoosin syövän tappaminen havaittu tämän lääkeyhdistelmää.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Sulindaakilla, N-asetyylikysteiini ja Tiron hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). DCA natriumsuola saatiin yhtiöltä Acros Organics (Geel, Belgia). H2DCFDA ja JC-1 hankittiin Molecular Probes (Eugene, OR). MTS-reagenssilla ja päättyvää Tunel Kit saatiin Promegalta (Madison, WI). Sytosoliin /mitokondrioita fraktiointi kit ja CBA077 InnoCyte ™ Virtaussytometrinen Sytokromi

c

Release kit olivat Calbiochem, Gibbstown, NJ. Kaikki soluviljelyalustoissa naudan sikiön seerumia, ja muita lisiä kuten penisilliini /streptomysiini, glutamiini, jne. Hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD).

A549 ja SCC25 syöpäsoluja, normaalin keuhkokudoksen solut ja ihmisen orvaskeden keratinosyyttejä hoidettiin konsentraatiot DCA: n läsnä tai poissa ollessa sulindaakin (Sul) 48 tunnin ajan. Solujen elävyys seurattiin MTS-määritys, kuten on mainittu Methods. Solujen elävyys ilmoitetaan% valvonnan (soluja, joita ei käsitelty sulindaakki). Virhepylväät ovat vakiona keskivirhe (SEM) ilmoitettuna% keskimääräisestä arvosta nelinkertaisesti edustavasta kokeesta. Elinvoimaisten solujen on havainnollistettu A549 syöpäsoluja (A), SCC25 syöpäsoluja (B), normaali keuhko-solut (C) ja normaaleissa ihmisen orvaskeden keratinosyyttejä (D). ♦, -Sul; ▪, + Sul. * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,0005.

Cell Culture

Ei pienisoluisen keuhkosyövän solulinjaa (NSCLC), A549, The normaalia ihmisen keuhkojen solulinja, MRC-5 ja kieli-johdettu okasolusyöpä linja, SCC25 hankittiin ATCC: ltä (Rockville, MD) ja pidettiin F12-K väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM glutamiinia, 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä kostutetussa, 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Normaalit ihmisen orvaskeden keratinosyyttejä saatiin Promocell GmbH (Heidelberg, Saksa) ja ylläpidetään suositeltu viljelyväliaineessa. Varhainen passage, ei-kuolemattomaksi normaalit solut käytettiin kokeita.

A549 ja SCC25 syövän soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla DCA: n läsnä tai poissa ollessa sulindaakkisulfoni (SulS) 48 tunnin ajan. SulS käytettiin lopullisessa pitoisuudessa 250 uM A549-syöpäsoluja ja 75 uM SCC25 syöpäsoluja. Solujen elävyys seurattiin MTS-määritys, kuten on kuvattu menetelmät. Solujen elävyys ilmoitetaan% valvonnan (soluja, joita ei käsitelty sulindaakkisulfoni). Virhepylväät ovat vakiona keskivirhe (SEM) ilmoitettuna% keskiarvosta kolmen rinnakkaisen edustavasta kokeesta. Elinvoimaisten solujen on havainnollistettu A549 syöpäsoluja (A) ja SCC25 syöpäsolujen (B). ♦, -SulS; ▪, + SulS. * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,0005.

solunelinkykyisyysmääritys

A549 syöpä ja keuhkojen normaalin solut maljattiin 3 x 10

3 solua kuoppaa kohti, kun taas SCC25 syöpäsolujen ja normaalien keratinosyyttien maljattiin 7,5 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppaiselle levylle. Soluja kasvatettiin 18-20 tuntia, väliaine heitettiin pois aseptisissa olosuhteissa ja korvattiin tuoreella viljelyalustalla, joka sisälsi ilmoitetun lääkkeen yhdistelmät. Milloin on osoitettu 500 uM sulindaakki käytettiin A549-syöpä ja keuhkojen normaalien solujen ja 100 uM sulindaakki käytettiin SCC25 syövän ja normaali keratinosyyttisoluja. Levyjä inkuboitiin 48 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Viljelyalusta poistettiin ja solut huuhdeltiin 1 x PBS: ssä. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä CellTiter 96 Aqueous One Cell Proliferation Assay (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Määritys käyttää tetratsoliumyhdisteen, joka on muunnettu vesiliukoinen formatsaaniksi, jonka toiminta solujen dehydrogenaasien läsnä metabolisesti aktiivisten solujen [24]. Formatsaanisakka kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi 490 nm: ssä käyttämällä kolorimetristä mikrotiitterilevylukijaa (SpectraMax Plus, Molecular Devices). Tausta-absorbanssi vähennettiin kustakin näytteestä.

solunsisäinen mittaus ROS

A549 ja SCC25 syöpäsolulinjoissa maljattiin edellä kuvatulla tavalla. Sen jälkeen, kun 48 tunnin lääkehoitoa, soluja inkuboitiin 50 uM dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (H

2DCFDA, Molecular Probes) indikaattori väliaineessa 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut huuhdeltiin PBS: lla ja ROS tasot visualisoitiin fluoresenssimikroskopialla. Kuvat otettiin kiinni käyttäen Qcapture ohjelmistoa ja käsitellä Adobe Photoshop. Kuva-analyysi tehtiin käyttäen slidebook ohjelmistoa. Saadut tiedot edustavassa kokeessa käytettiin kvantifiointia varten DCF-positiivisten solujen mitattuna vihreän fluoresenssin johtuen hapettuneen DCF.

Top paneelit (A) esittävät tulokset A549-syöpäsoluja ja pohjalevyjen ( B) kuvaavat tulokset SCC25 syöpäsoluja. Solut käsiteltiin osoitetulla lääkkeiden pitoisuuksia ja käsitellään fluoresenssimikroskopialla, kuten on kuvattu menetelmät. Laajuus solunsisäisten ROS tasot esitetty vihreä fluoresenssin havaittiin soluissa, joita käsiteltiin ilman lääkkeitä (alapaneeleja A1 ja B1), sulindaakki yksinään (alapaneeleja A2 ja B2), DCA yksinään (alapaneeleja A3 ja B3) ja sulindaakki ja DCA yhdistelmähoitona (alapaneeleja A4 ja B4). Useat riippumattomat kentät olivat photomicrographed ja edustavat kenttiä kullekin tilalle on esitetty.

JC-1 Värjäys Monitori Mitokondrioiden kalvojännite

Mitokondrioiden kalvon potentiaali määritettiin käyttämällä JC-1 väriaine ( Molecular Probes). A549 ja SCC25 syöpäsolulinjoissa maljattiin edellä kuvatulla tavalla. Sen jälkeen, kun 48 tunnin lääkehoitoa, soluja inkuboitiin 5 ng /ml JC-1 väriaineen merkkivalo väliaineessa 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut huuhdeltiin PBS: lla ja visualisoitiin fluoresenssimikroskopialla. Normaali mitokondriot aktiivisesti vievät JC-1 väriainetta mahdollinen riippuvaisella tavalla ja muodostavat J-aggregaatteja, joka antaa punaisen fluoresenssin. Häiriöt ja sen jälkeen mitokondrion kalvon potentiaalia johtaa lisääntyneeseen vihreän fluoresenssin sytosoliin johtuen monomeerisen JC-1, joka on määritetty sen jälkeen, kun ulkonäkö vihreän fluoresenssin käyttäen FITC suodattimen (Zeiss käännettyä mikroskooppia-Axiovert 40 CFL). Kuvankaappaus, käsittelyyn ja analysointiin suoritettiin kuten edellä. Saadut tiedot edustavassa kokeessa käytettiin kvantifiointia varten JC-1-vihreä-positiivisia soluja.

Top paneelit (A) esittävät tulokset A549-syöpäsoluja ja pohjapaneelit (B) kuvaavat tulokset SCC25 syöpäsoluja. Mitokondrioiden kalvon mahdollinen tappio havaittiin muutos JC-1 aiheutuva jakelun lisääntymiseen vihreän fluoresenssin (katso menetelmät). Koeolosuhteita JC-1 värjäystä ja fluoresenssimikroskopialla selitetään yksityiskohtaisesti alla Menetelmät ja huumeiden hoito-ohjelmat kuvataan alla paneelit. Käsittelemättömät solut (alapaneeleja A1 ja B1), soluja käsiteltiin sulindaakilla (sub-paneelit A2 ja B2), soluja käsiteltiin DCA (sub-paneelit A3 ja B3), ja soluja käsiteltiin sulindaakilla ja DCA (alapaneeleja A4 ja B4). Useat riippumattomat kentät olivat photomicrographed ja edustavat kenttiä kullekin tilalle on esitetty.

vaikutus ROS Scavengers on elinkykyyn läsnäolossa Sulindaakilla ja DCA

A549 ja SCC25 syöpäsolulinjoissa maljattiin edellä kuvatulla tavalla. Sitomiseksi ROS joko 2 mM N-asetyylikysteiini (NAC) tai 2 mM Tiron (4,5-dihydroksi-1,3-bentseenidisulfonihappodinatriumsuolaa) lisättiin yhdessä sulindaakki ja DCA 48 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solujen elinkelpoisuus valvoo MTS-määritys ja tilastollinen analyysi suoritettiin, kuten edellä on mainittu.

TUNEL Värjäys voidaan seurata apoptoosin alaisten solujen

TUNEL-määritys suoritettiin 96-kuoppaisilla levyillä käyttäen DeadEnd kolorimetristä tunel määritys kit (Promega) valmistajan protokollaa. A549 ja SCC25 syöpäsolulinjat maljattiin kuten edellä ja käsiteltiin 48 tuntia ilman lääkettä, sulindaakin DCA tai lääkeyhdistelmä. Sen jälkeen, kun lääkehoitoa, solut kiinnitettiin formaliinilla ja läpäiseviksi 0,2% Triton X-100 PBS: ssä. Soluja inkuboitiin rekombinantti-terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) ja biotinyloidun nukleotidin. Endogeeninen peroksidaasit blokattiin 0,3% H

2O

2 ennen inkubointia piparjuuriperoksidaasiin-streptavidiini (HRP-streptavidiini), joka sitoutuu biotinyloidun nukleotidin sisällytetty koloja päättyy läsnä apoptoosin alaisten solujen. HRP-streptavidiini leimatut solut detektoitiin vetyperoksidia ja diaminobentsidiini (DAB). Solut, jotka osoittavat tummanruskea tumavärjäystä ovat ohjeellisia apoptoosin.

A549 ja SCC25 syövän soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla DCA puuttuessa (harmaa palkki) tai läsnä sulindaakin (musta palkki) tai läsnä sulindaakki ja N-acetylcysteine ​​(raidallinen bar) 48 tuntia. Solujen elävyys seurattiin MTS-määritys, kuten on mainittu Methods. Solujen elävyys ilmoitetaan% valvonnan (soluja, joita ei käsitelty sulindaakki). Virhepylväät ovat vakiona keskivirhe (SEM) ilmoitettuna% keskimääräisestä arvosta nelinkertaisesti edustavasta kokeesta. Esto syöpäsolun kasvua tapahtui annosriippuvaisesti aikana yhdistelmä hoitoon DCA ja sulindaakin (mustat palkit) sekä A549 syöpä (A) ja SCC25 syöpäsolujen (B). Tämä parannettu tappaminen estettiin kun N-asetyylikysteiini oli läsnä lääkeaineen yhdistelmähoidon (viivoitetut pylväät A ja B).

Western Blot analyysi

Solut kasvatettiin 70 % konfluenssiin, käsiteltiin määritelty lääkkeitä ilmoitettu kestot, ja sytosolin fraktiot eristettiin käyttäen sytosoliin /mitokondrioiden fraktiointi kit (Calbiochem, Gibbstown, NJ) seuraten valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut kerättiin eri ajankohtina ja sentrifugoitiin sitten 600 x g: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pelletoidut solut suspendoitiin toimitettua puskuria ja inkuboitiin 10 minuutin ajan jäillä. Sitten solut homogenoitiin käyttäen lasista douncer ja homogenaattia sentrifugoitiin 700 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa sedimenttiin ytimet ja solujäte. Supernatantti sentrifugoitiin 10 000 x g 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa, jolloin saatiin mitokondrioiden pelletti ja supernatantti pidetään sytosolifraktion. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä standardia Bradfordin menetelmällä.

Kuusikymmentä mikrogrammaa kokonais-proteiinia ladattiin ja erotettiin 4-12% NuPage Bis-Tris geeleillä (Invitrogen, Eugene, OR) ja siirrettiin PVDF-kalvolle, joka seulottiin ensisijaisen vasta-aineita. Primaaristen vasta-aineiden JNK, pJNK, sytokromi

c

, ja PARP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), käytettiin 1:1000 laimennus. p-aktiini, (Santa Cruz Biotekniikka, Santa Cruz, Kalifornia), käytettiin 1:4000 laimennus. Piparjuuriperoksidaasi konjugoitu sekundäärisen vasta-aineita käytettiin ja kaistoja visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- menetelmä (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Top paneelit (A) esittävät tulokset A549-syöpäsoluja ja pohjapaneelit (B) kuvaavat tulokset SCC25 syöpäsoluja. Laajuus solujen apoptoosin seurattiin TUNEL värjäys käsiteltyjen solujen ei huumeita (alapaneeleja A1 ja B1), sulindaakki yksinään (alapaneeleja A2 ja B2), DCA yksinään (alapaneeleja A3 ja B3), ja sulindaakki ja DCA (alapaneeleja A4 ja B4). Soluja käsiteltiin osoitetuilla lääkkeiden mainitut paneelit, altistettiin TUNEL värjäys, ja käsitellään fluoresenssimikroskopialla, kuten on kuvattu menetelmät. Useat riippumattomat kentät olivat photomicrographed ja edustavat kenttiä kullekin tilalle on esitetty. Brown-värjättyjen solujen osoittavia soluja apoptoosin.

Ligaatioseoksista välittämää PCR-tekniikkaan perustuva DNA Laddering- Pitoisuus Monitori laajuus apoptoosin alaisten solujen

Vahvista laajuuden apoptoosin, ligation- välitteisen PCR perustuu nukleosomaalisia DNA-tikapuiden määritys suoritettiin, kuten on kuvattu [25]. A549 ja SCC25 syöpäsolulinjat maljattiin 5 x 10

4 ja 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti 35 mm ruokia. A549 syöpäsolut hoidettiin 48 tunnin ajan) ilman lääkettä, b) 500 uM sulindaakin c) 20 mM DCA, ja d) 500pM sulindaakki plus 20 mM DCA. Vastaavasti, SCC25 syövän soluja käsiteltiin edellä mainittujen neljän eri lääkeaineen yhdistelmiä, paitsi että sulindaakki ja DCA käytettiin 100 um, ja 10 mM pitoisuuksien, vastaavasti. Hoidon jälkeen koko solun DNA uutettiin, ligoitiin adapteri rakennettu 27-mer 5′-GACGTCGACGTCGTACACGTGTCGACT-3 ’ja 12-mer 5’AGTCGACACGTGTAC-3’. Jälkeen ligaatio DNA kuumennettiin vapauttaa 12-mer, täynnä Taq-polymeraasin, suoritettiin semi-kvantitatiivisen PCR:, ja analysoitiin 1,2% agaroosigeelillä yhdessä kokomarkkereina.

In situ

lokalisaatio sytokromi

c

immunofluoresenssillä

solunsisäinen sijainti sytokromi

c

seurattiin immunofluoresenssilla käyttämällä CBA077 InnoCyte ™ Virtaussytometrinen sytokromi

c

Release Kit mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, SCC25 solut maljattiin 3,5 x 10

5 solua per 35 mm: n lasin pohjalle astian ja käsiteltiin osoitetuilla lääkkeet 15 tuntia. Solut huuhdeltiin 5 ml: lla 1 x PBS: llä ja permeabilisoidaan jäillä 10 min 300 ul: ssa mukana puskuria. Solut kiinnitettiin huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan 500 ul: aan 4% paraformaldehydiä. Pesun jälkeen, ja esto, soluja inkuboitiin 250 ui anti-sytokromi c: n vasta-ainetta (1:500 laimennos) 1 tunnin ajan RT: ssä. Pesun jälkeen soluja inkuboitiin 300 ui FITC-IgG: tä (1:300 laimennos) 1 tunnin ajan RT: ssä. Lopuksi solut värjättiin 300 ul: DAPI (1 mg /ml) 10 minuuttia huoneenlämpötilassa. Solut visualisoitiin käyttäen Olympus käänteinen fluoresenssimikroskoopilla. Kuvat otettiin ja käsiteltiin kuten edellä on mainittu. Useita kenttiä analysoitiin ja edustava micrographs osoittaa lokalisoinnin kuviot sytokromin

c

samoilla hoito-olosuhteilla saatiin. Quantitative arvot esitetään tekstissä.

. SCC25-soluja käsiteltiin 48 h sulindaakilla (100 uM) ja osoitetut konsentraatiot DCA ja jossa ilmoitettu 20 uM JNK-inhibiittori, SP600125. ♦, Ei huumeiden; ▪, sulindaakki; ▴, sulindaakki ja SP600125. Solujen elävyys seurattiin MTS-määritys, kuten on mainittu Methods. Virhepylväät ovat vakiona keskivirhe (SEM) ilmoitettuna% keskimääräisestä arvosta nelinkertaisesti edustavasta kokeesta. Katso teksti yksityiskohtia. Tilastollinen analyysi välillä ♦, ei lisäksi ja ▪, Sul; * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,0005. Tilastollinen analyysi välillä ▪, Sul ja ▴, sulindaakki ja JNKI-;

$ p 0,05,

$$ p 0,005,

$$$ p 0,0005. B. tyypillisen western blotit kuvaa vaikutusta sulindaakin ja DCA tasoista koko JNK, phopsho-p46JNK ja phopsho-p54JNK. p-aktiini tasot käytettiin sisäisenä kontrollina. Solulimafraktiot alkaen SCC25 soluja eristettiin 12 tunnin aikapisteessä ja tasot JNK ja fosfo-JNK määritettiin western blottauksella. Vuonna SCC25 solulinjassa, yhteensä JNK osoitti kaksi erillistä bändejä 46 ja 54 kDa.

Tilastollinen analyysi ja määritys Yhdistelmä Indeksit

Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM solun elinkelpoisuuden määritykset. Tilastoanalyysiin Minitab tilasto-ohjelmalla käytettiin suorittamaan Studentin t-testiä ja arvot p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Sen varmistamiseksi synergistisen vaikutuksen sulindaakin ja DCA A549 ja SCC25 syöpäsolulinjat, määrällinen analyysi annos-vaikutus-suhde suoritettiin määrittämään yhdistelmä indeksien [26]. Sekä sulindaakki ja DCA testattiin yksin A549 ja SCC25 soluja annettuina pitoisuuksina. A549-soluja, suhteessa 1:50 ylläpidettiin sulindaakki: DCA lääkkeen yhdistelmät vaihtelevat 0,2 mM: 10 mM enintään 1 mM: 50 mM, vastaavasti. Sillä SCC25 solujen suhde 1:100 ylläpidettiin sulindaakki: DCA lääkeyhdistelmät 0,05 mM: 5 mM enintään 0,3 mM: 30 mM, vastaavasti. Meidän kokeellisia tuloksia ja määritetty yhdistelmä indeksin arvo sisältyy tekstiin.

Tulokset

Sulindaakilla ja DCA syy Enhanced tappaminen A549 ja SCC25 Syöpäsolut, mutta ei normaalien solujen

näitä tutkimuksia testasimme yhdistelmä sulindaakin ja DCA A549 ja SCC25 syöpäsoluja. Soluja inkuboitiin kunkin yhdisteen yksinään tai yhdessä 48 tuntia, ennen kuin ne analysoidaan elinkelpoisuuden (katso menetelmät). Sulindaakki annos-vaste-käyrä näissä olosuhteissa osoitti, että A549 ja SCC25 syöpäsolut voivat sietää pitoisuus on enintään 500 uM ja 100 uM sulindaakin, vastaavasti, osoittamatta mitään merkittävää tappamista (tuloksia ei ole esitetty), ja nämä pitoisuudet on käytetty kaikissa opinnot. DCA, kun se lisätään, käytettiin pitoisuuksina 0-40 mM, kuten on osoitettu. Käytimme Näiden pitoisuuksien perustuu aikaisempien raporttien, mikä osoitti, että yli 5 mM tarvitaan aiheuttamaan mitokondriohäiriöitä

in vitro

kokeiluja [27]. Kuten kuviossa 1A on esitetty, DCA yksinään (ei sulindakki) on jonkin verran myrkyllistä A549 syöpäsoluja, erityisesti yli pitoisuudet 20 mM, mutta kun läsnä on sulindaakin siellä on parannettu tappamista näiden solujen DCA pitoisuus on yli 5 mM. Siinä tapauksessa, että SCC25 syöpäsolujen joitakin solun elinkyvyn menetykseen kanssa DCA yksin nähtiin jopa DCA pitoisuuksina alle 10 mM (kuvio 1 B). Kuitenkin, kun läsnä on sulindaakin oli taas merkittävä kasvu solukuoleman, joka oli selvästi havaittavissa välillä DCA pitoisuuksia 2-10 mM. Aikaisemmin osoitimme, että yhdistelmä sulindaakin ja hapetinta oli valikoiva syöpäsoluja ja ei tehostanut tappaminen normaalien solujen [7]. Sulindaakki ja DCA ei myöskään parantaa tappaminen normaalin keuhkojen ja ihon solujen koeolosuhteissa käytetään, kuten on esitetty kuvioissa 1 C ja D. On huomattava, että MRC-5 (keuhko normaali) solut ovat erityisen herkkiä DCA, kuten raportoitu aiemmin [28] syistä, jotka eivät ole tiedossa.

jos haluat varmistaa, että oli synergistinen vaikutus, kun lääkeyhdistelmää käytettiin, päätimme yhdistelmä indeksit suorittamalla kvantitatiivinen analyysi annos-vaikutus-suhde [ ,,,0],26] kahdella eri syöpäsolulinjoissa (kuva S1). Yhdistelmä indeksit olivat 0,84 varten A549 ja 0,73 varten SCC25 syöpäsoluja, vastaavasti. Jos arvo on alle 1,00 osoittaa synergististä syöpä tappava vaikutus (kuva S2).

Euroopan Sulindaakilla Vaikutus ei johdu sen NSAID Activity

Aikaisemmissa tutkimuksissa käyttäen sulindaakki ja hapetusainetta osoitettiin että tehostettu ja selektiivinen tappaminen syöpäsolujen sulindaakki ja hapettava aine, joka ei liity tunnettujen NSAID kykyä sulindaakin. Roolin määrittämiseksi COX inhibition sulindaakki metaboliitti, sulindaakkisulfoni, voidaan käyttää, koska se ei estä COX 1 tai 2 [7], [29]. Kuten kuviossa 2 on esitetty, käyttämällä sekä A549 (A) ja SCC25 (B) syöpäsolut, yhdistelmä sulindaakkisulfoni ja DCA oli samanlainen tappava vaikutus, kuten edellä on todettu sulindaakilla. Nämä tulokset osoittavat, että sulindaakki parannettu syöpä tappava vaikutus läsnäollessa DCA ei liity sen tunnettujen tulehdusta ehkäisevä vaikutus.

Yhdistäminen Sulindaakilla ja DCA tuottaa ROS

synergiavaikutusta elinkelpoisuutta havaittiin sulindaakki ja diklooriasetaattia sekä A549- ja SCC25 syöpäsoluja on silmiinpistävän edellisiin tutkimuksiin käyttäen yhdistelmää sulindaakin ja TBHP [7]. Sen määrittämiseksi, ovatko ROS tuotanto oli mukana valikoiva tappaminen noudatettu käsiteltävänä olevassa tutkimuksessa, tuotanto ROS, käyttämällä indikaattoria väriaine H

2DCFDA (katso menetelmät), määritettiin syövän solulinjoissa altistuvat sulindac ja DCA. Tulokset on esitetty kuviossa 3. Kuviossa 3A on esitetty tulokset A549-syöpäsoluja. On selvää tulosten kuviossa 3A, että käsittelemätön A549 syöpäsolujen (paneeli A1), tai solut, joita käsiteltiin sulindaakilla yksinään (paneeli A2), tai DCA yksinään (paneeli A3), osoittavat vain muutamia positiivisesti värjäytyneiden solujen. Kuitenkin, kun solut altistettiin Sekä sulindaakki ja DCA (paneeli A4), suuri lisäys positiivisesti värjäytyneiden solujen ROS (vihreä fluoresenssi) nähdään, mikä osoittaa, että läsnäolo molempien sulindaakin ja DCA johtaa sukupolven merkittäviä määriä ROS. Kuten kuviossa 3B on esitetty samanlaisia ​​tuloksia nähty SCC25 syöpäsoluja. Sulindaakilla tai DCA yksin johtaa pieneen kasvuun ROS tuottavissa soluissa (kaistat B2 ja B3), mutta suuri lisäys ROS tuotanto on jälleen havaittu, kun molemmat lääkkeet lisätään (paneeli B4). Kvantifiointi käyttäen SCC25 soluja, osoittaa, että määrä DCF-positiivisten solujen (katso menetelmät) on 9-10 x enemmän, kun soluja käsitellään sulindaakilla ja DCA verrattuna lääkkeistä kutakin yksinään (katso kuvio S3A). Ilmenee näistä tuloksista ja aikaisempien tutkimusten että ROS tuotanto voi olla yhteinen piirre tehostetussa tappaminen syöpäsolujen kun sulindaakki käytetään yhdessä yhdisteiden kanssa, jotka vaikuttavat mitokondrioiden toimintaan.

Sulindaakilla yhdistelmähoidossa DCA Seurauksena mitokondrion kalvon Mahdolliset

Jos ROS tuotanto on osallisena sulindaakki /DCA tehostunutta tappava vaikutus voisi odottaa, että tuotanto ROS mukaan lääkeyhdistelmän vaikuttaisi mitokondrioiden toimintaan. Sen määrittämiseksi, tämän, mitokondrion kalvon potentiaali mitattiin käyttäen JC-1-värjäyksellä, kuten on kuvattu menetelmät. Menetys membraanipotentiaalille on merkitty vihreän fluoresenssin lisäys Menetelmät kuvatulla tavalla. Tyypillinen tulos on esitetty kuviossa 4. Sekä A549 ja SCC25 syövän solut altistettiin sulindaakki ja DCA joko yksinään tai yhdessä 48 tuntia ja värjättiin JC-1 valvomiseksi mitokondrion kalvon potentiaalia. Kuvio 4A esittää tulokset A549 syövän solulinja. Koska lääkeaine, mitokondriot näyttävät ehjä ja säilyttää kalvojännite kuten vähältä vihreän fluoresenssin (paneeli A1). Läsnäollessa sulindaakin yksinään (paneeli A2) tai DCA yksinään (paneeli A3) on pieni vihreän fluoresenssin lisäys, mikä osoittaa jotkut mitokondrion kalvon potentiaalia. Kuitenkin, kun sekä sulindaakki ja DCA ovat läsnä on silmiinpistävä mitokondrion kalvon potentiaalia osoituksena suuri kasvu vihreän fluoresenssin (paneeli A4). Havaitsimme samaa kaavaa, kun useita itsenäisiä kenttiä analysoitiin fluoresenssimikroskopialla. Kuvio 4B esittää samanlaisiin tuloksiin SCC25 syöpäsoluja. Jälleen merkittävä mitokondrion kalvon potentiaalia havaittiin ainoastaan ​​silloin, kun solut altistettiin sekä sulindaakki ja DCA (paneeli B4). Kvantifiointi vaikutus on esitetty kuvassa S3B. Voidaan nähdä, että prosenttia JC1 vihreä positiivisia soluja, kun lääkkeen yhdistelmää käytetään 3-4 x, joka nähdään joko lääkkeellä yksin.

ROS lopetukseen osallistuvan syöpäsolujen yhdistämiseen sulindaakki ja DCA

Tuottaa enemmän suoraa näyttöä siitä, että ROS tuotetut ovat mukana tehostetun tappaminen syöpäsolujen sulindaakki ja DCA, olemme käyttäneet kahta tunnettua ROS scavengers, N-asetyylikysteiini (NAC) ja Tiron ( katso menetelmät). Tuloksia käyttämällä NAC on esitetty kuviossa 5. Kuvio 5, paneeli A osoittaa, että sekä 20 ja 30 mM DCA, parannettu tappaminen A549 syöpäsolujen havaittu, kun läsnä on sulindaakin, on suurelta osin välttää, jos NAC (2 mM) on esittää vuoden 48 tunnin inkubaatioiden. Hyvin samanlaisia ​​tuloksia on nähty SCC25 syöpäsoluja, kuten on esitetty kuviossa 5, paneeli B. Vastaavia tuloksia saatiin, kun Tiron sijasta käytettiin NAC (kuvio S4).

sulindaakki ja DCA tappaminen Cancer Cells johon liittyy apoptoottinen kuolema

edellä olevat tulokset (kuviot 3, 4, 5) osoittavat, että parannettu tappaminen syöpäsolulinjoja liittyy mitokondrioiden, jotka viittaavat siihen, että havaittu solukuolema on apoptoosin kautta. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että sulindaakki ja sen johdannaiset ovat proapoptoottiset huumeita [5], [6]. Lisäksi kerrotaan, että DCA voi aiheuttaa solukuolemaa apoptoosin [20], [23]. Voit selvittää, onko tappaminen syöpäsolujen yhdistämällä näiden kahden lääkkeen, jota välittävät ROS, liittyy apoptoottisen kuoleman suoritimme TUNEL värjäys apoptoosin mittaamiseksi (katso menetelmät). Useita näytteitä testattiin sulindaakki ja DCA yksin tai yhdessä, että TUNEL värjäystä kokeet. Tyypillinen tulos on esitetty kuviossa 6, jossa ylin paneeli (kuvio 6A, paneelit A1-A4) edustaa tulokset A549-syöpäsoluja ja pohjapaneelit (kuvio 6B, paneelit B1-B4) esittävät tulokset, jossa SCC25 syöpä