Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

ohjelmoidun solukuoleman 4 (PDCD4), alun perin tunnistettiin neoplastisen transformaation estäjä, oli heikennetty eri syöpätyyppeihin. Aikaisemmat tutkimus osoitti jatkuva alas-säätely PDCD4 ilmentymisen sekvenssi normaalin-rajatapaus-pahanlaatuinen munasarja- kudosnäytteistä ja merkittävä korrelaatio PDCD4 ilmaisun kanssa tautivapaan elinajan. Tavoitteena olevassa tutkimuksessa oli tutkia tarkemmin toiminta ja modulaatio PDCD4 vuonna munasarjasyöpäsoluja.

Keskeiset havainnot

osoittaneet, että kohdunulkoinen PDCD4 ilmaisu esti merkitsevästi solujen lisääntymisen indusoimalla solusyklin pysähtymisen G

1 vaiheessa ja ylös-säätely solusyklin estäjiä p27 ja p21. Solujen migraation ja invaasion myös inhiboi PDCD4. PDCD4 yli-ilmentäviä soluja osoittivat kohonnutta fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) ja estivät proteiinikinaasi B (p-Akt). Lisäksi ilmaus PDCD4 oli säädelty ja se vietiin sytoplasmaan kun seerumin vieroitushoitoa, mutta se loppuu nopeasti kautta proteasomaalisten hajoamisen yhteydessä seerumin antamista uudelleen. Hoidettaessa fosfoinositidi-3-kinaasi (PI3K) estäjä esti hajoamista PDCD4, osoittaa osallistumista PI3K-Akt-reitin modulointi PDCD4.

Johtopäätös

PDCD4 voi olla kriittinen toiminto pidättämisessä solusyklin etenemistä keskeisissä Checkpoint, estäen siten solujen lisääntymistä, sekä tukahduttaa kasvaimen etäpesäke. PI3K-Akt-reitin oli hiljaista olla mukana säätelyssä PDCD4 hajoamisen munasarjasyöpäsoluja. Vastauksena stressiä kunnossa, endogeeninen PDCD4 pystyi välinen edestakainen solun osastojen hoitaa siirretään tehtäviä.

Citation: Wei N, Liu SS, Chan KKL, Ngan HYS (2012) Kasvaimen tukahduttava toiminto ja modulointi ohjelmoidun solukuoleman 4 (PDCD4) munasarjasyövässä. PLoS ONE 7 (1): e30311. doi: 10,1371 /journal.pone.0030311

Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: toukokuu 12, 2011; Hyväksytty: 13 joulukuu 2011; Julkaistu: 17 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Wei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat sisäinen avustusta University of Hong Kong Seed rahoitus ohjelman perustutkimus [on KKLC], sekä lahjoituksena Wong Check Hän hyväntekeväisyysyhdistykseksi [sen HYSN]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

PDCD4 alun perin tunnistettiin neoplasmic muutoksen inhibiittorin JB6 hiiren epidermaalista solulinja mallin [1]. PDCD4 hiiret osoittivat pienempi kasvaimen esiintymistiheys ja papilloomaviruksen-to-karsinooma muunnostaajuus [2]. Myöhemmin raportit ovat hiljaista PDCD4 estävä rooli proteiinin translaation estämällä eukaryoottisten initiaatiofaktoria 4A (eIF4A) helikaasi sekä häiritsevät yhdistyksen eIF4A kanssa eIF4G, jolloin epäonnistumiseen muodostumista käännös- initiaatiokompleksin [3], [4 ], [5]. Sittemmin useat tutkimukset on tehty tutkia roolia PDCD4 aikana tuumorigeneesiä. PDCD4 havaittiin olevan kykenee säätelemään transkriptiota. Yli-ilmentyminen PDCD4 johti tukahdutetaan karsinoidioireyhtymän solujen lisääntymisen kautta tukahduttaa transkriptio mitoosia edistäjänä sykliineistä riippuvaiset kinaasit (CDK) 1 /cdc2 säätelyn kautta p21

Waf1 /CIP1 [6], [7]. PDCD4 inhiboi paksusuolen syöpäsoluinvaasiota kautta tukahduttaa mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin kinaasikinaasikinaasina 1 (MAP4K1), mikä vaimentaa AP-1 riippuvaisen transkription [8]. Rooli PDCD4 solun apoptoosin on tutkittu myös eri tutkimuksissa. PDCD4 ehdotettiin olevan proapoptoottiset molekyyli osallistuu transformoiva kasvutekijä beeta-1 (TGF beta-1) indusoi apoptoosia maksasolusyövän (HCC) [9]. Vähentynyt PDCD4 ilmaisu vapautettu normaalia DNA-vaurioita vaste, mikä estää DNA-vaurioituneet solut apoptoosin [10].

Vaikka tuumorisuppressorigeenin edellä mainitut ominaisuudet, rooli PDCD4 tuumorin etenemisessä on ehdotettu olevan solutyyppispesifisiä [11]. Yli-ilmentyminen PDCD4 ei ollut vaikutusta joko proliferaatiota tai apoptoosin HEK293-soluissa [12], samoin kuin RKO koolonkarsinoomasoluissa [8]. Aiemmat tutkimukset raportoivat köyhdytetyn PDCD4 ilmaisun syövän verrattuna normaaleissa kudoksissa [13], [14], [15], ja PDCD4 suunnattiin hajoamisen aikana kasvaimen edistäminen [16] kuitenkin mekanismeja modulaatio PDCD4 oli epäselvä vielä.

tutkimukset roolista PDCD4 munasarjasyövän karsinogeneesissä olivat melko vähäisiä. Mukaan meidän aiempia havaintoja, menetys PDCD4 ekspressio havaittiin rajaa ja pahanlaatuisia munasarjojen kudosnäytteitä, ja liittyy haitallisia sairauden lopputulos [17]. Jotta voitaisiin edelleen tutkia roolia PDCD4 munasarjasyövän, nykyisessä tutkimuksessa selvitimme mahdollisia tuumorisuppressori toiminnot PDCD4 munasarjan syöpäsolujen ja uskottava mekanismi, joka säätelee PDCD4.

Tulokset

PDCD4 esti munasarjasyövän solujen lisääntymisen ja solusyklin etenemisen

tutkimiseksi toiminnon PDCD4 munasarjasyövän, kaksi PDCD4 yli-ilmentävien stabiilien kloonien 433-PDCD4c1 ja 433-PDCD4c2, perustettiin vuonna munasarjasyöpäsolu OVCA433. Yksi PDCD4 yli-ilmentäviä stabiileja klooni SKOV3-PDCD4, perustettiin vuonna munasarjasyöpäsolu SKOV3 (kuvio 1A). Perustaminen PDCD4 yli-ilmentävien stabiilien kloonien osoitettiin ylimääräinen bändi verrattuna vanhempien soluihin. pEGFP yli-ilmentäviä stabiileja klooneja (433-EV ja SKOV3-EV) on myös perustettu tyhjän vektorin ohjaus ja käytettiin seuraavissa kokeissa. Kun määritellään, kuinka western blotting bändejä esitettiin Data S1.

(A) PDCD4 yli-ilmentävien stabiilien kloonien 433-PDCD4c1, 433-pdcd4c2, ja SKOV3-PDCD4, perustettiin vuonna munasarjasyöpäsoluja OVCA433 ja SKOV3 . 433-EV ja SKOV3-EV: GFP yli-ilmentävät tyhjän vektorin stabiili klooneja valvontaa. (B) 433 PDCD4c1 ja 433 PDCD4c2 näytteillä merkittävä hitaampi proliferaationopeus verrattuna kontrolli (* p 0,01 ** p 0,05, vastaavasti) mukaan XTT (vasen paneeli) ja klonogeeniset määritys (p 0,05) (oikea paneeli). (C) PDCD4 indusoi solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa. Edustavia tietoja ovat yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta. Prosenttiosuudet soluja, jotka olivat G1 vaiheessa OVCA433 c1 ja c2 oli 84,6% (± 2,1%) ja 80,9% (± 2,2%), vastaavasti. Molemmat olivat huomattavasti suuremmat kuin verrokkiryhmän (69,9% ± 3,1%) (p = 0,004 ja P = 0,01, vastaavasti). Solujen prosenttiosuus, joka oli G1 vaiheessa SKOV3–PDCD4 oli 66,7% (± 1,8%), mikä oli merkitsevästi korkeampi kuin verrokkiryhmän (37,5% ± 2%) (p = 0,008). (D) PDCD4 yli-ilmentävien stabiilien kloonien sekä ohjaus tyhjän vektorin vakaata klooneja ylläpidetään MEM 10% FBS, ja sitten korjataan proteiiniuutto. Proteiini ilmauksia paneelin solusyklin sääntelyviranomaisten lukien p53, p21, p27, cdc25a, cyclinA ja sykliini analysoitiin. Intensiteetti bändi määritettiin densitometrinen skannaus. Kvantifiointi taajuusalueiden esitettiin Data S1. GAPDH sisällytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. Kolme riippumatonta koetta suoritettiin.

Solulisääntyminen arvioitiin XTT ja klonogeeniset määritys. Mukaan XTT tuloksia, sekä kaksi OVCA433-PDCD4 solut osoittivat merkittävästi hitaampaa lisääntymisnopeus kontrolliin verrattuna (p 0,05 OVCA433-PDCD4c1 ja p 0,01 OVCA433-PDCD4c2, vastaavasti, kuviossa 1B, vasen paneeli). Klonogeeniset määritys osoitti myös samankaltaisia ​​tuloksia: numerot muodostuneiden pesäkkeiden varten OVCA433-PDCD4c1 ja c2 olivat 33% ja 58% vähemmän verrattuna kontrolliin (GFP vain tyhjän vektorin ohjaus), vastaavasti (p 0,05, kuvio 1 B, oikea paneeli).

tutkia taustalla mekanismeja estäviä vaikutuksia PDCD4 on munasarjasyövän solujen proliferaatiota, me arvioitu vaikutus PDCD4 solusyklin etenemisen käyttämällä virtaussytometria-analyysi. Hallinnassa OVCA433, solujen prosenttiosuus G1 vaiheessa oli 69,9% (± 3,1%). Verrattain, prosenttiosuudet solujen G1 vaiheessa oli 84,6% (± 2,1%) ja 80,9% (± 2,2%) ja OVCA433-PDCD4c1 ja C2 vastaavasti, jotka molemmat olivat merkittävästi korkeampia kuin kontrolli (p = 0,004 ja P = 0,01, vastaavasti). Oli vastaava lasku solujen prosenttiosuus S vaiheessa OVCA433-PDCD4c1 (10,3% ± 2,4%) ja c2 (15,7% ± 2%)) kontrolliin verrattuna (25,9% ± 2,1%, kuvio 1C).

Yli-ilmentyminen PDCD4 vuonna SKOV3 vaikutti myös sen solusyklin etenemisen. Valvonnassa SKOV3- solujen prosenttiosuus solujen G1 vaiheessa oli 37,5% (± 2%). Verraten, in SKOV3–PDCD4 solujen, solujen prosenttiosuus G1 vaiheessa oli 66,7% (± 1,8%), joka oli merkittävästi suurempi kuin kontrolli (p = 0,008). Oli vastaava lasku solujen prosenttiosuus S vaiheessa SKOV3–PDCD4 soluja (20,9% ± 2,5%) verrattuna kontrolliin (46,2% ± 1,9%).

virtaussytometria analyysi osoitti, että yli -ilmaisu on PDCD4 aiheuttama solukierron pysähtymisen pääasiassa G1 vaiheessa; 1.2 (p = 0,01) ja 1,8 (p 0,01) kertainen prosenttiosuus soluja G1 vaiheessa OVCA433-PDCD4 ja SKOV3-PDCD4 munasarjasyöpäsoluja, vastaavasti (p = 0,01).

tunnistamaan mahdolliset molekyylien mukana edellä estäviä vaikutuksia PDCD4 solusyklin etenemisen, arvioimme ilmaisuja useiden solun lukiertosäätelijöistä lukien p21, p27, p53, cyclinA, sykliini, cdc25a. In OVCA433-PDCD4c1 ja c2, p53 ilmentymistä juuri muuttunut ja p21 merkittävästi ylös säännelty, kun taas p53-null SKOV3–pdcd4 solujen p21 ei havaittu. P27 ilmentyminen up säännelty kummassakin OVCA433-PDCD4 ja SKOV-PDCD4 soluissa. Lisäksi havaitsimme kasvua cdc25a ilmentymisen kahdessa 433 PDCD4 yli-ilmentävien stabiilien kloonien ja kasvua cyclinA ilmentymisen 433 PDCD4 c2 mutta ei c1 (kuvio 1 D). Kuitenkin vain hieman laskua cdc25a havaittiin SKOV-PDCD4 solu, ja cyclinA taso oli pysynyt samana sekä vakaa klooni ja vektori valvonta SKOV3- soluja. Kun määritellään, kuinka western blotting bändejä esitettiin Data S1.

PDCD4 esti munasarjasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota

tutkia mahdollisia vaikutuksia PDCD4 on munasarjasyövän solujen vaeltamiseen, kaksi erilaista lähestymistapaa oli sovellettu. Ensinnäkin, haavojen määritystä käytettiin seurata tarvittava aika sulkeminen haavan ohjaus ja PDCD4 yli-ilmentävät munasarjasyöpäsoluja. Ennen määritystä solut esikäsitelty mitomysiini C: llä, DNA-synteesi ja ydinvoiman jako-inhibiittori, sen varmistamiseksi, että sulkemisen haavan johtui yksinomaan solujen vaeltamiseen, mutta ei proliferaatiota. Tulokset osoittivat, että PDCD4 yli-ilmentäviä soluja osoittivat hitaampi maahanmuuttoluku. Naarmuuntunut haavan sekä verrokki- solujen lopetettiin 23 tuntia käyttöönoton jälkeen haavan, kun taas ero on vielä havaittu PDCD4 yli-ilmentäviä soluja (kuvio 2A).

(A) Sekä ohjaus- ja PDCD4 yli-ilmentäviä soluja käsiteltiin mitomysiini C: llä (10 ug /ml) kolme tuntia ennen käyttöönottoa haavan. Kuvat otettiin ilmoitettuina ajankohtina (0, 5, 8 ja 23 h). PDCD4 yli-ilmentävien stabiilien kloonien esillä hitaampi haavan paranemista verrattuna kontrolliin. (B) Munasarjojen syövän solujen annettiin kulkeutua läpi mikrohuokoisen kalvon 9 tuntia transwell migraatiokokeessa. Numerot vaeltaneet solut sen läpi PDCD4 yli-ilmentävien stabiilien kloonien olivat huomattavasti vähemmän verrattuna kontrolli (* p 0,01 ja ** p 0,05, vastaavasti). (C) munasarjasyöpäsoluja annettiin hyökätä läpi ECMatrix 72 tunnin ajan siirtokuoppaan invaasiomääritys. Numerot soluja tunkeutuu sen läpi PDCD4 yli-ilmentävien stabiilien kloonien olivat huomattavasti vähemmän verrattuna kontrolli (* p 0,05). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

arvioida määrällisesti solujen vaeltamiseen korko, siirtokuoppaan migraatiokokeessa sovellettiin. OVCA433-PDCD4c1 ja c2 osoitti 35% ja 63% vähemmän muuttoliike, vastaavasti, kuin kontrolli-solujen (p 0,01 kuvio 2B). SKOV3–PDCD4 solut osoittivat 22% vähemmän muuttoliike kuin kontrollisolut (p 0,05, kuvio 2B).

PDCD4 on myös vaikutus munasarjan syöpäsolujen invaasiota osoittaa transwell invaasiomääritys. OVCA433-PDCD4c1 ja c2 osoitti 27% ja 30% vähemmän invaasio kontrolliin verrattuna (p 0,05 kuvio 2C). SKOV3-PDCD4 osoitti 19% vähemmän invaasio kontrolliin verrattuna (p 0,05, kuvio 2C).

modulaatio PDCD4

PDCD4 ilmoitettiin käännös estäjä. Koska proteiinin translaation voitaisiin edistää seerumin ja estetty, kun soluja ilman ravintoa ilman kasvutekijöitä, me jolloin tutkittiin vaikutuksia seerumin runsaudesta PDCD4. Sekä OVCA433 ja SKOV3 nälkiinnytettiin seerumittomassa väliaineessa 48 tuntia, ennen kuin seerumin uudelleen otettu ilmoitetuilla aikavälein, mukaan lukien 1 h, 2 h, 6 h ja 24 h. Molemmissa soluissa, PDCD4 nostettiin kun ruokittu. Kuitenkin kun antamista uudelleen seerumia, PDCD4 vähitellen väheni aikaa riippuvainen tavalla SKOV3 ja nopeasti hävisivät 1 h OVCA433 (kuvio 3A). Kun määritellään, kuinka western blotting bändejä esitettiin Data S2.

(A) OVCA433 ja SKOV3 riistettiin seerumista (SD) 48 tuntia ennen seerumin uudelleen ylläpitäjä 1 h, 2 h, 6 h ja 24 h. Oli dramaattinen kasvu PDCD4 proteiinin ilmentymisen, kun seerumin deprival hoitoon. PDCD4 nopeasti hävisivät, kun seerumi antaa uudestaan. P-Akt ja p-ERK oli alassäädetty kun seerumia poistettiin ja vähitellen jatkaa, kun seerumia lisättiin takaisin. Yhteensä Akt ja ERK ei vaikuttanut hoidon aikana. (B) PDCD4 kohosi seerumissa puutteellisista soluista (SD) ja köyhdytettyä kun seerumia lisättiin takaisin (SA, seerumin lisäys) 2 ja 4 tuntia. Anto joko proteasomin estäjä MG132 (S + MG132), tai PI3K estäjä LY294002 (S + LY294002) esti ehtyminen PDCD4. DMSO: ta myös kontrollina (S + DMSO). Negatiivinen kontrolli (ve) tarkoitettu soluja viljeltiin alustassa, joka sisältää seerumia. (C) ilmentymistä PTEN, p-Akt ja p-ERK muutettiin kaikissa PDCD4 yliekspressio vakaa kloonien, kun taas ilmaisuja koko Akt ja ERK pysyi ennallaan. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin. Kun määritellään, kuinka western blotting bändejä esitettiin Data S2.

tutkia mahdollisuuksia reittejä mukana modulaatio PDCD4 yllä hoitoa, ilmauksia PTEN, p-Akt ja p-ERK ( ekstrasellulaarisen signaali säädelty kinaasi) tutkittiin. PTEN kohosi jälkeen seerumi poistettiin, ja ei ollut muita muutoksia sen jälkeen uudelleen lisäys seerumin asti jopa 24 tuntia. Oli merkittävä väheneminen p-Akt kun seerumi poistettiin sekä OVCA433 ja SKOV3- solut, jonka jälkeen uudelleen 6 h kuluttua seerumin uudelleen lisäys OVCA433. Vuonna SKOV3 elpyminen p-Akt oli niin nopeasti kuin 1 tunti. Väheten p-ERK havaittiin molemmissa soluissa ilman seerumia, ja lisävähennys havaittiin myös molempiin soluihin seerumin uudelleen otettu 1 tunti. Ilmaisu p-ERK jatkettiin 2 tunnin kuluttua seerumin hallinnon ja vähitellen saavutti alkuperäiselle tasolle 24 tuntia. Merkittävää muutosta ei havaittu joko yhteensä Akt tai ERK (kuvio 3A).

Vahvista mahdollisen osallistumisen PI3K-Akt ja MEK-ERK reittejä säätelyssä PDCD4, Specific PI3K estäjä LY294002, ja MEK estäjä U0126 esiteltiin nälkään soluihin yhdessä seerumin ja inkuboitiin 2 tunnin ja 4 tunnin kuluttua 48 tunnin nälkään hoitoa. Kun p-Akt oli nimenomaan alas säädellään hoidossa LY294002, ehtyminen PDCD4 estyi (kuvio 3B). Kuitenkin anto U0126 eivät osoittaneet mitään vaikutusta ehkäisyyn PDCD4 hajoamisen (kuvio S1). Lisäksi, kun proteasomi-inhibiittori MG132 esiteltiin nälkään solujen ehtyminen PDCD4 esti myös (kuvio 3B). Mitään vaikutusta ei havaittu DMSO-kontrollin soluissa. Tuloksemme osoittivat, että ehtyminen PDCD4 jälkeen uudelleen lisäämällä seerumin munasarjasyöpäsoluja johtui proteasomi-välitteinen hajoaminen. Kun määritellään, kuinka western blotting bändejä esitettiin Data S2.

PDCD4 yli-ilmentävien munasarjojen soluista, PTEN oli ylös säännelty, ja p-Akt ja p-ERK oli huomattavasti säädeltiin, kun taas koko Akt ja ERK ei ollut vaikutusta (kuvio 3C). Kun määritellään, kuinka western blotting bändejä esitettiin Data S2.

Solunsisäinen translokaatiota PDCD4

Aikaisemmat immunohistokemia tutkimus osoitti ero sijainti solun rakenteessa PDCD4 välillä normaalin ja pahanlaatuisten munasarjan solut [17] , viittaa siihen, että PDCD4 voi translokoituvat tumasta sytoplasmaan aikana munasarjojen syövän kehittymisen. Muut tutkimus osoitti myös solunsisäistä translokaatiota PDCD4 tietyin stressiolosuhteissa [18]. Sitten tutkittiin endogeenisen PDCD4 lokalisointiin munasarjasyöpäsoluja. Kaksi munasarjasyövän solulinjoissa, OV2008 ja C13, on korkea ekspressiotaso endogeenisen PDCD4, joka löytyi lokalisoitu yksinomaan tumaan normaaleissa viljelyolosuhteissa (kuvio 4). Jälkeen seerumistarvaatio hoidon 48 tunnin ajan, endogeeninen PDCD4 havaittiin kulkeutua välillä tumasta sytoplasmaan (kuvio 4).

Endogeeninen PDCD4 sekä OV2008 ja C13 munasarjasyöpäsoluja paikallistettiin yksinomaan tumaan, kun viljellään väliaineessa, jossa oli seerumin. Enemmän sytoplasmisen lokalisointia PDCD4 havaittiin alle seerumistarvaatio hoitoa. Endogeeninen PDCD4 havaittiin immunofluoresenssivärjäyksellä käyttäen PDCD4 primaarisen vasta-aineen ja FITC-leimattua vuohen anti-kaniini-vasta-aineita. Dapi värjäys osoitti tumaanohjaussignaali. Edustavia translokaatio oli nuolilla.

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat raportoineet estäviä vaikutuksia PDCD4 proteiinin käännös [19], [20], ja AP-1 riippuvainen transaktivaation [12], [21]. Tutkimukset PDCD4 tehtävänä solusyklin ovat tuottaneet ristiriitaisia ​​tuloksia. Rintasyöpäsoluissa, PDCD4 aiheutti lisääntynyttä väestön G0 ja G1 vaiheeseen vaikuttamatta muiden vaiheiden solusyklin viittaa mahdollisen roolin apoptoosin [22]. Vuonna Gliooma syöpäsoluja, PDCD4 viivästynyt solukierron siirtymistä G1-to-S-vaiheeseen [23]. Toinen ryhmä ilmoitti, että PDCD4 indusoi solut sekä osa-G1 ja G2-S-vaiheeseen, mikä osoittaa sen vaikutuksia sekä apoptoosin ja solukierron pysähtymisen [24]. Kuitenkin, paksusuolen syöpäsoluissa, PDCD4 ei muuttanut solusyklin etenemisen tai apoptoosin indusoimiseksi [8]. Nykyisessä tutkimuksessa, kohdunulkoinen PDCD4 ilmentyminen indusoi solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa ja näin ollen vaimentaa munasarjasyövän solujen lisääntymisen.

arvioitiin ilmaus paneelin solusyklin säätimiä, jotka tärkeä rooli G1-S siirtymisen PDCD4 yli-ilmentäviä soluja. PDCD4 indusoi ilmentymistä p27 ja p21, mutta ei ilmaukset sykliini E. Tuloksemme vastasivat havaintoja, knockdovvn PDCD4 AML soluissa johti alas säätelyyn p27 [25]; ja induktio p21 ja p27 by PDCD4 [26]. Solu vaikutukset PDCD4 ehdotettiin olevan erilainen solumalleissa kanssa tai ilman p53 ilmaisun [10], [27]. Kaksi munasarjojen solulinjat valitaan tässä tutkimuksessa on ero p53 asema, OVCA433 joissa villityypin p53, ja SKOV3 ollessa nolla p53. Molemmat solulinjat olivat kohonneet p27 ilmaisuja kun yli-ilmentymisen PDCD4 ja säätely ylöspäin p21 ei ollut välittämä p53 OVCA433 soluissa. Samanlaisia ​​havaintoja on raportoitu, että induktio p21 mukaan PDCD4 vuonna karsinoidioireyhtymän soluissa oli riippumaton p53 [7]. Meidän havainnot ymmärtää, että yksi mahdollisista mekanismeja solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa PDCD4 johtui säätelyn p21 ja p27. Huomasimme, että ei ollut eroa sykliini A tai cdc25a ilmaisuja välillä vakaa klooni ja tyhjän vektorin valvonta SKOV3 solulinjoissa. Kuitenkin OVCA433 soluja, havaitsimme kasvua cdc25a ilmentymisen kahdessa PDCD4 yli-ilmentävien stabiilien kloonien ja kasvua sykliini A: ekspression 433 PDCD4 c2, mutta ei c1. Ero ilmentyminen sykliini A voi johtua eri proliferatiivisia ja klonogeenisten toiminnan PDCD4-ilmentävän kloonin c1 ja c2. Kuitenkin vaikutukset PDCD4 on sykliini A ja cdc25a olisi lisätutkimuksia.

Lisäksi leviämisen, me myös osoittanut estäviä vaikutuksia PDCD4 on munasarjasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Samanlaisia ​​vaikutuksia on raportoitu myös tehdyissä tutkimuksissa paksusuolen ja HCC-soluissa [8], [20], [28]. PDCD4 havaittiin indusoituvan kun hoito pro-apoptoottisten aineet [29], [30]. Tutkimukset sen roolin apoptoosin ovat saaneet aikaan ristiriitaisia ​​tuloksia. PDCD4 on osoitettu indusoivan apoptoosin rinta- ja keuhkosyövän soluja [22], [26] Sitä vastoin ei ole apoptoottisen vaikutuksen PDCD4 havaittiin muissa tutkimuksissa [8], [12]. Lisäksi, korkeampi PDCD4 ilmaisuja on raportoitu korreloivan lisääntynyt herkkyys geldanamysiini ja tamoksifeeni [31]. Lisäksi äskettäin tehdyssä tutkimuksessa eturauhassyövän soluissa ehdotti lisääntynyt sisplatiinin ja paclitacel herkkyyttä yli-ilmentyminen PDCD4 [32]. Esillä olevassa tutkimuksessa, yliekspressio PDCD4 ei indusoinut apoptoosia mukaan virtaussytometrialla ja western blot analyysissä PARP ilmentymistä (kuvio S2). Me arvioi myös mahdollista roolia PDCD4 sisplatiinilla herkkyys. Ei kuitenkaan havaittu merkittävää eroa välillä PDCD4 yli-ilmentävien solujen ja kontrollisolujen vasteena sisplatiinin hoitoon (kuvio S2), joka oli yhdenmukainen sen aiempien julkaistujen tietojen että mitään korrelaatiota PDCD4 lausekkeen kemosensitiivisyys asema munasarjasyöpä potilaille havaittiin [17]. Ottaen huomioon, että mekanismi sisplatiini tappaa syöpäsoluja on aloittaa solujen apoptoosin, ja PDCD4 ei havaittu apoptoottisten vaikutusta munasarjasyöpäsoluja, tämä saattaa olla yksi syy edistää edellä mainitun havainnon.

Kuten meidän tuloksia, suuruus tukahduttaminen munasarjasyövän solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invaasio ei ollut suhteessa yli-ilmentymisen tasoja PDCD4 proteiinia näissä vakaa klooneja. Samanlaisia ​​havaintoja myös raportoitu tutkimuksessa Yang et al. hiiren orvaskeden JB6 RT101 soluihin [21]. Olemme ehdottaneet, että saattaa olla pitoisuuden raja-arvo, kun ylitetään, estävä toiminto PDCD4 kasvaimen etenemiseen tapahtuisi. Mukaan meidän virtaussytometrialla arvioinnin, yli-ilmentyminen PDCD4 sekä OVCA433 ja SKOV3-solut indusoitiin solusyklin pysähtymisen G1-vaiheessa. Vaikka tukahduttava vaikutus soluproliferaatioon ja pesäkkeen muodostusta havaittiin PDCD4 yli-ilmentävien SKOV3- solujen, vaikutus ei ollut tilastollista merkitsevä verrattaessa lapsilukon soluja (kuvio S3). Olipa johtui geneettistä taustaa SKOV3- solujen tai osallistumista muut mekanismit ja tekijät eivät tällä hetkellä ole selkeitä ja edellyttivät lisätutkimuksia.

havainnot alas-säätely p-Akt ja p-ERK in PDCD4 yli-ilmentäviä soluja ehdotti mahdollinen osallistuminen p-Akt ja p-ERK reittejä sääntelyssä PDCD4. Sen kysymyksen, että onko nämä kaksi reittejä todella mukana, me eteni tutkia samanaikainen ilmaisuja p-Akt, p-ERK ja PDCD4 aikana seerumin peruuttamista ja uudelleen lisäksi hoidon. Oli dramaattinen nousu PDCD4 kun seerumin peruuttamista, jota seurasi nopea ehtyminen PDCD4 jälkeen seerumia aloittaa uudelleen. Samalla prosessin, joka on käänteinen suuntaus ilmentymisen sekä p-Akt ja p-ERK, kaksi tärkeää solujen lisääntymistä säätelymolekyylejä, havaittiin: aluksi vähentynyttä ilmentymistä, jota seuraa asteittainen uudelleen. Muuttaminen p-Akt ja p-ERK voisi olla yksinkertaisesti seuraukset seerumin deprival hoitoa. Ja edelleen, koska samanaikaisesti muutokset ilmauksia PDCD4 ja p-Akt ja p-ERK, ja muuttaa ekspressiotaso sekä molekyylien havaittiin PDCD4 yli-ilmentäviä soluja, on olemassa mahdollisuus, että p-Akt ja p-ERK reittejä oli mukana säätelyssä PDCD4. Edelleen vahvistaa sen, haimme PI3K estäjä LY294002 (joka myöhemmin lohkot Akt fosforylaatio) yhdessä seerumin ja löysi PDCD4 proteiini ei enää ollut huonontunut. Käyttöönotto MEK estäjä ei estä ehtyminen PDCD4. Tuloksemme osoittivat, että p-Akt mutta ei p-ERK tarvittiin hajoamista PDCD4 kun seerumin stimulointi, ja näin PI3K-Akt-reitin voi olla suora rooli modulaatioon PDCD4 hajoamisen munasarjasyöpäsoluja. Kuitenkin osallistuminen p-ERK-reitti on epäselvää tällä hetkellä ja tarvitaan lisätutkimuksia. On tehty tutkimuksia raportointi p-Akt-reitin sääntelystä PDCD4. Dorrello tutkimus sekaantunut roolia S6K1 säätelyssä PDCD4 hajoamisen vastauksena mitogeeni [23]. Hoito kasvain promoottori 12-O-tetradekanoyyliforboli-13-asetaatti (TPA) vähentynyt PDCD4 ilmaisua, mikä johtui proteasomaalisten hajoamisen välittämä PI3K-Akt-mTOR-p70

S6K ja helpottaa MEK-ERK signalointireitin [16] . Käänteinen korrelaatio PDCD4 ja p-Akt ilme on raportoitu kolorektaalisyövässä kudosnäytteistä [33]. shRNA PDCD4 aktivoitu Akt-reitillä, joka johtaa lisääntyneeseen ilmauksia p-Akt, mTOR ja p70S6K keuhkoissa hiirillä [34]. Tuloksemme olivat yhdenmukaiset näiden havaintojen ja hiljaista osallistumista p-Akt-reitin säätelyssä PDCD4 vuonna munasarjasyöpäsoluja.

yhdistäminen ilmiö alas-säätely p-Akt ilmentymistä havaittiin PDCD4 yli ilmentävillä soluja, ja siitä, että esto p-Akt by PI3K-estäjä esti hajoamista PDCD4 aikana seerumistarvaatio ja uudelleen lisäksi prosessi, ehdotimme mahdollinen palautteen ohjaus PDCD4 kautta p-Akt-reitin: perustaminen PDCD4 yli- ilmentävien stabiilien kloonien voidaan saavuttaa vain silloin, kun hajoaminen PDCD4 estyi, joka vaaditaan tukahduttaminen p-Akt ilmentymistä (kuvio 5). Kuitenkin mahdolliset mekanismit välittävät tämän palautteen ohjaus ja molekyylien mukana ei ole tunnistettu, ja tarvitaan enemmän tutkimuksia.

Kohonneita PTEN ja tukahdutti p-Akt löytyivät PDCD4 yli-ilmentäviä stabiileja klooneja. Kun soluja nälkiinnytettiin kanssa seerumittomassa elatusaineessa, PDCD4 oli un-fosforyloitiin johtuen tukahdutetaan p-Akt ilmentymistä. Un-fosforyloitiin PDCD4 ei tunnista proteasomin mikä johtaa kertymistä PDCD4. Kun seerumi uudelleen ylläpitäjä soluihin, säädelty p-Akt fosfory- PDCD4, joka sitten tyhjentynyt läpi proteasomin hajoamista. Anto joko PI3K estäjän LY294002, joka kykenee estämään PDCD4 tulemasta fosforyloituu p-Akt tai proteasomin estäjä MG132, estää ehtyminen PDCD4, joka johtaa kertyminen PDCD4.

Nykyinen tulokset osoitti translokaatio endogeenisen PDCD4 välillä tumasta sytoplasmaan, kun seerumin nälkään. Oletimme, että PDCD4 voimin kuljetus sytoplasmaan näytteille sen estävä toiminto proteiinia käännösvaatimuksia solut epäsuotuisissa kasvu kunnossa. Mukaan aikaisempien havaintojemme kanssa, ero paikantaminen PDCD4 välillä havaittiin normaalien ja malignien munasarjojen kudosnäytteet: lisää sytoplasmisen lokalisointia PDCD4 havaittiin munasarjasyövän kudosnäytteistä [17]. Kun kasvain kasvaa, voi olla joitakin alueita, joissa happipitoisuus on merkittävästi alempi kuin, että normaaleissa kudoksissa, ja tuumorisolut ovat alle hypoksinen stressiä. Yksi hypoteesi on, että näissä soluissa, PDCD4 voi kuljetus sytoplasmaan estää käännös ja tämän jälkeen solujen kasvua. Koko, PDCD4 toimii tuumorisuppressori tumaan normaaleissa soluissa, mutta kun soluja tietyissä ympäristö- stressiä tai parhaillaan mahdollisia muutos normaalista pahanlaatuiseen yksi soluvasteen voi olla kuljettavat PDCD4 sytoplasmaan. Tämä tekee lokalisointi PDCD4 indikaattorina solujen poikkeuksellisissa kasvuympäristön tai neoplasmic muutosta. Kuitenkin translokaatiota mekanismi PDCD4 ei ole vieläkään selvä ja hypoteesin on vielä arvioitava.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely seerumistarvaatio hoito ja lääkehoito

Munasarjasyöpä solulinjoissa OVCA433 ja SKOV3 käytetty tässä tutkimuksessa olivat lahja professori SW Tsao, Department of Anatomy, University of Hong Kong. Munasarjasyövän solulinjoissa C13 ja OV2008 olivat lahja professori BK Tsang, laitos Naistenklinikka, University of Ottawa, Kanada. Nämä solulinjat viljeltiin MEM, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA).

Solut alle seerumistarvaatio hoidon viljeltiin MEM ilman FBS: ää. Fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) estäjä LY294002 (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA), MEK estäjä U0126 (Cell Signaling), proteasomin estäjä MG132 (Soluviestintä) liuotettiin DMSO: hon (Sigma Co., St. Louis, MO ) ja edelleen laimennettava ennen käyttöön soluihin. Medium pelkästään DMSO: lla oli myös mukana kontrollina.

Vasta-aineet ja western blot-analyysi

Proteiinin uutto ja western blot menetelmät olivat samat kuin aikaisemmin on kuvattu [17]. PDCD4 vasta-aine oli peräisin Rockland (Rockland Immunochemicalsilta, Gilbertsville, PA); vasta-aineita p21, cyclinA, sykliini ja p53 olivat Santa Cruz; vasta-PTEN, p-Akt, Akt, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, cdc25a, mTOR olivat solusignalointia; vasta-aineen p27 oli BD Transduction laboratorioissa.

rakentaminen PDCD4 cDNA ekspressiovektoriin

PDCD4 täyspitkän cDNA monistettiin PCR: llä käyttäen ihmisen PDCD4 cDNA-klooni (Origene Technologies, Inc., Rockville, MD) (geenipankin hakunumero NM_014456.3) templaattina ja seuraavia alukepareja 5 ’gaattccATGGATGTAGAAAATGAGCAGA 3’ (sense) ja 5 ’gtcgacTCAGTAGCTCTCTGGTTTAAGA 3’ (antisense), joka sisälsi EcoRI- ja Sall-restriktioentsyymien. 1,5-ke, täyspitkä PDCD4 PCR-tuote kloonattiin sitten kehyksessä, osaksi pEGFP-C1 (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).

perustaminen PDCD4 yli- ilmentävien stabiilien kloonien

PDCD4 plasmidiin tai GFP-C1 transfektoitiin OVCA433 ja SKOV3 munasarjasyöpä-soluihin käyttäen Fugene HD-transfektioreagenssia (Roche Molecular Biochemicals, Manniheim, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa.