Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Chemo-resistenssi sisplatiini keskitetty syövän hoito on merkittävä este tehokkaan hoidon ihmisen munasarjasyöpä. Aiemmat raportit osoittivat, että arseenitrioksidi (ATO) indusoi apoptoosia sekä huumausaineiden herkkä ja kestävä munasarjasyöpäsoluja.

Keskeiset havainnot

Tässä tutkimuksessa määritimme molekyylitason mekanismi ATO- aiheuttama apoptoosin munasarjasyöpäsoluja. Tuloksemme osoittivat, että ATO indusoi apoptoosia vähentämällä tasot fosforyloitua AKT (p-AKT) ja aktivoimalla kaspaasi-3 ja kaspaasi-9. Tärkeää on, BIM oli ratkaiseva rooli ATO aiheuttaman apoptoosin. Estyminen BIM ilmaisun esti AKT defosforyloinnilla ja esti kaspaasi-3 aktivaation aikana solujen apoptoosin. Yllättäen kuitenkin geenien AKT: tai FOXO3A oli vähän vaikutusta BIM ilmaisun ja fosforylaatio. Lisäksi kaspaasi-3: ATO hoito parantaa AKT defosforylaation, paitsi katkaisemalla sääntelyn A-alayksikkö proteiinifosfataasi 2A (PP2A), mutta myös lisäämällä sen aktivoinnin. Lisäksi meidän tiedot osoittivat, että c-Jun-N-terminaalista kinaasien (JNK) reitin osallistuu säätelyyn BIM ilmaisun.

Johtopäätökset

Osoitimme roolit BIM in ATO aiheuttaman apoptoosin ja molekyylitason mekanismeja BIM ilmaisun säädellään ATO aikana munasarjasyöpäsolu apoptoosin. Tulosten perusteella näyttää, että BIM on tärkeä rooli säätelyssä p-AKT aktivoimalla kaspaasi-3 ja että BIM välittää taso AKT fosforylaation määrittämiseksi kynnyksen voittamiseksi sisplatiinin resistenssin munasarjasyöpäsoluja.

Citation: Yuan Z, Wang F, Zhao Z, Zhao X, Qiu J, Nie C, et ai. (2011) BIM-välitteisen AKT fosforylaation Key modulaattori Arseenitrioksidi aiheuttama apoptoosi Cisplatin-Sensitive ja kestävä munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 6 (5): e20586. doi: 10,1371 /journal.pone.0020586

Editor: Pierre Bobé, Institut Jacques Monod, Ranska

vastaanotettu: 20 lokakuu 2010; Hyväksytty: 06 toukokuu 2011; Julkaistu: 31 toukokuu 2011

Copyright: © 2011 Yuan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee Natural Science Foundation of China (NSFC) -81071817 /H1609, (NSFC) -30800581 ja (NSFC) -30900744. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on yleisin syy syövän kuolemista gynekologiset kasvaimista [1]. Sisplatiini ja sen analogit ovat keskeisiä yhdisteitä kemoterapian ihmisen munasarja- syöpiä, mutta chemo-vastus on suuri este estää onnistuneen hoidon munasarjasyövän potilailla [2], [3]. Siten se olisi merkittävä läpimurto jatkoi prekliinisissä tutkimuksissa löytää uusi, alhainen myrkyllisyys, mutta tehokas lääke voittamaan sisplatiinin vastarintaa.

ATO, joka on osoittautunut tehokkaaksi kemoterapeuttinen lääkeaine on uusiutunut /vaikeahoitoinen akuutti promyelosyyttinen leukemia (APL) vuonna 1990 [4], on hyväksynyt FDA (Federal Drug Administration) hoitoon all-trans retinoiinihappo (ATRA) -kestävät APL [5]. Merkittävä tehoa ATO hoidossa APL on johtanut tutkia sen syövän vastaista aktiivisuutta ja taustalla mekanismi muiden pahanlaatuisten kasvainten. On ollut lupaavia tutkimuksiin, jotka osoittavat, että ATO ei vain omaa luontaista yhden aineen kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta munasarja–syöpäsolulinjoja, mutta voi myös laukaista apoptoosin sisplatiini-resistentit solut [6] – [10]. Kuitenkin tarkka molekyylitason mekanismeja, joilla ATO voitetaan Chemo-vastus ja indusoi apoptoosia munasarjasyöpäsoluja huonosti.

Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että epäonnistuminen lääkkeen aiheuttamista apoptoosin voi olla perimmäinen syy lääkeresistenssin. Joissakin tutkimuksissa on todettu useita keskeisiä välittäjiä apoptoosin jotka muutellaan kemiallis-resistenttien munasarjasyöpäsoluja [10] – [13]. Ekspressiotasot ja aktivointi BCL-2 proteiinit usein tärkeitä rooleja valvoa apoptoottista vastauksissa lääkehoidot, ja siten muokataan kemiallis-herkkyys syöpäsoluja [14] – [16]. Yliekspressio BCL-2: n ja Bcl-XL-geenien edistää apoptoottista inhibition ja kehittää usealle-resistenssi ihmisen munasarjojen syöpien. P53-proteiini on myös keskeinen säätelijä kemiallis-herkkyyden munasarjasyövän solujen ja nopeasti ylössäädelty vasteena DNA: ta vaurioittavien aineiden, kuten sisplatiinin. Lisäksi p53 indusoi apoptoosia ja säätelee vapautumisen sytokromi

c

, paitsi moduloimalla transkriptiota BH3-vasta-proteiinia (esim PUMA ja NOXA), mutta myös transkription-riippumaton mekanismi johon suorana translokaation p53-proteiinin mitokondriot, jota seuraa estävä vuorovaikutus BCL-2: n ja Bcl-XL [13], [17], [18].

BIM on myös jäsen BH3 vain perheen pro-apoptoottisten proteiinien ja ilmaistaan ​​useissa erilaisissa kudoksissa [19], [20]. Määritettynä western blot-analyysi, useimmissa kudoksissa ilmaista hallitseva isoformi BIM, kutsutaan BIM-EL [21]. Seuraavat apoptoottisen-stressistä, BIM translokoituu mitokondrioita ja käynnistää mitokondrioiden solukuolemareittiin joko suoraan aktivoimalla BAX: n kaltaisia ​​proteiineja tai epäsuorasti sitovia pro-selviytymisen BCL-2: n perheen jäsenten, vapauttaen siten BAX: n kaltaiset proteiinit [22], [23]. BAX-proteiinin on osoitettu moduloida apoptoosia munasarjasyöpäsoluja [2], [13]. Kuitenkin vaikutus BIM sisplatiinilla herkkä ja kestävä munasarjasyöpäsoluja ei ole täysin selvitetty.

Viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että AKT on tärkeä tekijä sisplatiinin herkkyyden munasarjasyöpäsoluja. AKT edistää solujen eloonjäämistä, tukahduttaa apoptoosin, ja säätelee sisplatiinin herkkyyttä munasarjasyöpäsoluja [10] – [13]. Lisäksi AKT, joka tunnetaan myös nimellä proteiinikinaasi B tai Rac [11], on inaktiivinen sytosolin proteiiniin. AKT rekrytoimista plasmamembraanin ja aktivoituvat fosforylaation treoniini 308 ja seriini 473 vastauksena kasvutekijöiden tai sytokiinien [2], [10], [11], [24]. Molekyyli vastuussa rekrytointi AKT että solukalvon sekä Aktivoinnin on fosfatidyyli 3-kinaasi (PI-3K) [2], [11]. Sekä PI-3K ja AKT usein aktivoidaan ja /tai yli-ilmennetään munasarjasyöpiä [2], [11], [13], [25]. Aktivoinnin AKT fosforyloi useita molekyylejä osallistuu apoptoosin säätelyyn, kuten pro-apoptoottisten proteiinien BAD, BIM ja kaspaasi-9 ja transkriptiotekijä FOXO3A. Seuraavaksi p-AKT estää sitoutumisen BAD tai BIM BCL-XL, estää kaspaasi-9-proteaasiaktiivisuutta, lohkot FOXO3A toimintaa ja vähentää Fas-ligandin transkriptio [19], [26] – [28].

Aikaisemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet moduloiva rooli PI-3K /AKT signaloinnin BIM ilme. PI-3K estäjä LY294002 lisää BIM ilmentymistä soluissa samanaikaisesti kasvun kanssa solukuolemaan [19]. On kuitenkin ehdotettu, että tärkeä alavirtaan vaikutus LY294002 on vähentää AKT sen aktiivisessa, fosforyloitua muotoa [2], [19]. Välinen yhteys pienentää AKT toimintaa ja lisätä BIM ekspressiotasot on FOXO3A, jäsen forkhead perheen transkription säätimiä, jotka voivat suoraan lisätä BIM ekspressiotasot ja apoptoosin syöpäsoluissa, kun yli-ilmentynyt [19], [29], [30]. Siten säätelyä BIM ilmaisun, säännellyt LY294002, liittyy menetys AKT-vaikutusta ja fosforylaatio ja kasvu aktiivisessa muodossa FOXO3A.

Vaikka AKT-BIM-reitti on tärkeä Chemo -sensitivity ja apoptoosin syöpäsolujen, onko AKT säätelee BIM aktiivisuutta munasarjasyöpäsoluja aikana ATO hoidon jää epäselväksi. Meidän raportti, osoitimme, että ekspressiotaso BIM nostettiin ja että fosforylaatiota AKT alentui vuoden apoptoosin sisplatiinin herkkien ja kestävä solujen jälkeen ATO hoidon. Lisäksi downregulation AKT siRNA voinut estää BIM ilmaisua ja fosforylaatio aiheuttama ATO, kun taas knockdovvn BIM esti AKT defosforyloinnilla in munasarjasyöpäsoluja. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että ATO aiheuttama AKT defosforyloinnilla riippuu kaspaasi-3-välitteisen PP2A aktivointi, joka säätelee BIM ilme. Nämä tulokset viittaavat siihen, että fosforylaatiota AKT negatiivisesti moduloidaan BIM ja että BIM-välitteinen AKT fosforylaatio on tärkeä molekyyli tapahtuma välittämisessä ATO aiheuttaman apoptoosin Chemo-herkkä ja kestävä munasarjasyöpäsoluja.

Tulokset

ATO indusoi apoptoosia sisplatiini-herkkä ja kestävä munasarjasyöpäsoluja

ensin määritellään kasvua estävää vaikutusta sisplatiinin eri sisplatiinin herkkien (ryhmää COC1 ja A2780) ja kestävä (ryhmää COC1 /CP, A2780 /CP ja OVCAR-3), ihmisen munasarjan solulinjat, kuten aiemmin on kuvattu [31]. Solujen elinkykyisyys havaittiin MTT-määritystä 72 tunnin käsittelyn. Kuten on esitetty kuviossa 1A, sisplatiinin aiheuttama annoksesta riippuvainen väheneminen solujen elinkelpoisuuden ryhmää COC1 ja A2780-soluissa, kun taas ryhmää COC1 /CP, A2780 /CP ja OVCAR-3 solujen todistettavasti oli resistentti sisplatiinia. Tutkia sisplatiinin indusoiman apoptoosin, soluja käsiteltiin 5 uM sisplatiinia. Seuraavaksi apoptoosin varmistettiin DNA: n fragmentoituminen ELISA-määritystä eri ajankohtina. Nämä tulokset osoittivat, että sisplatiinin tehokkaasti indusoi apoptoosia sisplatiinin herkkien munasarjojen solut, mutta ei sisplatiini-resistenttien solujen (kuvio 1 B). Tutkia vaikutuksia ATO apoptoosiin kaikissa munasarjasyöpäsoluja, käsittelimme munasarjasyöpä soluja ATO ja analysoitiin solujen apoptoosin prosessi, jonka DNA: n fragmentoituminen ELISA-määritystä. Meidän tiedot osoittivat, että ATO indusoi apoptoosia kaikissa munasarjasyöpäsoluja riippumatta niiden eroista kemiallis-herkkyys (kuvio 1 C). Virtaussytometrialla analyysi anneksiini V värjäys kertoo vielä, että ei ollut eroa ATO aiheuttaman apoptoosin välillä sisplatiinin-herkkä ja kestävä soluja (kuvio 1 D).

. Annoksesta riippuvaa vaikutusta sisplatiinin munasarjojen solulinjoissa. Solut altistettiin sisplatiinin ilmoitettuina pitoisuuksina DMEM tai RPMI-1640, jossa on 10% FBS: ää 96-kuoppaisella levyllä 72 tunnin ajan, ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Kuvaajat osoittavat tulokset MTT-määritys. Kaikki tiedot on esitetty graafisesti keinona ± keskivirheet välineet ainakin kolmen erillisen kokeen. B. analyysi apoptoosin. Soluja käsiteltiin sisplatiinin (5 uM) eri aikoja. Solujen apoptoosi kvantitatiivisesti havaita solukuolema ELISA kit. Kuvaajat osoittavat tulokset kvantitatiivisia analyysejä. Kaikki tiedot on esitetty graafisesti keinona ± keskivirheet välineet ainakin kolmen erillisen kokeen. *,

P

0,05, **,

P

0,01. C. Vaikutus ATO on apoptoottista kuolemaa sisplatiini-herkkä ja kestävä soluja. Soluja viljeltiin, kun läsnä tai poissa ATO (2 uM) eri aikoja, niin solun apoptoosi mitattiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Kaikki tiedot on esitetty graafisesti keinona ± keskivirheet välineet ainakin kolmen erillisen kokeen. *,

P

0,05, **,

P

0,01. D. havaitseminen apoptoosin kanssa virtaussytometrialla analysointia. Ryhmää COC1, ja ryhmää COC1 /CP-soluja käsiteltiin ATO (2 uM) 48 tunnin ajan, sitten värjättiin anneksiini V ja tutkittiin virtaussytometrialla. E ja F. analyysit cyt

c

julkaisu. Hoidon jälkeen ATO eri aikoja solut altistettiin subsellulaarifraktiointikokeet. Sytosolin tai mitokondrion fraktiot immunoblotattiin (30 ug proteiinia /kaista) ja spesifisen vasta-aineen cyt

c

. β-aktiini ja Cox IV käytettiin proteiinin lastaus ohjaus. Densitometrinen analyysi Western blotit suoritettiin, ja määrä cyt

c

verrattiin proteiinin kuormituksen valvonta. Sillä cyto cyt

c

, suhteellinen määrä cyt

c myynnissä maassa käsitellyistä soluista (72 h) asetettiin 1, kun taas suhteellinen määrä käsittelemättömästä soluista (0 h) asetettiin 1 Mito cyt

c

. Tiedot edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen.

Voit selvittää mitokondrioiden tärkeä rooli ATO aiheuttaman apoptoosin, vapauttamaan sytokromi

c

havaittiin solufraktioinnin analyysi. Tulokset paljastivat, että ATO aiheuttama vapautuminen sytokromi

c

on ajasta riippuva tavalla Chemo-herkkä ja kestävä soluja (kuvio 1 E, F), mikä viittaa siihen, että ATO käynnistää apoptoottisen solukuoleman kautta mitokondrioiden.

BIM on tärkeää ATO aiheuttaman apoptoosin chemo-herkkä ja kestävä munasarjasyöpäsoluja

Mitokondriovauriot tärkeä rooli apoptoosin munasarjojen soluissa. Aiemmat tutkimukset raportoitu, että muutokset geenin ilmentymisen BCL-2-perheen proteiinit oli mukana ATO: n indusoiman apoptoosin [32] ja että BH3 vain proteiinit olivat välttämättömiä ATO-indusoitua apoptoosia in myeloomasoluja. On kuitenkin epäselvää, BH3 proteiinit saattavat toimia munasarjasyöpäsoluja seuraavat ATO hoitoa. Siksi tutkimme ekspressiota BCL-2-perheen proteiinien sisplatiini-herkkä ja kestävä solujen jälkeen ATO hoidon. Kuten on esitetty kuviossa 2A, pro-apoptoottiset proteiinit, kuten BAX, PUMA ja NOXA, eivät muuttuneet merkittävästi ryhmää COC1 solut eri aikapisteissä jälkeen ATO hoidon. Antiapoptooppinen BCL-2 ja BCL-XL proteiinit myös ei esiintynyt merkittäviä muutoksia. Kuitenkin, toisin kuin muut proteiinit, ilmentymisen taso BIM lisääntyi merkittävästi, kun ATO hoidon, jotka osoittavat, että BIM oli mukana apoptoottisen solukuoleman munasarjasyöpäsoluja. Samaan aikaan, ATO aiheuttama BIM ilmaisun tasapuolisesti ryhmää COC1 /CP-soluja (kuvio 2B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös muita solulinjoja (tietoja ei esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että BIM on tärkeä rooli ATO-indusoidun apoptoosin munasarjasyöpäsoluja.

A ja B. Western blot-analyysin ekspression taso BCL-2-perheen proteiinia. Aikariippuvainen analyysi BCL-2 jäsenen ekspressiotasot ryhmää COC1 /CP ja ryhmää COC1 soluja. Soluja käsiteltiin ATO (2 uM) ilmoitetuilla aikaa, sitten lyysattiin NP40 puskurissa havaitsemiseen. p-Actin käytettiin proteiinin lastaus ohjaus. Yksittäiset proteiinia mitattiin densitometrisellä analyysi Länsi pyyhkii ja verrattuna aktiini tasolle. Suhteellinen määrä yksittäisen proteiinin käsitellyistä soluista (72 h) asetettiin 1. C. Vaikutus BIM shRNA solujen apoptoosin. Samoissa olosuhteissa A, solut transfektoitiin BIM tai Ctrl shRNA 48 h, ja sitten käsiteltiin kanssa tai ilman ATO: ssa 48 tuntia. Solulysaatit valmistettiin ja analysoitiin BIM, kaspaasi-9 ja pilkottiin kaspaasi-3 Western blot. CF viitataan pilkotaan kaspaasi-9. Suhteellinen kertainen tarkoittaa määrää BIM verrattuna aktiini ja Ctrl kunnossa pidettiin 1. D. Detection vaikutus BIM shRNA solukuolemaan kanssa tumavärjäystä. Solut transfektoitiin BIM tai Ctrl shRNA 48 tuntia, ja sitten transfektoidut solut käsiteltiin ATO 48 tuntia. Solukuolemaa arvioitiin mittaamalla solujen tiivistetyn ja hajanainen ydinvoiman mikroskoopilla. Nuolet osoittavat kondensoitu, hajanainen, kirkkaasti värjätty ytimet, jotka ovat tunnusomaista apoptoosin. Kaikki tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Vahvista vaikutuksen BIM on apoptoosin munasarjasyöpäsoluja, suoritimme geeni-hiljentäminen kokeita käyttäen shRNA spesifistä BIM että kohdennetut kaikki tunnetut isoformeja sen transkriptio. Samanlainen tulos on esitetty kuviossa 2A, ilmentymisen taso BIM oli korkea kontrollivektorilla transfektoidut ryhmää COC1, ja ryhmää COC1 /CP-soluissa sen jälkeen, kun ATO hoidon, kun taas BIM ekspressiotasot soluissa, jotka on transfektoitu BIM shRNA olivat suhteellisen alhaiset (kuvio 2C) . Lisäksi downregulation BIM esti kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 pilkkominen aiheuttama ATO. Samoin ATO aiheuttama ydinaseiden pirstoutuminen ja tiivistymisen kontrollivektorille transfektoiduissa A2780 ja OVCAR-3-soluissa, mutta ei BIM shRNA-transfektoiduissa soluissa (kuvio 2D). Nämä tulokset antavat lisänäyttöä, että BIM ilmaisu on välttämätöntä ATO aiheuttaman apoptoosin munasarjasyöpäsoluja.

AKT signalointi on osallisena solukuolemaan

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että AKT moduloi BIM aktivointia joko suoraan tai epäsuorasti [19], [33]. Lisäksi ATO indusoi apoptoosia myeloomasoluja vähentämällä AKT-vaikutusta ja ilmaisun soluissa [34]. Edellä esitetyn perusteella havaintojen me spekuloida, että AKT on todennäköisesti mukana ATO aiheuttaman apoptoosin säätelemällä BIM ilme. Niinpä ensin mitataan, onko AKT on mukana ATO aiheuttaman apoptoosin munasarjasyöpäsoluja. Kuten kuviossa 3A on esitetty, ATO indusoi downregulation p-AKT at Ser473 sisplatiini-herkkien ryhmää COC1 solujen ajan riippuvalla tavalla, vaikka ilmentymisen taso koko AKT-proteiinin ei esiintynyt muutoksia. Downregulation p-AKT aiheuttama kaspaasi-9 herkillä ryhmää COC1 soluissa. Samoin ATO aiheuttama vähentäminen p-AKT ja pilkkomista kaspaasi-9 muissa munasarjasyöpäsoluja, huolimatta niiden eroista chemo-herkkyyden.

. Havaitseminen AKT fosforylaation, ilmaisun ja kaspaasi-9 aktivointi. Western blot-analyysi koko AKT, p-AKT (Ser

473) tasot ja kaspaasi-9 lohkaisu ryhmää COC1 soluissa. Soluja käsiteltiin ATO (2 uM) eri ajankohtina ja lyysattiin NP40 puskurissa havaitsemiseen. CF viitataan pilkotaan kaspaasi-9. Sama tunnistus käytettiin ryhmää COC1 /CP, A2780 ja OVCAR-3. Näitä soluja käsiteltiin 72 tuntia, sitten lyysattiin ja määritettiin yksittäisten proteiinien tasoja Western blot. p-Actin käytettiin proteiinin lastaus ohjaus. p-AKT ja AKT mitattiin densitometrisellä analyysi Länsi pyyhkii ja verrattuna aktiini tasolle. Suhteellinen määrä p-AKT tai AKT käsittelemättömien solujen pidettiin 1. B. Proteiini tasoja PI-3K: n signalointireitin ATO-käsitellyissä soluissa. Solut altistettiin lääkettä eri aikoja. Solulysaatit valmistettiin ja määritettiin yksittäisten proteiinien tasoja Western blot. Yksittäiset proteiinia mitattiin densitometrisellä analyysi Länsi pyyhkii ja verrattuna aktiini tasolle. Suhteellinen määrä yksittäisen proteiinin käsittelemättömien solujen (0 h) asetettiin 1. C. vaikutukset ATO proteiinin tasot mTOR2, kuten p-mTOR (Ser

2448and

2481), mTOR, RICTOR, sin1, A2780 soluissa. Solut altistettiin huumeiden, kuten on kuvattu B, ja sitten solujen lysaatit analysoitiin Western blot. Suhteellinen määrä proteiinia määrät asetettaisiin kuvatulla B. Solulysaatit analysoitiin western blot. Suhteellinen määrä proteiinia määrät asetettaisiin kuvatulla B. D. Suojaava vaikutus konstitutiivisen AKT on ATO aiheuttaman apoptoosin munasarjojen soluissa. OVCAR-3 ja A2780-soluja transfektoitiin konstitutiivinen AKT1 ja valittiin 8 viikkoa G-418 ja käsiteltiin ATO: ssa 72 tuntia. Solut hajotettiin ja analysoitiin yksittäisten proteiinin tasot Western blot.

Vasen,

proteiinin tasot p-AKT (Ser

473) ja AKT (AKT1) molemmissa Ctrl tai AKT vektori transfektoidaan OVCAR-3 ja A2780-soluissa havaittiin. Suhteellinen määrä proteiinia määrät asetettaisiin kuvatulla B. p-AKT ja AKT tasot AKT1 transfektoituja A2780-soluja pidetään 1.

Oikea,

analyysi apoptoosin Ctrl tai AKT1 vektori transfektoidaan OVCAR-3 ja A2780 solut. -Solujen apoptoosin kvantitatiivisesti havaita solukuolema ELISA-kittiä kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kaikki tiedot on esitetty graafisesti keinona ± keskivirheet välineet ainakin kolmen erillisen kokeen. **,

P

0,01. E. havaitseminen roolin LY294002 apoptoosiin soluja. Soluja käsiteltiin ATO ja /tai 25 uM LY294002 72 tuntia, ja sitten solut hajotetaan ja määritettiin yksittäisten proteiinien tasoja Western blot.

Vasen,

proteiinin tasot p-AKT (Ser

473) ja koko AKT in ryhmää COC1 soluja havaittiin. Solujen apoptoosi kvantitatiivisesti havaita solukuolema ELISA kit. Suhteellinen määrä proteiinia tasot asetettu kuten on kuvattu B. p-AKT ja AKT tasot käsittelemättömien solujen asetettiin 1.

Oikea,

analyysi apoptoottisten solujen kuvataan materiaalit ja menetelmät. Kaikki tiedot on esitetty graafisesti keinona ± keskivirheet välineet ainakin kolmen erillisen kokeen. **,

P

0,01.

Sitten analysoimme ekspressiotasot ylävirtaan PI-3K viestintäproteiinit, jotka voivat vaikuttaa p-AKT tasot munasarjasyöpäsoluja. Kuten kuviossa 3B, tasoja PI-3K-reitin proteiinit, kuten p85 (sääntely alayksikköä PI-3K), PTEN ja PDK1 ei muuttunut merkittävästi jälkeen ATO hoidon eri aikoja ryhmää COC1 /CP soluja. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen nisäkkään rapamysiinin kohde 2 (mTORC2) tai Rictor proteiini oli vastuussa aktivoinnista p-AKT at Ser473 [35], [36], ja ehtyminen alayksiköiden ehjä mTORC2, kuten sin1, poistetaan AKT fosforylaation Ser473. Lisäksi Ser2448 on mTOR oli AKT fosforylaatiokohdan, ja fosfori-Ser2481 oli merkkiaine mTORC2 komplekseja [35], [37]. Tuloksemme osoittivat, että proteiini tasot mTOR monimutkaisten 2, kuten fosfori-mTOR (at Ser 2481 ja 2448), mTOR, RICTOR ja sin1 ei muuttunut merkittävästi A2780 soluissa altistuksen jälkeen ATO eri aikoja (kuvio 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että näillä proteiineilla ei ole mitään vaikutusta p-AKT tasolla.

vahvistaa, jos AKT signalointi on suuri molekyyli- kohde vastaa ATO: n indusoiman apoptoosin, transfektoimme konstitutiivisesti aktiivinen AKT1 geenin OVCAR-3 ja A2780-soluissa ja tutkittiin niiden vaste ATO hoitoon. Kuten on esitetty kuviossa 3D, OVCAR-3, ja A2780, jotka oli transfektoitu AKT1 osoitti selvää vastustuskyky ATO: n indusoiman apoptoosin.

Lisäksi, käytimme LY294002, PI-3K-inhibiittori, estää fosforylaation AKT by ylävirtaan signalointimolekyylien ja tutkittiin pro-apoptoottinen vaikutus ATO munasarjan syöpäsolujen. Olemme havainneet, että ATO yksin poistaa p-AKT ja indusoiman apoptoosin, kun taas LY294002 yksinään ei ollut riittävä aiheuttamaan apoptoosin, vaikka se osittain laskenut p-AKT. Lisäkokeet osoittivat, että yhdistelmä LY294002 ja ATO poistetaan kokonaan p-AKT ja parannettu apoptoosin induktiosta ryhmää COC1 soluissa (kuvio 3E). Tuloksemme osoittavat, että vaikutus yhdistelmän LY294002 ja ATO s-AKT ja apoptoosin on merkittävämpää kuin LY294002 yksin, ja että AKT signalointireitille on mukana ATO aiheuttaman apoptoosin munasarjasyöpäsoluja.

BIM-säännelty AKT fosforylaatiota solun apoptoosin

AKT sovittelee BIM aktivointi kautta kaksi ensisijaista reittiä: (1) AKT fosforyloi BIM suoraan ja estää BIM aktivointi [19], [33], tai (2) AKT fosforyloi FOXO3A , mikä sen soluliman säilyttämistä 14-3-3 proteiineja. Tällöin AKT voinut translokoituvat tumaan aiheuttavan BIM transkriptio, mikä tarkoittaa, että AKT säätelee BIM aktivointi välillisesti. Perusteella näiden havaintojen, päätimme tutkia AKT vaikuttaa BIM aktivaation munasarjasyöpäsoluja. Ensin vaimentua ilmentymistä AKT1 siRNA in ATO saaneilla A2780 ja OVCAR-3 soluja ja totesi, että downregulation AKT kasvoi kaspaasi-3 ja PARP pilkkominen aikana ATO hoidon. Kuitenkin AKT downregulation oli vähän vaikutusta BIM ilmaisua, vaikka AKT downregulation kasvoi, jossain määrin, ATO aiheuttama ydinaseiden pirstoutuminen ja seurasi solujen apoptoosin (kuvio 4A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös ATO-käsiteltyjen munasarjasyövän soluja FOXO3A ekspressiota säädeltiin käyttämällä siRNA kohdistaminen FOXO3A (kuvio 4B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että AKT reitti voi olla mukana säätelyssä BIM ilmaisun aikana ATO: n indusoiman apoptoosin.

. Vaikutus AKT siRNA on BIM ilmaisua. Solut transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai AKT1 siRNA 48 h, ja sitten altistettiin ATO 72 tuntia. Solut hajotettiin ja analysoitiin yksittäisten proteiinin tasot Western blot. CF viitataan pilkotaan PARP. p-Actin käytettiin proteiinin lastaus ohjaus.

Up,

proteiinin tasot AKT: n, BIM, pilkottiin kaspaasi-3, ja PARP havaittiin Western blot. Suhteellinen määrä yksittäisen proteiinin taso oli asetettu kuten on kuvattu kuviossa 3B. p-AKT ja AKT tasoja Ctrl siRNA transfektoitujen ja käsitelty A2780 soluja pidetään 1.

Down,

analyysi apoptoottisten solujen. kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. Kaikki tiedot on esitetty graafisesti keinona ± keskivirheet välineet ainakin kolmen erillisen kokeen.

P

0,05 (ei merkitsevä). B. Vaikutus FOXO3A siRNA on BIM ilmaisun ja solujen apoptoosin. Solut transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai FOXO3A siRNA 48 h, ja sitten altistettiin ATO 72 tuntia.

Up,

Transfektion jälkeen 48 tunnin ajan, immunoblot-BIM ja FOXO3A proteiinin ilmentyminen suoritettiin kokosolulysaateista. Suhteellinen määrä yksittäisen proteiinin taso oli asetettu kuten on kuvattu kuviossa 3B. FOXO3A ja BIM tasoja Ctrl siRNA transfektoituja ryhmää COC1 soluja pidetään 1.

Down,

proteiinin tasot BIM, sytosolia cyt

c

ja PARP analysoitiin Western blot FOXO3A siRNA OVCAR-3 solut. Sillä cyt

c

havaitseminen, soluja käsiteltiin seuraavasti Kuvio 1E. Kuten on kuvattu kuviossa 3B, suhteellinen määrä BIM ja cyt

c

vuonna ATO käsitellyissä soluissa (72 h) pidettiin 1. C. vaikutus AKT on BIM fosforylaatioon. Solut leimattiin metabolisesti [

32P] ortofosforihappoa ja käsiteltiin ATO (2 uM) 48 tuntia, ja BIM immunosaostettiin käyttämällä agaroosi-konjugoitu BIM-vasta-ainetta, niin havaitseminen fosforylaation BIM. Fosforylaatiota BIM määritettiin autoradiografialla (ylempi paneeli). Western blot -analyysi suoritettiin vahvistamiseksi ja määrällisesti BIM-proteiinia (alempi kuva).

Vasen

vaikutus LY294002 on BIM fosforylaatioon. Soluja käsiteltiin ATO ja /tai LY294002 (25 uM), sitten havaitseminen BIM ilmaisun ja fosforylaatio. Kuten on kuvattu kuviossa 3B, suhteellinen määrä

32p-BIM ja BIM ATO käsitellyissä soluissa pidettiin 1.

Oikea,

vaikutus AKT siRNA on BIM fosforylaatioon. Solut transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai AKT1 siRNA 48 h, ja sitten altistettiin ATO: ssa 48 tuntia. Havaitseminen BIM ilmaisun ja fosforylaatio kuvatulla. Suhteellinen määrä

32p-BIM ja BIM AKT transfektoiduissa ja ATO käsiteltyjä soluja asetettiin 1. D. vaikutus BIM shRNA on AKT fosforylaatioon. Solut transfektoitiin joko ohjattu shRNA tai BIM shRNA 48 tuntia ja sitten altistettiin ATO: ssa 48 tuntia. Western blot tutkittiin BIM ilmaisu, kaspaasi-3 pilkkominen, proteiini tasot p-AKT (Ser

473) ja AKT soluissa. Suhteellinen määrä p-AKT, AKT ja BIM Ctrl shRNA transfektoiduissa ja ATO käsiteltyjä soluja asetettiin 1. Kaikki tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

havaitsemiseksi BIM fosforylaation apoptoosin aikana, A2780 ja ryhmää COC1 /CP-solut leimattiin metabolisesti [

32P] ortofosforihappoa ja käsiteltiin ATO 48 tuntia, ja fosforylaatiota BIM analysoitiin autoradiografialla. Aiempi raportti osoitti, että BIM induktio ja fosforylaatio lisääntyi apoptoosin aikana [38]. Meidän tutkimukset ovat tarkastelleet BIM fosforylaatiota ja lisääntynyt BIM ilmaisun jälkeen ATO hoidon. Tuloksemme kertoo vielä, että AKT downregulation siRNA tai AKT-estäjällä (LY294002) ei vähennä BIM fosforylaatiota Chemo-herkkä ja kestävä solujen jälkeen ATO hoidon (kuvio 4C). Nämä tulokset osoittivat, että AKT inaktivaatio ollut juurikaan ole vaikutusta BIM fosforylaatioon ja ehdotti, että AKT voi säädellä BIM aktivointia ja että muita mahdollisia mekanismeja sääntelyn osalta BIM aktivointi voi esiintyä.

Kuitenkin meidän lisäksi tulokset osoittivat, että knockdovvn BIM esti AKT defosforyloinnilla ja kaspaasi-3 lohkaisu chemo-herkkä ja kestävä munasarjasyöpäsoluja (kuvio 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ATO aiheuttama BIM ilmentyminen estää fosforylaation AKT, joka osoittaa, että BIM säätelee AKT aktivoinnin aikana ATO stimulaation munasarjasyöpäsoluja.

BIM säätelee AKT defosforylaatio kaspaasi-3: n aktiivisuuden

Aiemmat raportit osoittivat, että AKT defosforyloitiin sekä Thr308 ja Ser473 ja inaktivoitu in vitro proteiini 2A (PP2A), joka muodosti kompleksin AKT. AKT aktivoitiin soluissa käsittelemällä PP2A-inhibiittorit, kuten okadahapon (OA) [39], [40]. Äskettäin on raportoitu, että kaspaasi-3: säädellään fosforylaation AKT kautta pilkkomalla sääntelyn A-alayksikön PP2A (PP2A /A), joka kasvoi PP2A toimintaa [39]. Tuloksemme osoittivat, että BIM on mukana sääntelyn kaspaasi-3 ja AKT aktivointi (kuvio 4D). Siksi ehdotamme, että BIM voi säädellä AKT fosforylaation kaspaasi-3-välitteisen PP2A aktivaation munasarjojen soluissa.

Validoida hypoteesia, ensin selvitettävä, PP2A välittämän AKT fosforylaatio tutkimuksessamme. Solujen esikäsittely nivelrikkoa, estäjä PP2A, johti asteittaisen purkamisen ATO-indusoidun AKT defosforylaation annoksesta riippuvalla tavalla ryhmää COC1 /CP-soluja (kuvio 5A). Samaan aikaan, OA pelasti myös AKT fosforylaatio A2780 ja OVCAR-3 solujen aikana ATO hoidon.

. Eri soluja esi-inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla OA 1 h ja altistettiin ATO: ssa 48 tuntia, sitten lyysattiin NP40-puskurissa havaitsemista varten. Western blot-analyysi koko AKT ja p-AKT (Ser

473) tasoja näytettiin. p-Actin käytettiin proteiinin lastaus ohjaus. Suhteellinen määrä p-AKT ja AKT käsittelemättömissä soluissa oli asetettu 1. B. Analyysi vaikutus kaspaasi-3 PP2A aktivointia.

Up

, Soluja esi-inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla DEVD-CHO 1 tunnin ja altistettiin ATO: ssa 48 tuntia, sitten lyysattiin NP40-puskurissa havaitsemista varten. Western blot-analyysi koko AKT ja p-AKT (Ser

473) tasoja näytettiin. Suhteellinen määrä p-AKT ja AKT käsittelemättömissä soluissa oli asetettu 1.

Lähi

, käsitellyt solut lyysattiin näytepuskurissa ja alistettiin immunoblot-määritys, jossa on A-alayksikkö-spesifisen anti-PP2A /A-vasta-ainetta. CF viitataan lohkaistaan ​​PP2A /A. Sitten membraania tislattiin ja uudelleenseulottiin C-alayksikön-spesifisen anti-PP2A /C-vasta-aine. Suhteellinen määrä PP2A /C käsittelemättömissä soluissa (0 h) asetettiin 1

Down

, Western blot-analyysi vaikutuksen DEVD-CHO (100 uM) in PP2A pilkkominen. C. havaitseminen PP2A toimintaa. Soluja esi-inkuboida kanssa tai ilman 0,2 uM OA tai 100 uM DEVD-CHO 1 tunnin ja altistettiin lääkettä 48 tunnin ajan.