Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Genistein on soijaisoflavoni joka on antituumorivaikutus sekä in vitro että in vivo. On osoitettu, että genistein estää monta tyyppiä syöpiä kuten eturauhassyöpää (PCA) säätämällä useiden solun signalointipolkujen ja MikroRNA (miRNA). Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että pitkään ei-koodaavat RNA: t (lncRNAs) ovat mukana myös monissa solun prosesseissa. Tällä hetkellä ei ole olemassa raportteja suhdetta gensitein, miRNA ja lncRNAs. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet miRNA, lncRNA joita säännellään genistein ja tutkitaan niiden toiminnallista roolia PCA.

Menetelmä

Microarray (SurePrint G3 Human GE 8 × 60K) käytettiin ilmaisua profilointi genisteiinin käsiteltyjen ja hallita PCa soluja (PC3 ja DU145). Funktionaalinen määritys (solujen lisääntymisen, migraation, invaasion, apoptoosin ja solusyklin määritykset) suoritettiin PCA solulinjojen, PC3 ja DU145. Sekä in vitro että in vivo (nude mouse) malleja käytettiin kasvun määrityksissä. Lusiferaasireporttiterilla määrityksiä käytettiin sitoutumisen miR-34a hotair.

Tulokset

LncRNA profilointi osoitti hotair oli erittäin säännelty genistein ja sen ilme oli suurempi kastraatio kestävä PCa solulinjojen kuin normaalissa eturauhasessa soluissa. Taintumisen (siRNA) on hotair väheni PCa solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion ja indusoi apoptoosia ja solusyklin pysähtymiseen. miR-34a oli myös ajan säädellään genistein ja voi suoraan kohdistaa hotair sekä PC3 ja DU145 PCa soluja.

Johtopäätökset

Tuloksemme osoittivat, että genisteiini esti PCa solujen kasvua alas-säätely onkogeeniset hotair että on myös kohdistettu tuumorisuppressoriproteiinia miR-34a. Nämä havainnot lisätä ymmärrystä siitä, miten genisteiinin säätelee lncRNA hotair ja miR-34a PCA.

Citation: Chiyomaru T, Yamamura S, Fukuhara S, Yoshino H, Kinoshita T, Majid S, et al. (2013) Genistein Estää Eturauhassyöpä Cell Growth by Targeting miR-34a ja onkogeeninen hotair. PLoS ONE 8 (8): e70372. doi: 10,1371 /journal.pone.0070372

Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Yhdysvallat

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2013. Hyväksytty: 17 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 01 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Chiyomaru et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Center for Research Resources National Institutes of Health kautta Grant Number R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 ja VA Merit Review ja VA Program Project. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Genistein on ravinnon soijaisoflavoni. Sen rakenne on samanlainen kuin ihmisen 17-β-estradioli aiheuttaa estrogeenisiä ja /tai antiestrogeeniset vaikutukset [1]. Genisteiini on myös proteiini tyrosiinikinaasin estäjä [2], ja on antituumorivaikutuksia, in vitro ja in vivo. On osoitettu, että genistein estää monta tyyppiä syöpiä kuten eturauhassyöpää (PCA) [3], [4] kautta sääntelyn useiden solun signalointipolkujen kuten Wnt, Akt ja JAK /STAT reitit [5] – [8].

Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että ei-koodaavat RNA: t (ncRNAs) ovat mukana monissa solun prosesseissa. MikroRNA (miRNA), luokka pieniä ncRNAs noin 22 aminohappoa pitkiä, toimivat alipaineensäätöventtiileillä kohde- mRNA: iden transkriptionaalisesti ja transkription jälkeen [9]. Tiedetään, että miRNA säätelevät jopa kaksi kolmasosaa ihmisen perimän [10] ja tärkeä rooli lukuisissa biologisissa prosesseissa kuten kehitys-, erilaistuminen, proliferaatio, angiogeneesi, aineenvaihduntaa ja pluripotenttisuus [11], [12]. On raportoitu, että genistein lisääntyneen ilmentymisen tuumorisuppressorin miR-146a, joka aiheuttaa estämällä EGFR: n ja NF-kB-reitin [13], [14]. miR-27a on raportoitu olevan onkogeenisen miRNA säädellään genisteiini ja säätelee VEGF-signaloinnin kohdentamalla ZBTB10 [15], [16]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että genisteiini hoito merkitsevästi alassäädetty ilmentymistä onkogeenisten miR-151, joka suoraan suunnattu SOX17 ja ARHGDIA [17]. SOX17 ilmoitettiin olevan kasvainsuppressorigeenin, joka estää WNT /β-kateniinin signaloinnin kohdistamalla sekä β-kateniinin ja T-solu-tekijä (TCF) /lymfaattisen edistäjän tekijä (LEF) proteiinit [18] – [20]. ARHGDIA säätelee negatiivisesti Rho perheen GTPaaseja (Rho, Rac, ja Cdc42) [21], jotka osallistuvat WNT signalointireitin [22]. Olemme myös havainneet, että genistein alas-säätelee Rac1 ja EP300 geenejä, jotka ovat tärkeitä säätelijöitä VEGF-välitteistä angiogeneesiä [23], [24] ja EGFR-geeniä jopa säätelevä miR-574-3p [25].

NcRNAs jaetaan kahteen pääluokkaan perustuu transkriptio koon; pieni ncRNAs ja pitkä ncRNAs (lncRNAs). lncRNAs ovat yleensä määritellään RNA-geenit suurempi kuin 200 nukleotidin, joissa ei ole proteiinia koodaavan potentiaalia. Laajamittaiset sekvensointi cDNA-kirjastojen ja seuraavan sukupolven sekvensointi mukaan lncRNAs nisäkkäillä numero kymmeniä tuhansia. Tähän mennessä vain 126 ihmisen lncRNAs on toiminnallisesti selityksin in lncRNA tietokantaan [26]. Siten ei ole raportoitu suhteesta gensitein ja lncRNAs.

HOX transkripti antisense-RNA (hotair) geeni sijaitsee alueella Homeobox C (HOXC) geeni klusterin kromosomissa 12 ja koodaa n 2,2 kb lncRNA molekyyli. Tämä geeni on edestakaisin kromosomista 12 kromosomiin 2 komponentti Polycomb Tukahduttamistoimet Complex 2 (PRC2) ja repressoi transkription homeobox D (HOXD) geenejä [27]. Hotair vuorovaikutuksessa sekä PRC2 ja lysiiniä demetylaasi 1 (LSD1) kompleksit ja parit histoni H3 lysiinin 27 metylaatio ja lysiiniä 4 demetylaatio varten epigeneettisellä vaiennettu paitsi HOXD geenejä vaan myös monia muita geenejä [28]. Tämä geeni ilmentyy erittäin monissa syövissä, kuten rintasyöpä, paksusuolen ja peräsuolen, maksa, haima, ja kurkunpään syöpä [29] – [33]. Korkea ilmentyminen hotair rintasyövässä on ennustaja etäpesäke ja huono tulos [29]. Hotair on myös ajateltu olevan potentiaalinen biomarkkeri olemassaolon imusolmuke etäpesäke maksasolukarsinoomassa [34]. Hotair on negatiivinen ennustetekijä ja toimii onkogeenin haimasyövän sekä in vitro että in vivo [32]. Siksi tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet lncRNA hotair joka säätelee genistein ja tutkitaan sen toiminnallista roolia PCA.

Tulokset

vaikutus Genistein Hoito leviämisen estämistä, Apoptosis and Cell Cycle PCA solut

Voit tarkistaa kasvain tukahduttava piirteet genisteiinin teimme funktioanalyysivalikko. MTS-määritys osoitti, että solujen lisääntymistä vähennettiin genisteiiniä kohtelu sekä PC3 ja DU145 soluja (Fig. 1A). Apoptoosimäärityksessä osoittivat, että genisteiini merkittävästi indusoi apoptoosia DU145-soluissa (kuvio. 1 B). Ei kuitenkaan merkittävää vaikutusta apoptoosin havaittiin PC3-soluissa. Solusyklin määrityksessä osoitti, että käsittely genisteiini- aiheuttamien G2 /M vaiheessa solukierron pysähtymisen sekä PC3 ja DU145 soluja (Fig. 1 C).

(A) Genistein merkittävästi estyy solujen elinkykyyn. Solujen elinkykyisyys analysoitiin MTS solulisäkasvumääritykselle jälkeen 4 päivää hoidon (25 uM). **, P 0,0001. *, P 0,01. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. (B) Apoptoosin määritys käyttäen virtaussytometriaa. Edustavia neljännekseen luvut ohjaus ja genisteiinin (25 uM) käsiteltyjen solujen PC3 (vasemmalla) ja DU145 (oikealla) soluja. P 0,05. (C) Tyypillinen luvut solusyklin analyysi ohjaus, tai genisteiini (25 uM) käsitellyt solut näytetään. Pylväskaaviolla näkyy oikealla jokaisen lukujen edustaa prosenttiosuutta solujen G0 /G1, S tai G2 /M vaiheessa esitetyllä. * P 0,05.

tunnistaminen kohdegeenien ja Molecular Väylät säätelemä Genistein PCA

geenien tunnistamiseen ja reitit kohteena genisteiiniä PCA soluissa, suoritimme geeniekspressioprofilointi käyttämällä genisteiini ja ajoneuvo (kontrolli) käsiteltiin PC3 ja DU145 soluja. Ilmaisu on 918 geenien laskivat tuntuvasti-säännelty kummassakin PCa solulinjoissa (keskiarvo log2 suhde -0,5, taulukko S1). Nämä geenit jaettiin Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) merkintäluettelon yksikkö rikastamiseen analyysiä GeneCodis. Merkittävästi rikastettu reittejä Kegg tunnistettiin kuten ”Pathways syövän”, ”Cell cycle ’,’ asetus aktiinisytoskeletonin” ja ”Jak-STAT signalointireitin ’(P 0,05, taulukko S2). Olemme keskittyneet Kegg ”Pathway syövän” ja geenien tämän reitin on korostettu Kegg kartta (Fig. S1).

määrittämiseksi geeniekspression PCA kliinisistä näytteistä, suoritimme lauseke analysoi kaikille ehdokas kohdegeeneihin mukana ”Pathways syövän” käyttäen microarray ekspressiotietojen, joka oli hyväksynyt Gene Expression Omnibus (GEO). Ilmentymistasojen näiden geenien tutkittiin 47 PCa ja 47 normaalia näytteitä, kuten on esitetty lämpöä kartan kaaviossa on esitetty. S2. Geenit säädellään ylöspäin PCa näkyvät punaisina, alas geenien esitetään sinisellä, kun taas valkoiset pylväät osoittavat geenit ilmentyvät samalla tasolla molemmissa. Tämän analyysin, useat ratkaiseva geenikohteet tunnistettiin, kuten histonideasetylaasi- 1 (HDAC1), proteiini estäjä aktivoitua STAT, 3 (PIAS3), tropomyosin 3 (TPM3), transkriptiotekijä 7 kaltainen 2 (T-solu erityisiä, HMG box) (TCF7L2), aryyli-hiilivety reseptori ydinaseiden translocator 2 (ARNT2), CREB sitova proteiini (CREBBP), risteykseen plakoglobin (JUP), ja v-akt hiiren thymoma virus- onkogeeni homologin 2 (AKT2).

tunnistaminen lncRNAs säätelemä Genistein PCA

SurePrint G3 Human GE 8 × 60K mikrosirujen alustalla myös koettimia lincRNAs. Tunnistaa lncRNAs säätelevät genisteiiniä PCA soluissa, suoritimme geeniekspressioprofilointi. Viisi lncRNAs olivat alassäädetty molemmissa PCa solulinjoissa (keskiarvo log2 suhde -1,0, taulukko 1) kanssa lncRNA hotair osoittaa suurimman vaikutuksen. Määrittämään suhteelliset ekspressiotasojen hotair eturauhasen soluissa, suoritimme kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä käyttämällä käsittelemätöntä PCa solulinjojen ja verrattiin niitä normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen (RWPE-1). Havaitsimme, että hotair ilmentyminen oli huomattavasti säädellään ylöspäin kastraatio kestävä PCa solulinjoja (PC3 ja DU145) verrattuna RWPE-1-soluja (PC3 3,35-kertainen, DU145 6,47-kertainen) (Fig. 2A). Vahvista microarray data, suoritimme TaqMan kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi ja totesi, että hotair ilmentyminen oli merkitsevästi alassäädetty kanssa genisteiini- hoitoon (Fig. 2B). Niinpä olemme keskittyneet hotair koska monet tutkijat ovat raportoineet, että hotair on onkogeenisessä toiminto useissa muissa syövissä (rinta-, maksa, haima, paksusuolen ja peräsuolen syöpiä ja kurkunpään okasolusyöpä) [29] – [33].

( A) ilmentyminen hotair PCA solulinjoissa (LNCaP, PC3 ja DU145) ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (RWPE-1). Reaaliaikainen PCR osoitti, että ekspressiotasot hotair olivat säädellään ylöspäin kastraatio kestävä PCa solulinjoja (PC3 ja DU145). Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. *, P 0,05. (B) Expression tasot hotair käsittelyn jälkeen genisteiini- (25 uM). Hotair ilme laski 30-40% vuonna genisteiiniä käsitellyissä soluissa verrattuna kontrolleihin. Hotair ilmentyminen normalisoitiin GAPDH. *, P 0,05. (C) Expression of miR-34a PCa solulinjoissa (PC3 ja DU145) ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (RWPE-1). Reaaliaikainen PCR osoitti, että ekspressiotasot miR-34a oli säädellä vähentävästi kastraatio kestävä PCa solulinjoja (PC3 ja DU145). miR-34a ilmentyminen normalisoitu RNU48. (D) Expression tasot miR-34a käsittelyn jälkeen genisteiini- (25 uM) in DU145 solussa. P 0,05.

asetukseen hotair Expression PCA Cell Lines by miR-34a

Äskettäin on raportoitu, että jotkut miRNA säätelemään lncRNAs [35] – [37]. Etsimään mahdollisia miRNA jotka säätelevät hotair, käytimme miRcode algoritmia. Useissa ehdokas miRNA kohdistaminen hotair keskityimme miR-34a koska meidän lab on aiemmin raportoitu toimii tuumorisuppressorina ja säätyy alas PCA kudoksissa [38]. Määrittää suhteelliset ekspressiotasot miR-34a eturauhasen soluissa, suoritimme kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä käyttämällä PCa solulinjoja (PC3 ja DU145) ja verrattiin niitä normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen (RWPE-1). Havaitsimme, että miR-34a ilmentyminen oli merkitsevästi säädellä vähentävästi kastraatio kestävä PCa solulinjoja (PC3 ja DU145) verrattuna RWPE-1-soluissa (PC3 0,22-kertainen, DU145 0,14-kertainen) (Fig. 2C). Etsimään vaikutuksen genisteiinin Mir-34a ilme, suoritimme TaqMan kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi ja totesi, että miR-34a ilmentyminen oli merkitsevästi ajan säädellä genisteiiniä hoitoa DU145 soluissa (1,36-kertainen) (Fig. 2D) .

jotta voitaisiin vahvistaa sitoutumisen miR-34a hotair teimme lusiferaasireportterilla määrityksiä. Hotair on yksi ennustettu sitoutumiskohta miR-34a (Fig. 3A), jotka me kloonattiin lusiferaasireport- määritys vektori. Lusiferaasireportteri- analyysit osoittivat, että miR-34a laski suhteellisen lusiferaasiaktiivisuudet villityypin vektorilla (Fig. 3B). Mutaatio oletetun miR-34a sitoutumiskohtien laski myös vastaus miR-34a osoittaa, että miR-34a sitoutuu suoraan hotair. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi osoitti, että ekspressiotasot hotair PC3 ja DU145 oli tukahdutettu vuonna miR-34a transfektantit kontrolleihin verrattuna (Kuva. 3C).

(A) Otaksutuista miR-34a sitova ja mutatoitunut sivustoja hotair. (B) lusiferaasireporttiterilla määritykset käyttäen vektoreilla, jotka koodaavat putatiivisia sitoutumiskohtia. PC3 ja DU145-soluja transfektoitiin ohimenevästi Pre-miR miRNA prekursori- tai negatiivinen kontrolli, jonka jälkeen lyhytaikaisella transfektiolla perus vektoriin tai villityypin toimittaja plasmidit tai mutatoituja plasmideja 24 tuntia. Toimittaja aktiivisuus mitattiin lusiferaasianalyysissä ja normalisoitiin aktiivisuus Renillan lusiferaasin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. *, P 0,05. (C) Ilmaisu taso hotair määritettiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR-analyysit transfektion jälkeen miR-34a matkii ja negatiivinen kontrolli PCA solulinjoissa (PC3 ja DU145). Hotair ilmentyminen normalisoitiin GAPDH. *, P 0,05.

In vitro ja in vivo vaikutus hotair on PCa Cell Proliferation, Migration, ja Invasion

Jotta voidaan tutkia toiminnallista roolia hotair teimme tappiota toiminnanhäviö tutkimukset käyttäen si-RNA pudotus kanssa PC3 ja DU145 soluja. Alussa rajoitu että ilmentyminen hotair oli merkittävästi tukahdutettu si-RNA transfektantit kontrolleihin verrattuna (Fig. 4A). Soluproliferaatiota (Fig. 4B) ja haavan määritys (Fig. 4C) osoitti merkittävää inhibitiota si-hotair transfektanttien sekä PC3 ja DU145-soluja verrattuna kontrolliin transfektanttien. Invaasiomääritys (matrigeelin) osoittivat myös, että määrä hyökkääviä solujen oli merkittävästi vähentynyt si-hotair transfektanttien verrattuna niiden ohjaus kollegansa (Fig. 4D). Vahvista vaikutuksen hotair on tuumorigeenisyyden in vivo, hotair siRNA ja si-ohjaus-transfektoidut DU145 solut injektoidaan subkutaani- nude-hiiriin. Havaitsimme, että knock-alas hotair ilmaisun esti DU145 kasvain muodostumisen in vivo (Fig. 4E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että hotair on tärkeä rooli PCa solun etenemistä.

(A) hotair ekspressiotasot PCa solulinjoissa (PC3 ja DU145) määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä 96 tunnin kuluttua lyhytaikaista transfektiota siRNA . Geenien ilmentyminen normalisoitiin GAPDH. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. **, P 0,0001. *, P 0,0005. (B) knockdovvn hotair merkittävästi estää solujen elinkelpoisuuden. Solujen elinkykyisyys analysoitiin MTS-solujen lisääntymisen määrityksessä 96 tunnin kuluttua lyhytaikaista transfektiota. (C) knockdovvn hotair merkittävästi estää solujen vaeltamiseen. Transfektion jälkeen (48 tuntia), haavan muodostettiin kaapimalla ja mitataan 24 tunnin kuluttua. Edustavat kuvat haavan paranemisen määrityksen on esitetty 200-kertaisella suurennuksella. **, P 0,0001. (D) knockdovvn hotair merkittävästi vähentynyt soluinvaasiota. Edustavat kuvat invaasiomääritys esitetään 200-kertainen suurennus. **, P 0,0001. (E) edustaja kuviin kasvaimista nude-hiirissä 5 viikkoa kuluttua ihonalaisen transfektoitujen hotair siRNA DU145 solulinjoja tai ohjaus solulinjojen ja ajan kulku kasvaimen kasvua.

hotair Vaikutteet Cellular Apoptoosi ja Cell Cycle Eturauhassyövän solut

apoptosis määrityksessä osoitti, että knock-alas hotair merkittävästi indusoi apoptoosia sekä PC3 ja DU145 soluja (Kuva. 5A). Solusyklin määritys osoitti, että knock-alas hotair aiheutti G2 /M vaiheessa solukierron pysähtymisen PC3-soluissa (kuvio. 5B), kun taas DU145 transfektoitu oli kasvanut merkittävästi S-vaiheen solusyklin.

( A) Apoptosis määritys käyttäen virtaussytometriaa. Edustavia neljännekseen luvut ohjaus ja si-hotair käsiteltyjen solujen PC3 (ylempi) ja DU145 (alempi) soluja. **, P 0,005. *, P 0,05. (B) Tyypillinen luvut solusyklin analyysi ohjaus, tai si-hotair käsitellyt solut näytetään. Pylväskaaviolla näkyy oikealla jokaisen luku ilmoittaa prosentteina solujen G0 /G1, S tai G2 /M vaiheessa esitetyllä. **, P 0,001. *, P 0,005.

Keskustelu

proteiini-koodaus geenit käsittävät vain pienen osan genomista, ja loput koostuu ncRNAs, intronit ja /tai muita sekvenssejä, jotka ei toiminta ole vielä määritetty [39]. NcRNAs (miRNA ja lncRNAs) on osoitettu olevan keskeinen rooli sääntelyn solujen prosesseja, kuten solun kasvua ja apoptoosin normaaleissa ja pahanlaatuisten solujen. Roolit miRNA syövissä on tutkittu laajasti, ja viime aikoina monia lncRNAs on yhdistetty kehittymistä ja etenemistä syövän. Ilmentyminen lncRNAs usein muuttaa aikana pahanlaatuisiksi ja ncRNAs ovat nousemassa avainmolekyylejä ihmisen syövässä, joilla on potentiaalia toimia uutena markkereita ja terapeuttisia tavoitteita. Kuitenkin tähän mennessä rooli vain muutama lncRNAs on ominaista PCA. High-throughput sekvensointi osoitti, että eturauhasen syöpään liittyvä ncRNA transkripti 1 (PCAT-1) on eturauhasspesifinen säädin soluproliferaation PCa ja kohde PRC2 [40]. Eturauhassyöpä geenien ilmentyminen merkki 1 (PCGEM1) polymorfismit voivat myötävaikuttaa PCa riski [41]. Expression of PlncRNA-1 on huomattavasti korkeampi PCA ja tässä lncRNA säätelee solujen lisääntymistä ja apoptoosia kohdistamalla androgeenireseptorin [42]. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet lncRNAs säädellään genisteiiniä PCA soluissa ja tunnistettu hotair ilmaisussa profiilin näiden lincRNAs.

Tässä tutkimuksessa löysimme korkea ilmentyminen hotair in kastraatio kestävä PCa solulinjoissa. Meidän toiminnalliset analyysit osoittivat, että pudotus on hotair laski PCa proliferaatiota in vitro ja in vivo ja indusoi apoptoosia. Siksi hotair voi olla toiminnallinen rooli tuumorisolujen kasvun PCA. Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että hotair säätelee keskeisten reittejä syövän eteneminen ja metastaasit. Hotair lisääntynyt rintasyövän invasiivisuus ja etäpesäkkeiden indusoimalla positiivinen sääntelyviranomaisten syövän etäpesäkkeiden (ABL2 SNAIL, LAMB3 ja LAMC2) tavalla riippuvaisia ​​PRC2 [29]. Korkea hotair ilme on riski uusiutumisen jälkeen hepatektomian maksasolukarsinoomassa ja voi säännellä MMP-9: n ja VEGF-geenien [34]. Meidän toiminnalliset analyysit osoittivat, että knockdovvn hotair laski PCa solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Meidän mRNA array data ja bioinformatiikan analyysi osoitti myös, että genistein tavoitteet MMP-9: n ja VEGF geenejä, jotka ovat komponentteja Kegg ”Pathway syövän”. Nämä tulokset osoittavat, että hotair voi olla tärkeä rooli PCA etenemiseen.

Koska geeni sääntelyviranomaisten miRNA sitoutuvat 3’UTR mRNA ja voivat yksilöllisesti kohdistaa useita proteiini-koodaus geenit. On kuitenkin vielä selvitettävä, onko miRNA voi myös kohdistaa lncRNAs. Äskettäin muutamat tutkimukset ovat kuvanneet vuorovaikutukset miRNA ja lncRNAs. miR-29 epäsuorasti säätelee ilmentymistä tuumorisuppressorin lncRNA, emolle ilmaistaan ​​3 (MEG3) vaikuttamalla sen metylaation hepatosellulaarinen syöpä [35]. miR-671 ohjaa pilkkomisen antisense-transkriptin pikkuaivojen degeneraatio-liittyvä proteiini 1, 34 kDa (CDR1), mikä johtaa samanaikaisesti lasku CDR1 [37]. Tässä tutkimuksessa, me katsoimme onko miR-34a vaikutuksia lncRNA ilme. Meidän lusiferaasireportterigeenin määritys ja tosiaikaisen PCR: n tulokset osoittivat, että miR-34a sitoutuu hotair mRNA-sekvenssin ja alas-säätelee hotair ilmentyminen PCa solulinjoissa. Siksi tämä tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa, että miR-34a suoraan suunnattu hotair sekä PC3 ja DU145 PCa soluja.

Yhteenvetona tuloksemme osoittivat, että genisteiini estää PCa solujen kasvua alas-säätely onkogeenisen hotair joka on kohteena tuumorisuppressori miR-34a. Nämä havainnot lisäävät tietämystämme genisteiinin vuorovaikutuksessa lncRNA PCA ja osoittaa muita potentiaalisia PCa terapia.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen PCa solulinjat, LNCaP, PC3 ja DU145 ja ei-pahanlaatuisen epiteelin eturauhasen solulinja, RWPE-1, hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PCA solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kosteutetussa atmosfäärissä 5% CO2 ja 95% ilmaa 37 ° C: ssa. RWPE-1-solulinjaa viljeltiin keratinosyyttien kasvualustassa, johon oli lisätty 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää ja 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Subkonfluentit solut (60% -70% konfluentteja) käsiteltiin genisteiiniä (25 umol /l, Sigma, St Louis, MO, USA) ja soluja käsiteltiin vehikkelillä (dimetyylisulfoksidi) toimi kontrollina. Cell-väliainetta ja genisteiiniä vaihdettiin joka päivä ja soluja kasvatettiin 4 päivää.

RNA uuttaminen

Kokonais-RNA uutettiin PCa solulinjojen ja ei-pahanlaatuisten epiteelin eturauhasen solulinja käyttäen miRNeasy mini (Qiagen, Valencia, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden.

microarray

microarray, kokonais-RNA uutettiin PC3 ja DU145 soluja käsiteltiin genisteiini- käyttäen miRNeasy Mini Kit . SurePrint G3 Human GE 8 x 60K Microarray (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) käytettiin ilmaisua profilointiin genisteiinin käsiteltyjen ja kontrolli soluja. Nykyinen microarray data oli hyväksynyt GEO ja määrättiin GEO hakunumero GSE47657.

Quantitative Reaaliaikainen PCR

Extracted kokonais-RNA käänteiskopioitiin yksijuosteista cDNA käyttäen iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi suoritettiin Applied Biosystems Prism7500 Fast Sequence Detection System käyttäen TaqMan Universal PCR Master Mix mukaan valmistajan protokollan (Applied Biosystems). Tasot RNA ilmaisun määritettiin käyttämällä 7500 Fast System SDS ohjelmistoversio 1.3.1 (Applied Biosystems). PCR-parametrit pyöräily olivat seuraavat: 95 ° C 20 sekunnin ajan, 40 sykliä PCR-95 ° C: ssa 3 sekunnin ajan, ja 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Kaikki reaktiot tehtiin 10 ul: n reaktiotilavuudessa kolmena kappaleena. Aineisto analysoitiin delta-delta Ct laskentatapana kertamuutosta. TaqMan-koettimet ja alukkeet hotair (määritys ID: Hs03296680_s1), GAPDH (määritys ID: Hs02758991_g1), miR-34a (määritys ID: 000426), ja RNU48 (määritys ID: 001006) saatiin Applied Biosystems. GAPDH ja RNU48 käytettiin sisäisen valvonnan.

Transfektio

hotair siRNA (SASI_Hs02_00380445 ja SASI_Hs02_00380446, Sigma) ja negatiivinen kontrolli siRNA (D-001810-10; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) käytettiin menettämisestä toiminnon kokeita. Pre-miR miRNA edeltäjän ja negatiivinen kontrolli (Applied Biosystems) käytettiin voitto-of-function kokeissa. PC3 ja DU145 soluja transfektoitiin ohimenevästi käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen), mukaan valmistajan suositusten.

Cell Proliferation, Migration, ja Invasion Analyysit

Solulisääntyminen mitattiin käyttämällä CellTiter 96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (MTS) -pakkausta (Promega, Madison, WI, USA) suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solujen proliferaatio määritettiin absorbanssilla mittauksia 490 nm: ssä käyttämällä SpectraMAX 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA). Solumigraation aktiivisuus arvioitiin haavan paranemista määrityksessä. Solut maljattiin kuusikuoppaisille ruokia, ja yksisolukerroksista kaavittiin käyttämällä P-20 mikropipetin kärki. Leveys alkuperäinen ero (0 h) ja jäljelle jäänyt aukko 24 tuntia haavoittamisen jälkeen laskettiin mikrovalokuvia. Soluinvaasion määritys suoritettiin käyttämällä muunnettua Boyden Chambers koostuu transwell-esipäällystetty matrigeeliä kalvosuodattimella insertit kahdeksan mikronin huokoset 24-kuoppaisille kudosviljelylevyille (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Minimum essential joka sisälsi 10% FBS: ää alemmassa kammiossa toimi kemoattraktanttia, kuten aiemmin on kuvattu [43]. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

In vivo tuumorikasvun

Kaikki eläinten hoito oli mukaisesti ohjeiden San Francisco Veterans Affairs Medical Center ja tutkimuksen hyväksyi San Francisco VA IACUC (Protocol numero: 11-008-01). Eläinten käyttäjät ovat suorittaneet koulutusohjelmia käsitellä ja työskennellä hiirillä kautta AALAS (American Association for Laboratory Animal Science) ennen eläinkokeita. Sillä ihonalaisen ksenografti hiirimallissa, DU145-soluja (5 x 10

6), jotka transfektoitiin väliaikaisesti si-hotair tai si-ohjaus suspendoitiin 100 ui RPMI 1640-elatusaineessa ja injektoitiin ihonalaisesti vasempaan ja oikea takapuolelle kyljet naisten nude-hiiriin, vastaavasti. (Kanta BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, USA, 5 viikkoa). Yhteensä 4 nude-hiiriä käytettiin ja kasvaimen kasvua tutkittiin aikana 35 päivää. Kasvaimen tilavuus laskettiin perusteella leveys (x) ja pituus (y): x

2y /2, jossa x y.

Apoptoosi ja Cell Cycle Analyysit

Fluorescence- aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) analyysi apoptoosin tehtiin 96 tuntia transfektion jälkeen käyttäen Annexin V-FITC /7-AAD Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), mukaisesti valmistajan protokollaa. Solusyklin analyysi suoritettiin 96 tuntia transfektion jälkeen. Solut kerättiin, pestiin kylmällä PBS: llä ja resuspendoitiin ydinvoima tahra 49,6-diamino-2-fenyyli (Beckman Coulter). Stained solut heti analysoitiin virtaussytometrillä (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).

tunnistaminen Genistein valvotuilla kohdegeenien ja bioinformatiikka- Analysis

Jos haluat etsiä geenejä, jotka sääntelevät genistein, suoritimme mikrosirun. Tunnistamaan biologisia prosesseja tai reittejä potentiaalisesti säätelevät genistein, suoritimme GeneCodis analyysi [44], [45] käyttäen kaikki ehdokas geenejä. Sitten tunnistaa verkostoja genisteiini ja niiden kohdegeenien, analysoimme ja ominaista niille geenien GO Biological prosessiin ja Kegg polku luokat. Näitä tietoja käytettiin tutkimaan genisteiiniksi säädelty molekyyli verkkojen ihmisen soluissa. Suoritimme geenien ilmentyminen analyyseja kaikista kandidaattigeenejä mukana kussakin reittejä käyttäen microarray ilmaisun tiedot, jotka hyväksyttiin GEO ja määrättiin GEO hakunumeroilla (GSE29079). Vuonna Affymetrix Human eksoni 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) aineistot, tutkimme 47 PCa kudosten ja 47 normaalin eturauhasen kudoksia, jotka kaikki kerättiin potilailla, jotka eivät olleet altistuneet neo-adjuvanttia radio-, cytotoxic- tai hormonaalisen hoidon ennen leikkausta. Aineisto oli normalisoitu ja analysoitiin GeneSpring (Agilent Technologies). Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Mann Whitney U-testi, joka leikkaa P 0,05, ja tulokset on esitetty lämpöä kartan kaavio.

plasmidin muodostaminen ja Dual-lusiferaasireportteri Analyysit

Jos haluat etsiä miRNA tavoitteita hotair, käytimme miRcode algoritmia (release 6,2, https://www.mircode.org/). MiRcode tarjoaa ihmisen miRNA tavoite perustuvia ennusteita kattavaan GENCODE geeni huomautus [46], mukaan lukien 10000 pitkän ei-koodaavan RNA geenejä. Lusiferaasin reportterimääritys, PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector käytettiin (Promega). Oligonukleotidisekvenssit (villityypin), jota käytetään on esitetty taulukossa S3. Meillä on myös rakennettu mutatoitujen oligonukleotidien kunkin villityypin oligonukleotidien (taulukko S3). Kokonaistilavuudessa 25 ui, 1 ui kutakin 100 uM eteenpäin ja taaksepäin oligonukleotidi, 2,5 ui 10 X hybridisointipuskuriliuosta (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl ja 10 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappo), ja 20,5 ui vettä oli inkuboitiin 95 ° C: ssa 3 minuutin ajan ja asetettiin sitten 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Oligonukleotidit ligatoitiin Pmel-Xbal pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector. Lusiferaasin reportterimääritys, PCa solut ko-transfektoitiin Pre-miR miRNA edeltäjä ja pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspressiovektorit käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ja X-tremeGENE HP DNA transfektio Reagent (Roche Diagnosis, Basel, Sveitsi, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lusiferaasireportterigeenin määritys tehtiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) 24 tuntia transfektion jälkeen.

Tilastollinen analyysi

suhde kahden muuttujan ja numeeriset arvot on saatu reaaliaikaisella RT -PCR analysoitiin käyttäen-parametristä Mann-Whitneyn U-testiä. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen Expert StatView (versio 4, SAS Institute Inc.). Tiedot esitetään keskiarvoina ± keskivirhe. Vertailussa yksi kolmesta muuttujasta a nonadjusted tilastollinen merkitsevyystaso P 0,05 vastaa Bonferronin suhteutettu taso P 0,0167.

tukeminen Information

Kuva S1. Otaksuttu genisteiiniä geenien in ”Pathway in cancer”. N oletettu genisteiini geenien (korostettu punaisella) määrittelemien Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) reitin ja määritetään GENECODIS analyysi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0070372.s001

(TIF)

Kuva S2. Lämpöä kartta kaavio ”Pathways syövän”. Analyysi osoittaa eturauhassyöpäkudoksille (n = 47) ja terveessä eturauhasessa (n = 47). Kukin neliö edustaa ilmentymistason tietyn geenin yksilön näytteessä. Punainen edustaa lisääntynyt ekspressio ja sininen edustaa vähentynyttä ilmentymistä suhteen normalisoitu geenin ilmentymistä kaikissa näytteissä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0070372.s002

(TIF)

Taulukko S1. Geenit vaimentua by genisteiiniksi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0070372.s003

(XLS) B Taulukko S2. Väylät säätelee tavoitteet genisteiinin (Kegg huomautus).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0070372.s004

(XLS) B Taulukko S3. Primer oligonukleotidisekvenssit (villityyppinen ja mutatoitu).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0070372.s005

(XLS) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori Roger Erickson hänen tuen ja avun valmistelun käsikirjoituksen.