Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vialliset IFN signalointi johtaa menetykseen luontaisen immuniteetin ja herkistää solut tehostetun sytolyyttisen tappamisen jälkeen Vesticular (VSV) infektio. Tutkiminen luontaisen immuniteetin aseman normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen Beas2B ja 7 keuhkosyöpäsoluissa paljasti, että kumoamisesta IFN signalointi syöpäsoluissa liittyy herkemmäksi VSV infektion. Häiriöitä IFN väylän keuhkosyövän solulinjoja ja primaarisia tuumorikudokset johtuu epigeneettisellä hiljentäminen kriittisen interferoni reagoivat transkriptiotekijöiden IRF7 ja /tai IRF5. Vaikka 5-atsa-2′-deoksisytidiini hoito epäonnistuu aktivoida IRF7 ja IRF5 ilmaisun tai suojaavat soluja VSV infektion, manipuloimalla IFN signalointi muuttamalla IRF ilmaisu muuttaa viruksen herkkyyttä näiden solujen. Keuhkosyöpä solut voidaan osittain suojata virustapon käyttämällä IRF5 + IRF7 yliekspressio, kun taas IFN reitin häiriöt transfektoimalla siRNA: iden ja IRF5 + IRF7 lisäävät solujen alttius virusinfektio. Siksi IRF5 ja IRF7 ovat keskeisiä transkriptiotekijöitä IFN reitillä, joka määrittää viruksen herkkyys keuhkosyöpäsoluissa; epigeneettiseltä heikentynyt IFN väylän keuhkosyövän kudoksiin tarjoaa potentiaalia biomarkkereita onnistuneen valikoivan tappamisen syöpäsolujen onkolyyttistä viruslääkkeitä.

Citation: Li Q, Tainsky MA (2011) Epigeneettiset vaiennettu IRF7 ja /tai IRF5 Lung syöpäsolut johtaa lisääntynyt herkkyys Onkolyyttiset virukset. PLoS ONE 6 (12): e28683. doi: 10,1371 /journal.pone.0028683

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 15 elokuu 2011; Hyväksytty 13 marraskuuta 2011; Julkaistu: 14 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Li, Tainsky. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Barbara ja Fred Erb Endaumentin Chair in Cancer Genetics Dr. Tainsky, varoja Karmanos Cancer instituutti, molekyylilääketieteen ja genetiikan Applied Genomics Technology Center Wayne State University, ja Genomics ja Biostatistiikka ytimet Karmanos Cancer Institute , P30CA022453. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Koska suurin syy syöpään liittyvää kuolleisuutta sekä miehillä että naisilla, keuhkosyöpä vastaa reilusti yli miljoona kuolemantapausta maailmanlaajuisesti vuosittain. Vaikka diagnoosi ja hoito ovat parantuneet, viiden vuoden eloonjäämisaste on vain 14% johtuu suurelta osin siitä, ettei kasvain rajaamisvai- kirurgian ja systeemistä kemoterapiaa. Parantaminen keuhkosyövän hoidossa on merkittävä kansanterveydellinen tavoite. Äskettäin, luonnossa esiintyvät tai geneettisesti onkolyyttisiä viruksia, mukaan lukien tuhkarokko-virus, Newcastlen taudin virus (NDV), VSV, adenovirukset, reovirus ja Herpes simplex -viruksen tarjoavat tehokkaan ja lupaava vaihtoehto terapeuttinen lähestymistapa taistella tätä tautia [1]. Käytetään yksin tai yhdessä kemoterapian, onkolyyttisten virukset valikoivasti tuhota tuumorisoluja kohdistamalla syöpä vioista suuria reittejä, kuten p53 kasvaimia estävä, ras signaalitransduktion ja IFN signalointireitteihin [1], [2]. Tällä hetkellä tehokkuus ja turvallisuus eri onkolyyttisten virusten hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä arvioidaan parhaillaan prekliinisissä eläinmalleissa ja vaiheen I-III kliinisissä tutkimuksissa [3]. Heistä negatiivisen juosteen RNA-virus, VSV, joka voi laukaista synnynnäisen immuniteetin mekanismeja, on osoitettu olevan tehokas vastaan ​​pahanlaatuinen gliooma, melanooma, leukemiat, hepatosellulaarinen, rinta-, virtsarakko- ja eturauhassyövät, joilla on viallinen antiviraalinen vastauksia. [4], [5], [6], [7].

Tyyppi I IFN signalointireittiä aktivoidaan VSV infektion ensilinjan synnynnäistä immuunivastetta suojaamaan normaaleja kudoksia virustapon, ja siksi kasvainsoluja jotka ovat menettäneet antiviraalisen reaktiivisuus edustavat selektiivinen tavoitteet VSV. Ensisijainen vasteen virusinfektion ja käyttöönottoa kaksijuosteisen RNA: t on TLR3 aktivointi, joka välittyy IRF-3, cJUN /ATF-2, ja NFKB, aiheuttaen siten tuotannon välitön varhainen muuniresponssigeeneinä ensisijaisesti IFNp. Ne varhaisen reagoinnin IFN sitoudu tyypin I IFN-reseptorit (IFNAR) autokriinisellä tai parakriinisesti aktivoida STAT1 ja indusoi toissijaisen antiviraalisen muuniresponssigeeneinä lukien transkriptiotekijä IRF7 joka sitten edistää ilmaisun muille IFN stimuloi geenejä (ISGs). Lopuksi kolmannen asteen transkription aalto IFNa perustetaan viruslääke tila [8], [9].

vajaatoiminta IFN signalointi liittyy kohonnut riski kasvaimen kehitystä [10], [11], [12 ] kuten IFN koulutusjakson myös antiproliferatiivinen ja immuunijärjestelmän valvontatoimien syöpää vastaan. Niinpä suurin osa (-80%) NCI 60 paneelin syöpäsolulinjoja näyttö häiriintynyt synnynnäisen immuniteetin vastaukset [9]. Olemme osoittaneet, että IFN signalointireitille kumottiin aikana spontaanin kuolemattomaksi fibroblasteissa Li-Fraumeni oireyhtymä (LFS) potilaat, jotka ovat alttiita varhain alkanut ja useita kasvaimia, koska ituradan mutaatioita p53. Tärkeänä epigeneettiset valvontamekanismi, DNA hypermetylaatiota CpG: t in promoottorialueiden tukahduttaa geenin ilmentymistä sekä kehityksen aikana ja kasvaimen kehittymisen. Useita ISGs olivat alas-säädellä epigeneettisellä hiljentäminen aikana kuolemattomaksi, varhainen ja välttämätön askel syövän synnyn, ja joitakin samoja ISGs olivat ajan säädellään monistus vanhenemista [13], [14], [15]. Hoito kuolematon työvoimatutkimuksen solulinjoissa 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC), estäjä DNA metyylitransferaasien palautettu IFN signalointia ja aiheutti vanhenemista kaltainen tila [13], [15].

IFN-indusoituva transkription tekijöitä, IRFs, ovat keskeisiä välittäjiä IFN-vastetta. Puute

IRF7

ilme vastasi poikkeava promoottori hypermetylaation CpG-saarekkeiden sen promoottorin ja määriteltiin myös yhdeksi metylaatiospe- vaiennettu geenien useita syöpätyyppejä, mukaan lukien keuhkosyöpä, hepatosellulaarinen, maha- ja haimasyöpiin [16], [ ,,,0],17], [18], [19]. Vähentynyt ilmentyminen IRF5, toinen tärkeä transkriptiotekijä IFN koulutusjakson, havaittiin myös hematologisten maligniteettien, joka on sopusoinnussa sen roolin aiheuttavan G2-M kasvun pysähtymisen ja apoptoosin [20]. Epigeneettiset inaktivointi

IRF5

oli niinikään havaittu hepatosellulaaristen ja mahasyövän [21], [22]. Koska suora indusoijat IFN koulutusjakson, IRF7 ja IRF5 aiheuttaa päällekkäistä ISG transkription profiileja kuitenkin differentiaalikaavojen kuvioita ja kinetiikka ISGs syytteeseen että heillä nonredundant ja erilliset tehtävät synnynnäisen immuunivasteen. Verrattuna IRF7, IRF5 on paljon vahvempi aktivaattori varhaisen viruslääkkeiden geenejä, mukaan lukien IFNP [23]. Tuoreessa raportissa osoitimme, että tehostettu ilmentyminen IRF5 ja /tai IRF7 voi aktivoida IFN liittyviä geenejä, estävät solujen kasvua ja aiheuttaa vanhenemista [15]. Hiljentäminen näiden olennaisten IRFs ja kasvua tukahduttava IFN reitti voi olla tarpeen varhainen tapahtuma syövän kehittymiseen, erityisesti liittyvät kuolemattomaksi.

Vaikka syöpäsolut, niiden IFN-reittiin kumottu, ovat voineet hankkia kasvu /mahdollisuudet säilyä niiden normaali kollegansa, he samalla vaarantaa niiden antiviraalisen suojaavaa kykyä. Täällä, uusia terapeuttisia paradigmat joihin onkolyyttisiä RNA-virusten kohdistaa viallisen luonnollinen immuniteetti syöpäsoluissa tutkitaan. Huomasimme, että herkkyys onkolyyttisten VSV voimakkaasti ja merkittävästi liittyvät häiriöt IFN signalointireitin. Epäonnistuminen säätää ylös ISG ilmaisu upon dsRNA stimulaation osoitti heikentynyt antiviraalisen vasteen herkistävät keuhkosyövän solulinjat VSV aiheuttama onkolyyttistä solukuolemaa. Kuitenkin kaikki keuhkosyöpä solut voidaan tappaa VSV infektion, kuten jotkut heistä omistavat suhteellisen normaali luontaisen immuniteetin polku ja siksi ovat resistenttejä VSV välittämää virustapon. Bisulfiitti sekvensointi paljasti promoottori hypermetylaatiota joko

IRF7

ja /tai

IRF5

useita keuhkosyövän solulinjoja. Samoin kun tutkimme DNA tuore keuhkosyöpään kudoksia, havaitsimme promoottori metyloinnin

IRF7

ja /tai

IRF5

, mikä viittaa siihen, että niiden IFN antiviraalisen vasteen myös epigeneettiseltä hiljeni, kun toiminnallinen IRF7 ja IRF5 tarvitaan koskemattoman IFN kautta. Kuitenkin 5-atsa-dC hoito ei aktivoida IRF5 tai IRF7 ilmentymistä tai pelastus keuhkosyöpä solut VSV infektion. Muuttamalla luontaisen immuniteetin manipuloimalla IRF ilme muuttui viruksen herkkyyttä normaalien Beas2B keuhkoputken epiteelisoluissa tai keuhkojen syöpäsoluja. Solut ilman funktionaalista IFN vastaus osittain suojattu viruksesta seuraavista IRF5 ja IRF7 yliekspressio, kun taas häiriöt IFN signaloinnin kohdentamalla IRF5 ja IRF7 käyttämällä siRNA lisäsi Beas2B solujen alttius sytolyyttisen vaikutuksia VSV. Näin ollen, IRF5 ja IRF7 ovat keskeisiä tekijöitä IFN polku, joka määrittää viruksen herkkyyttä solujen onkolyyttisten viruksia. Erittäin selektiivinen VSV tappaminen keuhkosyöpään solujen, joilla on heikentynyt IFN polku johtuu epigeneettiseltä downregulation IRFs osoittaa, että nämä geenit ovat ihanteellisia biomarkkereiden määrittämiseksi herkkyyttä kasvainten onkolyyttisten viruslääkkeitä.

Tulokset

IFN signalointi vajaukseen liittyy VSV herkkyys

IFN polku ohjaa solujen virusinfektioiden ja dsRNA. Solut, jotka ovat täysin toimiva synnynnäinen viruslääke järjestelmä pystyy suojautumaan viruksilta, mikä johtuu suurelta osin induktion IFN signalointiryöpyn. Olemme osoittaneet, että IFN koulutusjakso on epigeneettiseltä inaktivoituu fibroblasteista LFS potilaiden spontaanisti kuolemattomaksi [14]. Tutkiminen luontaisen immuniteetin tila normaalissa keuhkoputkien epiteelisolujen linja Beas2B, sen

ras

transformoituja johdannainen soluja ja 2 tuumorigeenisia kloonien paljasti, että kun IFN signalointi aktiivisuus vähenee herkkyyttä VSV tappaminen lisääntyi keuhko kasvaimen kehittymisen (Li ja Tainsky, julkaisematon data). Koska toiminnallisen inaktivoinnin IFN reitin on ollut yleinen piirre moniin syöpiin, käytimme 7 pitkän aikavälin keuhkosyövän solulinjat (4 adenokarsinoomat: CRL5800, CRL5807, CRL5810 ja CRL5872, 2 levy- karsinoomista: HTB172 ja CRL5928 ja 1 pienisoluinen karsinooma: CRL5869) tutkia muutoksia niiden luonnollinen immuniteetti.

Käyttämällä edustava joukko ISGs Q-RT-PCR-määrityksissä, me tutkittiin sekä perustason ISG ekspressiotasot ja niiden ilmaisun jälkeen stimulaation IFN-reitin synteettiset dsRNA polyI: C, joka jäljittelee viruksen RNA: n [15]. Olemme löytäneet alempi perustason ilmentyminen useimmissa ISGs testattu kaikissa keuhkosyövän solulinjat verrattuna Beas2B soluja (taulukko 1). IFN polku voitaisiin aktivoida Beas2B soluissa 12 ulos 14 geenejä indusoitavissa polyI: C stimulaatiota. Sen sijaan polyI: C onnistunut indusoimaan mRNA: iden kaikkien 14 geenien testattu CRL5810 soluissa, kun taas vaihteleva induktio puutteita olennaisten antiviraalisen vasteen geenejä, kuten

IFNa-

,

IFNP

,

IRF7

,

IRF5

ja

STAT1

havaittiin CRL5800, CRL5807, CRL5872 ja CRL5869 soluja. Yllättäen, Q-RT-PCR osoitti, polyI: C indusoituvan ilmentymisen 10: 14 ISGs on HTB182 ja CRL5928 solujen samalle tasolle Beas2B osoittaa suhteellisen normaali antiviraalisen vasteen näissä kahdessa keuhkosyövän soluja (taulukko 2).

Koska heikentynyt synnynnäisen immuniteetin signalointi johtaa usein lisääntynyt herkkyys virustapon, VSV herkkyys tutkittiin sen määrittämiseksi, onko puute ISG aktivointi vastaa kohonnut alttius onkolyyttinen viruksen tappaminen keuhkosyövän soluja. Kuten odotettua, Beas2B solut ehjillä IFN vastaus vastustanut VSV infektion esillä vähän muutoksia solujen elinkelpoisuutta. Lisäksi, HTB182 ja CRL5928 olivat suhteellisen resistenttejä verrattuna muihin keuhkosyövän soluista, kuten yli 60% soluista oli yhä elossa korkealla annoksella VSV (MOI5) ilman eksogeenista IFNa esikäsittelyä (kuvio 1A). Sen sijaan, loput keuhkosyövän solulinjat vaihtelevasti menettäneet kyvyn suojella itseään VSV. Yhä useampi IFN-signaloinnin puutteesta keuhkosyöpä solut (välillä -30%: sta -70%) kuoli nostamalla annosta VSV altistumisen ja lisäämällä IFNa keskipitkän eivät estäneet sytotoksisuuden suuren annoksen VSV (MOI5) in CRL5800, CRL5810 ja CRL5869 soluja (kuvio 1A). Mielenkiintoista on, että alennettu-tasojen useimpien ISGs kaikissa keuhkosyövän solulinjat ehdotettu mitään assosiaatiota VSV herkkyys ja pohjapinta ISG tasoilla (taulukko 1). Muuttuva herkkyys virustapon vastasi ero kumotaan IFN vasteen keuhkosyöpää solulinjoissa. Selektiivinen virolytic vaikutukset VSV olivat merkittävimmät CRL5810 soluissa sopusoinnussa vakavin puutteita niiden luontaisia ​​anti-virus-järjestelmä (taulukko 2 ja kuvio 1 A). Havaitsimme myös 5 ISGs (

IRF5

,

IRF7

,

STAT1

,

IRF3

ja

IFI16

), jonka ilmentyminen oli leimallisesti kohonnut 3-kertaiseksi vasteena poly I: C hoito ainoastaan ​​VSV-resistenttejä solulinjoja (taulukko 2 ja kuvio 1 A). Western blot-analyysi vahvisti, että kohonnut ISG mRNA: n ilmentymisen, kun polyI: C induktio johti ilmen- tymisen lisääntymisen proteiinin tasot VSV-resistentit solut. Ser727 fosforylaatio STAT1 voidaan indusoida IFN mutta ei IFNa [24], ja käytettiin markkerina varhaiseen vaste-geenin aktivointi IFN kautta. Vahva polyI: C-induktio fosforyloidun-STAT1 (p-STAT1, Ser727), STAT1, IRF5 ja IRF7 proteiinin tasot olivat yhdenmukaisia ​​vastus tavanomaisen Beas2B solujen ja kaksi syöpäsoluja, HTB182 ja CRL5928, VSV-infektion ja päinvastoin versa varten viruksen herkkä keuhkosyövän solulinjaa. Lievä Ser727 fosforylaatio STAT1 voidaan havaita CRL5807 soluissa osoittaa suhteellisen normaali alussa IFN signalointia tässä solulinjassa verrattuna muihin VSV-herkkiä solulinjoja. IRF5 ja IRF7 proteiinin tasot olivat kauttaaltaan ei indusoituvaa päälle polyI: C hoito kaikissa virus-herkän keuhkosyövän solulinjoja (kuvio 1 B). Ei merkittäviä muutoksia IRF3 proteiinin havaittiin polyI: C hoitoon kaikkien keuhkosyövän solut ehkä koska sen toiminta on pääosin säänneltyjä posttranslationaalisesti muutokset fosforylaatio (tuloksia ei ole esitetty). Siksi meidän havainnot tukevat käänteisen assosiaatiota onkolyyttisten herkkyyttä VSV ja indusoituvuus IFN signalointi normaaleissa keuhkoputken epiteelisoluissa Beas2B ja keuhkojen syöpäsoluja.

. Valikoiva sytotoksisuus VSV keuhkosyövän solujen viallinen IFN kautta. Beas2B ja 7 keuhkosyövän solulinjoja arvioitiin niiden kyky indusoida antiviraalisen vasteen VSV-infektion kanssa tai ilman IFNa esikäsittely viruksen aiheuttama cytopathicity käyttäen MTT-määritystä. Arvot normalisoitiin arvoon ohjaus infektoitumattomiin soluihin, jotka oli asetettu 100% vähintään kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta (

n

= 3), jossa SD on 10%. (-): Ei VSV infektioiden hallintaan. MOI0.05: infektiokertoimella 0,05, pieni annos VSV-infektion. MOI5: infektiokertoimella 5, suuren annoksen VSV-infektion. B. Proteiini ekspressiotasot useiden ISGs in polyI: C käsiteltiin Beas2B ja keuhkosyövän soluja käsittelemättömiin soluihin verrattuna käyttäen Western blot. Kertamuutoksia of IRF5 ja IRF7 ilmaisun jälkeen polyI: C hoito oli ilmoitettu. Tubuliinia käytettiin normalisoi ohjaus.

Epigeneettiset hiljentäminen kriittisten transkriptiotekijöiden

IRF7

ja

IRF5

tuloksia kumota IFN koulutusjakson

promoottori hypermetylaation on epigeneettiset mekanismi geenisäätelystä tiedetään hiljentämään geeniekspressio mekanismeja solujen kohtalon määrittämiseen ja syövän syntymistä. Olemme aiemmin raportoitu, että IFN polku on kumonnut epigeneettisellä vaiennettu keskeinen viruslääkkeiden puolustus välittäjänä IRF7 in kuolematon LFS fibroblasteissa [14], [15]. Mielenkiintoista, toisessa tutkimuksessa havaittu tupakansavun altistumisen seurauksena tukahduttaminen IFN signaloinnin takia

IRF7

promoottori hypermetylaation, mikä johti laskenut viruslääkkeiden vastustuskykyä hengitysteiden epiteelin [25]. Siksi me tutkimme, promoottorin metylaation

IRF7

voisi myös olla syynä IFN reitin häiriöt keuhkosyövän solulinjat. DNA-sekvensointi natriumbisulfiitin käsitellyn genomista DNA paljasti

IRF7

promoottori hypermetylaation 2 keuhkosyövän solulinjoja (CRL5810 ja CRL5869), mikä viittaa siihen, että epigeneettisellä vaiennettu

IRF7

on ollut rooli häiriöt IFN signalointia näissä solulinjoissa (kuvio 2A). Koska IRF5 indusoi voimakkaamman transkription profiili alussa antiviraalisen geenejä [23] ja on hiljattain tunnistettu uusi metylaation markkeri syövän [21], [22], olemme edelleen tutkittiin metylaatiostatuksen

IRF5

promoottorin alueet keuhkojen syöpäsoluja. Lisääntyvä

IRF5

hypermetylaation havaittiin CRL5800, CRL5807, CRL5872 ja CRL5810 solulinjoissa (kuvio 2B), mikä samanlainen virus alttius

IRF7

-unmethylated CRL5800, CRL5807, CRL5872 solut oli seurausta epigeneettiset

IRF5

inaktivoitumista. Lisäksi promoottori hypermetylaation sekä

IRF7

ja

IRF5

selitti korkein herkkyys VSV ilmenee CRL5810 soluja. Sen sijaan, promoottorialueet ole

IRF7

eikä

IRF5

havaittiin metyloitavaa Beas2B, CRL5928 ja HTB182 solulinjoja sopusoinnussa niiden ehjä luontaisen immuniteetin ja kestävyys onkolyyttistä virusten tuhoutumisen. Kaikkiaan selektiivinen menetys viruksen suojan keuhkosyöpä soluissa, jotka liittyvät epigeneettisiä inaktivaatio ainakin yhden IRFs syytetään välttämättömyys sekä IRF7 ja IRF5 olla aktiivinen funktionaalinen IFN-reitin.

metylaatiostatuksen CpG saaret

IRF7

ja

IRF5

promoottori alueille Beas2B, ihmisen keuhkosyövän solulinjoja ja primaarisia kudoksissa tutkittiin sekvensoimalla bisulfiitin käsitellyn genomista DNA: ta. A. IRF7. B. IRF5. Suljetut ympyrät, metyloitu C CpG dinukleotideissä; avoimet ympyrät, metyloitumattomia C CpG dinukleotideissä. TSS, transkription aloituskohdasta.

Koska epigeneettisellä tilanteet saattavat ilmetä pitkäaikaiseen viljelyyn, jotka eivät olleet läsnä alkuperäisessä syöpä, tutkimme IRF-promoottori metylaatiovyöhykkeiden makean pakastetut ensisijainen keuhkosyöpä kudoksia .

IRF7

promoottori oli täysin metyloitu 6 ulos 20 NSCLCs, kun taas 5 muut kasvaimia oli 5′- osittainen metylaatio (kuvio 2B) alustavana tapahtuma, joka voi levitä viereisiin CpG sivustoja [26]. Samanaikaisesti löysimme raskas metylaation 4 20 NSCLC näytettä ja 11 muilla oli osittainen metylaatio

IRF5

promoottorialueille. Kaiken kaikkiaan 15: 20 potilaan näytteillä oli promoottorin metylaation jompikumpi tai kumpikin IRFs, tapahtumia riittävästi vaimentamaan niiden IFN vaste. Ei poikkeava

IRF7

tai

IRF5

hypermetylaation havaittiin matching buffy coat DNA: t näistä samoista potilaista mikä osoittaa, että IRF promoottori hypermetylaation ollut seurausta iturataan epigeneettiset muutokset. Siksi metylointi

IRF7

tai

IRF5

promoottorit löydetty keuhkosyövän solulinjat oli luultavasti alkunsa kasvain sijaan, että tapahtuman aikana valittu sen soluviljelmässä. Tuloksemme osoittivat, että lisääntynyt alttius virusinfektio välittävät epigeneettisellä mekanismit alaspäin säätäminen avain viruslääkkeiden puolustus koulutusjakson sääntelyviranomaisten IRF5 ja IRF7. Esiintyvyys epigeneettiset vaiennettu IRFs ja sen tiukka yhdessä VSV herkkyys tekee niistä ihanteellisia teranostiikka- biomarkkerit seuloa keuhkosyöpäpotilaita mahdollisia onkolyyttistä viruslääkkeitä.

manipulointi IFN signalointireitin kohdistaminen IRFs muuttaa VSV viruksen herkkyys

aiemmin osoitettu, että 5-atsa-dC demetylaatio hoito voisi palauttaa geenin ilmentymistä epigeneettiseltä vaiennettu

IRF7

ja muut ISGs siten uudelleen käyttöön IFN-signalointireitin in kuolematon LFS fibroblastisolulinjat [14], [15] . Yllätykseksemme IRF7 ja IRF5 ekspressiotasot pysyi poissa (kuvio 3A, vähemmän kuin 1,5-kertainen kasvu sekä IRF5 ja IRF7) keuhkosyövän solulinjassa CRL5810 jälkeen 5-atsa-dC hoitoa niin kauan kuin 4 viikkoa. Yllättäen sekvensointi ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta

IRF5

ja

IRF7

promoottorialueet paljasti, että pitkittynyt 5-atsa-dC sovellus ei pysty kääntämään promoottorin hypermetylaatiota IRFs in CRL5810 soluissa (tietoja ei näytetty). Samanlaisia ​​resistenssin 5-atsa-dC hoidon havaittiin muiden IRF7-metyloituja keuhkosyövän solulinjassa CRL5869 (tuloksia ei ole esitetty). Tämän seurauksena, laajennettu demetylaatio hoito 5aza-dC voinut vaikuttaa VSV herkkyys CRL5810 soluja (kuvio 3B), ja osoittavat lisäksi, että IRF5 ja IRF7 ovat kaksi keskeistä tekijää IFN signalointi, joka voi säädellä onkolyyttistä viruksen herkkyyteen.

. Western blotit paljastaneet mitään lisäystä IRF7 tai IRF5 proteiinin ilmentymisen jälkeen 5-atsa-dC hoidossa CRL5810 soluja. Kertamuutoksia of IRF5 ja IRF7 ilme oli merkitty päälle 5-atsa-käsitellyt DC sarake. B. CRL5810 solut olivat edelleen herkkiä VSV cytolyic vaikutukset sen jälkeen, kun 5-atsa-dC hoitoon.

Kumpikaan näistä kahdesta IRF transkriptiotekijöiden voitiin indusoida VSV-herkkien keuhkosyövän soluja (taulukko 2 ja kuvio 1 B), kun taas yliekspressio IRF5 ja /tai IRF7 in kuolematon LFS fibroblasteissa voimistunut muut ISGs, ilmenee nopeampi ja vahvempi synnynnäisen immuniteetin signalointi kun dsRNA stimulaation, joka on riittävä indusoimaan vanhenemista [15]. Elvyttämiseksi vammaisten IFN-vasteen keuhkosyövän soluja, IRF5 ja IRF7 yksinään tai yhdistelmänä transfektoitiin stabiilisti osaksi CRL5810 soluihin, joissa jatkuva 5-atsa-dC hoito ei ollut vaikutusta demetylaation IRF-promoottorin. Western blot-analyysi vahvisti kohonnut pohjapinta-proteiinin ilmentyminen IRFs on IRF5 ja IRF7 yli-ilmentäviä soluja (kuvio 4A). Yksittäiset palauttaminen IRF ilmaisun osittain suojattu CRL5810 soluja VSV sytolyysi kaikella lisääntyminen solujen elinkelpoisuuden välillä -50%: sta yli 85%: iin MOI0.05, ja -30%: sta -50%: iin MOI5 VSV infektion soluissa yli-ilmentävät sekä IRF5 ja IRF7 verrattuna vektorisäädön soluihin (kuvio 4B). Selitimme vaatimaton voitto virus suoja jälkeenkin IRF5 ja IRF7 yhdistetyt transfektio vakavia menetyksiä muita tärkeitä ISGs vuonna CRL5810 soluissa kuten puute vaikutus eksogeenista IFN.

. Proteiinin ekspressiotasot STAT1, IRF5 ja IRF7 analysoitiin western blotteja IRF transfektoitu stabiilisti CRL5810 soluja. Anti-flag-vasta-ainetta havaitsemaan transfektoitujen IRF-proteiinin tasot, kun taas IRF5- ja IRF7-spesifisiä vasta-aineita käytettiin yhteensä IRF-proteiinin ilmentymisen. B. yliekspressio IRF5 ja /tai IRF7 osittain lisäsi CRL5810 solujen vastustuskykyä VSV infektion eniten kasvu yhdistetyssä trasfection. * P 0,02, ** p 0,001.

valikoiva replikaatio VSV kasvaimissa vaarantunut IFN polku on kulmakivi sen kliinisen hakemuksen onkolyyttistä viruslääkkeitä. Kuitenkin kaikki keuhkosyöpää potilaiden syöpiä ovat puutteellisia niiden synnynnäisen immuniteetin kautta. Voittaa tämän esteen ja tuhota niitä VSV-resistentit solut, siRNA: t ja IRF5 (siIRF5) ja IRF7 (siIRF7) levitettiin tukahduttaa IFN-vasteen soluissa, joilla on aktiivinen IFN kautta. Verrattuna Beas2B transfektoitujen solujen ohjattu salattu siRNA, jotka on transfektoitu siIRF5 tai siIRF7 johti vähenemiseen IRF5 ja IRF7 induktio jälkeen polyI: C hoitoon, kun taas transfektio sekä siIRF5 + siIRF7 täysin eliminoida IRF aktivaation (kuvio 5A). Transfektio siIRF5 yksin inhiboi merkittävästi polyI: C-aktivointi sekä IRF5 ja IRF7, joka voidaan selittää keskeinen rooli IRF5 niin vahva induktori IFNP [23]. Vähentynyt IRF5 ilmentyminen siIRF5 johti paljon vähemmän IFNP tuotanto mikä alentaa stimulaation johdetun vasteen geenin IRF7. Kuten odotettua, tukahduttaminen ne 2 geenien siRNA aiheutti merkittävän menetyksen suojaa VSV infektion kaikkein sytotoksisuuden kasvu lähes 40%, kun suurempi annos VSV altistuminen yhdistelmä knockdowns vertailuryhmän siRNA (kuvio 5B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin samanaikaisesti transfektiotutkimuksissa VSV-resistenttien CRL5928 soluja, jotka ovat suhteellisen ehjänä IFN signalointia (tuloksia ei ole esitetty). Tämä osoittaa selvästi, että IRF5 ja IRF7 ovat toiminnallisesti välttämättömiä synnynnäisen immuniteetin, joka määrittää viruksen herkkyys näiden solujen.

. Kumota IRF5 ja /tai IRF7 induktion siRNA päälle polyI: C treatmentwas esitetty Western blot. Kertamuutoksia of IRF5 ja IRF7 ilmaisun jälkeen polyI: C hoito oli ilmoitettu. Si (-): ohjaus siRNA. B. IRF5 ja IRF7 ovat tärkeitä tekijöitä, jotka vaikuttavat viruksen herkkyys soluja. Esto nämä 2 geenien johti menetykseen suojaa VSV infektion eniten sytotoksisuuden kasvu yhdistelmä knockdown. * P 0,03, ** p 0,001.

Yhteenvetona menetys IFN signalointi on välttämätön ja riittävä lisääntynyt herkkyys tappamista onkolyyttisten viruksia. Manipuloinnin IFN-reitin kautta transkriptiotekijöiden IRF5 ja IRF7 muuttaa solujen vaste VSV-infektion. Analyysi IFN reitin käyttämällä näitä IRF metylaatio biomarkkerit voivat tarjota uusia teranostiikka- biomarkkereita määrittämiseksi potilaan herkkyyttä onkolyyttistä viruksia.

Keskustelu

Toimiva synnynnäisen immuniteetin viruslääke järjestelmä suojaa soluja vastaan ​​virusinfektio, pääasiassa johtuen induktion puolustava IFN signalointiryöpyn, joka näyttää olevan perusta virus resistenssin ja immuuni stimuloiva ominaisuudet. Täällä olemme osoittaneet vahvaa ja vakuuttavaa käänteinen suhde tehokas luontaisen antiviraalisen vasteen ja onkolyyttisten viruksen herkkyyttä käyttäen keuhkosyövän solulinjoja. Lisäksi transkriptiotekijöiden IRF5 ja IRF7 katsottiin kriittisiksi säätelijöinä luonnollinen immuniteetti ja käyttökelpoinen biomarkkereita onkolyyttisten Virusalttius keuhkojen syöpäsoluja koska molemmat olla indusoituva varten toimiva IFN-reitin. Inaktivointi joko IRF5 tai IRF7 heikensivät antiviraalisen vasteen merkittävimmät menetys, kun molemmat IRFs olivat epigeneettiseltä vaiennettu vuonna CRL5810 soluissa. Vaihteleva laajuus sytolyyttisen kuoleman liittyy ero vakavuus IFN reitin vikoja. Läsnäolosta huolimatta eksogeenisen IFNa, CRL5810 solut ovat ei-reagoiva ja edelleen alttiina VSV tappaminen, joka vastaa täydellistä häiriöitä IFN-reitin aktiivisuuden.

menetys tuumorisuppressorigeenin ilmentymisen poikkeava promoottori metylaatio on varhainen ja yhteisen epigeneettiset tapahtuma puhkeamista ja etenemistä syövän [27]. Olemme osoittaneet epigeneettisellä vaiennettu

IRF5

ja

IRF7

at CpG-saarekkeiden promoottorin alueiden keuhkosyöpä. Farmakologinen kohdentaminen poikkeavien epigeneettiset muutokset demetyloimalla agentit ovat osoittaneet kliinistä tehoa useissa hematologisia syöpiä [28]. Kuitenkin ne metylaatio inhibiittorit voi estää toistumisen hypermetylaation ja olemme esittäneet todisteita siitä, että epigeneettisellä vapauttaminen ei voida täysin palautuneet sarjassa keuhkosyövän solulinjat. Epäonnistuminen demetylaatio aineiden palauttaa ratkaiseva ISG ilmaisu osoittaa, että nämä keuhkosyöpään solut ovat ihanteellisia kohteita onkolyyttistä viruslääkkeitä.

Vaikka pohjapinta tasot useimpien ISGs vähenivät kaikissa keuhkosyövän solulinjat verrattuna normaaliin keuhkoputken epiteelin solut, onkolyyttisten viruksen herkkyys on vain liittyy polyI: C-indusoituvaa ekspressiotasot tiettyjen keskeisten ISGs kuten IRF7 ja IRF5. Kuitenkin IRF5 ja IRF7 yli-ilmentyminen ei ole riittävä täysin palauttaa IFN-reitin ja vain osittain pelastettiin solujen viruksen aiheuttaman infektion puutos muita tärkeitä ISGs. Jättäminen aiheuttaa Ser727 fosforylaatio päälle polyI: C hoito ehdotti lisäksi synnynnäisen immuniteetin puutteita useissa VSV herkillä solulinjoista (kuvio 1 B). Lisäksi mRNA: n 3 muuta ISGs (STAT1, IRF3 ja IFI16, taulukko 2) on johdonmukaisesti indusoi in VSV-resistentit solut. Lisätutkimuksia tarvitaan vahvistamaan niitä teranostiikka- biomarkkereita ja voi tunnistaa muita ISGs biomarkkereina keuhkosyövässä jonka aktivointi voisi erottaa virus-resistentti virus-herkkien syöpien.

esittänyt todisteita siitä, että funktionaalinen inaktivaatio IRF5 ja IRF7 on suuret mekanismi häiritä IFN signalointi keuhkojen syöpäsoluja. Kuitenkin oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia satama monipuolinen molekyyli- vikoja tämän reitin. Vapautettu JAK3 ja RNaasi L reittejä LNCaP eturauhassyövän solut [29], vialliset STAT1 ja Stat2 aktivaatio fibrosarkooma ja melanoomasolujen [30], [31] ja alassäädetty IFNAR in high grade virtsarakon syöpä [32] on kaikki raportoitu poistaa synnynnäisen immuniteetin signalointi. Kaiken IFN polku on usein vaimentua aikana tuumorigeneesin vaikka erillistä sarjaa ISGs vaimennetaan eri mekanismien syöpää tyyppikohtaista tavalla.

Epäonnistuminen aktivoida luontaisen immuniteetin vasteen onkolyyttisten RNA virusinfektion johtaa erittäin selektiivinen puhdistuma IFN-nonresponsive kasvainsoluja. Lisäksi VSV, muut RNA-virukset, kuten NDV: n [33] ja influenssaviruksen [34] on myös osoitettu olevan kasvaimen selektiivisen sytotoksisuuden käyttäen samaa mekanismia kohdesoluihin on heikentynyt IFN-aktiivisuuden. Kliinisissä tutkimuksissa laskimoon NDV (PV701) osoitti sen alkuperäisen onkolyyttisten vaikutuksia useisiin kiinteiden kasvainten [35]. Lisäksi VSV kannat M-proteiinin mutaatioiden (AV1 ja AV2) laukaisi vankempi antiviraalisen vasteen koska niiden puutteita kyky shutdown IFN signalointia; nämä mutantit selektiivisesti hävitetään IFN-responsiiviset solut alemmalla terapeuttisen annoksen pysyessä erittäin lyyttinen syöpäsoluissa [9]. Expression of immuunijärjestelmää stimuloivien proteiinien, kuten interleukiini-2 (IL-4) tai IFNp geenimuunnelluissa VSV on myös luotu edistämään viruksen sytolyyttisen vastaukset [5], [6]. Täten lisäämällä anti-virus vasteita normaaleissa soluissa lisäävät onkolyyttisten valikoivuutta IFN-nonresponsive kasvaimia.

Vaikka alennettua antiviraalisen vasteen voi olla yhteinen piirre laajan syöpien, onkolyyttisten tehoa luonnossa esiintyviä RNA virukset voivat silti olla suhteellisen alhainen, kuten jotkut kasvaimet osoittamaan vankka luontaisen immuniteetin vasteita, jotka estävät viruksen replikaatiota ja leviämistä.