Krooninen sairaus

tiivistelmä

Valitsemalla peräsuolen syöpä (CRC) potilaat todennäköisesti reagoivat hoito on edelleen kliinisen haaste. Tavoitteet Tämän tutkimuksen selvittääkseen, mitä geenit ilmentyvät differentiaalisesti osalta hoitoon herkkyyttä ja suhteuttaa kopioida numeron paneelin 15 CRC solulinjoissa. Kopioluvun vaihtelut tunnistettujen geenien arvioitiin kohortin CRC. IC

50: n mitattiin 5-fluorourasiilin, oksaliplatiinia ja BEZ-235, PI3K /mTOR-estäjä. Solulinjat profiloitiin käyttäen array vertailevaa genomista hybridisaatiota, Illumina geeniekspressioanalyysissä, käänteisfaasi- proteiinijärjestelmien, ja kohdennettua sekvensointi

KRAS

hotspot mutaatioita. Usein voitot havaittiin 2p, 3Q, 5p, 7p, 7q, 8q, 12p, 13q, 14 q, ja 17Q ja tappiot 2q, 3p, 5q, 8p, 9P, 9q, 14 q, 18q, ja 20p. Usein saadut alueet sisälsivät

EGFR

,

PIK3CA

,

MYC

,

SMO

,

TRIB1

,

FZD1

, ja

BRCA2

, kun taas usein hävisi alueilla sisälsi

FHIT

ja

MACROD2

.

TRIB1

valittiin jatkotutkimuksiin. Gene rikastamiseen analyysi osoitti, että ilmennetty eri geenien osalta hoitovaste oli mukana Wnt signalointia, EGF-reseptorin signalointi, apoptoosin, solusykliä, ja angiogeneesi. Vaiheittainen integrointi kopioluvun ja geenien ilmentyminen saadut tiedot 47 kandidaattigeenejä jotka korreloi merkitsevästi.

PDCD6

oli ilmennetty eri kaikissa kolmessa hoitovasteita. Kudossiruina rakennettiin varten kohortin 118 CRC potilaista ja

TRIB1

ja

MYC

monistukset mitattiin fluoresenssi

in situ

hybridisaatiolla.

TRIB1

ja

MYC

monistettiin 14,5% ja 7,4% kohortin vastaavasti ja nämä tiomonistukset korreloi merkitsevästi (p≤0.0001).

TRIB1

proteiinin ilmentymisen potilaan kohortin korreloi merkitsevästi Perk, Akt, ja kaspaasi 3 ilme. Lopuksi joukko ehdokas ennakoivan biomarkkereita 5-fluorourasiilin, oksaliplatiinia ja BEZ235 kuvataan, jotka edellyttävät lisätutkimuksia. Monistaminen oletetun onkogeenin

TRIB1

on kuvattu ensimmäisen kerran vuonna kohortin CRC potilailla.

Citation: Briffa R, Um I, Faratian D, Zhou Y, Turnbull AK, Langdon SP, et ai. (2015) Multi-Scale Genominen, Transcriptomic ja proteomiikan analyysi peräsuolen syövän solulinjojen tunnistaa uusia biomarkkerit. PLoS ONE 10 (12): e0144708. doi: 10,1371 /journal.pone.0144708

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 16 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 23 marraskuu 2015; Julkaistu: 17 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Briffa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain rahoittama strategisen koulutusväylien Scholarship (Malta). Stipendin on osarahoitettu Euroopan unioni – Euroopan sosiaalirahasto (ESR) alle Toimenpideohjelma II – Koheesiopolitiikka 2007-2013, ”Empowering People for enemmän työpaikkoja ja parempaa elämänlaatua”. Hanke lisäksi rahoittama Medical Research Scotland.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) osuus 8 % kaikista syöpäkuolemista [1], jossa vaihteleva selviytyminen välillä 39% ja 65% riippuen vaiheessa diagnoosi [2]. Riski sairastua CRC riippuu sekä geneettisiä ja elintapoihin liittyvistä tekijöistä ja kasvaa selvästi iän myötä [2]. Vaikka hoito voi olla parantava, huomattava osa CRC potilailla on suuri riski taudin uusiutumisen jälkeen leikkauksen ja kemoterapian [3].

Suurin reittejä sekaantunut peräsuolen syövän synnyn sisältyvät, mutta eivät rajoitu, PI3K /mTOR reitissä mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK) reitin, ja Wnt-reitin [4], jossa JAK /STAT-reitin, Hedgehog polku, ja NFKB polku mukana [5]. Nämä reitit ohjataan monimutkaisia ​​ylikuulumisen, negatiivista palautetta, ja muita korvaavia mekanismeja. Vaikka aktivoituminen näiden reittien kautta tapahtuvaa mutaatiot osallistuvissa onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille vastaavasti 80 somaattisten mutaatioiden yksittäisen CRC, vain 15 tai jopa alle todennäköisesti olennainen kuljettajia kasvaimen aloittamisesta, etenemiseen ja /tai huolto [ ,,,0],6]. Yleisimmin muuntunut geenien CRC ovat

APC

(70-80%),

TP53

(50%),

KRAS

(35-45%),

PIK3CA

(25-32%),

BRAF

(10-17%) ja

PTEN

(4-5%) [7-12].

Ensimmäinen rivi hoito CRC on yleensä fluoropyramidine monoterapiana ja oksaliplatiinia tai irinotekaania kemoterapian [13]. Viime aikoina monoklonaalisia vasta-aineita kuten setuksimabi, panitumumabi, ja bevasitsumabi on lisensoitu yhdistettynä kemoterapiaa metastasoituneen CRC (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) [14] valikoivaksi ja erityisiä syöpälääkkeiden, joilla on korkea terapeuttinen indeksi ja pienempi myrkyllisyys kuin tavanomaisten hoitomuotojen [15]. Kuitenkin hoitovaste ovat erilaisia, joissa on vähemmän kuin kolmasosa potilaista reagoi 5-fluorourasiilin [16]. Vaikka

KRAS

ja

BRAF

mutaatiot osoittavat vastustuskykyä EGFR-kohdistettuja hoitomuotoja, noin 40-70% villityypin

KRAS

metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaat saavat vähän tai ei lainkaan hyötyä EGFR- kohdennettuja hoitomuotojen [17]. On puutteellista ennustavia markkereita, joiden avulla lääkärit valita potilaat todennäköisimmin hyötyvät tietystä terapia.

Täällä pyrimme järjestelmällisesti luonnehtia paneelin CRC solulinjojen, valitut tulokset heijastavat tämän taudin käyttäen suuren suoritustehon analyysejä, jotta voidaan tunnistaa biomarkkerit vastustuskyvyn sekä kohdennettuja ja ei-kohdistettuja hoitomuotoja.

Methods

CRC solulinja paneelissa

Viisitoista CRC solulinjoja tutki: lähi diploidisolupopu- linjat DLD-1, HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, ja LoVo (kaikki ECACC paitsi HCT116p53 – /- joka oli lahja tri G Smith, University of Dundee, UK [18]) ja aneuploidi solulinjat SW480, SW837, HT29, T84, Colo 201, Colo 320DM, LS411N, SK-CO-1, NCI H508 ja NCI H716 (kaikki ATCC) lukuun ottamatta Colo 320DM, T84, ja SW837 (kaikki ECACC) .

solulinjoja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Gibco

®, Cat. no. 31885), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; PAA, Cat. no. A15-101) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Gibco

®, Cat. No.15140-122). Solulinjoja kasvatettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, joka sisälsi 5% CO

2. Kaikki solulinjat testattiin mykoplasman käyttäen Venor

™ GeM Mycoplasma Detection Kit (Sigma-Aldrich, Cat. No. MP0025). Kun solulinjat saavutti 70-80% konfluenssiin, ne käsiteltiin trypsiinillä käyttäen 0,05% trypsiini-EDTA (1 x), jossa fenolipunaista (Gibco

®, Cat. No. 25300).

Kliiniset näytteet

Archival formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kudosnäytteitä saatiin resektio näytteitä potilaista asuu Skotlannissa, joilla oli diagnosoitu CRC vuosina 1996 ja 2003 ja oli alle 55-vuotiaita ajankohtana diagnoosin (katso S1 Taulukko). Kaikkiaan 870 potilasta oli otettu palvelukseen kuten aiemmin on kuvattu [19]. Kaikki tapaukset tarkistettiin jonka ruoansulatuskanavan histopathologist ennen TMA rakentamista, jotta kudos koostui pääasiassa kasvain. Kaikki syöpiä järjestetään Dukes A ja B. Colson materiaali ja kliiniset tiedot pääsy myönsi Tissue komitea, Edinburgh Experimental Cancer Medicine (Ref: TR029), Lothian Research eettisen komitean (Ref: 08 /S1101 /41) ja Kaakkois-Skotlannissa HSS (SAHSC) Bioresource (Ref: SR117).

Drug herkkyys määrityksissä

5-fluorourasiilin (5-FU) 50 mg /ml liuosta varten ostettiin Medac GmbH. Oksaliplatiini (L-OHP) 5mg /ml infuusiokonsentraatti, liuosta varten (Fresenius Kabi Oncology plc, UK) saatiin Western General Hospital Pharmacy, Edinburgh. Tavoiteltu estäjä BEZ235 (Cat. No. S1009) hankittiin Selleck Chemicals. Kukin 96-kuoppaisen levyn koostui kuudesta kuoppiin, jotka sisältävät soluja DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä, joka toimi kontrollina. Solut siirrostettiin 48 tuntia ennen kuin lisättiin lääkkeitä. Kahdeksaa eri pitoisuutta kohden käytettiin lääkettä vaihtelee välillä 5 uM ja 100 uM (5-FU, L-OHP) sekä 2.5nM ja 80nm, (BEZ235), vastaavasti. Soluja inkuboitiin lääkkeiden 96h. Solujen elinvoimaisuuden määrittämiseen, 20 ui Alamar Blue lisättiin kuhunkin kuoppaan 6 tuntia ennen lukemista levyillä käyttäen Fluoroskan Ascent FL. Kaikki lääkkeen herkkyys määritykset toistettiin ainakin kaksi kertaa, ja kuusi kuoppaa ympättiin kunkin lääkkeen pitoisuus.

Keskimääräinen RFU lukema otettiin jokaisen lääkeaineen pitoisuus ja solujen elinkelpoisuus laskettiin prosentteina käsittelemättömään kontrolliin. Virhepalkit laskettiin käyttäen vastaaviin keskihajonta keinoin. IC

50s 5-FU, L-OHP ja BEZ235 määritettiin käyttämällä XLfit 5,0 ohjelmistopaketti (ID Business Solutions, UK). Ei ekstrapolointi tehtiin määriteltäessä IC

50-arvot ja harha laskettiin olevan luottamustasolla yli 0,05.

DNA, RNA ja proteiini uuttamalla

Genominen DNA uutettiin kunkin solulinjan kanssa käyttäen DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, luettelonro 69504) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA pitoisuudet todentaa NanoDrop 2000 mikro-tilavuus spektrofotometrillä (Thermo Scientific). Tyydyttävä DNA puhtaus on pidetty suurempi tai yhtä suuri kuin 260/280-suhde on 1,8, mikä varmistaa minimaalisen proteiinin näytteen saastumisesta. Laatu DNA-näytteiden edelleen määritettiin käyttämällä agaroosigeelielektroforeesia. Elektroforeesin jälkeen geeli poistettiin varovasti ja DNA juovat visualisoitiin käyttäen Gel Documentation System.

Kokonais-RNA uutettiin solulinjoista kahtena kappaleena käyttämällä RNeasy MinElute uudelleenjärjestäminen Kit (Qiagen, Cat. No. 74204 ) ja miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Cat. no. 217004). Pitoisuus RNA varmistettiin käyttämällä NanoDrop 2000 spektrofotometrillä. Tyydyttävä RNA puhtaus pidettiin 260/230-suhde oli noin 2,0.

Protein lysaatit valmistettiin, kun solulinjat olivat noin 80% konfluentteja, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti muualla [20]. Proteiinipitoisuus lysaatit määritettiin kautta bikinkoniini- happo (BCA) -määrityksellä (Sigma-Aldrich, cat. No. C2284-25ML, luett B9643-1L).

KRAS

mutaation analyysi Sangerin sekvensoinnilla

hotspot mutaatiot kodonissa 12 ja 13 analysoitiin. Aluke suunniteltiin käyttäen Primer Premier

® V6.0 ohjelmistot (PREMIER Biosoft International). Alukesekvenssejä (5 ’: sta 3’) ja

KRAS

01 olivat seuraavat: GGT ACT GGT GGA GTA TTT GAT AGT GT (eteenpäin) ja TGA ATT AGC TGT ATC GTC AAG GCA CT (reverse).

KRAS

eksoni 2 monistus suoritettiin käyttäen Hotstar Hi Fidelity Polymerase Kit (Qiagen Quality

®, kissa. No. 202602). PCR-reaktio suoritettiin DNA Engine Opticon 2 Real-Time Cycler (GMI, Inc). Odotettu pituus PCR-tuote varmistettiin, että läsnä on yksi ainoa kaistan sopivana molekyylipaino. Sangerin sekvensointia suoritettiin Medical Research Council Human Genetics Unit (MRC-HGU), Edinburgh. Tuotteet sekvensoitiin käyttäen ABI Prism

® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) ja tiedot analysoitiin käyttämällä mutaatio Surveyor

® DNA Variant Analysis V3.97 ohjelmiston.

Microarray analyysit

Array vertaileva genominen hybridisaatio.

vertaileva genominen hybridisaatio (CGH) suoritettiin käyttäen NimbleGen mikrosirulla (Roche). Näyte merkinnöistä suoritettiin NimbleGen Dual-Color DNA Labeling Kit (Roche, kissa. No. 06 370 250 001). Hybridisaatio suoritettiin MRC-HGU, Edinburgh käyttäen NimbleGen hybridisaatio Kit (Roche, kissa. No. 05 583 683 001), NimbleGen Näyte Seuranta valvonta Kit (Roche, kissa. No. 05 223 512 001) ja kaksi ihmisen CGH 12 x 135K Koko-Genome Laatoitus Array V3.0 (Roche, kissa. no. 05 520 878 001). NimbleScan ohjelmistoa käytetään tuottamaan paria raporttitiedostot käytetään kopiomäärä data-analyysi. Tiedot on talletettu National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus hakunumerolla GSE72296.

geeniekspressioprofilointi.

kolme sarjaa RNA-näytteet valmistettiin Illumina

® Whole Genome geeniekspressioprofilointi, jossa 48804 selostukset näytettä kohden syntyy. Kolme sarjaa jaettu kahteen biologisen rinnakkaisnäytteiden ja yhdet teknisten rinnakkaista. Kaikki RNA-näytteet laimennettiin pitoisuuteen 500 ng /11μl. Illumina

® TotalPrep

™ RNA -monistustarvikesarjaa (Ambion

®, kissa. No. AMIL1791) käytettiin tuottamaan biotinyloidun, monistettiin RNA hybridisaatioon Illumina

® Human HT-12 v4. 0 BeadChip. Ennen etenevät valmisteluun RNA näytteitä mikrosiruanalyysi, RNA eheyttä tutkittiin lisäksi kanssa Agilent

® 2100 Bioanalyzer käyttäen Agilent

® RNA 6000 Nano Kit (Agilent, kissa. No. 5067-1511) . Näytteitä, joiden RNA Integrity Number (RIN) 7 tai parempi pidettiin hyväksyttävinä hybridisaatioon.

Näytteet analysoitiin Wellcome Trust Clinical Research Facility, Edinburgh (Gene Expression Project-CRF E11960), missä he olivat laimennettu pitoisuuteen 150 ng /ul ja hybridisoitiin päälle kolme Ihmisen HT-12 v4 Expression BeadChip taulukot. Kaksi teknistä rinnakkaista hybridisoitiin päällekkäin array toimimaan sisäisenä laadunvalvontaa. Näytteet sattumanvaraisesti hybridisoitiin pitkin kolme Illumina

® HumanHT-12v4 Expression BeadChip paneelit.

Hybridisaation jälkeiset, taulukot skannattiin käyttäen Illumina HiScan

® Platform (Illumina

®, cat. no. SY-103-1001). BeadArray tiedostoja vietiin Illumina n skannausohjelmisto ja tuodaan geeniekspression moduuli GenomeStudio ohjelmiston (Illumina

®), jossa myöhemmin datatiedostot muuttuivat Sarkaineroteltu tiedostoja. Tiedot on talletettu National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus kanssa hakunumerolla GSE72544 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE72544).

Käänteisfaasi proteiinijärjestelmien

Käänteisfaasi proteiinijärjestelmien (RPPA) ovat keskipitkän suoritusteho tekniikka, joka mahdollistaa seulonta näytteitä suuri paneeli kiinnostavien proteiinien suhteellisen lyhyessä ajassa , kun käytät minimaalisia määriä sekä näytteen ja vasta-aineet [21]. Denaturoidun ja vähentää proteiinin näytteitä 15 CRC näytteet täplikäs kolmena kappaleena päällekkäin pad on 2-Pad FAST

® nitroselluloosa pinnoitettu lasilevy (Whatman Ltd., kissa. No. 10485317) käyttäen BioRobotics microgrid MG II Biopankkiverkosto (Isogen Life Science). Sen jälkeen ne onnistuneesti koetettiin paneelin 31 optimoitu, in-house validoitu, yhteensä ja fosforia vasta aikaisemmin kuvatulla tavalla (S2 taulukko) [20]. Nämä vasta-aineet valittiin kohdistaa avaimen proteiineja, jotka liittyvät solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen, invaasio, etäpesäke, angiogeneesi, DNA-vaurioita, ja apoptoosin optimoitiin ja validoitu kautta Western blotting. RPPA täplät kvantitoitiin käyttämällä MicroVigene

™ RPPA analyysimoduulit ohjelmisto (VigeneTech Inc.). Aineisto analysoitiin aikaisemmin kuvatulla [22].

RPPA täplät kvantitoitiin käyttämällä MicroVigene

™ RPPA analyysimoduulit ohjelmisto (VigeneTech Inc.).

Tietojen analysointi

Genominen tietojen analysointi.

Sangerin sekvensoinnin tulokset analysoitiin käyttämällä mutaatio Surveyor

® DNA Variant Analysis Software V3.97 (Soft Genetics

®, USA). Raaka tiedostoja .ab1 tuottamat ABI Prism

® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) tuotiin ohjelmisto ja oletuksena analyysi asetuksia sovellettiin. GenBankin merkintätiedostoja olivat ladataan automaattisesti ja viitetiedostojen käyttää mutaation havainnointi automaattisesti synteettistä.

aCGH Aineisto analysoitiin Partek

® Perimän Suite

™ Version 6.6 (Partek Inc.). Tiedot alun perin normalisoitiin käyttämällä lössi normalisointi ja Genominen segmentointialgoritmi käytettiin analysoimaan kopioluvun monistukset ja poistoja. Mukautettu segmentointi parametrit olivat seuraavat: pienin genomi-markkereita oli 10, p-arvo oli 0,001, ja signaali-kohina-suhde oli 0,03. Alueella oli ilmoitettu kadonneeksi, jos log2 kopiomäärä suhde oli alle -0,3 ja sai jos log 2 kopiomäärä suhde oli yli 0,15. Kolme eri aluetta luettelot luotiin: (1) alueet, jotka saadut seitsemän tai useamman solulinjoissa; (2) alueet poistetaan seitsemässä tai useamman solulinjoissa; (3) ne, jotka sisältävät korkeimman monistuksia, eli log2 suhde oli vähintään 1,0 (vastaa kopiomäärän 2). Lisäksi genomista segmentointi klusterointi suoritettiin käyttäen Euklidinen etäisyys ja keskimääräinen sidos. Kopiomäärä analyysi tehtiin kromosomissa 1 kromosomi 22 ja sulki pois kaksi sukupuolikromosomeissa.

Transcriptomic tietojen analysointi.

Näyte geeni profiilin tiedosto syntyvät geenien ilmentymisen analyysi oli quantile normalisoitu ja suodatettu niille antureista, joissa havaitseminen p-arvo ≤0.05. Sitten aineisto log2 transformoitiin ja merkitsevät keskitetty saada suhteellisen arvon välillä solulinjoja. Näyte geeni profiilin tiedosto sitten selityksin käyttämällä Hg18 ennen suorittamista ero geeniekspressioanalyysissä (DGEA).

DGEA suoritettiin käyttäen ArrayMining, online microarray data mining ohjelmistopaketti [23]. Differential geeniekspressio suoritettiin käyttämällä SAM analyysiä luetella geenit ilmentyvät differentiaalisesti suhteen hoitovastetta. Kolme eri analyysit tehtiin: (1) 5-FU erittäin herkkä solulinjoissa

vs

. 5-FU vähemmän herkkiä solulinjoja, jossa erittäin herkkiä solulinjoja on määritelty, jolla on IC

50 ≤ 30 uM; (2) L-OHP erittäin herkkä solulinjoissa

vs

. L-OHP vähemmän herkkä solulinjoissa, jossa erittäin herkkä solulinjat määritellä sisältävän IC

50 ≤ 10 uM; (3) BEZ235 herkkä solulinjat

vs

. BEZ235 tunteeton solulinjat, jossa herkkä solulinjoja on määritelty, jolla on IC

50 80nm.

tulkinta tietojen suoritettiin käyttäen Toiminnallinen Lisäykset Clustering in DAVID bioinformatiikan resursseja [24].

integrointi usein monistettu alueiden kanssa geenien ilmentyminen tietoja.

geenien ilmentymistä tiedot geenit sijaitsevat usein saaneet alueet erotettiin suodattamalla. Pearsonin korrelaatiokertoimet kanssa Bonferroni korjaus, luettelo geenejä, jotka oli merkittävä korrelaatio log2 kopiomäärä arvon ja geenien ilmentyminen syntyy. Geeniekspression tiedot solulinjoja analysoitiin suhteessa hoitovasteen käyttäen Mann-Whitneyn U-testiä käyttäen GraphPad Prism 6.

proteomiikan data-analyysi.

Data tuotetaan RPPA normalisoitiin käyttäen Cluster 3.0 Se on avoimen lähdekoodin klustereiden työkalu [25]. Aineisto log-transformoitiin, tarkoittaa keskitetty Cluster 3.0, ja ryhmittyivät korrelaatio keskitys ja keskimääräinen nostolaitteen avulla MeV 4.8 [26]. RPPA tulokset 15 CRC paneeli analysoitiin suhteessa hoitovasteen käyttäen Mann Whitney U -testillä käyttämällä GraphPad Prism 6.

Tissue mikrosiru (TMA), automatisoitu määrällinen analyysi (AQUA), ja FISH

Viisi mikronin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjätään levyt valmistettiin FFPE lohkot, ja kasvaimen alueita leimasi patologi ja koulutettu tutkimus teknikko. Sen jälkeen histopatologinen tutkimus, 118 tapausta valittiin pois alkuperäisestä kohortin ja kudoksen mikrosiru (TMA) rakennettiin pätevä asentaja. Neljä biologisia näytteitä (TMA000034A-D) rakennettiin, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti muualla [27], ja leikattiin 5 pm osiin käyttämällä mikrotomia ja kiinnitettiin objektilaseille. Kliiniset ja patologiset parametreja tämän kohortin esitetty yhteenvetona S1 taulukossa.

Proteiinin ilmentymistä TRIB1 arvioitiin anti-TRIB1 kanin polyklonaalista vasta-aineen CRC TMA käyttämällä Automated kvantitatiivinen analyysi (AQUA), on kuvattu yksityiskohtaisesti muualla [28 , 29]. TRIB1 ilmentyminen sekä sytoplasman ja ydinaseiden osastoja myöhemmin korreloi muiden proteiinien aiemmin mitattu tässä kohortissa. TRIB1 ilmentyminen tutkittiin myös suhteessa potilaan selviytymistä, kuten alla on kuvattu.

TRIB1

ja

MYC

vahvistus CRC potilaan kohortin tutkittiin käyttäen fluoresenssia

vuonna situ

hybridisaatio (FISH). Myc /CEN8p koetin ostettiin Abnova (cat. No. FG0065) ja TRIB1 /CEN8p koetin oli mukautetun suunnitellut Abnova. Proteaasikäsittely aika vaihteli optimoimiseksi ruoansulatusta ja varmistaa hyvä laatu hybridisaatiolla. Visualisointi suoritettiin käyttäen DAPI (4,6-diamino-2-fenyyli-2-hydrokloridia (Abnova) värjäämiseksi ytimeksi.

Ready-to-use dual-leimattuja koettimia varten

MYC

ja

TRIB1

ostettiin Abnova. myc /CEN8p FISH koetin koostui ~ 160KB

mYC

anturi sijaitsee 8q24.12-q24.13 kanssa Texas Red fluorofori yhdessä ~ 520kb CEN8p anturi sijaitsee 8p11.21 FITC fluoroforin. TRIB1 /CEN8p FISH koetin koostui ~ 260kb

TRIB1

anturi sijaitsee 8q24.13 kanssa Texas Red fluorofori yhdessä ~ 520kb CEN8p anturi sijaitsee 8p11.21 FITC fluoroforin.

Pisteytys suoritettiin koulutettu teknikko ja konsulttina patologi. Levyjä pisteytetty Leica DMLB fluoresenssimikroskoopilla käyttäen 100X öljyssä linssi. Colorado Pisteytys kriteerit käytettiin [ ,,,0],30] pisteet TMA dioja. enintään kaksikymmentä ytimien ydintä kohti pisteytettiin useimmissa tapauksissa, mutta joissakin tapauksissa vähintään kymmenen tumat sijoitettiin koska siinä ei ole kaksikymmentä Pisteytettävät ytimiä. Summa punaisen ja vihreän fluoroforeilla todettiin kunkin ytimen, ja lopputulos muodostui suhde punaista fluoroforin vihreä fluoroforin. FISH tulokset alle 1,8 tulkittiin negatiivisiksi [31].

Tilastolliset analyysit

TRIB1 proteiinin ilmentymisen tuottaman tiedon AQUA analyysin korreloivat AKT, kaspaasi 3, sykliini B1, ERK, Ki67, MYC, S6, PTEN, Pakt, Perk, pHistone H3, pMEK, ja PS6 proteiinin ilmentymisen. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiota, ja p-arvot korjattiin useita testejä käyttäen Bonferronin korjausta. Avoimen lähdekoodin ohjelman TMA Navigator (https://www.tmanavigator.org/) käytettiin tilastolliseen analyysiin. Survival analyysi

TRIB1

ja

MYC

vahvistus CRC kohortin suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism 6.

Tulokset

Yhden geenin mutaatioanalyysiin on riittämätön kerrostuminen kasvainten suhteen hoidon

kun hoito 5-fluorourasiilin (5-FU) 96 tuntia, kolmetoista CRC solulinjat osoittivat eriasteista herkkyys hoidetuilla lääkeaineen pitoisuuksina 2.5μM 100 um ( kuvio 1A). Kaksi CRC solulinjoja (Colo320DM, T84) oli herkkä 5-FU pitoisuutena 100 uM. IC

50-arvot 5-FU vaihteli 3,1 100gM kanssa mediaani 19.6μM. Herkin solulinjat olivat HT29, LS411N, ja HCT116. DLD-1, HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, ja LoVo on raportoitu olevan yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmä puutteellinen [32]. Tämä profiili epäsuhta korjauksen tila ei korreloinut 5-FU herkkyys (p = 0,713; U-testi) vastaisesti tekemä tutkimus Bracht ja työtovereiden [33].

. Vesiputous tontilta 5-fluorourasiilin IC

50 (iM) arvot. B. vesiputous kuvaaja oksaliplatiinin IC

50 (iM) arvot. C. vesiputous kuvaaja BEZ235 IC

50 (nM) arvot. D. Ohjaamaton hierarkkinen klusterointi IC

50-arvot 5-FU, L-OHP ja BEZ235 käyttämällä Pearsonin Korrelaatio täydellisen sidoksen.

Vaikka useita

in vitro

tutkimukset ovat viitanneet siihen, että

TP53

puutos vaikuttaa lääkeresistenssin [34], emme onnistuneet nähdä yhdistyksen (p = 0,238; U-testi). HT29, LS411N, HCT116 p53 – /-, SW837, NCI H508, NCI H716 kaikki

TP53

puutosta (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/), mutta ne oli vielä herkkä 5-FU tässä tutkimuksessa. Mariadason et al., Mutta raportoitu eroa 5-FU aiheuttama apoptoosin mutantin ja villityypin p53 solulinjoja [35].

Kun oksaliplatiinihoidon (L-OHP) 96 tuntia, CRC solulinjat osoittivat eriasteista herkkyys, kun käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla L-OHP vaihtelevat 2.5μM ja 100 uM (kuvio 1B). IC

50-arvot L-OHP vaihteli 3,0 31.1μM, joiden mediaani 8,0 uM, mikä osoittaa kymmenkertainen valikoima herkkyys. Herkin solulinjat olivat HT29, LS411N, ja SW837, kun taas vähiten herkkä olivat Colo320DM, NCI H716, ja Colo201. Tilastollisesti merkitseviä (p = 0,462; Mann Whitney U-testi) havaittiin verrattaessa L-OHP IC

50-arvojen dMMR solulinjojen ja pMMR solulinjoissa, mikä on yhtäpitävä samanlaisella tutkimus Fink et al. [36].

Ei ollut yhdistyksen välillä p53 tila ja L-OHP IC

50-arvot (p = 0,187; Mann Whitney U Test), toisin kuin edellisen raportin [37]. Kuitenkin tuoreessa tutkimuksessa suoritetaan 51 kehittynyt CRC potilailla todettiin, että

TP53

mutaatiostatuksesta riippumatta ei liittynyt hyötyä ensilinjan oksaliplatiinipohjaisen hoito [38].

Seven CRC solulinjoja olivat herkkiä ja kahdeksan CRC solulinjoja tunteeton hoidon eri pitoisuuksina (2.5nM ja 80nm) on BEZ235 96 tuntia (kuvio 1 C). IC

50-arvot BEZ235 vaihtelivat 13,4 osoitteeseen 80nm, jossa herkkä solulinjojen jonka keskimääräinen herkkä pitoisuus 23.6nM. Herkin solulinjat olivat HT29, Colo201 ja NCI H716, ja NCI H508, T84, SW48, SW480, Colo320DM, HCT116, HCT116 p53 – /-, ja LoVo oli tunteeton pitoisuutena 80 nm. Tilastollisesti merkittävää eroa ei havaittu (p = 0,346, Mann-Whitneyn U-testi) välillä IC

50-arvot BEZ235 hoitoon ja

PIK3CA

mutantin ja villityypin ryhmiä. Kaikki

PI3KCA

mutantti solulinjoissa oli joko

BRAF

tai

KRAS

co-mutaatio. Ei COSMIC tietoja oli käytettävissä

mTOR

mutaatiot näissä solulinjoissa (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Serra et ai. vahvistettu, että BEZ235 pidätetty leviämisen kaikkiaan 21 syöpäsolulinjoissa käyttää tutkimuksessaan, riippumaton PI3K koulutusjakson mutaatiostatus [39], ja että solulinjat, joissa on

BRAF

tai

KRAS

mutaatio tai

EGFR

vahvistus oli hieman vähemmän herkkä BEZ235 verrattuna muihin solulinjat [39].

15 CRC-solulinjat, kahdeksan solulinjat hallussaan

KRAS

eksoni 2 mutaatiot . DLD-1, HCT116, HCT116 p53 – /-, ja LoVo solulinjoissa oli 5574 G Korvaushoidon sopusoinnussa G13D missensemutaatio; SK-CO-1 ja SW480 solulinjoissa oli 5571 G T korvaaminen sopusoinnussa G12V missensemutaatio; SW837 oli 5570 G T korvaaminen sopusoinnussa G12C mutaation; ja T84 oli 5574 G Korvaushoidon sopusoinnussa G13D mutaatio. Tämä on yhtäpitävä julkaistun sekvensointi tiedot ja kosmisessa tietokannassa (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Ei ollut tilastollisesti merkitseviä eroja vastauksena 5-FU, L-OHP, ja BEZ235 osalta

KRAS

mutaatiostatuksesta riippumatta (p = 0,98, p = 0,60 ja p = 0,17, vastaavasti).

valvomaton hierarkkinen klusterointi IC

50-arvot 5-FU, L-OHP, ja BEZ235 käyttämällä Pearsonin korrelaatiot täydellisen sidoksen osoittivat, että solulinjat eivät klusterin minkä tahansa mutaation. Oli vaihtelua vastauksena kolme erilaista käsittelyä (kuvio 1 D).

kromosomaalinen alueilla usein saatu ja hävisi paksusuolen syövän solulinjat

paneeli solulinjojen seuraavan arvioitiin aCGH ja tunnistamaan yhteiset kromosomialueiden voiton ja tappion. Kaksikymmentäneljä alueet olivat usein saaneet vähintään 7/15 CRC solulinjoissa. Usein voitot havaittiin 2p, 3Q, 5p, 7p, 7q, 8q, 12p, 13q, 14 q, ja 17Q (kuvio 2) (taulukko 1). Toisaalta, yhteensä 14 aluetta menetettiin ainakin 7/15 CRC solulinjoja (taulukko 2). Usein tappiot havaittiin 2Q, 3p, 5q, 8p, 9P, 14 q, 18q, ja 20p (kuvio 2). Nämä alueet voiton ja tappion olivat samanlaisia ​​kuin aikaisemmin raportoitu [32, 40-44].

Hierarkkinen ryhmittely segmentoidun kopioluvun dataa Euklidinen etäisyys keskimäärin sidos johtanut kaksi suurta klusterit: yksi klusteri sisälsivät NCI H716, kun taas toinen ryhmä sisälsi muun 14 solulinjoissa (kuvio 3). Yksi alaryvästä sisälsi HT29, SW48, LS411N, LoVo, HCT116, ja HCT116p53 – /-. HCT116, HCT116p53 – /-, SW48, ja LoVo ovat lähes diploidinen ja tiedetään olevan mutaatioita MMR geenien

MLH1

ja

MSH2

[45, 46]. Toinen lähes diploidisolupopu- linja, DLD-1, myös ryhmitelty erikseen. Tämä solulinja on MMR puutteellinen MSH6 [47].

Differential geenin ilmentymisen suhteen huumeiden herkkyyden

Genes ilmentyvät eri suhteessa 5-FU herkkyys on lueteltu S3 taulukossa ja kuvattu että karttaa kuvassa 4A. Toiminnallinen merkintä käyttäen DAVID [24] osoitti, että nämä geenit olivat pääasiassa mukana solusyklin (

TAF2

,

CHFR

,

CCND2

,

OSGIN2

,

TERF1

,

TBRG4

), fokaalisen adheesion (

ABCB1

,

SH3KBP1

,

EBAG9

), apoptoosin (

SHRKBP1

,

EBAG9

,

TERF1

,

TBRG4

), ja transkription säätelyyn (

LASS2

,

LMCD1

MAF1

,

TAF2

,

THAP11

,

CHURC1

,

MED14

,

PIAS3

,

PURB

,

TERF1

,

ZNF239

,

ZNF7

). Tärkeää Kegg reitit liittyy 5-FU toimintatapa ja myöhemmin rikastunut luettelossa peräisin tässä tutkimuksessa olivat puriinimetabolia (

NT5C2

,

POLR2J2

), pyrimidiini aineenvaihdunta (

NT5C2

,

POLR2J2

), lääkeainemetaboliaan (

GSTO2

), ABC kuljettajat (

ABCB1

), ja oksidatiivinen fosforylaatio (

NDUFA9

).

. Lämpökarttana kuvaa SAM analyysi geenien ilmennetty eri välillä 5-FU herkkä ja vähemmän herkkä CRC solulinjoissa; B. heatmap kuvaa SAM analyysi geenien ilmennetty eri välillä L-OHP herkkä ja vähemmän herkkä CRC solulinjoissa; C. heatmap kuvaa SAM analyysi geenien ilmennetty eri välillä BEZ235 herkkä ja vähemmän herkkä CRC solulinjoissa.

Genes ilmentyvät eri suhteessa L-OHP herkkyys olivat mukana DNA: ta sitovan (