Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tietyt onkolyyttisiä virukset hyödyntävät aktivoitu Ras signalointi, jotta jäljitellä syöpäsoluja. Konstitutiivisen aktivaation Ras /MEK polku tiedetään tukahduttaa tehokkuutta interferoni (IFN) antiviraalisen vasteen, joka voi myötävaikuttaa Ras-riippuvainen virusonkolyysiä. Täällä tunnistimme 10 ihmisen syövän solulinjat (out of 16) ja lisääntynyt herkkyys anti-virus vaikutuksia IFN-α-hoidon jälkeen MEK estäjän U0126, mikä viittaa siihen, että Ras /MEK-reitin taustalla niiden alennettu herkkyys IFN. Sen määrittämiseksi, miten Ras /MEK estää IFN vasteen näissä soluissa, käytimme DNA mikrosiruja verrata IFN-indusoidun transkription IFN-herkkien SKOV3- soluja, kohtalaisen resistenttejä HT1080-solujen, ja HT1080-solut, joita käsiteltiin U0126. Olemme havainneet, että 267-geenit indusoitiin IFN SKOV3- soluissa, kun taas vain 98-geenien indusoitiin HT1080-soluissa samaan aikaan pisteen. Lisäksi ilmaisu erillisten osajoukko IFN indusoitavissa geenejä, jotka sisälsivät RIGI, GBP2, IFIT2, BTN3A3, MAP2, MMP7 ja Stat2, palautettiin tai lisääntynyt HT1080-soluihin, kun solut ko-käsitelty U0126 ja IFN. Bioinformatiikka- analyysi biologisten prosessien edustaa näiden geenien paljasti lisääntynyttä edustus geeneistä, jotka liittyvät anti-virus vaste, apoptoosin säätelyyn, solujen erilaistumista ja aineenvaihduntaa. Lisäksi käyttöönotto konstitutiivisesti aktiivisen Ras osaksi IFN herkkä SKOV3- solut vähensivät IFN herkkyyttä ja kykyä aktivoida IFN aiheuttama transkriptio. Tämä työ osoittaa ensimmäistä kertaa, että aktivoitu Ras /MEK ihmisen syöpäsoluissa indusoi downregulation tietyn osajoukon IFN-indusoituvia geenejä.

Citation: Christian SL, Zu D, Licursi M, Komatsu Y, Pongnopparat T , Codner DA, et ai. (2012) Suppression IFN aiheuttama transkriptio taustalla IFN viat Syntyy Activated Ras /MEK ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (9): e44267. doi: 10,1371 /journal.pone.0044267

Editor: Elankumaran Subbiah, Virginia Polytechnic Institute ja State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 18, 2012; Hyväksytty: 31 heinäkuu 2012; Julkaistu: 07 syyskuu 2012

Copyright: © Christian et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Canadian Institutes for Health Research (www.cihr-irsc.gc.ca), lupanumeroita MOP74429 ja ROP99020. SLC tukivat harjoittelija palkinnon Beatrice Hunter Cancer Research Institute varoilla antamat Cancer Research Training Program osana Terry Fox Foundation Strategic Health Research Training Program in Cancer Research at CIHR (www.bhcri.ca). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Onkolyyttiset virus erityisesti replikoitumaan syöpäsoluissa, mutta ei normaaleissa soluissa, hyödyntämällä eroja solunsisäisessä ympäristössä kasvainsolujen joka edistää epänormaalia solukasvua [1], [2], [3], [4] . Konstitutiivisen aktivaation Ras signalointi on alun perin raportoitu, jota onkolyyttinen reovirus kasvattaa replikatiivista kykyä [5]. Havaitsemisen jälkeen reoviruksen oncolysis, muut virukset, kuten villityypin herpes simplex -viruksen (HSV) [6], vesicular stomatitis -virus (VSV) [4], influenssaviruksen (delNS1 kanta) [7], adenoviruksen (VAI-mutantti) [ ,,,0],8], poliovirus [9], ja Newcastlen taudin viruksen [10] havaittiin samalla tavalla hyödyntävät aktivoitu Ras-signalointireitin varten oncolysis. Ras on kalvoon sitoutuneen GTP-sitovaa proteiinia, joka toimii molekyyli kytkin aktivoida alavirtaan väyliä säätelemään proliferaatiota, erilaistumista ja transformaatio [11]. Vuonna kanoninen Ras reitissä GTP-sidottu Ras aktivoi sen loppupään välittäjänä Raf-kinaasi. Aktivoitu Raf sitten fosforyloi ja aktivoi MEK1 /2 kinaasien, jotka fosforyloivat ja aktivoivat solunulkoisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) 1 ja 2. ERK1 /2 voidaan sitten aktivoida tai inhiboida transkriptiotekijöiden edistää solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä [12]. Aktivoivat mutaatiot Ras on löydetty noin 30% kaikista ihmisen kasvaimista [13]. Lisäksi, koska ei ole aktiivista mutaatio Ras, Ras-reitti usein aktivoidaan väärin aktivoituminen sen alkupään signaloinnin komponentteja, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptori, HER2 /neu, ja Src [14].

Useita matkapuhelinverkon mekanismeihin, jotka ovat Ras riippuvainen virusonkolyysiä on tunnistettu. Esto antiviraalinen double-RNA-aktivoitu proteiinikinaasi (PKR) Ras kuvattiin alun perin suuri mekanismi onkolyyttisten viruksen replikaation tuumorisoluissa [5], [6]. On myös osoitettu, että aktivoitu Ras edistää kuoriutumista ja vapautumista onkolyyttisten reoviruksen mikä lisää tuotantoa jälkeläisten viruksia [15]. Ras aktivointi myös lisää tehokkuutta cap-riippumaton käännös onkolyyttisten polioviruksen [9]. Lisäksi me ja toinen ryhmä ovat raportoineet, että aktivointi Ras-reitin voi estää tehokkaasti aktivointi tyypin I interferonin (IFN) anti-virus vasteen ihmisen syöpäsoluja ja hiiren fibroblastisoluja [16], [17], [18], mikä viittaa siihen, että vika IFN indusoiman aktivoitu Ras on yksi yhteinen mekanismeja virusonkolyysiä.

IFN erittävät sytokiineja, joilla on useita vaikutuksia kehossa, mukaan lukien anti-virus, anti-proliferatiiviset ja immunomodulatorisia rooleja. Sinänsä, IFN käytetään virustautien hoidossa, kuten hepatiitti-C-virus-infektio, syövän ja multippeliskleroosi. IFN sitoutuu IFN-α-reseptori (IFNAR) [19], joka johtaa aktivaatioon kaksi tyrosiinikinaasien Janus-kinaasi 1 (Jak1) ja tyrosiinikinaasi 2 (Tyk2), jotka liittyvät IFNAR [20], [21]. Jak1 ja Tyk2 sitten fosforyloivat signaalin anturi- ja aktivaattori transkription (STAT) 1 ja Stat2, joka sitten liittää DNA: ta sitovan proteiinin IFN säätelytekijän 9 (IRF9), muodostamiseksi heterotrimeeristen transkriptiotekijä kutsutaan IFN-stimuloidun geenin tekijä 3 (ISGF3) [22], [23]. Sitoutuminen ISGF3 IFN-stimuloidun vaste-elementin (ISRE) in promoottorit IFN-indusoituvia geenejä indusoi satoja geenejä yhdessä kutsutaan IFN-stimuloidun geenejä (ISG), monet anti-virus, anti-proliferatiiviset ja immunomodulatoriset toiminnot [24]. Kuitenkin tehokkuuden IFN voidaan rajoittaa anti-IFN-proteiineja koodaa viruksen genomeja tai endogeenisten solun vaimentimia säätelevä IFN signalointi [21].

Aikaisemmin on osoitettu, että IFN herkkä virus, VSV, kykeni replikoitumaan NIH3T3-solut aktivoidulla Ras /MEK kun IFN esti infektion kontrolli NIH3T3-solut [16]. NOSER et. al. [25] myös, että inhibitio Ras /MEK ihmisen syöpäsolulinjoissa palautettu antiviraaliset vasteet aiheuttama IFN. Nämä tutkimukset osoittavat selvästi, että Ras /MEK aktivoinnin taustalla IFN vajaatoiminta syöpäsoluissa. Vuonna seurantatutkimus, huomasimme, että aktivoitu Ras /MEK tukahdutti transkription Stat2, joka on yksi keskeisistä IFN signalointikomponentteja [17]. IFN-välitteisen suojaa virustartunnan vain osittain palautettu RasV12 transformoituja NIH3T3-solut yliekspressioon Stat2. Kuitenkin, kun Ras /MEK reitin estyi MEK estäjä U0126 in RasV12 soluissa IFN oli yhtä tehokas indusoimaan antiviraalisen vasteen kuin vektorisäädön soluissa. Siksi on epätodennäköistä, että downregulation Stat2 ilmaisu on ainoa mekanismi, joka osallistuu Ras /MEK välittämää IFN tukahduttaminen. Täällä, edelleen tunnistaa mekanismia Ras estoa IFN vastauksen, olemme analysoineet osallistuminen Ras /MEK-reitin säätelyssä IFN aiheuttaman transkriptio ihmisen syövän solulinjoissa.

Tulokset

herkkyys Human Cancer Cell Lines IFN-indusoidun Antiviral Response

ensin valitaan 16 syöpäsolulinjoissa, jotka ovat peräisin eri kasvaimen (3 rinta-, 1 kohdunkaulan, 4 paksusuoli, 1 fibrosarkooma, 2 melanooma , 3 munasarja- ja 2 eturauhasen solulinjoissa) ja mitataan kykyä reagoida anti-virus aiheutuvaa IFN. Solut käsiteltiin IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1000 ja 5000 U /ml) 16 tunnin ajan ja altistettiin sitten VSV on infektiokertoimella (MOI) 1 24 tunnin ajan. Kokonaistaso oncolysis arvioitiin käyttäen kristalliviolettia värjäystä. Joka perustuu tehokas annos (sytopaattisen vaikutuksen (CPE) 50) IFN, joka määritellään tehokas IFN pitoisuus, joka saa aikaan 50% suojan VSV infektion solulinjat jaettiin kolmeen ryhmään: IFN herkkä: solulinjoja jossa CPE50 alle 10 U /ml, IFN kohtalaisen kestävä: solulinjoissa CPE50 10 5000 U /ml, ja IFN täysin resistenttejä: solulinjoissa CPE50 yläpuolella suurin pitoisuus IFN testasimme (5000 U /ml) (kuvio . 1). Kuten taulukossa 1 on esitetty, kolme solulinjoja (HeLa, SKBR3- ja SKOV3) olivat herkkiä IFN kun 9-solulinjat (A375, DLD-1, HT29, HTB129, HT1080, MCF-7, MDAH, MDA-MB468 ja SW48) osoittivat kohtalainen kestävyys IFN hoitoon. Sen sijaan 4 solulinjat (DU145, HCT116, LNCaP ja PA-1) ei vastannut IFN pitoisuusalueella IFN tutkittiin.

IFN herkkiä (A), kohtalaisen kestävä (B) ja täysin resistenttejä solulinjoja (C) tunnistettiin esikäsittelemällä soluja IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1000 ja 5000 U /ml) 16 tunnin ajan ja altistettiin sitten VSV MOI 1 24 tunnin ajan. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä kristalliviolettia värjäystä ja ilmaistaan ​​keskimääräinen prosenttiosuus verrattuna infektoimattomia kontrollikuoppiin (n = 3) syvennyksiin. Yksi edustava koe esitetään.

Palauttaminen IFN Herkkyys MEK esto IFN Kohtalaisen tai täysin Kestää Cancer Cell Lines

vieressä ratkaistava, onko aktivointi Ras /MEK polku vähentää IFN aiheuttamaa antiviraalisen vasteen IFN kohtalaisen tai kokonaan resistenttejä syöpäsolun linjat. IFN herkkyydet solulinjat tutkittiin, kun läsnä on MEK-inhibiittorin U0126. Solut käsiteltiin IFN (0, 12,5, 25, 50, 200, 500 ja 2000 U /ml) ja U0126 (0, 2,5, 5, 10 ja 20 uM) 16 tunnin ajan ja altistettiin sitten VSV MOI 1 24 tunnin ajan. Tartunta kvalitatiivisesti Western blot -analyysillä viruksen VSV-G-proteiinia. Tehokkuutta U0126 MEK inhibitio varmistettiin analysoimalla ERK-fosforylaation, ensisijainen kohde MEK [13]. MEK esto lisääntynyt herkkyys 10 syöpäsolun riviä IFN (A375, DLD-1, DU145, HCT116, HT1080, HT29, HTB129, MDA468, MDAH ja PA-1) (U0126 reagoiva solulinjat), mutta ei ollut vaikutusta 3 syöpäsolun linjat (LNCaP, MCF7 ja SW48) (U0126 ei reagoi solulinjoja) (Fig. 2 ja Fig. S1). Esimerkiksi VSV toistettava HT1080-soluissa, kun läsnä on IFN (50 ja 200 U /ml), kun taas VSV replikaation estyi soluissa, joita käsiteltiin sama määrä IFN yhdessä U0126 hoitoon (Fig. 2A). HT1080-solut oli myös hieman vähäisempää VSV-infektion läsnä ollessa 20 uM U0126 yksin. Samoin IFN aiheuttama antiviraalisen vasteen palautettiin vuonna HT29, HCT116 ja MDAH soluja Ras /MEK reitin estyy U0126. Sitä vastoin emme tarkkailla palauttaminen IFN aiheuttama antiviraalisen vasteen mitä tahansa pitoisuuksien U0126 ja IFN LNCaP ja MCF7-soluissa viittaa siihen, että niiden IFN vastus säätelee solujen muut tekijät kuin aktivoitu Ras /MEK-reitin. Sama analyysi suoritettiin tutkimaan edistämiseen IFN-indusoidun antiviraalisen vasteen muita solulinjoja (A375, DLD-1, DU145, HTB129, MDA468, PA-1 ja SW48) (Fig. S1).

(A) solulinjat infektoitiin VSV (MOI = 1) ja 24 tunnin kuluttua altistuksesta ja IFN (0-5000 U /ml) kanssa tai ilman U0126 (0-20 uM) 16 tunnin ajan. Western blot-analyysiä käytettiin havaitsemaan viruksen proteiini (VSV-G) tasolle, taso fosforyloidun ERK (p-ERK) ja GAPDH käytetään latauskontrollina. Näytteet analysoitiin kaksi kalvoja samanaikaisesti käyttäen identtisiä olosuhteita haudotettavia ja havaitsemiseen. Yksi edustava koe 3 on esitetty. (B) Viral jälkeläiset tuotanto määritettiin infektion jälkeen VSV (MOI = 1) ja 24 tunnin kuluttua hoidon IFN (50 tai 2000 U /ml) ja U0126 (0, 5, 10 tai 20 uM) 16 tunnin ajan.

palauttaminen antiviraalisen vasteen MEK esto neljän U0126 reagoivien solulinjojen vahvistettiin jälkeläisten virus määrityksellä (Fig. 2B). HT1080-solut, infektoitiin VSV: llä, osoittivat merkittävää vähenemistä jälkeläisten virus tuotanto yhdistettynä hoidon IFN (50 U /ml), ja kaikki pitoisuus U0126 (5, 10 ja 20 uM). Lisäksi U0126 (20 uM) yksin oli vaatimaton, mutta tilastollisesti merkitsevä väheneminen viruksen jälkeläiset. Muissa solulinjoissa (HT29, HCT116 ja MDAH), yhdistetty IFN ja U0126 hoito osoitti huomattavaa ja tilastollisesti merkittävä väheneminen virusjälkeläisten tuotantoon verrattuna IFN ainoa tai U0126 ainoa hoito osoittaa herkempiä IFN kun MEK esto.

Nämä tulokset osoittavat, että aktivointi Ras /MEK-reitin estää IFN-indusoidun anti-virus toimintaa joissakin syöpäsolulinjoissa. Emme löytäneet korrelaatiota joko IFN reagointikykyä tai U0126 reagointikykyä, ja syöpäsolutyyppien.

vaikutus Ras /MEK esto IFN aiheuttaman transkriptio

tarkoitus selvittää, miten aktivoida Ras /MEK estää IFN vasteen ihmisen syöpäsoluja, teimme globaali geeniekspressioanalyysissä ja tunnistaa geenien kanssa tilastollisesti lisääntynyt ilmentyminen verrattuna käsittelemättömiin ajan sovitettu ohjaus (ks tukevat tiedot [File S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7] täydellisen luetteloita erilaisesti ilmaistuna geenejä). Ensinnäkin, vertasimme ilmentymistä IFN indusoitavissa geenien IFN herkkien SKOV3- soluja ja kohtalaisen resistenttejä HT1080-solut (Fig. 3A). Kun IFN stimulaatio 6 tuntia, 267 geeniä yläreguloituja SKOV3- soluissa, kun taas vain 98 geenit indusoitiin HT1080 soluissa. Seitsemänkymmentä geenit indusoitiin yleisesti molemmissa SKOV3- ja HT1080-solujen, kun taas 197 IFN indusoitavissa geenit yliaktiivista vain SKOV3- soluissa ja 28 IFN indusoitavissa geenejä vain HT1080 soluissa. Nämä tulokset osoittavat, että IFN-indusoitu transkriptio estyy IFN kohtalaisen resistenttien HT1080-soluja verrattuna IFN herkkien SKOV3- soluja.

(A) Venn kaavioita DNA-mikrosiru-analyysi osoittaa maailmanlaajuisen tukahduttaminen IFN-geenien in HT1080-soluissa verrattuna ja SKOV3- soluihin. Siinä on esitetty joukko geenejä merkittävästi voimistunut (FDR 0,01) 6 tuntia IFN-käsittelyn jälkeen on SKOV3 vs. HT1080 solulinjoissa. (B) Venn kaavioita, jotka esittävät joukko geenejä merkittävästi voimistunut (FDR 0,01) HT1080-solujen hoidon jälkeen IFN, U0126 tai molemmat IFN ja U0126 6 tuntia tai 12 tuntia kuten on osoitettu. (C) Venn-diagrammi vertaamalla geenit voimistuvan ”suojaava” hoitoja jokaisessa solutyypissä (IFN SKOV3- solujen ja IFN /U0126 for HT1080-solut).

määritetään sitten onko estyminen Ras /MEK voisi muuttaa transkription vaste HT1080 solujen IFN. IFN ainoa hoito transkriptiota 98 ​​geenien 6 tuntia ja 167-geenien 12 tuntia, kun U0126 ainoa hoito indusoima 636 geenien 6 tuntia ja 97 geenien 12 tuntia (Fig. 3B). Yhdistetty hoito IFN ja U0126 aiheuttama transkriptio 652 geenien 6 tuntia ja 354 geeniä 12 tuntia. Nämä tulokset osoittavat, että aktivoitu MEK estää IFN-indusoidun transkription IFN kohtalaisen resistenttien HT1080-solut. Mielenkiintoista on, löydettiin 111 geenien 6 tuntia (taulukko S1) ja 135-geenien 12 tuntia (taulukko S2) on merkittävästi indusoi yhdistetyn hoidon IFN ja U0126, kun jompikumpi hoito yksinään eivät indusoi, mikä osoittaa todellista synergististä geenin ilmentymisen säätelyyn IFN ja Ras /MEK tukahduttaminen. Näitä geenejä ovat välittäjiä anti-virus-toiminto (esim. Apobec3 [26], IFIT2 [27], [28], [29], RSAD2 (viperin) [30], GBP2 [31] ja MAP2 [32], [33 ], [34]), aktivaattoreita antiviraalisia signaalin siirtoon, (esim. RIGI [35]), sääntelyviranomaisten antigeenin käsittely ja esitys (esim. IFI30 (GILT) [36], BTN3A3 [37] ja PSME1 [38] ), ja sääntelyviranomaisten tuumorigeneesiä (esim. MMP7 [39]). Koska VSV monistaa yli 30 kertaa vähemmän tehokkaasti HT1080 käsitellyissä soluissa IFN ja U0126 verrattuna hoidettu IFN ainoa tai U0126 vain (Fig. 2B), uskomme, että jotkut geenit voimistuvan yhdistetyn hoidon HT1080 soluissa (111 geenien 6 tuntia 135 geenit 12 tuntia) on merkittävä anti-virus-toiminto. Sitten verrataan geenien aiheutettiin HT1080 yhdistetyllä hoito IFN ja U0126 niille indusoitiin SKOV3- soluissa IFN vain hoitoa rajata jotka geenit voivat olla olennaisia ​​geenejä tarvittavat suojaavan anti-virus IFN vaste (Fig. 3C ). Olemme havainneet, että 36-geenit olivat yleisesti indusoitiin 6 tunnin ja 26 geenien 12 tuntia, kahden koeryhmään (taulukko S3).

Gene ontologian (GO) analyysi suoritettiin sen määrittämiseksi, biologisen prosessin liittyy geenejä tunnistettu merkittävästi muuttunut HT1080 käsitellyissä soluissa IFN vain, U0126 vain, ja molemmat IFN ja U0126 (taulukko 2 ja kuva. 4). Hoidon U0126 vain tai molemmat IFN ja U0126 6 tuntia ryhmitelty yhteen osoittaen, että nämä hoidot muuttunut geenien kanssa samankaltaisia ​​toimintoja (GO yli-esitys). Vastaavasti 12 tunnin hoitojen U0126 yksin tai yhdistettynä hoito johti kaikkein samanlaisin GO yliedustus ryhmiä. IFN-vasta hoitoryhmissä (6 ja 12 tuntia) ryhmittyivät yhteen todennäköisesti koska suhteellisen pieni määrä GO luokkien muuttui verrattuna muihin hoitoryhmissä. Kaiken geenit putosi 312 GO ryhmiin, jotka liittyvät 3 GO yliedustus klustereita, jossa klusterin 3 voitaisiin jakaa 11 alaryhmiä. Ryhmät 1, 3A, 3B, 3D ja 3I osoittivat lisääntynyttä GO yliedustettuina vastauksena yhdistetyn U0126 ja IFN hoitoa verrattuna jompikumpi hoito yksinään. Nämä klusterit sisältyvät GO ryhmiin liittyvät NF-KB signalointi, anti-virus vaste, immuunivasteen, apoptoosin säätelyyn, kemokiinin signalointi, solujen kehitystä, ja aineenvaihduntaa. Sen sijaan, klusterit 3C, 3E, 3F, 3H ja 3K oli vähentänyt GO-yliedustus luokkiin upon yhdistelmähoito, mikä osoittaa, että lisääminen IFN stimulaation johti menetys geenisäätelyn kuuluvien geenien GO ryhmiin liittyy solun liikkuvuus, DNA: n korjaukseen ja solunjakautumisen. Näin ollen, MEK inhibitio muuttaa tyyppisiä geenejä, jotka voidaan indusoida IFN hoidon lisäksi lisätään myös joukko geenejä aiheuttama.

Genes merkittävästi voimistunut tai vaimentua ekspressiotasoja verrattuna kontrolliin analysoitiin yliedustus GO luokan verrattuna havaittiin genomin. Huomattavasti yliedustettuina GO luokat (FDR 0,05) on esitetty korkeimman FDR = 0 punaisella ja kategoriaa FDR ≥0.05 tai puuttuu näkyy sinisenä.

Yhdessä nämä analyysit osoittavat, että Ras /MEK reitin estää ilmentymisen ISGs mukana antiviraalisen vasteen useilla tasoilla kuten havaitseminen taudinaiheuttajan liittyy kuvioita, aktivointi anti-virus signalointi kaskadi ja suora antiviraalisia efektori geenejä.

validointi palauttaminen IFN indusoimaan Gene Expression MEK esto

kvantitatiivinen RT-PCR (RT-qPCR) tehtiin vahvistaa muutoksia geenien ilmentyminen havaittiin mikrosiruanalyysi käyttäen HT1080 soluja käsiteltiin IFN ja /tai U0126 (Fig. 5 ). Kahdeksan geenit (IFIT2, GBP2, MAP2, RIGI, Stat2, BTN3A3, MMP7 ja ID2) valittiin perustuen niiden biologiset toiminnot ja geeniekspression muutokset vasteena IFN ja /tai U0126 hoitoon. IFIT2, GBP2, MAP2 ja MMP7 ilmentyivät ainoastaan ​​HT1080 soluja käsiteltiin sekä U0126 ja IFN 6 tuntia, kun taas geenin induktion havaittiin IFN vain U0126 vain ryhmien myöhemmin ajankohtana (12 tuntia). BTN3A3 indusoitiin yhdistelmähoito sekä ajankohtina, mutta ei U0126 ainoa tai IFN ainoa hoito. Lisäksi Ras /MEK inhibitio U0126 oli kykenee edistämään geenin ilmentymistä RIGI ja Stat2 12 tuntia IFN: n puuttuessa, kuten aiemmin on kuvattu [17], [40]. Olemme havainneet, että ID2, joka ei ole IFN-geenin, oli upregulated vain U0126 hoitoon ja yhdistetyn hoidon, mutta ei IFN hoitoon. Useimmat muutokset geenien ilmentyminen varmistettiin RT-qPCR, mutta koska ero herkkyys ja tilastollinen voima kaksi eri tekniikoita, eivät kaikki geeni muutoksia havaittiin tilastollisesti merkitseviä molemmissa analyyseissä. Esimerkiksi, RIGI havaittiin indusoituvan HT1080-soluissa IFN ainoa hoito käyttäen RT-qPCR, mutta ei mikrosiruanalyysi.

taso geenin ilmentymisen HT1080-solut jätettiin käsittelemättä, käsiteltiin IFN (50 U /ml), ja U0126 (20 uM) tai IFN ja U0126 6 tuntia tai 12 tuntia, määritettiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. Suhteellinen ilmentyminen taso laskettiin verrattuna 6 tunnin käsittelemätön kontrolli normalisoinnin jälkeen vastaan ​​GAPDH ekspressiotasoja. (N = 3, * P 0,01 verrattuna aika-Hyväksytty ohjaus, ** P 0,05 verrattuna kaikkiin muihin ryhmiin).

Effects of Ras aktivointi IFN aiheuttamaa Transkriptio IFN Sensitive SKOV3 solut

tutkia edelleen tukahduttaminen IFN transkription aktivoitu Ras, tuottamaamme SKOV3- solut (IFN-herkkä), jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktiivisen Ras-mutantin (SKOV3-RasV12, kloonit 10 ja 15). Ras /MEK aktivaation mutantti-soluissa varmistettiin western blot -analyysillä käyttäen anti-fosforyloitu ERK, ja ras-vasta-aineita (Fig. 6A). Vektorisäätö SKOV3 ja SKOV3-RasV12 soluja käsiteltiin IFN (0, 12,5, 25, 50 ja 100 U /ml) 16 tunnin ajan ja altistettiin sitten VSV MOI 1. Western blot-analyysi VSV-G-proteiinia 24 tuntia infektion jälkeen osoittivat, että VSV selvästi toistettu tehokkaammin Ras-transformoitujen SKOV3-mutantit (klooni 10 ja 15) kuin verrokeilla SKOV3- solujen läsnä ollessa IFN (Fig. 6B). Olemme myös mitattava jälkeläiset virusmäärät 48 tuntia infektion jälkeen määrällisesti aste virusinfektio (Fig. 6C). Yhteisymmärryksessä western blot -analyysin, huomasimme, että jälkeläisten virus tuotanto oli merkitsevästi korkeampi Ras-transformoidut SKOV3 mutantti kuin verrokeilla SKOV3- käsitellyissä soluissa IFN (50 ja 100 U /ml). Edelleen määrittää, onko lasku IFN herkkyyttä käyttöön aktiivisen Ras indusoi downregulation IFN-indusoidun transkription, tutkimme muutoksia IFN-indusoidun transkription 5 geenien (GBP2, IFIT2, MAP2, Stat2 ja RIGI), joka me aiemmin tunnistettu vaimentua Ras /MEK HT1080 soluissa (kuvio 5). Induktio GBP2, IFIT2, MAP2 ja RIGI estyi Ras-transformoitujen SKOV3- soluja verrattuna valvoa SKOV3- solujen 12 tunnin kuluttua IFN-stimulaation, kun Stat2 induktio ei vaikuttanut merkittävästi (Fig. 7). Nämä tulokset osoittavat, että aktivoitu Ras signalointi estää transkription tiettyjen IFN-indusoituvia geenejä johtaa lasku solun herkkyyttä IFN.

(A) Western blot -analyysi käyttäen anti-Ras, fosforyloitu ERK tai GAPDH-vasta-aineen määrittämiseksi Ras /MEK aktivaation ohjaus SKOV3 ja Ras muuttaneet SKOV3 (klooni 10 ja 15). Ohjaus SKOV3 ja Ras transformoituja SKOV3- soluja käsiteltiin IFN (0, 12,5, 25, 50 ja 100 U /ml), ja sitten altistettiin altistettiin VSV (MOI 1). Infektio arvioitiin (B) Western blot analyysi VSV-G-proteiinin ja GAPDH 24 tuntia infektion ja (C) jälkeläisten virus-määritys 48 tuntia infektion jälkeen.

ilmentymisen GBP2, IFIT2 , MAP2, RIGI ja Stat2 valvonta SKOV3 ja Ras-transformoitujen SKOV3- solut (klooni 15), 12 tunnin kuluttua IFN-stimulaation (0, 12,5, 50 ja 100 U /ml) määritettiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. Suhteellinen ilmentymistaso laskettiin verrattuna käsittelemättömään kontrolliin SKOV3- solujen normalisoinnin jälkeen vastaan ​​GAPDH-ekspressiotasot. (N = 3, * P 0,05 ** P 0,01 verrattuna IFN pitoisuus-sovitettua kontrolli).

Keskustelu

Kuten osoitettiin aiemmin, arvonalentumisesta IFN vasteen syöpäsolut pidetään yhtenä yhteiset mekanismit virusonkolyysiä [3], [10]. Aktivointi Ras /MEK-reitin on raportoitu tukahduttaa antiviraalinen indusoimia IFN [4], [16], [17], [25], [40]. Tässä tutkimuksessa ensin kartoitettiin paneelin ihmisen syöpäsolujen linjat ja määritetään 1) kykyä reagoida IFN tuottamaan anti-virus tila ja 2) kyky MEK estäjän, U0126, palauttaa IFN herkkyyttä. Olemme havainneet, että 13 16: sta testatuista solulinjoista olivat kohtalaisesti tai kokonaan resistentti IFN: n antiviraalisia vasteen. 10: ssä näistä 13 solulinjojen, herkkyyttä IFN palautettiin käsittelemällä MEK estäjä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että aktivoitu Ras /MEK-reitin taustalla syöpäsolujen vastustuskyky antiviraalisten vaikutusten aiheuttamien IFN. Jotta voitaisiin edelleen tutkia oleva mekanismi estävä vaikutus Ras /MEK-reitin IFN vastausta, suoritetaan globaali geenin ilmentymisen analyysi määrittää IFN-indusoidun transkription toimintaa IFN herkkiä SKOV3: n ja IFN kohtalaisen kestävä HT1080-solut. Huomasimme, että oli huomattava määrän väheneminen geenien aiheuttama IFN HT1080 soluissa verrattuna että SKOV3- soluissa (276 geenejä SKOV3, 98 geenien HT1080 soluissa, Fig. 3A). Lisäksi MEK inhibitio palauttaa IFN: n kyky aktivoida sen transkription HT1080-soluissa, kuten olemme havainneet, että ylimääräinen 111 geenien 6 tuntia ja 135-geenien 12 tuntia ilmennettiin HT1080 soluissa, joita käsiteltiin sekä IFN ja U0126 (Fig. 3B), mikä osoittaa, että aktivoitu Ras /MEK estää transkription ryhmä IFN-indusoidun geenejä. Lopuksi, pystyimme osoittamaan, että ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen Ras IFN herkillä SKOV3- solut pienentää niiden kykyä aktivoida IFN aiheuttama transkriptio ja perustaa IFN aiheuttama antiviraalisen vasteen. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että aktivoitu Ras /MEK reitin estää transkription tiettyjen IFN indusoitavissa geenejä perustaa IFN heikentynyt ihmisen syöpäsoluja.

Voimme Hypoteesimme useita mahdollisia taustalla olevien mekanismien laajalle tukahduttaminen IFN aiheuttaman transkription Ras /MEK-reitin. 1) Ras /MEK säätelee aktiivisuus transkription co-säädin ISGF3, kuten positiivinen yhdessä säätävät IRF1 [41], [42], ja Sp3 [43] tai negatiivista yhdessä säätävät NF-KB: n [44] ja IFN-konsensussekvenssi sitova proteiini [45]. Tällöin IFN-indusoituvia geenejä, jotka vaativat ylä- tai alas-säätely co-säädin niiden ilmentyminen tukahdutetaan soluissa aktivoidulla Ras /MEK. 2) Ras /MEK estää pohjapinta ekspressiotasot avaintekijät IFN signalointireitin. Riittämätön ekspressiotasot näiden komponenttien johtaa maailmanlaajuiseen heikentyvän IFN indusoi antiviraalisen vasteen samanlainen downregulation Stat2 ilmaisun että vietämme NIH3T3-soluissa yli-ilmentävät konstitutiivisesti aktiivista Ras [17]. 3) ilmentymistä IFN-indusoituvia geenejä voidaan vaimentaa epigenetic mekanismeja. Esimerkiksi vuorovaikutus Stat2 kanssa BRG1 [46], joka on keskeinen osa ATP-riippuvaiset chromatin remodeling SWI1-SnF2 kompleksi [46], voi muuttaa ilmaus osajoukon IFN geenien. Vaikka sääntely BRG1 Ras ei ole osoitettu, downregulation siihen liittyvän proteiinin, Brm1, on raportoitu [47]. Samoin Ras-säätelyyn DNA metylaatio [48] tai histonimodifikaation [49], jos kohdistettu IFN-geenien, voisi maailmanlaajuisesti tukahduttaa niiden ilmaisua. 4) Lopuksi Ras /MEK reitti voi aktivoida tai upregulate alipaineensäätöventtiileillä IFN reitin kuten SOCS [50] tai PIAS [51]. Nämä alipaineensäätöventtiileillä voivat tukahduttaa transkriptio IFN indusoitavissa geenit tunnistettiin vaimentua Ras /MEK tässä tutkimuksessa.

analyysi biologisten prosessien edustettuina geenin sarjaa paljasti, että numerot biologisten prosessien vaikuttaa IFN ja U0126 oli korkeampi kuin joko U0126 tai IFN yksin. Lisäksi useita erilaisia ​​GO edustamaan ryhmään oli suurempi 6 tuntia verrattuna 12 tuntia joko U0126 yksin tai yhdistettynä hoitoon viittaa siihen, että pitkäaikainen stimulaatio rajoittaa määrää biologisista prosesseista, jotka voidaan suorittaa geenit, jotka ilmenevät . Kuten odotettua, IFN pystyi säätelemään geenien tunnettu vaste virus ja NF-KB: n signalointi on kuitenkin yhdistetty hoito lisäsi edustus enemmän anti-virus GO tuoteryhmät sekä geenien tärkeä sytokiini sääntelyä. Lisäksi verrattuna U0126 yksin hoitoon yhdistettynä U0126 ja IFN hoito vähensi edustus geenien vastuussa DNA: n replikaatio ja korjaus, solusyklin säätelyssä ja solun liikkuvuus. Kaiken yhdistetty hoito täydennetty anti-virus /tulehduksellisen geeniekspression vaste konsertti vähentynyt edustus geenien edistää onnistuneen solun jakautumista.

Mielenkiintoista, osajoukko geenien indusoitiin yleisesti kahden suojaava hoitoja, IFN hoidon in SKOV3- soluissa ja yhdistetty IFN ja U0126 hoitoa HT1080 soluissa (taulukko S3). Nämä geenit olivat C14orf159 geeni, joka on viime aikoina osoitettu olevan laajaa anti-virus-toiminto, ja MOV10 ja IFI44 geenien osoitettu olevan rajoitetumpaa antiviraalinen [52]. Samoin jäsenet antiretroviraalisten APOBEC3 [53] ja leikata [53] geeniperheistä indusoitiin molempia suojaavia hoitoja. IFIT2 on hiljattain osoitettu olevan anti-virus-toiminto [27], [28], [29] ja anti-proliferatiivista toiminto [54]. Lisäksi IFIT2 vuorovaikutuksessa mikrotubulusten [27] viittaa siihen, että IFIT2 voi liittyä IFN-voimistunut MAP2 häiritä virionin kokoonpano ja /tai kuljetuksen säätelemällä mikrotubulusdynamiikan [32], [33], [34]. Lisäksi meillä on myös tunnistettu kriittisiä antiviraalisia geenejä, kuten guanylate sitovan proteiinin (puntaa) -2 [31] ja RIGI [35], jotka ovat synergistisesti indusoituvat HT1080 käsitellyissä soluissa U0126 ja IFN. Siksi nämä tulokset tarjoavat lisänäyttöä huomioon näiden geenien luoda onnistuneen antiviraalista vastetta. Jatkotutkimuksissa pyritään tunnistamaan tarkkaa roolia näiden geenien joko yksittäin tai yhdistelminä, välittävä suojaava IFN: n antiviraalisia vasteen ja säätelemällä virusonkolyysiä.

Ei ollut korrelaatiota kudosalkuperää ihmisen syövän solut, joita käytetään tässä tutkimuksessa ja herkkyys IFN tai kykyä U0126 palauttaa IFN reagointikykyä.