Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

eturauhasen antigeenin (PSA) seulonta, vaikka yleinen, on viime aikoina asetettu kyseenalaiseksi. Löytää eturauhassyöpä (PCA) diagnostiset biomarkkerit, jotka voivat tehdä varten puutteita PSA, vertasimme secretomes useiden hyvänlaatuisia ja PCa solulinjat, valittu ehdokas molekyylejä, ja sitten vahvistivat kliinistä arvoa.

Menetelmät /Keskeiset havainnot

ensimmäinen tunnistettu ekstrasellulaariproteiineista kaksiulotteisella geelielektroforeesilla (2-DE) yhdistettynä nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS) tunnistaminen. Sitten validoitu eritettyjen proteiinien solutasolla, ja lopullisesti määritelty ne voitaisiin käyttää PCa diagnostinen biomarkkereita käyttäen eturauhasessa ja seerumin yksilöitä kiinalaisten vapaaehtoisten immunohistostaining ja sandwich-ELISA. Saimme uskottava solunulkoinen proteiini 2-DE kuvaajia eturauhasen solulinjoissa. 5 paikkoja, jotka osoittivat parempia toistettavuus valittiin LC-MS /MS-analyysia joka määritti seitsemän ehdokasta molekyylejä. Yksi kandidaattimolekyylejä, spondin-2 (SPON2), on vain ilmaistu medium (CM) ja androgeenireseptorin (AR) positiivinen PCa solulinjat. Käyttämällä kudos microarray by immunohistostaining, löysimme SPON2 olevan yli-ilmentynyt PCA. SPON2 värjäys oli voimakasta Gleason summa 7-8 ja PCA potilailla, joilla on etäpesäkkeitä. Vastaanottimen operaattori (ROC) käyrä analyysi, huomasimme, että seerumin SPON2 taso kohosi PCA potilailla, osoittaa herkkyys ja tarkkuus sopii diagnostiseen käyttöön. Olemme myös havainneet, että SPON2 voitaisiin käyttää tunnistamaan PCa seerumin PSA-arvot korkeintaan 10 ng /ml terveistä iäkkäillä miehillä.

Päätelmä /merkitys

SPON2 on uusi seerumi ja histologisia diagnostiset biomarkkereiden PCA. Se voi välttää joitakin ongelmia PSA testaus ja oli täällä havaittu tarjoavan suhteellisen suuri herkkyys ja spesifisyys suhteessa PSA.

Citation: Qian X, Li C, Pang B, Xue M, Wang J, Zhou J (2012) Spondin-2 (SPON2), a Lisää Eturauhasen-Cancer-Specific Diagnostic biomarkkereiden. PLoS ONE 7 (5): e37225. doi: 10,1371 /journal.pone.0037225

editori: Christina Lynn Addison, Ottawa Hospital Research Institute, Kanada

vastaanotettu: 20 joulukuu 2011; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2012; Julkaistu: May 15, 2012

Copyright: © 2012 Qian et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat tutkimusta apurahan Jianguang Zhou ja Jian Wang National Natural Science Foundation of China (nro 30870961 ja 81172445). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Yhdysvalloissa, eturauhassyöpä (PCA) yksinään vastaa 28% kaikista syöpätapauksista miehillä [1]. Prostataspesifinen antigeeni (PSA), joka on androgeenisäädellyn tuottama seriiniproteaasi sekä normaaleissa eturauhasen epiteelisolut ja eturauhasen syöpä (PCa), on yleisimmin käytetty seerumin biomarkkeri PCa [2]. Määrittäminen seerumin PSA-tasoihin ja eturauhasen tutkimukset (DRE) suositellaan, että suurin osa kliinisten suositusten varhaisia ​​eturauhassyövän [3].

Vaikka PSA on monia etuja, se on kyseenalaistettu viime vuotta. Yksi suurimmista haitoista PSA on, että sitä ei voida käyttää valvomaan terveiden miesten eturauhassyövän samanaikaisesti korkea herkkyys ja korkea spesifisyys [4]. Taso koko PSA koholla akuutti eturauhastulehdus ja eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH) [5], [6]. Miehillä on lievästi kohonneet PSA-arvot 4-10 ng /ml, neljä miestä on suoritettava koepala havaitsemaan yksi mies PCA [3]. PSA saattaa myös aiheuttaa väärän diagnoosin ja estää potilaita etsivät hoitoa ajoissa. Thompson et ai. havaitsi, että joukossa 2950 iäkkäillä miehillä, joiden PSA taso 4,0 ng millilitrassa tai vähemmän PCA todettiin 449; 67 heistä oli Gleason summa 7 tai korkeampi [7]. Nämä esimerkit korostavat kiireellisyyden löytää uusia eturauhasen syövän-erityisiä seerumi biomarkkerit, jotka voivat erottaa hengenvaarallisia kumppanuus- sekä kumppanuus- joiden seerumin PSA-arvot ≤10 ng /ml.

Tässä vertasimme keskittynyt kunnossa keskipitkällä (CM) proteiini kaksiulotteinen geelielektroforeesi (2-DE) kuvaaja BPH-1 (a BPH epiteelisolulinja, ja sen sytokeratiini ilmentymisen profiili on sopusoinnussa eturauhasen luminaaliseen epiteelisolujen [8]), LNCaP ja C4-2 (johdannainen solulinja LNCaP, joka on androgeenista riippumaton, erittäin tuumorigeenisemmiksi, ja metastaattisen [9]). Noin 400 hopea-värjäys-positiiviset täplät saatiin per 2-DE geeli. Eliminoinnin jälkeen taustamelun, standardointia, ja ottelu analyysi, päätimme 5 paikkoja, joiden erot esiintyi stabiilina LC-MS /MS tunnistaminen. Seitsemän ehdokasta molekyylit tunnistettiin. Yksi kandidaattimolekyylejä, SPON2, on vain ilmaistu CM androgeenin-reseptorin positiivinen (AR-positiivinen) PCa solulinjat.

kudos microarray immunohistokemiallisella värjäyksellä, olemme huomanneet, että SPON2 ilmentyminen PCa kudoksissa korkeampi kuin normaalissa eturauhasessa ja BPH kudoksiin. SPON2 ilme oli korkeampi PCa kudoksissa Gleason tulokset 7-8 ja niissä peräisin metastaattisen potilaista. Käyttämällä sandwich-ELISA-protokollaa, vertasimme 13 tervettä, iäkkäillä miehillä 70 PCa potilaille ja totesi, että seerumin SPON2 taso kohosi jälkimmäisessä. Pinta-ala saa operaattori (ROC) (AUC) seerumin SPON2 oli suurempi kuin 0,90, osoittaa suurempi diagnostinen arvo. ROC-käyrä ehdotti myös, että seerumin SPON2 pitoisuudet noin 8 ng /ml tuotti korkeimman tarkkuuden ja parhaan positiiviset ja negatiiviset ennustearvot-97,2% ja 100%, vastaavasti, samoin kuin paras herkkyys (100%) ja spesifisyys (84,6%) . Verrattaessa ROC käyrät seerumin SPON2 ja PSA Eturauhassyövän sairastavien potilaiden PSA-arvot alle 10 ng /ml terveisiin kontrolleihin, SPON2 todettiin erottamaan PCa seerumin PSA≤10 ng /ml terveistä, vanhukset ikäisten miesten, kun taas PSA ei voinut .

tulokset

seulonta ehdokas molekyylien CM Eturauhassyövän solulinjojen

Kahdeksankymmentä mikrogrammaa väkevää ja puhdistetun solunulkoisen proteiinien CM BPH-1, LNCaP ja C4- 2 erotettiin 2-DE. Skannattuja kuvia hopeavärjätyn 2-DE-geelit esitetään kuviossa 1A-C. Tulokset analysoitiin PDQuest ohjelmistoa, paljastaen noin 400 proteiinia paikkoja kohden geeliä, joista viisi oli säädellään ylöspäin CM päässä LNCaP ja C4-2 solut kolme itsenäistä toistuvia kokeita (Vastaavat alueet ovat laajentuneen ja kuviossa 1D.) . Viiden differentiaalisesti ekspressoidun proteiinin täplät edelleen havaita LC-MS /MS, ja seitsemän kandidaattimolekyylejä havaittiin: trioosifosfaatti-isomeraasi 1 (TPI1-), trombospondiini 1 (THBS1), fosfoglyseraattimutaasi 1 (PGAM1), spondin-2 (SPON2), syndekaani sitova proteiini 1 (ST1), peroxiredoxin 1 (PRDX1), ja nucleophosmin (NPM1). Kuten taulukosta 1, kaikki seitsemän proteiinit oli korkea järjestyksessä kattavuus ja Mascot tulokset. Todennäköisyys perustuva Mowse pisteet kunkin täplän ja sovitettu peptidejä kunkin proteiinin on esitetty kuvassa S1. Emme pystyneet määrittämään, mikä neljästä ehdokas proteiinit tunnistettu Spot 1 (taulukko 1) oli säädellään ylöspäin CM päässä LNCaP ja C4-2 soluja. Selvitetään tarkemmin kutakin proteiinia, on solutasolla, on ansainnut.

Kaksiulotteinen electrophoregram ehdon median (A) BPH-1, (B) LNCaP, ja (C) C4-2 solut näkyvät. (D) laajentuneessa vastaavat alueet on valittu proteiinin täplät näistä solulinjoista on myös esitetty. Proteiinit kunnossa media kaikkien solujen erotettiin kaksiulotteisella geelielektroforeesilla ja hopea-värjättiin. Valkoinen nuolet osoittavat ero paikkoja.

ilmentäminen SPON2 oli säädellään ylöspäin CM AR-positiivisten PCa solulinjoissa

Ensinnäkin viisi seitsemästä kandidaattimolekyylejä tunnistettiin RT-PCR kuudessa eturauhasen solulinjoissa, kohdunkaulan syövän solulinjassa Hela, ja rintasyövän MCF-7. Yksi ehdokas molekyylien SPON2 mukaisesti taipumus valitun 2-DE paikalla, oli säädellään ylöspäin CM LNCaP ja C4-2 suhteessa BPH-1 (kuvio 2A). RT-PCR-tulokset viittaavat siihen, että SPON2 mRNA ilmentyy voimakkaasti androgeeni-reseptorin positiivinen PCa solulinjoja. Western-blotit solulysaateista (CL) ja CM-proteiini osoitti myös, että SPON2 oli vain positiivinen CM LNCaP ja C4-2 (kuvio 2B). Tämä oli yhdenmukainen tulosten kanssa semikvantitatiivista RT-PCR: llä. Perustimme menetelmän SPON2 sandwich-ELISA kvantitointiin. Piirtämällä log korjatun optisen tiheyden (x-akseli) vs. log niitä vastaavien SPON2 pitoisuus (y-akseli), joka on lineaarinen yhtälö on asennettu kuviossa 2C. SPON2, 10 ug väkevää solunulkoisen proteiinin CM eri eturauhasen solulinjojen, kvantitoitiin sandwich-ELISA: lla, kuten on esitetty kuviossa 2D. Löysimme mukaisesti tulosten semikvantitatiivista RT-PCR: llä, joka SPON2 vasta ilmaistu CM AR-positiivisten PCa solulinjat LNCaP, C4-2, ja C4-2B. Valitsimme SPON2 ehdokkaaksi histologista ja serologista testausta varten.

(A) Semi-kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR-analyysi viiden ehdokkaan molekyylejä. (B) Western blot -analyysi solulysaateista ja kunnon media proteiinia anti- SPON2 ja anti- prostataspesifinen antigeeni (PSA) vasta-aine. (C) Standard käyrä SPON2 sandwich-ELISA. (D) SPON2 määritysrajan 10 ug solunulkoisen proteiinia kunnossa median eri eturauhasen solulinjojen.

Immunohistostaining ehdotti SPON2 oli mahdollinen biomarkkereiden PCA

Kaksi kohdat yhdestä kudoksesta lohkon erikseen värjättiin hematoksyliinillä eosiini (HE) ja SPON2 on esitetty kuviossa 3. HE-värjäys on esitetty ohjaus. Ilmentymisen SPON2 eri tapauksissa on myös esitetty kuviossa 3A-D. Keskimääräinen integroitu optinen tiheys (IOD) varten SPON2 proteiinin ilmentymisen (immunohistokemia) 73 näytteistä sisälsi 10 normaalin eturauhasen kudosnäytteitä, 19 BPH kudosnäytteet, 44 PCa kudosnäytteet eri Gleason tulokset, ja näytteet Eturauhassyövän kudosta sekä ilman etäpesäkkeitä oli lasketaan Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmisto (taulukko S1).

SPON2 kiinteä optinen tiheys (IOD) summia kaikkien eturauhassyöpäpotilaalla (A), ryhmä Gleason pisteet summa 7-8 (B) ja etäpesäkkeiden (C ) olivat kaikki korkeampia kuin sekä normaali- ja eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (SNK * edustaa SNK ryhmittely testitulokset ja ryhmiä samalla kirjaimella eivät ole merkittävästi erilaiset; GS ** edustaa Gleason pisteet summaa; M *** edustaa etäpesäkkeiden tila.). Samat alueet samojen näytteiden värjäyksen hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) ja SPON2 erikseen näytettiin (D).

SPON2 IOD summat edustivat mediaani (kvartiiliväli), esim. M (Q

R), ja tilastollisesti testattu SNK ryhmittelemällä testi (q testi). Olemme havainneet, että SPON2 ilmaisu oli korkeampi PCA kuin normaali tai BPH kudosnäytteet, tilastollisesti merkittävästi (kuvio 3A).

PCA näytteet jaettiin kolmeen ryhmään, jonka Gleason pisteet summa: Gleason pisteet summia enintään 6, Gleason pisteet summia 7 tai 8, ja Gleason pisteet summa 9 tai 10. Löysimme SPON2 ilmaisua ryhmässä kiteyttää 7 tai 8 olevan suurempi kuin joko normaalissa tai BPH kudosnäytteet, tilastollisesti merkittävästi. Näytteet, jotka olivat summat enintään 6 verrokkeja enemmän ilmaisun kuin BPH (kuva 3B).

PCa näytteet myös jaettu kahteen ryhmään sen perusteella, potilaan tila: potilas jolta näyte ilman etäpesäke (M0) ja yksilöitä potilailla, joilla on etäpesäkkeitä (M1). Olemme havainneet, että SPON2 ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi ryhmässä M1 kuin normaalissa tai BPH kudoksissa (kuvio 3C).

Seerumin SPON2 tasot olivat koholla PCa potilailla

seerumissa SPON2 tasot 13 tervettä , iäkkäillä miehillä ja 70 PCa potilasta (taulukko S2) kvantifioitiin käyttäen SPON2 sandwich ELISA: lla edellä mainittua standardikäyrä (kuvio 2C). Löysimme seerumin SPON2 taso Eturauhassyövän potilaista (95% luottamusväli, 95% CI = 27,55-52,69) oli huomattavasti suurempi kuin terveillä, iäkkäillä miehillä (95% CI = 0-7,78) (

P

0,001).

(A) SPON2 70 eturauhassyövän potilailla ja 13 terveiden iäkkäiden miesten verrattiin. Willcoxon 2 näytettä testaus käytettiin määrittämään olevien erojen merkitsevyys kahden ryhmän välillä. (B) SPON2 vastaanotin operaattori (ROC) käyrä edellä mainituissa tapauksissa on esitetty. (C) SPON2 ja eturauhasen antigeenin (PSA) ROC käyrät eturauhassyövän potilailla, joiden seerumin PSA≤10 ng /ml ja terveiden iäkkäiden miesten näkyvät.

70 PCa potilaat jaettiin kahteen ryhmiä, 9, joiden seerumin PSA ≤0 ng /ml ja 61, joiden seerumin PSA 10 ng /ml. Seerumi SPON2 ja PSA-arvot näiden kahden potilasryhmissä verrattiin ryhmään terveillä ikääntyvillä miehillä (taulukko 2). Seerumin SPON2 Eturauhassyövän kanssa PSA≤10 ng /ml ja 10 ng /ml olivat huomattavasti korkeammat kuin terveiden verrokkien (

P

= 0,0013 ja

P

0,001). Kuten odotettua, seerumin PSA-arvot Eturauhassyövän 10 ng /ml olivat merkittävästi korkeampia kuin terveiden verrokkien, kun taas PSA≤10 ng /ml ei havaittu tilastollista merkittävyyttä vastaan ​​terveillä verrokeilla (

P

= 0,2852). ROC-analyysi seerumin SPON2 ja PSA Eturauhassyövän sairastavien potilaiden PSA-arvot ≤10 ng /ml ja terveillä verrokeilla tehtiin myös (kuvio 4C). AUC: t olivat 0,915 (SE = 0,063, 95% CI = 0,790-1,039,

P

= 0,001) ja 0,645 (SE = 0,146, 95% CI = +0,359-0,931,

P

= 0,256), tässä järjestyksessä. Jotta seerumin SPON2 tasot näiden potilaiden ja terveiden verrokkien, sulku arvo 8 ng /ml antoi herkkyys 100% ja spesifisyys 84,6%. PSA, suositellulla 4 ng /ml raja-arvo, herkkyys ja tarkkuus olivat vain 44,4% ja 92,3%, tässä järjestyksessä.

Keskustelu

Kaikki erittämät proteiinit eläviä soluja muodostavat organismin ” secretome ”. Jotkut erittämät proteiinit vapautuu vereen, joten secretome tutkimus voi auttaa paljastamaan uusia ehdokas seerumin biomarkkerit mahdollisten kliinistä merkitystä [10].

Gross et al. verrataan secretome proteiiniprofiileja sisään väliainetta LNCaP stimuloidaan androgeenien, estrogeeni, ja interleukiini-6 ja havaitsivat, että β2-mikroglobuliini (B2M) tuli nimenomaan säädelty kunnossa keskipitkällä androgeenin indusoiman LNCaP [11]. Lisätutkimuksia ehdotti, että seerumin B2M tasot ovat koholla metastasoituneen, androgeenista riippumaton eturauhassyöpä. Sardana G. suoritetaan laadullinen proteomiikka analyysi CM peräisin PCA solulinjasta PC3 (AR)

6 ja löysi uuden kumppanuus- seerumin biomerkkiaineen, Mac-2BP [12]. Tämä viittaa siihen, että analyysi CM voi paljastaa lisää uusia, arvokkaita PCa seerumin biomarkkereita.

SPON2 (spondin-2, Mindin, DIL-1) kuuluu F-spondin perheen erittyvien soluväliaineen proteiinien [13] . SPON2 ilmentyy differentiaalisesti syöpä- ja ei-syöpäsolujen keuhkojen soluihin [14]. On tärkeää aloittamisen synnynnäisen immuunivasteen Rakennus on ainutlaatuinen kuvio tunnustamatta molekyylin solunulkoisen matriisin Mikrobipatogeenien [15]. Toinen tutkimus kertoo, että se toimii integriinin ligandi ja on kriittinen tulehdussolujen rekrytointi [16]. Viimeaikainen tutkimus on ehdottanut, että R-spondin perheenjäsenet säädellä Wnt-reitin yhteinen mekanismi ja että R-spondin2 on erittyvä aktivaattori Wnt /β-kateniinin signalointi [17], [18]. Iris Simon havaitsi, että SPON2 on säädelty seerumeissa munasarjasyöpää sairastavilla potilailla [19]. Renate Parry tutkimus ehdotti, että SPON2 mRNA ilmentyy pääasiassa eturauhasen (sekä tuumori ja normaalit näytteet), ja merkittävästi pienemmillä tasoilla muissa kudoksissa [20]. Romanuik: n analyysi osoitti, että SPON2 on rikastettu ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, jotka yli muiden ihmisen syöpäsolulinjoissa [21]. Käyttäen LNCaP -tuumoriksenografti nude-hiirissä malleja, SPON2 käytettiin vasta-aineisiin perustuva sädehoitoa eturauhasen syöpä [20]. Sardana et ai analysoi CM proteomiikka päässä PC3, LNCaP ja 22Rv1 eturauhassyövän solulinjoissa kaksiulotteisella kromatografia ja tandem-massaspektrometrialla, saadaan neljä ehdokasta biomarkkerit lukien spondin-2, ja havaitsivat, että sen ilmentymistaso seerumeista osoitti merkittävää eroa potilaiden välillä tai ilman eturauhassyövän [22]. Kaikki nämä tulokset viittaavat SPON2 voi olla uusi biomarkkereiden PCA.

eturauhasessa mikrosiru oli immunohistostained anti-SPON2 vasta-aine. Huomasimme, että SPON2 värjäytymisen intensiteetti Eturauhassyövän oli huomattavasti voimakkaampi kuin terveiden, miehillä ja BPH potilaita. SPON2 värjäys oli voimakkaampi näytteen kanssa Gleason summaa 7-8 ja näytteissä metastaattisen PCa potilaista.

Käytimme sandwich-ELISA-protokollaa verrata seerumin SPON2 tasoja 13 tervettä verrokkia ja 70 PCa käyttävillä potilailla Willcoxon 2 pistokokeita ja arvioimaan diagnostinen tehokkuus käyttäen ROC käyriä. Huomasimme, että seerumin SPON2 taso oli merkittävästi kohonnut PCA potilailla. Alue ROC-käyrän alla oli suurempi kuin 0,90, mikä osoittaa, tarkkuutta. Seerumin SPON2 pitoisuudet 8 ng /ml antoi parhaan positiiviset ja negatiiviset ennustearvot, 97,2% ja 100%, vastaavasti, paras herkkyys (100%), ja paras spesifisyys (84,6%).

Willcoxon 2 pistokokeita, huomasimme myös, että seerumin SPON2 tasot Eturauhassyövän potilaille, joiden seerumin PSA taso oli tai alle 10 ng /ml oli merkitsevästi korkeampi kuin terveillä verrokeilla, mutta heidän seerumin PSA-arvot eivät olleet. Perustuu AUC ja niiden 95%: n luottamusväli ja P-arvot, ROC käyrät seerumin SPON2 ja PSA ehdotti, että SPON2 voivat erilaistua PCa seerumin PSA≤10 ng /ml terveistä, vanhusten valvonta ja että PSA ei.

Valitettavasti emme kerää seerumeita BPH, akuutti eturauhastulehdus, tai eturauhasen intraepiteliaalisten neoplasia ehdokas potilaat, osittain siksi potilaiden mieltymysten ja osittain siksi, että vaikeudet ilman samanaikaista PCa ilman koepala. Lisätutkimukset näillä potilailla tarvitaan, mutta yhdistämällä tulokset edellä mainittujen immunohistostaining tuloksia, uskomme, että SPON2 näkyy, mahdollisuudet entistä PCa-erityisiä seerumin biomarkkereiden kuin PSA.

Näiden tulosten perusteella, solmimme että SPON2 oli uusi seerumin ja histologiset diagnostisia biomarkkereiden eturauhassyöpään, joka osoittaa itsenäistä diagnostinen arvo ja kyky välttää joitakin ongelmia luonnostaan ​​PSA.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

seerumi kerättiin ennen kliinistä hoitoa päässä syövän sairaalan Kiinan Academy of Medical Science (taulukko S2). Kaikki vapaaehtoiset olivat kotoisin Kiinan, xanthoderm. Seitsemänkymmentä PCa inpatients tästä sairaalasta myös vapaaehtoisesti. Heidän diagnoosit varmistettiin koepala, ja kaikki antoivat kirjallinen lupa. Kolmetoista terve, iäkkäillä miehillä (myös kirjallinen suostumus) tarjoutui toimimaan kontrolliryhmään. Vain miehet saapuvat DRE ja B-mode ultraääni olevan mitään eturauhasen legionaa saivat ajan kontrolleina. Protokollat ​​keräämiseen ja näytteiden analysointi hyväksyttiin National Cancer Center (NCC) eettinen komitea Kiinan mukaisesti nykyisen tarkistamisen Helsingin julistuksen. Näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Seerumin PSA-pitoisuudet potilaiden kvantifioitiin käyttäen Roche Elecsys automaattinen elektrokemoluminesenssia immunomääritys sekä sen täydentävän PSA elektrokemiluminesenssin ilmaisu- kit (Roche Diagnostics, GmbH). Vastaavat käyränvalmisteluvaihe ja seerumin PSA kvantitointi tiukasti totteli operaation protokollan tarjoamia Roche.

Soluviljely

Ihmisen eturauhasen sinoomasolulinjoja, LNCaP, C4-2, C4-2B (myös johdannainen solu rivi LNCaP, joka on androgeenista riippumaton, erittäin tuumorigeenisemmiksi, ja metastaattisen [9]), PC3 ja DU145, jota oli käytetty viite [23] saatiin lahjaksi Leland WK Chung (Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, CA, USA); solulinjaa BPH-1 oli lahja J. Zhang (Nankai University, Tianjin, Kiina, PR.) ja oli käytetty viite [24]. Rintasyöpä MCF-7 ja kohdunkaulan syövän solulinja HeLa ostettiin ATCC ja säilynyt meidän lab. Ne kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa (Gibco, Paisley, UK), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia.

Protein erotus 2-DE ja hopeavärjäyksellä

Collection, määritys, pitoisuus, ja proteiinien puhdistukselle CM suoritettiin, kuten viitteessä [25]. Saostunut proteiini näytteet (80 ug) ladattiin 2-DE-proteiinin erottaminen käyttämällä 7 cm ReadyStrip IPG Strips (pH 3-10, lineaarinen) tiukasti mukaisesti tuotteen manuaalinen

2-D Elektroforeesi varten Proteomiikka

(Bio -Rad), Kukin koe toistettiin itsenäisesti kolme kertaa. Geelit hopeavärjätyssä kuten viitteessä [26]. Skannaus tehtiin tasoskanneri ja käsitelty PDQuest ohjelmisto (Bio-Rad). Kukin geeli normalisoitiin yhteensä pätevä paikalla intensiteettiä, ja ilmennetty eri paikkoja määriteltiin täplien yli kaksinkertaistuu ero solulinjoista.

In geeliä ruuansulatuksen, LC-MS /MS, ja tietokanta hakujen

geeli ruoansulatusta, LC-MS /MS, ja tietokanta hakujen ovat rutiinia toimintaa välineen keskellä meidän instituutti. Protokollat ​​luetellaan Teksti S1.

Semi-kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) B

Yhteensä RNA puhdistettiin käyttämällä Trizol reagenssia (Invitrogen Life Technologies). Ensimmäisen juosteen cDNA generoitiin käyttäen First Strand Synthesis System (TOYOBO, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukkeet semikvantitatiivisella RT-PCR on esitetty taulukossa S3.

Western blot

Solunulkoisilla proteiinien CM ja holoproteins CL kerättiin ja analysoitiin kuten on kuvattu viitaten [25]. Western blot -analyysit suoritettiin myös, kuten on kuvattu, paitsi käytimme vuohen anti-ihmisen SPON2 (R 0,05 katsottiin merkitseväksi. Yli kolmen jakelu mittaustiedot ryhmiä, käytimme SNK ryhmittymä (q testaus) ja Kruskal-Wallisin testaus. Kaikki edellä mainitut analyysit suoritettiin käyttäen tilastollista ohjelmistoa SAS 8.0 for Windows. ROC käyrät rakennettiin SPSS 13.0 for Windows.

tukeminen Information

Kuva S1.

LC-MS /MS tunnistaminen valittu paikkoja. A. Mowse pisteet spot 1. B. Sequence kattavuus peptidien SPON2 (Hyväksytty peptidejä lihavoitu). C. Sequence kattavuus peptidien THBS-1 (Hyväksytty peptidejä lihavoitu). D. Sequence kattavuus peptidien TPI1- (Hyväksytty peptidejä lihavoitu). E. Sequence kattavuus peptidien PGAM1 (Hyväksytty peptidejä lihavoitu). F. Mowse pisteet spot 2. G. Sequence kattavuus peptidien ST1 (Hyväksytty peptidejä lihavoitu). H. Mowse pisteet spot 3. I. Sequence kattavuus peptidien TPI1- (Hyväksytty peptidejä lihavoitu). J. Mowse pisteet spot 4. K. Sequence kattavuus peptidien PRDX1 (Hyväksytty peptidejä lihavoitu). L. Mowse pisteet spot 5. M. Sequence kattavuus peptidien NPM1 (Hyväksytty peptidejä lihavoituina).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0037225.s001

(TIF) B Taulukko S1.

Tiedot ihmisen eturauhasessa microarray käytetään tässä tutkimuksen paperi lukien SPON2 IOD summaan lasketaan.

doi: 10,1371 /journal.pone.0037225.s002

(DOC) B Taulukko S2.

tiedot Eturauhassyövän potilaiden ja normaalien ikäisillä miehillä käytetään tässä tutkimuksen paperi mukaan lukien seerumin SPON2 tasolla laskimme.

doi: 10,1371 /journal.pone.0037225.s003

(DOC) B Taulukko S3.

Alukkeet Semi-kvantitatiivinen RT-PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0037225.s004

(DOC)

Text S1.

Protocols In geeliä ruuansulatuksen, LC-MS /MS ja Tietokanta istä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0037225.s005

(DOC) B