Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

selenoenzyme tioredoksiinista reduktaasi 1 on monimutkainen rooli liittyvät solun kasvuun. Se indusoi osana soluvasteen mahdollisesti mutageenisiä hapettimia, mutta myös näyttää tarjoavan kasvun etuja transformoituja soluja estämällä apoptoosin. Lisäksi selenokysteiini puutteesta tai alkyloidut muodot tioredoksiinin reduktaasin 1 ovat myös osoittaneet oksidatiivisen, pro-apoptoottista aktiivisuutta. Siksi ymmärtämään paremmin roolin tioredoksiinin reduktaasin redox aloitettu apoptoottisen prosesseja on perusteltua.

Menetelmät

rooli tioredoksiinin reduktaasin 1 in RKO soluissa arvioitiin lieventäviä endogeenisen tioredoksiinista reduktaasin 1 ilme siRNA ja sitten joko indusoimalla seleeni-puutteellinen tioredoksiinin reduktaasin tai käsittelemällä erillisiä redox haasteita, mukaan lukien vetyperoksidi, hapettunut lipidi, 4-hydroksi-2-nonenol, ja typpioksidin luovuttavia aihiolääke. Tioredoksiini redox tila, solujen elinkelpoisuus, ja efektori kaspaasiaktiivisuus mitattiin.

Johtopäätökset /merkitys

solujen heikennetyllä endogeenisen tioredoksiini-reduktaasi-1, joka on stabiilisti integroitu selenokysteiini puutteesta entsyymin muodosta indusoitui mutta ei muuttanut joko tioredoksiinin redox tilan tai solujen kasvun kinetiikka. Hapettunut lipidi ja typpioksidin luovuttajan osoittanut parannettu sytotoksisuutta kun tioredoksiinista reduktaasin 1 oli tippuu alas; kuitenkin, vaikutus oli suurempi, typpioksidin aihiolääke. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa hypoteesin, että vaimennus tioredoksiini-järjestelmä voi edistää apoptoosin typpioksidin riippuvaisella tavalla.

Citation: Edes K, Cassidy P, Shami PJ, Moos PJ (2010) JS-K , typpioksidin aihiolääke, on lisännyt Sytotoksisuus in koolonkarsinoomasoluissa kanssa knockdovvn tioredoksiinin reduktaasin 1. PLoS ONE 5 (1): e8786. doi: 10,1371 /journal.pone.0008786

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 syyskuu 2009; Hyväksytty: 30 joulukuu 2009; Julkaistu: 20 tammikuu 2010

Copyright: © 2010 Edes et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat USPHS Grant CA115616 (PJM). Tunnustamme myös käyttöä ydintoiminteiden tukee P30 CA042014 myönnettiin Huntsman Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. Moos tukee NIH mutta suunnittelu ja toteutus on hänen oma. Tohtori Shami on perustaja ja pitää varastossa JSK Therapeutics, Inc. Dr. Cassidy ja Ms Edes julistaa ole eturistiriitoja.

Johdanto

nisäkkäiden tioredoksiinista Järjestelmä koostuu selenoprotein tioredoksiinin reduktaasin (TR), tioredoksiini (Trx), ja elektronidonorin NADPH. TR-Trx järjestelmä osallistuu erilaisiin redox reaktioita soluissa [1], tukemisesta DNA-synteesi [2] redox-riippuvainen solu- signalointipolkujen [3] – [6]. TRX ja TR voi helpottaa kasvua ja /tai eloonjäämistä pahanlaatuisten solujen niiden ilmentyminen on kohonnut joissakin kasvaimissa [7], [8]. Tioredoksiinin reduktaasin entsyymiaktiivisuutta ei rajoitu tioredoksiini, vaan monet substraatit on tunnistettu, mukaan lukien; selenocompounds, askorbaatti, lipoate, ja hapettuneiden lipidien [9] – [11]. Kuitenkin jotkut hapettuneita lipidejä toiminto estää TR1 aktiivisuutta reagoimaan nukleofiilisen C-pää, joka sisältää Sec jäännös [12] – [14].

viereisen selenokysteiini (Sec) ja kysteiini (Cys) jäämät C-päähän nisäkkäiden TR vaaditaan reduktaasin aktiivisuutta, kun Trx on substraatti; kuitenkin, Sec-puutosta TR1 joutua biokemiallisia [15] ja biologisen [16] toiminnalle kuin Sec-riittävä TR1 joilla voi olla merkitystä syövän tai muiden tautien. Sek-puutteellinen TR1 on osoittanut, pro-apoptoottista aktiivisuutta tutkimuksissa arvioidaan rooli TR1 interferoni ja retinoiinihappo indusoiman apoptoosin [17], samoin kuin uudemmat tukevat tiedot, jotka on osoitettu s-puutteellinen TR1 lajien (nimetty SecTRAPs) ovat itse voimakas initiaattoreita apoptoosin ihmisen syövän solulinjoissa [16]. Apoptoosin näissä tapauksissa oletettiin välittävän lisätä oksidatiivista stressiä soluissa. Nämä esimerkit osoittavat, että häiriöt C-pään TR1 johtaa vahvistuksen-of-function-proteiinin, joka voi olla hyödyllinen pro-apoptoottisen ainetta, jos se voitaisiin kohdentaa pahanlaatuisia soluja.

Tässä tutkimuksessa olemme tutki vaikutuksia paksusuolen syöpäsoluissa kaksi skenaariota, jossa kanoninen TR1 (toisin sanoen kyky vähentää Trx) on vähentänyt joko siRNA hoitoon tai mutaatiosta C-terminaalisen Sec ja Cys-tähteet. Aloitimme arvioimalla redox tilan Trx in RKO koolonkarsinoomasoluissa jossa endogeeniset TR1 tasot vaimennetaan siRNA. Näissä samoissa soluissa puuttuu villityypin TR1, me sitten indusoi ilmaisi Sec-puutteellinen TR1 ja totesi, että tämä proteiini muuttaa kumpikaan Trx redox tilan eikä solujen kasvun kinetiikkaa. Vain soluja oksidatiivista stressiä hoidosta diamidiyhdisteille löysimme eroja TR1-comprimised soluissa. Tämä johti meidät tutkimaan vaikutuksia TR1 pudotus on erilaisia ​​oksidatiivisen stressitekijät, kuten reaktiivisen hapen, elektrofiilisen lipidi- ja typpioksidin (NO) -prodrug. Vaikutukset TR1 ehtyminen oli selvintä yhdistettynä jälkimmäisen hoidon.

NO on laaja kirjo fysiologisia vaikutuksia, kuten lausutaan vaikutuksia verisuonten ja hermoston [18], [19]. Se on myös lupaava antineoplastinen lääkeainetta koska sen sytotoksisuus; kuitenkin, optimaalinen kliininen vaste edellyttää uudenlaisia ​​toimitusmekanismit NO kasvaimeen sijaan systeemisen antamisen välttää verisuonten haittavaikutuksia [20].

O

2- (2,4-dinitrofenyyli) 1 – [(4-etoksikarbonyyli) piperatsin-1-yyli] diazen-1-ium-1,2-diolate (JS-K) on aihiolääkkeen suunniteltu vapauttamaan NO solunsisäisesti [21] siis välttää yleistynyt vaikutuksia verisuonistoon. Vapautuminen NO JS-K on riippuvainen metabolia glutationi S-transferaasit (GST: t), ja riippuvuus saattaa tarjota lisää neoplastisia valikoivuus koska GST usein yli-ilmentynyt syövän [22]. JS-K on osoittanut antineoplastinen teho sekä ihmisen syöpäsolujen linjat sekä eläinmallijärjestelmiä [23].

NO voi olla erilaisia ​​vaikutuksia soluissa. Toimivat hapettimena, se voi reagoida metalli-ionien, tai suoraan muokata proteiineja kysteiinitähdettä muodostavat S-nitrosotiolit. Tämä muutos voi moduloida proteiinien toimintaa [24]. Solu redox hallinta kysteiini nitrosylation on aktiivinen tutkimusalue, ja TR-Trx järjestelmä on tunnistettu säätelijänä ilmiön [25]. Erityisesti, apoptoottisia proteiineja on tunnistettu kohdeproteiinit muutettuna nitrosylation [26]. Todellakin, efektori kaspaasi, kaspaasi-3, on tavoite nitrosylation, joka on moduloitu soluliman ja mitokondrioiden Trx järjestelmät [27]. Siksi NO ja TR-Trx järjestelmä ovat olennainen osa solujen prosesseissa ohjelmoidun solukuoleman. Nykyisessä työssä me laajentaa tutkimus Tämän vuorovaikutuksen sisällyttää vaikutukset TR1 aktiivisuudesta tärkeän uuden ehdokkaan syövän terapeuttista ainetta, JS-K.

Tulokset

Nisäkkäiden tioredoksiini reduktaasin ilman Sec ajateltiin olevan minimaalinen aktiivisuutta; kuitenkin, tuoreet tiedot viittaavat Sec-puutosta tioredoksiinista reduktaasin saattaa olla muita redox toimintaa. Siksi rakensimme indusoituva solulinjan jossa voisimme ilmaista C-terminaalista mutantin TR1 joka oli resistentti siRNA knockdown. Mittasimme ilmaus TR1 Western-blottauksella ja mitattiin TR toiminta perustuu insuliinin vähentäminen sekä lipoiinihappoa vähennys (kuva 1). SiRNA tehokkaasti kaataa endogeenisen TR1 mukaan -70% ja tetrasykliiniä induktio stabiilisti integroitu C-terminaalisen mutantti oli ~75% tasosta endogeenisen TR1 (kuvio 1A). Lisäksi pudotus johti -70%: n vähennys TR aktiivisuus mitattuna biokemiallisten määrityksen NADPH hapetus Trx välituotteena ja insuliinin palvelevat lopullisessa elektronin vastaanottaja (kuvio 1 B). Koska TR1 voi vähentää vaihtoehtoisten substraattien Trx

in vitro

, arvioitiin myös kyky C-terminaalisen mutantti TR1 vähentää lipoiinihappoa soluun perustuvassa määrityksessä (kuvio 1C). Useat solun entsyymit voivat vähentää lipoate mutta ei tarkkailla -40% vähenemistä lipoate vähentäminen RKO-solujen endogeenisen TR1 vaimentaa siRNA ja solut, jotka ekspressoivat C-terminaalinen mutantti TR1.

Solut altistettiin ja vastaan ​​suunnattu siRNA TR1 yhteensä 96 tuntia, ja Sec-puutteellinen C-terminaalinen mutantti TR1 indusoitiin viimeisen 24 tunnin ajan. A) immunoblottianalyysi TR1 proteiinin ilmentymisen seuraavat siRNA hoitoja ja induktio Sec-puutteellinen mutantti TR1. B) TR biokemiallinen aktiivisuus mitattiin solulysaateista seuraamalla NADPH hapetuksen menetelmällä, joka on riippuvainen Trx ja käyttää insuliini on viimeinen elektronin vastaanottaja. Ensimmäinen pylväs vasemmalta edustavat aktiivisuutta ohjaus (si-Sekoita) ilman Trx lisättiin reaktioseokseen, joka osoittaa taustan signaali. C) Cell-pohjainen TR aktiivisuus mitattuna lipoiinihappoa väheneminen kolorimetristä määritystä käyttäen Ellmanin reagenssia. Ensimmäinen pylväs vasemmalta edustavat aktiivisuutta ohjaus (si-Sekoita) ilman lipoiinihapon lisättiin reaktioseokseen. Lysaatit soluista kanssa TR1 pudotti osoittavat merkittäviä vähennyksiä toiminnan kontrolliin verrattuna (si-Scramble) molemmissa määrityksissä (***, p 0,001).

Koska TRX on ensisijainen substraatti ja TR1 ja koska muut Sec-puutosta TR1 ovat osoittaneet oksidatiivisen stressin, mittasimme Trx redox asema määrittää, onko Sec-puutteellisia C-terminaalinen mutantti TR1 muuttanut redox tilan Trx. Arviointi Trx redox tilan suoritettiin alkyloimalla jodietikkahapolla, vähentäminen hapetetaan Cys DTT, ja sitten jodiasetamidi alkylointi, kuten on kuvattu [28]. Ei muutoksia Trx redox tilan havaittiin solujen joukossa on endogeeninen TR1, solujen TR1 tippuu alas, ja solujen endogeenisen TR1 tippuu alas plus induktio Sec-puutteellinen C-terminaali mutantti TR1 (esimerkki aineisto kuvassa 2 ja yhteenveto useiden kokeiden taulukko 1). Jos solut altistettiin 1 mM diamidi, muutokset hapetus-pelkistys-tila Trx havaittiin, ja ero si-TR1 käsiteltyjä soluja ja SI-Sekoita oli ilmeistä viittaa siihen, että määritys havaitsee muutokset hapetus-pelkistys-tila jälkeen hapettava haaste .

soluja ilman stimulaatiota (vasen kolme kaistaa), TRX on pääasiassa pelkistetyssä tilassa, vaikka TR1 tippuu alas ja C-terminaalin mutantti TR1 ilmaistu. 1 mM diamidiyhdisteille stimulaatio 30 min (oikealla kolme kaistaa), solujen endogeeninen TR1 osoittaa enemmän pienentää Trx kuin solujen endogeenisen TR1 tippuu alas siRNA.

Koska Sec-puutosta TR1 on osoittanut parannettu sytotoksisuutta muissa järjestelmissä ja siten yksi mahdollisuus oli, että solut indusoituvan Sec puutosta TR1 ei yleistyvät samalla nopeudella kuin soluja endogeenisen TR1. Mittasimme määrä solujen kasvua seuraavien siRNA knockdown ja induktio ilmaisun Sec puutteellinen TR1 laskemalla solupopulaatiomäärä (kuva 3). Solu kaksinkertaistaa aikaa kaikille kolme ehtoa oli ~24 tuntia, ajan aluksi lag ajan. Siksi tämä Sec puutteesta TR1 mutantti ei näytä muuttavan kasvukinetiikat RKO solujen ole merkittäviä eroja rinteillä kasvukäyrät mitattiin (0,35 ± 0,004 solua /h si-Scramble, 0,36 ± 0,006 solua /HR si-TR1, ja 0,33 ± 0,008 solua /h si-TR1 plus induktio C-terminaalin mutantti TR1).

salattu siRNA käytettiin verrokkina mitata pohjapinta kasvuvauhti (täytetty neliö) TR1 oli tippuu alas siRNA (ympyrä) sekä induktion Sec-puutteellinen, C-terminaali mutantti TR1 (täytetty kolmio). Mitään merkittäviä eroja kasvun havaittiin kuten yhtenäiset viivat laskemisessa käytetty kasvu hinnat nämä ehdot lähes yhdensuuntaiset.

Koska indusoidun ilmentymisen Sec-puutteellinen C-terminaali mutantti TR1 konstruktio teki ei saada muutosta redox tilan Trx, arvioimme sytotoksinen vaste RKO solujen endogeeninen TR1 sekä solut, joissa TR1 oli heikennetty siRNA reaktiivisten hapen ja typen muodossa H

2O

2 hapetettu lipidi 4-HNE, tai NO luovuttajan JS-K (kuvio 4). Elinkelpoisuus seuraava H

2O

2 altistumista ei ollut erilainen (kuvio 4A); 4-HNE altistus osoittivat vaatimaton, ~ 2-kertainen herkkyyden solujen TR1 tippuu alas, jossa on LC

50 ero oli 10,6 ± 0,7 uM soluissa kanssa TR1 pudotettiin verrattuna 24 ± 3,4 pM solujen endogeeninen TR1 (kuvio 4B); NO-luovuttaja, JS-K, osoitti ~6-kertaisesti lisääntynyt herkkyys soluissa kanssa TR1 vaimennetaan siRNA kanssa LC

50 ero oli 3,1 ± 0,5 uM soluissa kanssa TR1 pudotettiin verrattuna 19 ± 2 pM solujen endogeeninen TR1, kuten mitattuna MTT-määritystä (kuvio 4C).

solut endogeenisen TR1 (si-Scramble, täytetty neliö), ja solujen TR1 tippuu alas siRNA (si-TR1, ympyrä) verrattiin vastaavilla annoksilla redox modulaattorit. A) RKO-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla H

2O

2 ja elinkelpoisuus mitattiin 24 tunnin altistus. Mitään merkittäviä eroja ei havaittu. B) RKO-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla 4-HNE ja elinkelpoisuus mitattiin 24 tunnin altistus. Si-TR1 soluilla ~ 2-kertaisesti lisääntynyt herkkyys 4-HNE. C) RKO-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla JS-K ja elinkelpoisuus mitattiin 24 tunnin altistus. Si-TR1 soluilla ~6-kertaisesti lisääntynyt herkkyys JS-K.

Koska NO-luovuttaja edistänyt merkittävämpi ero elinkelpoisuuden välillä RKO solujen endogeeninen TR1 verrattuna solut TR1 tippuu alas, muita arviointi solujen redox tilan tehtiin arvioimaan mekanismi NO välittämän tehostetun sytotoksisuuden. Ensinnäkin, joka perustuu merkittäviä eroja solujen elinkelpoisuutta havaittiin MTT-määritystä, TRX redox tila arvioitiin seuraavien 5 uM JS-K inkubointia. JS-K käsiteltyjen TR1 knockdown soluilla enemmän hapettunut jakautumista Trx redox valtioiden seuraavat 90 min inkubaation NO aihiolääke (taulukko 2). Seuraavaksi yleisempää arviointiin oksidatiivisen tilan solujen arvioitiin seuraavien 5 uM JS-K hoidon 24 tunnin mittaamalla suhde vähentää GSH kokonaismäärään GSH tasoilla. Mitään merkittäviä eroja alentunut GSH kokonaismäärään GSH havaittiin (kuva 5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että maailmanlaajuinen muutos redox asemaa ei havaittu vaan valitse proteiinit saattavat kohdistua.

GSH mittaukset tehtiin hoidon jälkeen 5 uM JS-K 24 tuntia., Ja suhde alennettu GSH kokonais- GSH mitattiin. Merkittäviä eroja ei havaittu usein kaikissa hoitoryhmissä.

Voit selvittää mekanismia taustalla muutoksia solujen elinkelpoisuus määritettynä MTT-määritystä, immunoblot-analyysi kaspaasi 3 ja DNA: n korjaukseen proteiinin poly ADP riboosi-polymeraasi (PARP) arvioitiin (kuvio 6). Halkaistut kaspaasi 3 on sopusoinnussa aloittamisen apoptoosin ja määrä kaspaasi 3 katkaisun näytti olevan laajempi kun TR1 oli tippuu alas. Lohkaista PARP havaittiin myös näissä kokeissa annoksesta riippuvaisella tavalla.

RKO soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä, 1,5 tai 5 uM JS-K 24 tuntia. Proteiini erotettiin SDS-PAGE: lla ja detektoitiin immunoblot-analyysillä. Annoksesta riippuva kasvu halkaistut PARP ja kaspaasi 3 (CASP3) havaittiin enemmän lohkaistaan ​​materiaalia TR1 knockdown. GAPDH arvioitiin latauskontrollina.

Evidence apoptoosin aloittamisesta havaittiin sekä 1,5 ja 5 uM JS-K on immunoblot-analyysillä; siksi, solujen elinkelpoisuuden ja sytotoksisuus jos uudelleenkäyttö arvioitiin seuraavien 1,5 uM JS-K inkubaation (jossa solut edelleen näkyä 75% elinkelpoisia, kuva 4), joka perustuu proteaasi- aktiivisuus käyttämällä MultiTox määritystä. Tämä määritykset näytti olevan herkempi kuin MTT-määritystä, koska tälläkin pienellä annoksella, JS-K aiheutti merkittäviä sytotoksisuuden ja /tai menetystä elinkelpoisuus TR1 taintumisen solut (~45% elinkelpoisia) verrattuna soluihin on endogeeninen tasot TR1 (~68% elinkelpoisia, kuvio 7A ja 7B). Seuraavaksi suhteellinen kaspaasi-3/7-aktiivisuus mitattiin ja yhdenmukainen sytotoksisuustiedot, oli merkittävä parannus kaspaasin aktiivisuuden solujen TR1 tippuu alas (kuvio 7C). Erillisissä kokeissa, laaja kirjo kilpailukykyinen kaspaasiestäjä, Z-Asp-CH

2-DCB, oli mukana inkuboinnin aikana JS-K vahvistaa entsyymiaktiivisuuden havaittiin aiemmin oli kaspaasiriippuvaisen aktiivisuutta.

RKO-solujen käsiteltiin 1,5 uM JS-K 24 tuntia. arvioitiin A) elinkelpoisuus, B) sytotoksisuus, ja C) kaspaasi-3/7-aktiivisuus. Erillisissä kokeissa soluja inkuboitiin Z-Asp-CH

2-DCB, laaja, kilpailukykyinen kaspaasiestäjä, sen määrittämiseksi, että kaspaasi-määritys todellakin osoittaa efektori kaspaasiaktiivisuus (C). RKO solujen TR1 tippuu alas osoittavat huomattavasti suurempi menetykset elinkelpoisuutta, lisääntynyt sytotoksisuus, ja lisääntynyt kaspaasi-3/7-aktiivisuus seuraavat JS-K kohtelun kuin RKO soluja endogeenisten TR1 (**, p 0,01; ***, p 0,001; †††, p 0,001).

keskustelu

Vaikka selenoprotein tasot ovat yleensä riippuvaisia ​​seleenin ja seleenin puute näyttää lisäävän syöpäriskiä kuolleisuutta [29] , TR1-Trx järjestelmä voi olla epätavallinen keskuudessa selenoenzymes sen kyky edistää syövän [8], [30]. Todellakin, TRX on usein yli ilmaistuna monissa kasvaimissa, voi olla anti-apoptoottisia ominaisuuksia, ja se voi myötävaikuttaa jossain muodossa hoidon vastus [7], [31] – [34]. Tästä näkökulmasta inhibitio TR1 on erinomainen kohde estämään vähentämiseen tioredoksiinin, kun läsnä on lisäksi oksidatiivisen stressin. Myös useat yleisesti käytetty terapeuttisten aineiden, kuten sisplatiinin, syklofosfamidin tai doksorubisiini näyttävät kohdistaa tioredoksiinista reduktaasin sekä DNA [35] – [39]. Tuloksemme viittaavat siihen, että vaimennus TR1 ei riitä muuttamaan kasvun tilan soluja, mutta että asianmukaiset redox stressi seuraavat vaimennus TR1 voi olla tehokkain keino saavuttaa sytotoksista vastetta.

antiapoptoottisten aktiivisuus Trx on on sijaittava perustelut kohdistettu TR-Trx järjestelmä ihmisen syövässä [40], [41]. Äskettäinen havainto, että TR-Trx järjestelmä moduloi kaspaasi-3 on nitrosylation riippuvaisella tavalla [27] viittaa aseman vahvistamista TR-Trx järjestelmän NO välittämän apoptoottista aktiivisuutta. Tässä työssä olemme myös todeta, että NO aihiolääke, JS-K, nostaa apoptoosin TR1 on tippuu alas siRNA (kuviot 4 ja 6). Tämä mekanismi on yhdenmukainen aiempien mekanistisen tiedot, jotka osoittavat lisääntynyt kaspaasiaktiivisuus akuutin myelooisen leukemian solujen [42]. Lisäksi NO-lahjoittamalla aspiriini osoittivat synergististä aktiivisuutta yhdistettynä kulta sisältäviä yhdisteitä, joita ajatellaan ensisijaisesti tähtää TR-Trx järjestelmä [43].

rooli TR1 apoptoosin on tehty tutkimuksen koska se on tunnistettu ”GRIM” geeni (eli geenejä, jotka liittyvät retinoidi-IFN-indusoidun kuolleisuuden, GRIM 12) näytön geenejä, jotka liittyvät retinoidi-IFN-indusoidun apoptoosin [17]. Viime aikoina on osoitettu, että TR1-proteiinia ilman funktionaalista Sec jäännös vuoksi alkyloidaan tai katkaisu, kun se tuodaan soluihin käyttäen

BioPORTER

, indusoiman apoptoosin [16], [44]. Kuitenkin mekanismit TR-välitteisen apoptoosin TR1 SecTRAPs ole tiedossa. Mutantti TR1 käytimme, jossa C-pään Gly-Ser-Ser-Gly, ei ole toimiva tioredoksiini reduktaasin mitattuna NADPH hapetus /insuliinin vähentäminen sekä lipoiinihappoa vähennys (kuvio 1); kuitenkin, se ei myöskään näytä toimimaan SecTRAP apoptoottisten initiaattoria, kuten ovat kuvanneet Arner ja kollegat [16]. Samanlainen aiemman raportin [45], emme pystyneet tunnistamaan pohjapinta muutoksia Trx tai solujen redox tilan, kun TR1 oli tippuu alas siRNA (kuvio 2, taulukko 1), mutta ei tarkkailla muuttunut Trx redox tilan seuraavat JS-K hoitoa ( Taulukko 2). Lisäksi ilmaus tästä Sec-puutteellinen mutantti TR1 ei muuttanut oksidatiivisen tilan Trx. Näin ollen näyttää siltä, ​​että kaikki Sec-puutosta TR proteiineja edistää oksidatiivista stressiä ja apoptoosin.

Kohdistaminen TR1 syövän hoito voi olla ilman ei-toivottuja haitallisia vaikutuksia, jos sitä ei ole suunnattu kasvaimeen. Esimerkiksi tuumorisuppressorin, p53, on tärkeä säätelijä solujen kasvua ja apoptoosin, ja TR1 tehostaa p53-toiminto, oletettavasti edistämällä vähentämällä vastineet läpi Trx ydin- redox säädin Ref-1 [12], [13], [46 ], [47]. Useat yleisesti käytetty terapeuttisten aineiden, kuten sisplatiinin, syklofosfamidin tai doksorubisiini näyttävät kohdistaa TR1 sekä DNA [35] – [39], mutta ehkä aiheuttavat joitakin havaittavia haittavaikutuksia näitä yhteisiä terapeuttisia, voi olla ” off-tavoite ”esto TR1. Toinen redox modu yhdiste, joka on arvioitu syövän kliinisissä kokeissa, motexafin gadolinium, ajateltiin nimenomaan kohdistaa TR1 [7]. Kuitenkin motexafin gadolinium näyttää olevan substraatti TR1 ja synnyttää reaktiivisia happiradikaaleja läpi tämän vuorovaikutuksen samoin kuin estäjänä ribonukleotidireduktaasia [48]. Jos tämä yhdiste kliininen toiminta on todella johtuu sen vuorovaikutusta TR1, on vielä epäselvää, mikä kasvaimia tulee suunnata koska tämä yhdiste on osoittanut ristiriitaisia ​​tuloksia kliinisissä tutkimuksissa tähän mennessä [49] – [51], mutta se näyttäisi olevan erityisen lupauksen kuten säteily herkistävä [52], [53].

Vaikka mahdolliset komplikaatiot kohdistaminen TR1 syöpiä, tulokset tässä viittaavat siihen, että lääkkeen yhdistelmä lähestymistapoja, kuten NO-luovuttaja, JS-K, voisi olla kaikkein tehokas, jos yhdistetään aineilla, jotka kohdistuvat TR1.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Advanced DMEM, Glutamax, 5,5 ’, 6,6’-tetra- 1, 1 ’, 3,3’-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine jodidia (JC-1, MitoProbe JC-1 Assay Kit), 3- (4,5-dimethylthiaxol-2-yyli) -2,5-diphenyltretraxolium bromidia (MTT), Hankin tasapainotettua suolaliuosta, jossa Ca ja Mg (HBSS), Tris-glysiini-8% geelit ja naudan seerumin albumiinia ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Naudan sikiön seerumia ostettiin Hyclone (Logan, UT). RKO solulinja hankittiin American Tissue Type Culture Collection (Manassas, VA). Monoklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja tioredoksiini-reduktaasin (B-2, sc-28321, erä # J1304); polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja tioredoksiini (FL-105, SC-20146, erä # A1907), ja GAPDH (FL-335, SC-25778); aasin polyklonaalista anti-hiiri ja anti-kani-vasta-aineita konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Muihin polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja kaspaasi 3 (9661), pilkottiin kaspaasi 3 (9662), ja PARP (9532) ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Naudan seerumialbumiinia standardin ja Coomassie Plus Protein Reagent olivat Pierce Biotechnology (Rockford, IL). Proteaasiestäjäseostabletit tablettia (complete®) ostettiin Roche (Indianapolis, IN). PVDF-kalvo hankittiin Millipore (Burlington, MA). Kaspaasi-inhibiittori, Z-Asp-CH

2-DCB, oli peräisin Peptides International (Louisville, KY). Western Lighting kemiluminesenssin reagenssit olivat PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA). JS-K syntetisoitiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [54]. Dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja yhteisiä puskureita ja suoloja, ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Soluviljely

RKO paksusuolen syövän soluja käytettiin edustavana koolonsolulinjassa ja pidettiin Advanced DMEM 1% Glutama- ja 2% naudan sikiön seerumia. Aikaisemmin on kuvattu kohdennetun mutageneesin, että C-pää TR1 Gly-Cys-Sec-Gly Gly-Ser-Ser-Gly plus hiljainen mutaatio siRNA identiteetin sivuston, jotta tämä konstrukti resistenttejä siRNA suunnattu endogeeninen TR1. Me subkloonattiin tämä mutatoitunut TR1 rakentaa osaksi pcDNA5 /FRT /TO ja sitten työnnetään RKO solut stabiilisti integroitu pcDNA6 /TR ja pFRT /

lac

Zeo tehden tetrasykliini indusoitavissa mutantti TR1 solulinjassa. Nämä mutaatiot TR1 sekä siRNA käytetään moduloimaan endogeenisen TR1 on kuvattu aikaisemmin [13]. Kokeellisesti, solut maljattiin 2-3 x 10

5 solua /kuoppa 6 kuoppalevyllä ja transfektoidaan siRNA suunnattu TR1 (si-TR1) tai kontrolli tuottamat muokkaussalataan si-TR1 sekvenssi (si-Scramble) 72 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin tai stimuloitu tetrasykliiniä 24 tuntia, kuten osoitettu.

immunoblot-analyysi

solut 6-kuoppaisilla levyillä pantiin jäihin. Imettiin ja solut pestiin 1 ml: lla kylmää 1 x PBS: llä ja PBS imettiin pois. Solulysaatit otettiin talteen kuten aikaisemmin on kuvattu [13]. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä Coomassie Plus Protein Reagent (Pierce). Absorbanssi 595 nm: ssä mitattiin käyttäen Perkin-Elmer Victor

3V levylukijalla. Kymmenen 15 ug proteiinia erotettiin joko 8% Tris-glysiini geeleillä (for TR1) tai 10% natiivi ureaa geelejä (TRX), siirrettiin PVDF kalvo, blokattiin 10% rasvatonta maitoa, inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (1:200 TR, 1:250 TRX, 1:1000 sekä kaspaasi 3 ja halkaistut kaspaasi 3, 1:1000 varten PARP, ja 1:500 GAPDH) yön yli 4 ° C: ssa, pestään 3 ×, inkuboidaan sekundaarinen vasta-aine (1:5000) 45 minuutin ajan 22 ° C: ssa, pestään 3 x, inkuboitiin chemiluminesence reagenssien, ja valotettiin röntgenfilmille.

tioredoksiini-reduktaasin aktiivisuus määrityksissä

Cellular TrxR1 aktiivisuus mitattiin kuten on kuvattu aiemmin [13]. Lisäksi, mittasimme lipoiinihappo vähentäminen on samanlainen kuin aiemmin kuvattu määritys [55]. Lyhyesti, solut maljattiin ja käsiteltiin, kuten on kuvattu. Sitten solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen liuokseen, jossa on 1 ml ja joka sisältää 5 mM glukoosia PBS: ssä, kanssa tai ilman sitä 1 mM lipoiinihappo ja 0,2 mM DTNB varovasti ravistellen 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Solut sentrifugoitiin ja supernatantti näyte laimennettiin 1:01 vedellä ja absorbanssi mitattiin 412 nm: ssä. Negatiivinen kontrolli oli väliaine ilman soluja. Solupelletti pestiin PBS: llä, hajotettiin solujen hajotuspuskuria, ja proteiini mitattiin käyttäen Bradfordin menetelmällä. Alennetun lipoate normalisoitiin solun proteiinipitoisuus.

Redox tilan Trx

redox tila Trx suoritettiin, kuten on kuvattu [28]. Lyhyesti, solut hajotettiin 8 M ureaa puskuroitu Tris pH 8,9, joka sisälsi 30 mM jodietikkahappoa, sonikoitiin, ja inkuboitiin 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Proteiini saostettiin 10 tilavuudella jääkylmää asetonia, 1 N HCl: lla (98:2, tilavuus /tilavuus), sentrifugoitiin 11000 x g: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa, pestiin kylmällä asetonilla-HCl, suspendoitiin uudelleen 95 ul: aan puskuroitua ureaa joka sisälsi 35 mM DTT: tä, inkuboitiin 30 minuuttia 37 ° C: ssa, 7,5 pl 200 mM jodiasetamidia oli lisätä kuhunkin näytteeseen ja inkuboitiin 15 minuuttia 37 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus arvioitiin käyttäen Coomassie Plus Protein Reagent.

MTT-määritystä

Cellular elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT kuten aikaisemmin on kuvattu [56], joka perustuu tetratsoliumsuolan vähennys NADH elävien solujen ( Berridge

et ai.

, 2005).

glutathione kvantitoimiseksi

pelkistettyä glutationia (GSH) ja yhteensä GSH mitattiin käyttäen GSH-GLO reagenssit (Promega). Noin 2,5 x 10

3-soluja, jotka olivat esi-inkuboitiin siRNA suunnattu TR1 maljattiin valkoinen puolinen 384-kuoppalevyille, annettiin kiinnittyä, ja sitten käsiteltiin 0 tai 5 uM JS-K 24 tuntia. Väliaine poistettiin sentrifugoimalla, alennettu GSH mitattiin suoraan mukaisesti valmistusohjeet ja koko GSH mitattiin inkuboimalla soluja 1 mM TCEP: tä vähentää hapettuneen GSH. Tämä määritys on glutationi-S-transferaasi-riippuvaisia ​​määrityksessä, joka käyttää GSH tuottaa lusiferiini substraattina lusiferaasin tuottamaan valoa. Luminenssi mitattiin käyttäen Perkin-Elmer Victor

3V -levylukijalla.

MultiTox määritys

Elinkelpoisuus ja sytotoksisuutta mittaukset arvioitiin ero proteaasiaktiivisuuksien käyttäen MultiTox-Fluor Multiplex Assay (Promega) . Tämä määritys käyttää GF-AFC alustaan, joka on solu läpäisevä arvioida elinkelpoisten solujen, ja bis-AAF-R110 alustalle, joka ei ole solun läpäisevä arvioida proteaasiaktiivisuutta kuolleita soluja. Fluoresenssin näiden substraattien mitattiin käyttäen Perkin-Elmer Victor

3V levylukijalla; GF-AFC elinkelpoisuus alustaan ​​mitattiin 405 nm: n virityksellä, 475 nm emissio; ja bis-AAF-R110 sytotoksisuus alustaan ​​mitattiin 485 nm: n virityksellä, 535 nm emissio.

Caspase aktiivisuusmäärityksen

Effector kaspaasi-aktiivisuus mitattiin käyttämällä kaspaasi-GLO 3/7 Assay ( Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tämä on määritys, jossa DEVD peptidi substraatin katkaisee aktiivisen kaspaasin vapauttaa aminoluciferin substraattina lusiferaasin valon tuottamiseen. Luminenssi mitattiin käyttäen Perkin-Elmer Victor

3V -levylukijalla.

Tilastollinen

1-suuntainen ANOVA määrittämiseen käytettiin tilastollista merkittävyyttä joukossa näytteitä (GraphPad InStat Version 3.06). Bonferroni monivertailuja post hoc testaus käytettiin luomaan merkitys joukossa Hoitoryhmien p 0,05 pidettiin merkittävinä.