Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli todistaa toteutettavuutta longmer oligonukleotidin microarray alustan profiloida geenikopiomäärä muutoksia eturauhassyövän solulinjoissa ja nopeasti osoittaa uusi ehdokas geenejä, joka voi olla rooli syövän synnyssä.

menetelmät /tulokset ja havainnot

genominlaajuiset seulonta alueille geneettisen ja -tappiot yhdeksän eturauhassyövän solulinjoissa (PC3, DU145, LNCaP , CWR22, ja johdetut alilinjat) toteutettiin käyttäen vertailevaa genomista hybridisaatiota on 35000 ominaisuus oligonukleotidi mikrosiru (arrayCGH). Verrattuna perinteisiin kromosomi CGH, enemmän poistot ja pienten alueiden voittojen, etenkin pericentromeric alueilla ja alueilla vieressä telomeres, havaittiin. Koska validointi korkean resoluution of arrayCGH me analysoitiin edelleen pieni amplikonin 1,7 MB at 9p13.3, joka löydettiin CWR22 ja CWR22-Rv1. Lisääntynyt kopiomäärä vahvistettiin fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio käyttäen BAC-kloonin RP11-165H19 päässä monistettu alue käsittää kaksi geeniä interleukiini 11-reseptorin alfa (

IL11-RA

) ja dynactin 3 (

DCTN3

). Käyttämällä kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) voisimme osoittaa, että

IL11-RA

on geeni, jolla on korkein kopio vahvistuksenkertojan solulinjoissa verrattuna

DCTN3

viittaa

IL11-RA

olla vahvistus kohde. Seulonta 20 ensisijainen eturauhasen karsinoomat mukaan qPCR paljasti

IL11-RA

kopioluvun voitto 75% kasvaimista analysoitu. Gain

DCTN3

löydetty vain kaksi tapausta yhdessä voitto

IL11-RA

.

Johtopäätökset /merkitys

ArrayCGH käyttäen longmer oligonukleotidigeenisirumenetelmää on mahdollista korkean resoluution analyysi chomosomal epätasapainoa. Luonnehdinta pieni saanut alue klo 9p13.3 eturauhassyövässä solulinjoissa ja ensisijainen eturauhassyöpänäytteissä fluoresenssilla

in situ

hybridisaatio- ja kvantitatiivinen PCR on paljastanut interleukiini 11-reseptorin alfa-geenin ehdokkaaksi kohteena monistuksessa vahvistus taajuus 75% eturauhasen karsinoomat. Usein monistaminen

IL11-RA

eturauhassyövässä on mahdollinen mekanismi

IL11-RA

yliekspressio tässä kasvaimen tyyppi.

Citation: Kamradt J, Jung V, Wahrheit K, Tolosi L, Rahnenfuehrer J, Schilling M, et al. (2007) havaitseminen Novel amplikonien eturauhassyövän Kattava Perimän profilointi Eturauhassyöpäsolulinjat käyttäminen Oligonukleotidiperustaisella ArrayCGH. PLoS ONE 2 (8): e769. doi: 10,1371 /journal.pone.0000769

Academic Editor: Stefan Maas, Lehigh University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 heinäkuu 2007; Hyväksytty: 18 heinäkuu 2007; Julkaistu: 22 elokuu 2007

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoittajat: Deutsche Forschungsgemeinschaft myöntää numero KA1793 /1-1, Bundesministerium für Bildung und Forschung, myöntää numero 01GR0453, BioSapiens Network of Excellence EU sopimuksen numero LSHG-CT-2003-503265

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

geneettisiä muutoksia, joiden uskotaan olevan avain tapahtumien kehittäminen eniten kasvainten, mukaan lukien eturauhassyöpä [1]. Kasvaimen eteneminen näyttää riippuvan peräkkäisten hankinnasta kromosomipoikkeavuuksien johtavat voittoja tai tappioita osan kasvainsolun genomiin. Luonnehdinta nämä genomista poikkeavuuksia eturauhasen syöpä voi siis auttaa ymmärtämään molekyylitason synnyssä ja voi paljastaa geneettisiä markkereita etenemisen.

Koska ensimmäisen kuvauksen mukaan Kallioniemi et al. (1992) [2] kromosomi vertaileva genominen hybridisaatio (cCGH) on tullut yleisimmin käytetty tekniikka havaitsemiseksi DNA kopioluvun muutoksia kasvaimen genomeja. Me ja muut ovat analysoitu genomin eturauhassyövän solulinjoissa ja ensisijainen eturauhassyöpänäytteissä tällä tekniikalla [3] – [5]. Fluoresenssi

in situ

DNA-hybridisaatiolla (FISH) ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR on osoitettu olevan arvokkaita työkaluja kohdegeenin löytö sisällä tunnistaa kromosomi alueilla vahvistuksen, esim.

TLOC1 /sec62

geenin 3q26.2 eturauhassyövässä [6]. Hakeminen kehittynyt bioinformatiikan mallit cCGH tulokset osoittivat, että kuviot kromosomipoikkeavuuksien sisältävät arvokasta prognostista tietoa kasvaimen [7].

Koska suhteellisen pieni spatiaalinen resoluutio (~20MB) sekä cCGH ja sen virheellisyys sentromeerisen kuin sekä telomeerisesti alueilla tämä tekniikka ei ole pystynyt riittävän hyvin havaita pieniä alueita voitot tai menettää eikä genomista muutoksia vieressä centromere tai telomere. Myös kohde-geenin tunnistamista saavuttanut alueilla saapuvat cCGH, hieno-kartoitus tekniikoita kuten FISH on työlästä ja aikaa vievää.

Verrattuna cCGH, microarray-pohjainen CGH, kutsutaan array CGH (aCGH ) tai matriisi CGH [8] – [9], on noin 1.000 kertaa suurempi resoluutio (tai jopa korkeampia) ja sallii kromosomaalisen alueiden lähellä sentromeerin ja telomere. Erilaiset lähestymistavat aCGH on noudatettu vuosien mittaan. Useat ryhmät hyödynnetään genomista BAC paneelit [10], kun taas toiset ovat valinneet cDNA- tai oligonukleotidisirujen jotka on alun perin suunniteltu ilmentymisen analyysi [9], [11]. Arrays suunniteltu geenien ilmentyminen ovat edullisia suoraa vertailua perimän muutoksiin ja geenien ilmentyminen samalla alustalla. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä lähestymistapa osoittaa merkittävää yhdistyksen välillä geenikopiomäärä ja ilmaisun taso [12], [13]. Viime aikoina käyttöön oligonukleotidisirujen erityisesti aCGH suunniteltu pidemmän on raportoitu [14], ja se on nyt kaupallisesti saatavilla aCGH alustalla. Sillä aCGH analyysit eturauhassyövän solulinjoissa sekä kliinisistä näytteistä joko BAC tai cDNA paneelit on käytetty [12], [13], [15] – [20].

Tässä esittelemme ensimmäistä tutkimusta käyttämällä 35000 ominaisuus 70-mer oligonukleotidi array, alun perin suunniteltu ilmentymisen analyysi, yksityiskohtaista genomin yhdeksän eturauhassyövän solulinjoissa. Tuloksena aCGH profiileja verrataan cCGH tuloksia. Esiintyminen äskettäin havaittu pieni amplikonin että pericentromeric 9p13.3 osakaistan erilaisissa solulinjoissa on vahvistanut FISH ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR ja vahvistetaan myös ensisijainen eturauhassyöpänäytteissä.

Materiaalit ja menetelmät

Kasvainsolulinjat ja DNA: n eristä-

ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa DU145, PC3, LNCaP, CWR22 ja CWR22-Rv1 saatiin American Type Cell Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) ja viljellään protokollien mukaisesti suosittelemaa ATCC. Vuodesta PC3 ja DU145, kaksi eri haarat olivat saatavilla, yksi pidettiin laboratoriossa Cancer Genetic Branch, NHGRI, NIH (PC3

NIH

, DU145

NIH

) , toinen urologinen laboratoriossa Homburg (PC3

HOM

, DU145

HOM

). PC3-N, PC-125-1L, ja DU145-MN1 perustettiin aikaisemmin kuvatulla [21], [22]. LNCaP-CN4-2 oli ystävällisesti Z. Culig, Department of Urology, Medical University, Innsbruck, Itävalta.

Ensisijainen eturauhassyöpänäytteissä

Quantitative geenikopiomäärä mittaukset tehtiin 20 ensisijainen eturauhasen adenokarsinooma näytteet, jotka on saatu sen jälkeen, kun eturauhasen aiemmin hoitamaton eturauhassyöpäpotilaalla. Sen jälkeen prostatektomia, näytteet leikeltiin jonka patologi, jäädytettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Vain näytteet, joissa 50% kasvainsoluja mukana tutkimuksessa.

DNA eristäminen ja määrittäminen

DNA eristettiin käyttäen QiAmp DNA eristäminen (Qiagen, Hilden, Saksa) ja tämän jälkeen kvantifioitiin fluorometrisellä määrityksellä (Quant-iT Pico Green dsDNA, Invitrogen, Karlsruhe, Saksa). Fluoresenssi mitattiin käyttämällä TECAN (Salzburg, Itävalta) SpectrafluorPLUS mikrolevyn fluoresenssi lukija viritysaallonpituudella 485 nm ja emissio aallonpituudella 535 nm. DNA-konsentraatiot laskettiin standardikäyrästä kaksijuosteisen kontrolli-DNA varustettu pakkaus, joka mitattiin kolmena kappaleena pitoisuuksina 30, 3, 0,3, ja 0,03 ng /ul (mitattuna fluorometrialla).

Koko genomin monistamisen ja puhdistus

tilavuus 2,5 ui pois 4 ng /ul laimennokset solulinjojen ja ohjaamaan DNA: ta käytettiin lähtöaineena vahvistusta. Phi29-monistus suoritettiin mukaisesti Repli-G kit valmistajan ohjeiden (Qiagen) käyttäen inkubointiaika 16 tuntia. Repli-G reaktiot tarkastaa reaaliaikaisesti sisäiseen

Alu

-PCR määrityksessä. Lisäksi DNA: n konsentraatio fluoro- kvantifioitiin Quant-iT Pico Green dsDNA Kit (Invitrogen) ja vaihteli välillä 10-30 ug.

Alu-PCR-määritys

Koska usein havaittu tausta synteesiä Repli-G monistettiin no-mallia ohjaus, suoritimme ylimääräisen laadunvalvonta 1 pl (1:50) puhdistamattoman phi29-monistettu DNA.

Alu

tietyllä taajuusalueella pitäisi olla läsnä kaikissa Repli-G monistetaan näytteitä ja poissa että Repli-G monistettiin no-mallia ohjaus. Kukin 2 ui näytettä verrattiin 1 ui sarjalaimennoksia uros kontrolli-DNA (Promega, WI, USA) (10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,01, 0,001 ng /ul). 25 ui reaktiot sisälsivät 1 x Hot start SYBR green master mix (Qiagen), 1,5 mM MgCl

2, 0,2 mM dNTP Mix, 400 nM alukkeita kutakin (

Alu

-forw: 5′-GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT- 3 ’ja

Alu

-rev: 5′-ATTCAAAGGGTATCTGGGC TCTGG-3′). Pyöräily-olosuhteet olivat seuraavat: 1 min 94 ° C: ssa; 35 sykliä 20 s 94 ° C: ssa, 20 s 55 ° C: ssa ja 20 s 72 ° C: ssa; 10 min 72 ° C: ssa. Monistustuotteet tarkastettiin sulamiskäyräanalyysillä käyttäen LightCycler ™ kvantifiointitietokoneohjelmaa 3,5 (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) ja geelielektroforeesilla. Monistaminen pidettiin onnistuneena, kun määrä ihmisen

Alu

sekvenssien phi29 luotu DNA-fragmentit vaihteli 10-30%, ja kun preparaatti DNA-fragmentteja, jotka vaihtelevat 1-20 kb, oli nähtävissä geelielektroforeesilla.

ArrayCGH

10 ug monistettua ja puhdistettua DNA leimattiin käyttämällä BioPrime Array CGH genominen Labeling kit (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden tilavuudessa 50 ui modifioitua dNTP sisälsi 120 uM kutakin dATP, dGTP ja dCTP; 60 uM dTTP: tä; ja 60 uM Cy5-dUTP tai Cy3-dUTP. Leimatun DNA puhdistettiin käyttäen QIAquick Gel Extraction pylväät (Qiagen). Kasvain ja viite DNA yhdistettiin, sekoitettiin 50 ug Cot-1 DNA: ta (Invitrogen), ja konsentroitiin tilavuuteen 20 ui vakuumisentrifugissa. DNA sekoitettiin sitten yhtä suuren määrän kanssa 2 x formamidia puskuria, denaturoitiin 95 ° C: ssa 5 min ja esi-inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 min vesihauteessa.

Hybridisaatiot suoritettiin mukautetun (tulostaa NHGRI /NIH Microarray Core Facility) lasiliuskat sisältävä operonin 70mer oligonukleotidiyhdistelmä versio 3 34,580 oligonukleotidien. Oligonukleotidit suunniteltiin alunperin ilmentymisen analyysi. Sillä arrayCGH kaikki oligonukleotidit järjestyksessä kohdistettu vasten ihmisen genomin (build 34), Ensembl, RefSeq, dbEST ja UCSC tunnettuja geenejä johtaen 29,383 oligonukleotidien tietyn kromosomaalisen kartoituksen.

DNA-näytteet hybridisoitiin kiinni matriisia 16 -18 tuntia 42 ° C: ssa hyödyntämällä MAUI 4-bay hybridisaatiosysteemiä ja MAUISSA Mixer A0 (BioMicro System, Salt Lake City, UT, USA). Hybridisaation jälkeen taulukot ja MAUISSA Mixer purettiin 42 ° C 1 x SSC ja 0,05% SDS: ää (Pesuliuos 1) ja pestiin sen jälkeen kaksi kertaa pesuliuoksessa 1 5 minuuttia, mitä seurasi kaksi pesua 0,1 x SSC: tä (pesuliuos 2) ja 5 minuuttia. Kuivatut array dioja skannattiin käyttäen ScanLite Express mikrosirulla skanneri (Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA). Raw kuvatiedostot taulukoiden käsiteltiin käyttäen DeArray ohjelmistojen [23] ja tuloksena kuvadatan tuotiin R ympäristössä Bioconductor paketteja [24] tarkempaa analysointia.

Tietojenkäsittely ja tilastollinen analyysi microarray tietojen

tilastollinen analyysi tunnistaa kromosomialueita muuttuneeseen kopiomäärän yhden paneelit koostui kahdesta vaiheesta. Ensinnäkin, kun kartoitetaan mitattu geenikopiomäärä log-suhdeluvut niiden kromosomi paikoissa, tasoitus sovellettiin. Mukautuva painot tasoitus-pohjainen algoritmi GLAD [25] tunnistamiseksi alueille vakio kopioluvun käytettiin. Tämä algoritmi sopii paloittain jatkuva funktio pitkin kromosomi log-suhde. Sitten kunkin näytteen osalta alueita, jotka ovat monistetaan tai poistetaan tunnistettu. Täällä normaalijakaumat asennettiin tukevassa tavalla tasoitetun log-suhde kunkin array. Erityisesti, mediaani ja kvartiilivälin pituus laskettiin, ja normaalijakauma on asennettu nämä parametrit. Lopuksi vakioalueet joiden arvot yli tai alle määritellyn cutoffs havaittiin niin saanut tai menettänyt alueita, vastaavasti. Jotta syrjiä heikkoja ja vahvoja signaaleja, mediaani plus tai miinus yksi tai kaksi standardipoikkeamaa valittiin cutoffs heikoille ja vahva poikkeavuuksia, vastaavasti. Algoritmit toteutettiin R ohjelmointikielellä (www.r-project.org). Tulokset saatiin käyttämällä R-versiossa 2.3 ja GLAD kirjaston tarjoamia Bioconductor hanke (www.bioconductor.org), versio 1.7.

Kromosomi CGH

Hybridisaatio suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu vähäisin muutokset [26]. 500 ng biotiinilla leimattu koetin-DNA, 500 ng digoksigeniinillä leimattua viite DNA: ta (ihmisen uros viite DNA, Promega, WI, USA) ja 50 ug ihmisen leimaamatonta cot-DNA: ta (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa) saostettiin 0,3 M natriumasetaatilla, että 2,5 kertainen tilavuus etanolia ja liuotettiin 2,5 ui deionisoitua formamidia. 30 minuutin jälkeen, 2,5 ui kaksinkertaisen hybridisaatioseosta (100 mM natriumfosfaattipuskuria, 4 x SSC: ssä ja 20% dekstraani sulfaattia, pH 7,0) lisättiin ja denaturoidaan 5 minuutin ajan 75 ° C: ssa, jota seurasi 15 min preannealing 37 ° C. Hybridisaatio suoritettiin sinetöidyssä peitinlaseilla ja 3 päivää 37 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Hybridisaation jälkeen kalvot pestiin kolme kertaa 5 min pesuliuosta (50% formamidia 2 x SSC, pH 7,0) 45 ° C: ssa, kahdesti 2 x SSC: ssä (pH 7,0) 45 ° C: ssa, ja kerran 0,1 x SSC: tä (pH 7,0) 45 ° C: ssa.

biotinyloitua koetinta DNA havaittiin FITC-leimatulla streptavidiinilla (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Digoxigenized kontrolli-DNA havaittiin rodamiini leimatun anti-digoksigeniini-vasta-aineita (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa). Lopuksi objektilasit vastavärjättiin, ja mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää liuosta levitetään samassa vaiheessa (Vectashield DAPI, Vector Laboratories).

Objektilasit analysoitiin käyttämällä digitaalista kuva-analyysi-järjestelmän (MetaSystems, Altlußheim, Saksa), joka perustuu Olympus AX 70 mikroskooppi varustettu jäähdytetyllä CCD-kameralla (Photometrics, Tucson, AZ, USA). Analysointiin ero fluoresenssituloksista käytimme MetaSystems ISIS 3 -ohjelmiston. Kolmen värikuvia kanssa punainen, vihreä ja sininen hankittiin 15-20 metafaasien. Kromosomi epätasapaino havaittiin perusteella fluoresenssin suhde profiilin, joka poikkeaa tasapainoarvon (FITC: rodamiini = 1). Kunkin kromosomin lopullinen suhde arvot valmistettiin keskiarvoista vähintään kymmenen kromosomissa homologit erillinen metafaasissa levitteet. CGH tulokset esitettiin graafisesti sarjan vihreästä punaiseksi suhde profiileja, ja tulosten tulkinta seurasi aiemmin kuvattu protokollien [3].

Fluoresenssi in situ

FISH suoritettiin ydinten ja metafaasissa levitteet solulinjat CWR22 ja CWR22-Rv1. Metafaasissa levitteet lymfosyyttien terveestä luovuttajasta, käytettiin kontrollina. BAC klooni RP11-165H19 (9p13.3, GenBank AQ382511) saatiin BacPac Resource Center lastensairaalassa (Oakland Research Institute, Oakland, CA, USA) ja cohybridized kanssa spesifistä koetinta centromere kromosomin 9 (D9Z1; Oncor, Gaithersburg, MD, USA). Bakteeriviljelmät ja DNA eristys tehtiin mukaisesti BacPac Miniprep protokolla (https://www.biologia.uniba.it/rmc).

Alu

-PCR tuotteita BAC käytettiin koettimina ja biotinyloitiin käyttäen nick-translaatio. Dual väri fluoresenssi

in situ

hybridisaatio- ja havaitseminen fluoresenssisignaalien tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [6].

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR geenikopiomäärä mittaus perustui äskettäin kuvattua lähestymistapaa [27]. Tässä tutkimuksessa käytimme ennalta suunnitelluista validoitu SNP (Applied Biosystems, CA, USA) kanssa AB 7900 järjestelmä (Applied Biosystems). Sillä validointi 9p13.3 amplikonin kaksi geeniä sisällä amplikonin (IL-11RA, AssayID: C__11340987_10 ja DCTN3, AssayID: C__25472566_10) ja geenin at 3p24.2 sijaitsee ei muuttunut alue eturauhassyövässä (TOP2B, AssayID : C__8063527_10) analysoitiin.

ensimmäisessä vaiheessa, kaikki SNP tässä tutkimuksessa käytetyt ajettiin laimennussarja veren normaalin DNA: n määrittämiseksi PCR-tehokkuus (E) kutakin aluketta asettaa kaavalla E = 10

-1 /s, jossa s edustaa absoluuttinen arvo kulmakerroin tontti kynnyssykli (C

T) vastaan ​​log panos määrästä. Kaikki alukkeet osoitettu olevan yhtä hyötysuhde on noin E = 2 ja suhteellinen tehokkuus tontteja vertaamalla eri alukkeita (log panos määrä

vs.

ACk

T) absoluuttinen arvo kulmakerroin oli vähemmän kuin 0,1. Suhteellinen geenikopiomäärä laskettiin sitten seuraavan equitation: 2

-ΔΔCT (User ilmoitustaulu # 2, Applied Biosystems). Kalibrointia normaali veren DNA lisättiin kuhunkin PCR aikavälillä. Geenejä, joilla on molemmat alleelit havaita määrityksessä C

T arvo vähennettiin 1 perustuu osoittaneet tehokkuutta 2. Sen määrittämiseksi, saatujen tulosten reaaliaikaisen PCR analyysi eturauhassyöpänäytteissä olivat merkittävästi erilaisia ​​kuin saadut näytteitä terveiltä yksilöiltä, ​​päätimme toleranssin välein (TI) suhteellista geenin kopion numeroita käyttäen keskihajonta (SD) on C

T arvot kohde- ja viite geenien 8 terveillä henkilöillä yhtälöllä: TI = 2 ± (SDΔC

T x 2). TI vaihteli 1,62-3,17 varten

DCTN3

ja 1,77-2,94 varten

IL11-RA

.

Tulokset

Vähäinen toistuvia alueilla muutoksia

Koska niiden erittäin muuttunut genomit ja suuria tietomääriä tuottaman array analyysejä, yksinkertainen silmämääräisesti muuttuneen loci osoittautunut tehottomaksi tunnistaa minimaalinen toistuvat alueet poikkeama. Tietojen analysoimiseksi asetettu, yhdistimme automaattinen poikkeaman tunnistus modifioidun taajuus juoni menettelyä. Soveltaminen painotettu taajuuden analyysin autosomeiksi eturauhassyövän solulinjoissa paljasti useiden alueiden, useiden erittäin toistuvia muutoksia. Verrattuna meidän cCGH analysoi useita pieniä monistukset ja poisto yksiköt vain havaita aCGH erityisesti pericentromeric alueilla ja alueilla lähellä telomeres (Fig. 1). Koko pienimmän alueiden poikkeavuus voitaisiin määrittää 110 kb tappiot 19q13.41 solulinjoissa DU145

NIH

, DU145-MN1, PC3 125-1L ja CWR22-Rv1, ja 760 kb lisäämisessä 14q32.11-q32.12 PC3

HOM

, PC3-N ja PC3-125-1L. Useimmat kromosomimuutokset havaittuna cCGH nähtiin myös aCGH. Kuitenkin enemmän tappioita ei havaittu mikrosiruja ja enemmän suuria alueita voittoja kanssa metafaasissa tekniikalla. Sillä yleisesti havaittu alueilla poikkeamia, ei välinen ristiriita kahden menetelmän määrittämällä voittoja ja tappioita yksittäisiin alueelle havaittiin (taulukko 1).

pieni alue voitto 9p lähellä sentromeerisekvenssin (B, nuolenkärki) ja pieni poiston 14 q (D, nuolenkärki) vain havaitsee arrayCGH.

Sytogeneettiset perustuslain eri alojen eturauhassyövän solulinjoissa ja emosolulinjassa vs. alalinjan vertailun

aCGH tulokset kantasolulinjoista PC3

HOM

, DU145

HOM

, LNCaP ja CWR22 ja niiden alilinjat esitetty yhteenvetona kuvassa 2. PC3 ja DU145, kaksi eri alojen voisi verrata (

HOM vs. NIH

). Useimmat Hämmästyttävää, sytogeneettinen perustuslaki PC3

HOM

poikkesi huomattavasti PC3

NIH

. Kaikkiaan 54 poikkeavuuksien molemmissa solulinjoissa, vain kuusi vahva poikkeavuuksia löytynyt yhteistä: tappiot 1Q, 8p, 10p ja 13 ja voitot klo 10q ja 17Q. Vahvistus 8q11.2-8q24.3 PC3

HOM

havaittiin myös PC3

NIH

osoittaa minimikoko muunnelma 100 kb. Sillä DU145

HOM

ja DU145

NIH

, hyvän yleiskuvan konkordanssin geneettisen koostumuksen havaittiin.

Numerot edellä juoni osoittavat kromosomi numeroita ja pystysuorat viivat väliset rajat kromosomeja.

Vertaamalla solulinjoissa PC3

HOM

, DU145

HOM

, LNCaP ja CWR22 niiden johdettujen alilinjat PC3 N, PC3-125-1L, DU145-N, LNCaP-CN4-2 ja CWR22-Rv1 vastaavasti korkea yhdenmukaista ja sytogeneettisten poikkeavuuksien välisen vastaavan solulinjojen tuottamia aCGH. On syytä mainita, että lisäksi pienten muutosten lukumäärän ylimääräisiä alueita, joilla voittoja tai tappioita geneettistä materiaalia eroista vanhempien solulinjojen ja alilinjat pääasiassa kyseessä laajuudesta vastaavia alueita, joilla kopioluku muutoksia, kuten esimerkiksi havaittiin alueille voitot at 12q ja 15q PC3

HOM vs.

PC3-N sekä alueilla, joilla tappiot 2Q, 4q 6Q ja 13q21.33 LNCaP

vs

. LNCaP-CN4-2.

validointi monistetun pericentromeric alueen 9p13.3 käyttämällä FISH-analyysillä ja määrällinen reaaliaikainen PCR

A novel 1,7 Mb alueen kopioluku voitot johdonmukaisesti tunnustettu solussa linjat CWR22 ja CWR22-Rv1 ja kartoitettiin sen pericentromeric 9p13.3 osakaistan. Esiintyminen amplikonin solulinjoissa CWR22 ja CWR22-Rv1 vahvistettiin metafaasissa FISH käyttäen BAC-klooni (RP11-165H19) päässä monistettu alue ja spesifistä koetinta sentromeerin kromosomin 9 (Fig. 3A ja B). Optimaalinen signaali ja puute ristihybridisaation varmistettiin normaalia metafaasivaiheeseen levitteet (Fig. 3C). Tämä BAC klooni sisälsi kaksi geeniä,

IL-11RA

ja

DCTN3

, jotka oli jo ajateltu olevan merkitystä eturauhassyövässä kasvua [13].

tunnistetiedot lisääntynyt kopioita signaalien BAC-kloonin RP11-165H19 kartoitettu 9p13.3 amplikonin solulinjassa CWR22 ja CWR22-Rv1 (A ja B). C Optimaalinen signaali ja puute ristihybridisaation varmistettiin normaali metafaasissa levitteet osoittaa kahta signaalia kunkin koetin. BAC-kloonin RP11-165H19 näyttävät vihreää; punainen signaalit osoittavat kromosomissa 9 sentromeeriantigeenin (D9Z1).

Perustuu geenin lokalisointi ja selityksin geenien toiminnan, valitsimme nämä kaksi kandidaattigeenit geenikopiomäärä mittaukset eturauhassyövän solulinjoissa ja 20 ensisijainen prostatakarsinoomassa näytteitä kvantitatiivista reaaliaikaista PCR.

IL-11RA

osoitti merkittävää kasvua geenikopiomäärä tavallista suurempia CWR22 ja CWR22-Rv1 ja 15: ssä 20 (75%) ensisijainen eturauhassyöpä kasvain näytteissä (kuvio. 4). Sillä

DCTN3

, ei kopio vahvistuksenkertojan havaittu missään solulinjassa ja vain 2 ulos 20 (10%) eturauhassyöpä kasvain näytteitä. Ohjaus-geenin

TOP2B

on 3p24.2 osoittautui muuttumattomana verrattuna normaaliin verta (tuloksia ei ole esitetty).

IL-11RA

osoitti merkittävää kasvua geenin kopioluvun tavallista suurempia CWR22, CWR22-Rv1, DU145

HOM

ja DU145-MN1 ja 15 ulos 20 (75%) eturauhassyöpänäytteissä. Sillä

DCTN3

, ei kopio vahvistuksenkertojan havaittu missään solulinjassa ja vain 2 ulos 20 (10%) eturauhassyöpänäytteissä. Arvot yllä katkaista linjan ollessa määrätty lisääntynyt geenikopiomäärä verrattuna normaaliin.

Keskustelu

Vaikka eturauhassyövän solulinjoissa on aiemmin analysoitu aCGH hyödyntämällä cDNA microarray alustoille [12] , [13], [15] – [20], osoitamme tässä tutkimuksessa, onko mahdollista toteuttaa longmer oligonukleotidiyhdistelmän, alunperin suunniteltu ilmentymisen analyysi, korkean resoluution genomista profilointi yhdeksän eturauhassyövän solulinjoissa. Microarray Tämän tutkimuksen aineisto on jätetty NCBI GEO liittymiseen GSE7376. Verrattuna cCGH, havaitsimme enemmän poistot ja pienten alueiden voittojen kanssa aCGH etenkin pericentromeric alueilla ja alueilla lähellä telomeres, jossa cCGH tiedetään olla antamatta luotettavaa informaatiota DNA epätasapainoa. Toisaalta, suuria alueita voitot paljastui cCGH kattaa lähes koko käsivarren kromosomien oli huomaamatta aCGH. Samanlaisia ​​havaintoja tehtiin myös raportoineet Saramäki et al. (2006) [13], käyttämällä cDNA-pohjainen aCGH. Sen lisäksi normalisointi esineitä voidaan katsoa, ​​että nämä erot voivat johtua DNA vahvistus askel aCGH tutkimuksessamme, kun taas ei-monistettu DNA käytettiin cCGH. Vaikka koko genomin monistamisen phi29 polymeraasi voi lisätä jonkin verran vaikutusta ja lisätä taustamelun, sitä pidetään kaikkein puolueeton lähestymistapa verrattuna PCR-pohjainen DNA monistusmenettelyjä [28]. Kuten mikä tahansa DNA monistusvaiheena näyttää väistämättömältä tutkimuksessa ensisijainen eturauhassyöpänäytteissä, käytimme vahvistus vaihe tutkimuksessamme vaikka DNA määrä ei ollut rajoittava tekijä työskenneltäessä solulinjoilla.

aCGH havainnot ovat hyvä kanssa ilmoitettujen tietojen kirjallisuudessa PC3, DU145, LNCaP ja CWR22 [12], [13], [15] – [20]. Kuitenkin mielenkiintoinen sivuaspektina Tutkimuksemme on havainto merkitty sytogeneettisen ero kahden PC3 oksat, jotka pidettiin kahdessa eri Labs (PC3

HOM vs.

PC3

NIH

). Oletettu genomin epästabiilisuuden solulinjoista voi johtaa geneettisen eroavuus, mitä on pidettävä verrattaessa havaintoja eri Labs näennäisesti samalla solulinjat. Laadunhallintajärjestelmällä, joka sisältää tietoja geneettisen koostumuksen erikseen käytettyjen solulinjojen, näyttää harkittu.

Mitä vertailun vanhempien solulinjojen ja alilinjat, ei brutto eroja sytogeneettistä koostumuksessa löytyivät aCGH. Erot pääasiassa koski rajoja vastaavia alueita, joilla kopioluku muutoksia. Nämä havainnot ovat päinvastoin kuin edellisessä cCGH tutkimukset osoittavat useita ylimääräisiä alueita DNA kopioluvun muutoksia siinä alilinjat verrattuna kantasolulinjoista [4]. Selitys voisi olla tekninen, kuten aiemmin raportoitu eroja pääasiassa mukana suuri kromosomialueita, jotka havaitaan pienemmällä herkkyyttä aCGH verrattuna cCGH, kuten edellä.

Koska validointi korkean resoluution aCGH me analysoitiin edelleen pieni vahvistus yksikkö 1,7 Mt vuonna pericentromeric alueella kromosomissa 9 at 9p13.3, joka löydettiin ksenograftissa solulinjat CWR22 ja CWR22-Rv1 by aCGH mutta ei cCGH. Mielenkiintoista on, Saramäki et ai. (2006) [13], on myös havaittu tällä alueella, jonka aCGH voidaan monistettiin eturauhassyöpäksenograftista LuCaP35. He vahvistivat tulokset BAC-FISH ja osoittivat vahvistusta ja yli-ilmentyminen ubikitiinipromoottori-konjugointientsyymiä geeni E2R2 (

UBE2R2

), The dynactin 3-geenin (

DCTN3

) ja WD toista verkkotunnuksen 40A geeni (

WDR40A

) klo 9p13.3. Käyttäen reaaliaikaista PCR-tekniikkaa, olemme edelleen määrällisesti kopioluku interleukiini 11-reseptorin alfa-geenin (

IL-11RA

) ja dynactin 3-geenin (

DCTN3

) sekä paljastaa korkein log2 suhde aCGH sisällä 9p13.3.

IL-11RA

löydettiin korkein kopioluku voitto CWR22, CWR22-Rv1, DU145

HOM

ja DU145MN1 viittaa

IL-11RA

kuin otaksuttu kohdistaa geeni tämän amplikonin. Olemme näin ollen seulotaan 20 ensisijainen eturauhassyöpänäytteissä ja todettu 75% kasvaimista kätkeminen

IL-11RA

kopioluvun vahvistuksen yksin, yksikään

DCTN3

yksin, ja 10% sekä geenien . Mean kopioluku vahvistus

IL-11RA

oli noin 4-kertainen. Nämä tiedot korostavat alkuperäistä oletukseen, että

IL-11RA

edustaa vahvistus kohde sijaan

DCTN3

. Tätä olettamusta vahvistavat edelleen immunohistokemiallisella tutkimuksissa [29], [30] ja syöpä profilointi tietokannan Oncomine ™ (www.oncomine.org) jotka molemmat paljastavat suuren yliekspressio

IL-11RA

eturauhassyövässä verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta.

IL-11RA

koodaa spesifinen reseptori IL-11 ja kuuluu perheeseen gp130-riippuvaisten sytokiinireseptorit, joka sisältää reseptorit IL-6, leukemiaa estävä tekijä, siliaarinen neurotrofinen tekijä, onkostatiini M, ja kardiotrofiini [31]. Tärkeä merkinantojärjestelmä aktivoidaan

IL-11RA

ja muiden tämän reseptorin perhe on Janus-kinaasi-signaali anturin ja aktivaattori transkription (Jak-STAT) polkuun STST3 ottaa hyvin tutkittu merkitys eturauhasen syövän synnyn [ ,,,0],32]. Lisäksi aktivoitu STST3 uskotaan olevan keskeinen rooli androgeenireseptorin aktivaation puuttuessa androgeenien, yksi selitys hormoniresistentti kasvun eturauhassyövän [33]. Olipa

IL-11RA

on kausaalinen eturauhasen syövän kasvua on tutkittava jatkotutkimuksissa.