Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Erzin on jäsenenä esriinin, radixin, ja moesiini perhe, joka tarjoaa toimivan yhteys solukalvon ja aivokuoren aktiinisytoskeletonin. Välinen korrelaatio esriinin yli-ilmentymisen ja aggressiivinen syöpä käyttäytyminen on hiljattain raportoitu eri kasvaintyypeissä. Kuitenkin sen roolit mekanismeista etenemistä kielen okasolusyöpä (SCC) ovat epäselviä.

Menetelmä

Käytimme ihmisen kielen SCC ja noncancerous kudossiruina jotta immunohistokemiallisesti analysoida esriinin ekspressiotason ja sen suhde lisääntymisaktiivisuus. Ihmisen kielen SCC solulinjaa HSC-3 käytettiin määrittämään vaikutuksia esriinin RNA-häirintää (RNAi) syöpäsoluihin aikana MTT; haavan paranemista ja invaasio määritykset; immunofluoresenssimenetelmällä aktiinisytoskeletonin; ja western blottaus E-kadheriinin, N-kadheriinin, β-kateniinin, sekä aktiivinen ja koko RhoA /Rac1 /Cdc42.

Tulokset

Erzin yliekspressoitui vuonna 46,4%: n kasvaimia tarkastellut ihmisen kielen SCC kudossiruina. Erzin ilmentyminen korreloi Ki-67-indeksi. Erzin ehtyminen RNAi vuonna HSC-3-solujen vähensi solujen lisääntymisen, migraation ja invasiivisuus ja häirinnyt aktiini uudelleenjärjestely aikana podia muodostumista. Sen vaikutukset RhoA /Rac1 /Cdc42 ilmaisua eivät olleet merkittäviä, kun se parantaa E-kadheriinin ja β-kateniinin ilmaisun ja väheni N-kadheriiniekspressiota.

Johtopäätökset

Erzin usein yli-ilmennetään ensisijainen kielen SCC ja voi olla tärkeä rooli niiden kasvua, muuttoliike, ja invasiivisuus mahdollisesti kautta suhdettaan E-kadheriinin /β-kateniinin monimutkainen ja kadheriinin kytkin. Näin ollen, esriinin voisi olla terapeuttinen tavoite kielen SCC.

Citation: Saito S, Yamamoto H, Mukaisho K-i, Sato S, Higo T, Hattori T, et ai. (2013) mekanismeista syövän etenemisessä aiheuttamat Erzin yliekspressio Tongue Okasolusyöpä. PLoS ONE 8 (1): e54881. doi: 10,1371 /journal.pone.0054881

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 syyskuu 2012; Hyväksytty: 17 joulukuu 2012; Julkaistu: 24 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Saito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on tällä hetkellä seitsemänneksi yleisin syöpä, jossa 260.000 uutta tapausta diagnosoidaan vuosittain noin 128.000 vuosittaisen kuolemantapausta maailmanlaajuisesti [1], [2]. Kieli on yksi yleisimmistä sivustoja alkuperän HNSCC Japanissa [3]. Neck imusolmuke etäpesäke on yksi kriittisimmistä tekijöitä selviytymisen ja tarjoaa hyvän opas hoitostrategioita [4] – [8]. Kuitenkin elämänlaatua ja viiden vuoden pysyvyys ovat vähän kehittyneitä kielen syöpiin jopa nykyisen multimodaalisen hoito ja kirurginen mukana kemoterapiaa ja sädehoitoa. Parantaa tuloksia kehittyneiden kielen syöpiä, meidän on kehitettävä uusia kohdennettuja hoitomuotojen perustuu ymmärrystä molekyylitason mekanismeja taustalla aggressiivista käyttäytymistä kielen syöpiä.

Erzin alun perin eristettiin cytoskeletal osa suoliston suolinukan, ja tiedetään olevan substraatti tyrosiinikinaasin [9]. Erzin on jäsen esriinin, radixin, ja moesiini proteiinin perheen, joka yhdistää F-aktiini solukalvoon proteiinien fosforylaation jälkeen [10] – [13]. Tämä linkkeri toiminto viittaa siihen, että esriinin on monille olennainen solun prosessit, mukaan lukien solun määrityksen muoto, polaarisuus, pintarakenne, soluadheesio, liikkuvuuteen, sytokineesi, fagosytoosia ja integroinnin kalvon kuljetuksen kautta signalointireittejä [14] – [17] . Nämä toiminnalliset näkökohdat esriinin odotetaan edistävän kasvaimen etenemistä. Todellakin, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että esriinin voi olla tärkeä rooli kasvainten synnyssä, kehittämiseen, invaasio, ja etäpesäkkeiden, luultavasti säätelemällä adheesiomolekyylien, osallistuminen solusignaalitransduktion, ja signalointi muihin solukalvon kanavia kasvain [18] – [22]. Erzin on välttämätön tekijä kasvainsolujen etäpesäkkeitä luusarkoomista [23], rintasyövän [24], nenänielun karsinoomat [25], ja eturauhasen syöpä [26]. Erzin ilme on myös yhdistetty huono hengissä useita syöpiä, kuten rinta- [21], [27], kohdun limakalvo [28], ja munasarja [29]; iho- ja uveal melanoomat [30]; ja pehmytkudossarkoomien [31], [32]. Kuitenkin sen roolit suusyöpä ovat epäselviä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selkiyttää esriinin in kielen SCC etenemisen kanssa esriinin RNA-interferenssi (RNAi) solulinjassa peräisin kielen SCC. Käytimme ensisijainen kieli SCC esiintymistiheyden määrittämiseksi esriinin yli-ilmentymisen ja korrelaatiot esriinin ilmaisun kanssa Ki-67-indeksi ja apoptoottisten indeksi, joka heijastaa maksut solujen lisääntymisen ja soluhävikkiä vastaavasti kasvaimen kasvua ja aggressiivisuus. Tuloksemme viittaavat siihen, että esriinin voi soveltua kohdennettuja geeniterapiaan kielen SCC.

Materiaalit ja menetelmät

immunohistokemiallinen värjäys esriinin ja histologinen tutkimus

normaali ja kasvain kielen kudos mikrosiruja ihmisten tässä tutkimuksessa käytetyt saatiin US Biomax Company (MD, USA). Niistä 79 näytettä, 10 olivat normaalit kielen kudosten ja 69 olivat kielen SCC kudoksiin. Yhdysvaltain Biomax- Company saatua kudosta resursseja kudospankkeihin jotka taata, että kaikki ihmisen kudosta kokoelmat tehtiin sertifioitu sairaaloissa mukaan korkeimpia eettisiä normeja. Kaikki ihmisen kudokset kerättiin myös protokollien mukaisesti, jotka noudattanut sairausvakuutuslain siirrettävyyden ja Accountability Act (HIPPA). He sertifioitu, että kaikki kudospankkeihin jotka tarjotaan ihmisen kudosta voimavaroja täyttivät seuraavat vaatimukset Human materiaalin siirto sopimuksen: luovuttajan henkilöllisyys oli anonymisoituja ja kaikki kudokset ja tiedot leimattiin käyttäen ID-koodi henkilöllisyyden suojaamiseksi kudoksen luovuttajia. Tietoon perustuva suostumus pidettiin kudospankeissa ja ei tarjota Yhdysvaltojen Biomax Company, minkä vuoksi se suojaa luovuttajan yksityisyyttä.

immunohistokemiallinen värjäys ihmisen kielen SCC kudossiruina suoritettiin käyttäen anti-esriinin kani-vasta-ainetta (# 3145; Cell Signaling, MA, USA) ja hiiren monoklonaalinen anti-Ki-67-vasta-ainetta (klooni: MIB-1, Dako, Glostrup, Tanska). Värjäys suoritettiin käyttäen Discovery XT Automated IHC stainer kanssa Ventana DABMap Detection Kit (nro 760-124; Ventana Medical System, AZ, USA). Jokainen vaihe Ventana DABMap Detection Kit menettely optimoitiin Discovery XT väline, ja olosuhteet olivat valmiiksi. Antigeeni haku päässä kudosleikkeiden suoritettiin käyttäen lämpöä.

värjäytymisen intensiteetti ihmisen kielen SCC kudos luokiteltiin seuraavasti: 0, negatiivinen; 1+, heikko; 2+, kohtalainen; ja 3+, voimakas. Tämän arvion käytti seuraavia perusteita: 1+ osoitti intensiteetti samanlainen kuin normaalissa kielen kudos; 3+ osoitti voimakasta värjäytymistä kalvon ja sytoplasmaan; 2+ ilmoitti intensiteetin välillä 1+ ja 3+. Me kahtia luokat aikana tilastollista analyysiä. Siten heikko-kohtalainen värjäytymisen intensiteetti osoitti alhainen esriinin ilmaisu, kun taas voimakas värjäytyminen intensiteetti osoitti korkean esriinin ilme.

Ki-67 ilmoitetaan yleensä solun tumassa. Ki-67-indeksi (eli määrä Ki-67-positiivisia kasvainsoluja jaettuna määrä tuumorisolujen x 100%) määritettiin laskemalla kasvainsolujen kolme sattumanvaraisesti valittua suuren tehon kenttää (x 400 ).

apoptoottinen indeksi mitattiin käyttämällä in situ Apoptosis Detection Kit (Takara Bio, Otsu, Japani). Värjäytyminen menettelyissä valmistajan ohjeiden. Jälkeen rutiini deparaffinization, kudos hajotettiin ProteinaseK (20 ug /ml PBS: ssä) 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin PBS: llä. Sitten aluslaseja inkuboitiin 3% vetyperoksidia 5 min ja pestään PBS: llä. TdT entsyymin ja substraatin pipetoitiin osat, joita inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 90 min. Pesun jälkeen anti-FITC-HRP-konjugaattia lisättiin kalvot 30 min. Objektilasit pestiin, värjättiin diaminobenzine (Nichirei, Tokio, Japani), ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Apoptoottista indeksiä (positiivisten kasvainsolujen jaettuna tuumorisolujen lukumäärän x 100%) määritettiin laskemalla kasvainsolujen kolme sattumanvaraisesti valittua suuren tehon kenttää (x 400). Korrelaatiot esriinin ilmaisu, Ki-67, ja apoptoottisen indeksi arvioitiin myös ihmisen kielen SCC kudoksiin.

Soluviljely

Kielen SCC solulinja HSC-3 ostettiin JCRB Cell Bank ja ylläpidetään Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM; Nacalai Tesque, Kioto, Japani), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% antibioottista-antimykoottista liuosta (Invitrogen, CA, USA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, täydennetty 5% CO

2.

sirna (siRNA) B

Erzin siRNA (5′-GAUUUCCUACCUGGCUGAAGCUGGA-3 ’) ja nonsilencing ohjaus (NSC) siRNA ostettiin Invitrogen . Solut transfektoitiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX reagenssia (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Esriinin siRNA-transfektoiduissa HSC-3-solut (esriinin-siRNA) ja NSC-transfektoidut HSC-3-solut (NSC) käytettiin kaikissa

in vitro

kokeita.

Quantitative käänteistranskriptio polymeraasin toi- ketjureaktio (qRT-PCR) B

qRT-PCR, kokonais-RNA eristettiin solulinjoista käyttämällä RNeasy (Qiagen, Tokio, Japani), ja cDNA syntetisoitiin 2 ug kokonais-RNA. cDNA altistettiin PCR (LightCycler480, Roche, Tokio, Japani) käyttämällä alukkeita ja SYBR Esiseos Ex Taq II (Takara Bio). Kaikki PCR-alukkeet ostettiin Takara Bio ja niiden sekvenssit on esitetty taulukossa 1. PCR suoritettiin käyttäen seuraavia olosuhteita: denaturointi 95 ° C: ssa 30 s, mitä seurasi 40 PCR-sykliä 95 ° C: ssa 5 s, pariutuminen 60 ° C: ssa 20 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 10 s. MRNA: n ekspressiotasot normalisoitiin mRNA: ta vastaan ​​ekspressiotasot sisäisen standardin geenin glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH).

Western blotting

Konfluentteja solut hajotettiin hajotuspuskuriin (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM natriumkloridia, 0,5 mM EDTA: ta, 0,09 yksikköä /ml aprotiniinia, 1 ug /ml pepstatiinia, 10 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 1 ug /ml leupeptiiniä). Proteiini lysaatit (20 ug per kaista) havaitaan BCA-proteiinimäärityksellä erotettiin käyttäen 4% -12% SDS-PAGE-gradienttigeelissä (NuPAGE, Invitrogen) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Invitrogen). Membraanit blokattiin 4% rasvatonta maitojauhetta TBS-T: n (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 g /l natriumkloridia ja 0,1% Tween 20) ennen inkuboidaan primaarisilla vasta-aineilla.

Anti esriinin kani-vasta-ainetta (# 3145) ostettiin Cell Signaling Technology. Anti-β-aktiini-hiiren monoklonaalinen vasta-aine (sc-47778) ja anti-N-kadheriinin hiiren vasta-aineen (sc-7939) ostettiin Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Anti-E-kadheriinin hiiren vasta-aineen (klooni 36) ja anti-β-kateniinin hiiren vasta-aineen (klooni 14) hankittiin Becton Dickinson and Company (BD, NJ, USA). Vuohi peroksidaasiin konjugoitua anti-kani-IgG: llä (# L3012; Signalway Antibody, TX, USA) ja vuohen peroksidaasilla konjugoidun anti-hiiri-IgG (# AP124P; Millipore, MA, USA) käytettiin sekundäärisiä vasta-aineita. β-aktiini käytettiin sisäisenä positiivisena kontrollina. Proteiinit saatiin näkyviin käyttäen HRP-substraattia (Millipore) ja skannattu tehostetun kemiluminesenssin järjestelmä (Las 4000; Fuji Film, Tokio, Japani). Bändi intensiteetit normalisoitiin P-aktiini.

Solusykli ja apoptoosimäärityksessä

Solut (1 x 10

5) ympättiin 75-cm

2 pulloihin ja transfek- kanssa esriinin tai negatiivinen kontrolli siRNA. Solut kerättiin talteen kolmen päivän kuluttua transfektion ja valmistettiin virtaussytometria-analyysiä. Solut kiinnitettiin 30 minuuttia 70% etanolissa ja värjättiin propidiumjodidilla. Mittaukset DNA solun sisällön suoritettiin käyttäen FACSCalibur (BD).

solukasvumäärityksessä

MTT-määritystä käytettiin arvioimaan solujen kasvua. Solut ympättiin 12-kuoppalevyille (1 x 10

4 solua /kuoppa), ja MTT-liuosta (0,25 mg /ml) lisättiin alustaan ​​inkuboinnin jälkeen 24, 48, 72 tai 96 h. Formatsaanikiteet liuotettiin DMSO, ja absorptio mitattiin 570 nm: ssä käyttäen Infinite 200 mikrolevynlukijaa (TECAN, Kawasaki, Japani).

Cell migraatiokokeessa

Migration arvioitiin käyttämällä haavan paranemista määritys. -Soluja kasvatettiin 12-kuoppalevyillä, jotta lähes konfluentin tason DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää. Ristissä juovia tehtiin yksikerrosviljelmään käyttäen 200-ul pipetinkärjet. Solut pestiin välittömästi DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää poistamiseksi irrotettuja soluja. Soluja inkuboitiin alustassa, joka sisälsi mitomysiini (3 ug /ml; Nacalai Tesque) 1 h proliferaation inhiboimiseksi. Siten havaittiin solujen lukumäärän suureneminen ei johtunut lisääntyneestä solujen lisääntymistä. Solumigraation tarkkailtiin 0, 12, 24, ja 48 h, ja kuvat otettiin kiinni kunakin ajankohtana digitaalisella kameralla (Nikon, Tokio, Japani) kiinnitettynä ylösalaisin vaihekontrastimikroskoopilla (Nikon).

invaasiomääritys

invaasio määrityksiä käytetään 24 kuopan BD BioCoat matrigeelin invaasio kammiot 8 um huokosia insertit (BD). -Soluja (5 x 10

4) suspendoitiin seerumivapaassa DMEM ympättiin ylemmän insertit, kun taas DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alakammioissa kuin kemoattraktantti. Solut poistettiin yläpintaan suodattimen kaapimalla pumpulipuikolla kuluttua 22 h viljelmässä. Solut, jotka soluttautunut suodattimen läpi kiinnitettiin ja värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla (H /E). Keskiarvot tuloksista jotka saatiin kolme kammiota käytettiin analyysissä.

Immunofluoresenssi

Soluja kasvatettiin kahdeksan hyvin kulttuuri Leikkeitä kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä PBS: ssä 30 minuutin ajan, läpäiseviksi 0,25% Triton X-100 (Merck CalBiochem, Darmstadt, Saksa), ja salvattiin 1% FBS PBS: ssä. Aktiini värjättiin käyttäen rodamiini-phalloidin (Invitrogen). Immunofluoresenssikoe kuvat visualisoitiin käyttäen Olympus BX-61 fluoresenssimikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani), ja kuvia otettiin kiinni kanssa CoolSNAP-HQ kamera (NIPPON ROPER, Tokio, Japani).

Rho perhe aktiivisuusanalyysiä

Rho perheen aktivaation määritys suoritettiin myös käyttämällä RhoA /Rac1 /Cdc42 aktivointi Combo Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA), mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, solut pestiin, lyysattiin määrityspuskurissa, ja sentrifugoitiin 10000 x

g

1 min solujätteiden poistamiseksi. Kokonaismäärän määrittämiseksi ilmentymistasojen RhoA /Rac1 /Cdc42 Western blottauksella, 20 ui kutakin näytettä säilytettiin -80 ° C: ssa erillistä analyysiä varten. Solu lysaattia, joka sisälsi 500 ug kokonaisproteiinia inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa samalla pyörittäen 40 ui agaroosihelmiä, jotka sitoutuneen aktivoitu RhoA, Rac1, ja Cdc42. Agaroosihelmiin sitoutuneena aktiivinen RhoA /Rac1 /Cdc42 pestiin kolme kertaa käyttäen koepuskuria, suspendoitiin uudelleen 40 ul: aan 2 x MAP-näytepuskuria, ja keitettiin 70 ° C: ssa 10 min. Aktiivinen (GTP-sitoutunut) ja yhteensä RhoA /Rac1 /Cdc42 proteiinin tasot kussakin näytteessä määritettiin western blottauksella.

Tilastolliset analyysit

Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena. Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Excel (Microsoft, WA, USA). Vertailut ryhmien välillä suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testi. Korrelaatio on esriinin ekspressiotasoja kanssa kielen SCC ja imusolmuke etäpesäke analysoitiin Fisherin testiä, kun taas vaiheessa ja erilaistumista laadut analysoitiin Tukeyn vertailumenetelmää. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä

P

0,05.

Tulokset

Erzin ilmentymistä kielen syövän ja noncancerous kudosten

Erzin immunoreaktiivisuus havaittiin solukalvot, kun se oli heikosti positiivinen sytoplasmassa normaalin kielen limakalvon (Fig. 1A). Sen sijaan kielen SCC näytteet osoittivat, kalvomainen ja sytoplasminen esriinin värjäys, ja sytoplasminen värjäytyminen oli suurempi näissä näytteissä kuin normaalissa kielen limakalvon näytettä (Fig. 1 B). Taulukossa 2 on esitetty tulokset esriinin värjäystä. Vuonna noncancerous ihmisen kielen kudoksia, kaikki 10 näytettä ilmaisi esriinin matalalla tasolla. Ihmisen kielen SCC kudoksissa, mutta korkea esriinin ekspressiota havaittiin 32/69 (46,4%) kasvaimia, kun taas heikkoa ilmentymistä havaittiin 37/69 (53,6%) kasvaimissa. Korkea esriinin ilme oli huomattavasti yleisempää ihmisen kielen SCC kudosten kuin noncancerous kudoksissa (

P

= 0,0046). Korkea esriinin ilmaisu yleensä havaita useammin tapauksissa imusolmuke etäpesäke (62,5%) kuin niiden kanssa ilman imusolmuke etäpesäke (44,3%), mutta ei ollut merkittävää korrelaatiota esriinin ekspressiotasot ja vaihe luokalla, alueellinen imusolmuke etäpesäke ja erilaistumista arvosana (

P

0,05).

(A) Erzin ilmentyminen oli alhainen noncancerous kudoksissa (suurennus 40 x ja 200 x). (B) Erzin oli erittäin ilmaistu kielen okasolusyöpää (suurennus 40 x ja 200 x). Erzin immunoreaktiivisuus näkyi kalvon normaalin kielen epiteelin, kun taas positiivinen värjäys esriinin ensisijaisesti sytoplasmassa tai kalvo ja sytoplasmassa kielen okasolusyöpä soluja.

väliset korrelaatiot esriinin ilmaisun ja indeksit Ki-67 ja apoptoosia ihmisen kielen SCC kudosten

Arvioimme korrelaatioita esriinin ilmaisun ja Ki-67 ja apoptoottisten indeksit ihmisen kielen SCC kudoksiin. Ki-67-indeksi oli 33,0 ± 19,3% kudoksissa alhaisen esriinin ekspressiotasot ja 48,1 ± 15,0%: in kudoksista korkealla esriinin ekspressiotasot (Fig. 2A). Oli positiivinen korrelaatio esriinin ekspressiotasot ja Ki-67-indeksi (

P

= 0,0003). Apoptoottiset indeksi oli 0,60 ± 0,74% kudoksissa alhaisen esriinin ekspressiotasot ja 0,70 ± 0,78% vuonna kudoksista korkealla esriinin ekspressiotasot (Fig. 2B). Ei ollut mitään merkittävää korrelaatiota esriinin ekspressiotasot ja apoptoottisten indeksi (

P

= 0,5776).

(A) Ki-67-indeksi oli 33,0 ± 19,3% kudoksissa matalalla esriinin ilmaisun ja 48,1 ± 15,0%: in kudoksista korkealla esriinin ilme. Merkittäviä eroja havaittiin korrelaatio esriinin ilmaisun ja Ki-67-indeksi (

P

= 0,0003). (B) ei ollut merkitsevää korrelaatiota esriinin ilmaisun ja apoptoottisten indeksit (

P

= 0,5776).

Erzin geenin ilmentymistä ihmisen kielen SCC solulinjaa HSC-3 jälkeen RNAi

vaikutusten tutkimiseksi esriinin siRNA kohtelu HSC-3-soluissa, käytimme qRT-PCR ja western blotting mitata esriinin mRNA ja proteiini tasoilla, vastaavasti, HSC-3-solut, jotka transfektoitiin siRNA. Kuten kuviossa 3A esriinin-mRNA selvästi estyy esriinin-siRNA soluja kuin NSC soluissa (0,10 ± 0,03 vs. 1,06 ± 0,21;

P

0,05). Western blot-analyysi osoitti, että RNAi vähensi esriinin proteiinin tasot (Fig. 3B).

(A) Erzin mRNA: n ekspressio analysoitiin käyttäen reaaliaikaista PCR jälkeen RNAi. Estyminen esriinin mRNA ilmaisun havaittiin selvästi vuonna esriinin siRNA-transfektoiduissa HSC-3-soluissa verrattuna, että HSC-3 säätökennoja (0,10 ± 0,03 vs. 1,06 ± 0,21;

P

0,05). (B) Erzin proteiinin ekspressio havaittiin Western blot jälkeen RNAi. Ilmaisu esriinin väheni jyrkästi esriinin siRNA-transfektoiduissa HSC-3-soluissa.

Effects esriinin RNAi solusyklin etenemisen ja apoptoosin

Transfektoimme HSC-3-solujen kanssa esriinin siRNA ja kerätty niitä kolmen päivän solusyklin analyysi. Virtaussytometria osoitti, että G0 /G1 jae kasvoi 37,7% ± 4,9%: sta 54,1% ± 0,5% (

P

= 0,0046) on HSC-3-solujen jälkeen RNAi (kuvio. 4). Sen sijaan, S ja G2 /M-fraktiot laski HSC-3-soluissa, kun RNAi. Erityisesti osuudet S vaiheessa olevien solujen laski 50,8% ± 1,6%: sta 36,6% ± 0,4% (

P

= 0,0018), kun taas osa G2 /M-soluissa laski 11,5% ± 3,3% 9,3% ± 0,9% (

P

= 0,1155). Ei preG0 /G1-soluja tai apoptoottisten kappaleiden havaittiin ohjaus- ja siRNA-transfektoiduissa soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että esriinin siRNA voivat estää soluproliferaatiota häiritsemällä solun mitoosia ja solusyklin etenemisen.

osuus HSC-3 solujen S-vaiheen laski 50,8 ± 1,6%: sta 36,6 ± 0,4%, kun RNAi (

P

= 0,0018). Osuus solujen G0 /G1 vaiheessa myös kasvoi 37,7 ± 4,9%: sta 54,1 ± 0,5%, kun RNAi (

P

= 0,0018). Apoptoosi ei havaittu.

Effects esriinin RNAi solujen kasvuun

vaikutukset esriinin proteiinin ilmentymisen solun kasvuun testattiin käyttämällä MTT-määritystä. Kasvuvauhti on esriinin siRNA käsiteltyjä soluja väheni ajasta riippuva tavalla (kuva. 5). Absorbanssi arvot MTT-määritystä 72 tunnin jälkeen olivat 0,36 ± 0,02 ja 0,30 ± 0,01 varten NSC- ja esriinin siRNA-transfektoiduissa HSC-3-soluissa, vastaavasti. Nämä tiedot osoittavat, että oli merkittävä väheneminen solujen kasvun esriinin siRNA-transfektoiduissa soluissa kuin kontrollisoluissa.

kasvu esriinin siRNA-transfektoiduissa HSC-3-solujen väheni aikaa riippuvalla tavalla. (24 h:

P

= 0,6727; 48 h:

P

= 0,5314; 72 h:

P

= 0,0122; 96 h:

P

= 0,0065).

Effects esriinin RNAi solun muuttoliikettä ja invaasiota

Haavan paranemista määritykset arvioitiin solun motiliteettia NSC- ja esriinin siRNA-transfektoiduissa soluissa. Haava oli luotu solu Yksikerrosviljelmissä, ja haavan arvioitiin eri ajankohtina. Erzin hiljentäminen että HSC-3-soluissa heikentynyt niiden kyky parantaa haava verrattuna hallinnassa soluissa, jotka ilmensivät esriinin (Fig. 6). Invasion määritykset suoritettiin myös käyttämällä Matrigel päällystettyjä TranswellTM soluviljelykammioihin, ja tunkeutuvat solut laskettiin kuluttua 22 h. Esriinin siRNA-transfektoiduissa soluissa osoitti neljä kertaa pienempi soluinvaasiota nopeudella kuin NSC-transfektoituja soluja, jotka ilmaisivat esriinin (564,7 ± 111,8 vs. 1969,8 ± 126,6;

P

0,05; Fig. 7).

solut haavoittui raaputtamalla pipetillä kärki, ja mitomysiini (3 mg /ml) lisättiin keskipitkällä 1 h estävän syöpäsolujen lisääntymistä. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin DMEM: lla 48 tuntia. Solut valokuvattiin käyttäen faasikontrastimikroskopiaan. HSC-3 solumigraatio väheni esriinin siRNA hoitoon.

(A) Matrigel päällystettyjä TranswellTM kammioita käytettiin analysoimaan soluinvaasiota. Solut, jotka soluttautunut suodattimen läpi kiinnitettiin ja värjättiin, ja edustava kentät valokuvattiin. (B) Soluja kvantitoitiin laskemalla valomikroskoopilla. Verrattuna HSC-3 ohjaus soluissa esriinin siRNA-transfektoiduissa HSC-3-solut osoittivat merkitsevästi vähentynyt invasiivisuus (1969,8 ± 126,6 vs. 564,7 ± 111,8;

P

0,05).

Effects esriinin RNAi on aktiinisytoskeletonin uudelleenjärjestelystä

Analysoimme vaikutukset esriinin downregulation järjestämisestä aktiinisytoskeletonin. Analyysit phalloidin-värjättyjen solujen osoitti, että podia muodostumista selvästi estyy esriinin siRNA-transfektoiduissa soluissa (Kuva. 8). Nämä havainnot osoittivat, että puuttuminen esriinin aiheuttanut morfologisia muutoksia syöpäsolujen kautta aktiinisytoskeletonin remodeling.

NSC- ja esriinin siRNA-transfektoiduissa HSC-3-solut leimattiin vastaisella vasta-aineella aktiini. Erzin ehtyminen HSC-3-solujen vähentänyt esriinin proteiinin tasot. Downregulation liittyi menetys ulokkeita (nuolet).

Rho proteiinit, E-kadheriinin, N-kadheriinin, ja β-kateniinin ilmentymistä esriinin vaje solujen

ei ollut eroja proteiinin kokonaismäärän tasoja RhoA, Rac1, ja Cdc42 (Fig. 9), ja tasot niiden aktiivisia muotoja olivat liian pieni havaitaan NSC- ja esriinin siRNA-transfektoiduissa soluissa.

ilmentyminen E-kadheriinin ja β-kateniinin nostettiin ja ilmentymistä N-kadheriinin aleni esriinin siRNA-transfektoiduissa HSC-3-soluissa verrattuna, että NSC-transfektoiduissa soluissa. Ei ollut merkittävää eroa proteiinin kokonaismäärän tason RhoA, Rac1 ja Cdc42.

testasimme ovatko ekspressiotasot E-kadheriinin, N-kadheriinin, ja β-kateniinin vaikuttivat esriinin ehtyminen että HSC-3-soluissa mittaamalla niiden ilmaisua käyttäen western blotting. Kuten kuviossa 9 on esitetty, E-kadheriinin ja β-kateniinin ilmaisuja lisättiin, kun taas N-kadheriinin ilmentyminen väheni esriinin siRNA-transfektoiduissa soluissa kuin NSC-transfektoiduissa soluissa. Nämä tulokset osoittavat, että suppressio esriinin proteiinin ekspressiota indusoitiin säätely E-kadheriinin ja β-kateniinin, mutta downregulation N-kadheriinin, että HSC-3-soluissa.

Keskustelu

Tissue microarray analyysit osoittivat, että korkea esriinin ilmentyminen oli merkitsevästi yleisempää ihmisen kielen SCC kudosten kuin noncancerous kudokset (

P

= 0,0046). Siellä oli myös positiivinen korrelaatio esriinin ilmaisun ja Ki-67-indeksi tässä tutkimuksessa. Ki-67-antigeeni on ilmaistu lisääntyvien solujen aikana G1, S, G2, ja M vaiheita, mutta ei aikana G0 vaiheen (lepäävät solut) [33]. Ki-67 käytetään markkerina kasvaimen leviämisen ja aggressiivisuus, ja se voi olla suuri vaikutus ennusteeseen potilailla, joilla on HNSCC [34]. Korkea esriinin ilmaisu yleensä havaita useammin tapauksissa imusolmuke etäpesäke (62,5%) kuin ne, ilman imusolmuke etäpesäke (44,3%). Meidän

in vitro

kokeellisesti ihmisen kielen SCC solulinjaa HSC-3 ja ilman RNAi hoitoa myös havainnut yhdistyksen välillä esriinin yli-ilmentymisen ja lisää aggressiivista käyttäytymistä, kun taas ei ollut merkittäviä korrelaatioita esriinin ilmentymiskuviot ja TNM lavastus ihmisen kielen SCC kudoksiin. Nicolas et ai. myös raportoitu mitään merkittävää eroa esriinin ilmaisun pitkälle ja alemman TNM kasvaimia, kun taas korkea esriinin ja moesiini ilmentyminen liittyy huono syövän säilymiseen [35], [36]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että esriinin yliekspressio voidaan käyttää ennustetyövälineenä merkki riippumatta TNM lavastus.

in vitro

rooleissa esriinin solujen käyttäytyminen ei ole arvioitu kielen SCC. Meidän RNAi kokeissa havaittiin vahva tukahduttaminen solujen kasvua, liikkuvuuteen ja invasiivisuuden että HSC-3 kielen SCC soluja. Solusyklin analyysi paljasti, että esriinin ehtyminen lisääntynyt G0 /G1 murto mutta pienensi G2-M murto häiritsemällä solun mitoosia ja solusyklin etenemisen. Nämä tulokset yhtyä ilmoittamien Zhang et al. maksasolukarsinoomassa [37]. He osoittivat myös, että esriinin voitaisiin edistää syöpäsolujen kasvua tukemalla solujen jakautumista ja solusyklin etenemistä G0 /G1 S ja G2 /M-vaiheessa. Tämä sopi tuloksiin kudoksen microarray Ki-67-indeksi. Havaitsimme myös, että esriinin ehtyminen esti solun kasvua MTT-määritys.

Solun muuttoliikettä ja invaasiota ovat välttämättömiä prosesseja etäpesäke syöpäsolujen. Muuttavien syöpäsoluja tehdään useita morfologisia muutoksia kautta uudelleenjärjestely adheesiomolekyylien ja aktiini kuidut [38]. Se on nyt laajalti hyväksytty, että prosessi syöpäsolun muuttoliikkeen kuuluu neljä päävaihetta muodostumista ja laajentaminen filopodia ja lamellipodioihin eturintamassa, uusien tartuntaa sivustoja edessä, supistuminen solun elin, ja irtoaminen kiinnikkeistä klo takana [39]. Havaitsimme, että esriinin ehtyminen vähentynyt syöpäsolun liikkuvuutta ja invasiivisuus ja esti podia muodostumista. Nämä tulokset osoittavat, että esriinin esto häiriintynyt remontin aktiinisytoskeletonin, mikä vähensi liikkuvuutta ja invasiivisuuden HSC-3-soluissa. Nämä havainnot samaa mieltä aikaisempien raporttien, joka osoitti, että muutokset solun tukirangan voi olla keskeinen tekijä säätelyssä neoplastisten etenemisen ja kasvaimen kasvua [24], [40] – [43]. Aiemmassa tutkimuksessa on myös havaittu dramaattista määrän vähentämistä haimasyövän soluja podosomal ruusukkeet jälkeen esriinin RNAi hoidon ja kertoi, että muodostuminen podosomes ja niiden ruusukkeita ajettiin jota esriinin-cortactin vuorovaikutusta, joka on rooli haimasyövän invaasiota [44 ]. Toinen raportti paljasti, että pseudopod muodostumista selvästi vähentynyt esriinin RNAi hoitoa neljässä maksasyövän solulinjoja [37].

Tuloksemme viittaavat siihen, että esriinin tärkeä rooli invasiivisia kasvun kielen SCC. Tutkimme myös aktiini, Rho proteiinit, E-kadheriinin, N-kadheriinin, ja β-kateniinin tutkimaan molekyylitason mekanismeista näitä havaintoja. Olemme havainneet, että esriinin suppression indusoi lisääntynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja β-kateniinin, että HSC-3-soluja. On tunnettua, että E-kadheriinin on keskeinen rooli epiteelisolujen-soluadheesiota ja ylläpito epiteelisolujen pesäkkeen eheys [45]. On hyvin dokumentoitu, että menetys tai esto E-kadheriinin toiminto, tai siihen liittyvien catenins johtaa vähentyneeseen välistä adheesiota ja lisääntynyt invasiivisen potentiaalia [46]. Lisäksi useissa tutkimuksissa on epiteelin maligniteetteja, mukaan lukien suun SCC, ovat ehdottaneet, että E-kadheriinin /β-kateniinin kompleksi säätelee syövän eteneminen ja metastaasit [47], [48]. Kadheriinin kiinnitysalueisiin vuorovaikutuksessa aktiinisytoskeletonin monimutkaisella tavalla, joka on huonosti ymmärretty. Nykyinen näkemys on, että E-kadheriinin liittyy aktiinitukirankaan kautta vuorovaikutuksessa β-kateniinin, joka puolestaan ​​sitoo aktiini-sitovan proteiinin α-kateniinin [49]. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että esriinin on tärkeää lokalisointia E-kadheriinin solukalvoon [24]. Niinpä arveltu, että E-kadheriinin ja β-kateniinin downregulation liittyy Erzin yli-ilmentymisen on voitu liittynyt aktiini remontin ja muodostumista podia laajennuksia.

On yleisesti tiedossa, että aktiini uudelleenjärjestely säätelee Rho perhe pienet GTPaasit kuten Rho, Rac, ja Cdc42 [50], eli Rho säätelee stressi kuitu ja fokaalisen adheesion kokoonpano, Rac säätelee muodostumista lamellipodioihin ulokkeita ja kalvo röyhelöitä, ja Cdc42 laukaisee filopodial laajennukset solun reuna [51]. Tutkimme ilmaisua ja toimintaa RhoA, Rac1 ja Cdc42 että esriinin siRNA- ja NSC-transfektoidut HSC-3-soluissa.