Krooninen sairaus

tiivistelmä

nenänielusyöpä (NPC) on ainutlaatuinen EBV-epiteelin maligniteetti, osoittaa erittäin invasiivinen ja metastaattinen fenotyypin. Kasvusta huolimatta todisteet osoittavat kriittinen rooli syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja (CSCS) ylläpitoon ja etenemistä kasvaimia eri maligniteetteja, olemassaolo ja ominaisuudet CSC EBV-NPC ovat suurelta osin tuntemattomia. Tutkimuksemme tavoitteena on valaista läsnäolon ja aseman CSCS patogeneesissä tämän pahanlaatuisen sairauden. Palloja muodostavan solut eristettiin EBV-positiivinen NPC solulinjan C666-1 ja sen kasvaimen aloittamista ominaisuudet vahvistettiin

in vitro

ja

in vivo

määrityksissä. Näissä sferoideja, ylössäätöä useiden kantasolujen markkereita havaittiin. Virtaussytometrillä, olemme osoittaneet, että sekä CD44 ja Sox2 oli yli-ilmentynyt useimmissa palloja muodostavan C666-1 soluja. CD44 + Sox2 + solujen havaittiin vähäinen väestön EBV-positiivisten ksenografteissa ja ensisijainen kasvaimia ja pitää mahdollisina CSC NPC. Huomattavaa on, että eristetty CD44 + NPC solut olivat resistenttejä kemoterapia-aineiden ja korkeamman pallomainen muodostumisen tehokkuutta, osoittavat CSC ominaisuuksia. Toisaalta, mikrosiruanalyysi on paljastanut useita ilmentyvät eri geenien transkription säätelyyn (esim

FOXN4

,

GLI1

), immuunivaste (

CCR7-

,

IL8

) ja transmembraanisen liikenne (esim

ABCC3

,

ABCC11

) in palloset. Näistä geeneistä, lisääntynyt ilmentyminen CCR7- in CD44 + CSCS vahvistettiin NPC ksenografteissa ja ensisijainen kasvaimia. Tärkeää on, esto CCR7- poisti palloja muodostavan kyky C666-1

in vitro

. Expression CCR7- liittyi uusiutuva sairaus ja etäinen etäpesäke. Nykyinen tutkimus määritteli ominaisuuksia CSC alaryhmän EBV: hen liittyvien NPC. Meidän havainnot tarjonnut uusia näkökulmia kehittää tehokkaita hoitoja kohdistamisesta CSCS, siten voimistavan hoidon tehokkuutta varten NPC potilaille.

Citation: Lun SW-M, Cheung ST, Cheung PFY, To KF, Woo JK-S, Choy KW , et ai. (2012) CD44 + Cancer Stem kaltaisia ​​soluja EBV-Associated nenänielusyöpä. PLoS ONE 7 (12): e52426. doi: 10,1371 /journal.pone.0052426

Editor: David Loeb, Johns Hopkins University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10. heinäkuuta 2012 Hyväksytty: 12 marraskuu 2012; Julkaistu: 21 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Lun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat Research Grants neuvosto Hong Kong (GRF: Grant nro 470321, 471610, 471211, 471709, GRF: Grant No. CUHK8 /CRF /11R; AoE /M-06/08) ja Research Grant neuvoston (GRF776608M; GRF777809M). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tällä hetkellä co-kirjoittajat Kwok-Wai Lo Siu Tim Cheung, Pierre Busson ja Sai Wah Tsao kuuluvat PLoS One toimitusneuvosto. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Ei-keratinisoituvissa nenänielun karsinooma (NPC) on selvä epiteelin maligniteetti johtuvat pään ja kaulan alueella. Johdonmukaisesti yhdistää Epstein-Barrin virus (EBV) ja näyttää ainutlaatuinen kliiniset ja patologiset ominaisuus. Kun kloonilaajenemisen yhden EBV-tartunnan esisolujen, ilmentämällä viruksen piilevä geenien ja kertymistä useita geneettisiä muutoksia edistävät taudin alkamisen ja etenemisen tämä syöpä [1], [2].

NPC osoittaa vahva maantieteellinen etusija, joka osoittaa korkea esiintyvyys Kaakkois-Aasiassa, etenkin Kantonin alueella mukaan lukien Hongkong, joiden vuosittainen ilmaantuvuus 25-50 per 100,000 henkilöille [1]. Tukipilari hoito NPC on joko sädehoitoa tai yhdistetyn kemosädehoidon joka osoittaa yli 90%: paranemisasteella potilailla, joilla varhaisessa sairauden vaiheessa [3]. Kuitenkin lopputulos potilailla, joilla on edennyt paikallista alueellista sairauksia ja etäispesäkkeitä eivät ole tyydyttäviä. Merkittäviä määriä kaukaisten uusiutumisen ja etäpesäke esiintyy edelleen näillä potilailla sädehoidon jälkeen tai kemosädehoidon. Yksi tärkeimmistä mekanismeista tällaisen jälkeiseen terapeuttinen toistuminen NPC on ehdottanut ”syöpä kantasolujen kaltaisia ​​cell” (CSC) ehdotus [4].

Mukaan CSC malliin, syöpien hierarkkisesti järjestäytynyt samankaltaisia normaaliksi kudosten ja syövän kasvua ja etenemistä ohjaa pienessä määrässä kasvainsolujen kantasolun kaltainen ominaisuuksiensa CSCS. Tämä harvinainen solu subpopulaatio vastaa kasvain aloittamista, ylläpito ja uudistaminen [4], [5]. CSCS on tunnistettu erilaisissa ihmisen maligniteettien kuten rinta-, eturauhas-, munasarja-, keuhko- ja pään ja kaulan syöpä [5], [6], [7], [8], [9]. Kyvyt nämä solut aloittaa kasvaimen kasvua, yllä itseuudistuminen ja helpottaa lääkeresistenssi on laajalti osoitettu. Ottaen huomioon ainutlaatuisia ominaisuuksia CSCS, uusiutumisen kasvainten ehdotetaan johtuvan epäonnistuminen poistaa kaikki CSCS ja elossa CSCS sitten liuottaa kasvain paikallisissa ja kaukaisilla alueilla.

Vaikka CSCS on osoitettu olevan elintärkeitä kehittämisessä useimmat syövät, tietoa niiden olemassaolosta EBV-NPC on niukkaa. Joko tutkimus suoritettiin käyttämällä EBV-negatiivisia solulinjoja tai ei pystynyt selvittämään mitään toiminnallista CSCS [10], [11], [12]. Ryhmämme on aiemmin perustettu useita EBV-positiivinen kasvain siimoja NPC potilaista endeemisillä alueilla [13], [14], [15], [16] ja käyttämällä näitä natiivi EBV-positiivisia kasvainsoluja, pyrimme tunnistaa ja kuvata toiminnallista NPC CSCS.

tässä tutkimuksessa pallo muodostavien solujen ( ”palloset”) EBV-positiivisten solulinjan C666-1 eristettiin ja niiden kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia vahvistettiin. Olemme paljasti, että CD44 ja Sox2 ilmaistiin enemmistö näistä CSCS. Vuoteen mikrosiruanalyysi, poikkeavasti Solun geenien CSCS tunnistettiin. Mielenkiintoista on, CCR7, solun pinnan kemokiinireseptoriin, todettiin johdonmukaisesti ilmaistaan ​​NPC linjat ja ensisijainen kasvaimia. Sattumalta se oli yli-ilmentynyt meidän tunnistaa NPC CSCS ja neutralointi tämän reseptorin poistetaan palloja muodostavan kyky C666-1. Tämänhetkinen tutkimus tuottaa ensimmäiset todisteet läsnäolo tuumorigeenisiä CSCS EBV-positiivisten NPC ja CCR7 saattaa olla merkitystä niiden kasvaimia synnyttäviä toiminto. Edellä esitetyt havainnot vahvistavat ymmärrystämme luonteesta NPC CSCS, mikä on tärkeää kehittää tehokkaampia hoitointerventio tätä tautia vastaan.

Tulokset

CSC ominaisuudet EBV-positiivisten NPC johdettu Pallot

CSCS hallussaan kyky muodostaa kiinnittymisestä riippumatonta tuumorin aloilla, kun kasvatetaan erikoistunut seerumittomassa elatusaineessa. Kuten kuviossa 1A on esitetty, vapaasti kelluva kasvaimen palloset muodostuu, kun liukenevat C666-1 soluja viljeltiin päällystämättömän levyt seerumivapaassa kantasolujen väliaineessa. Tarttumattomat pallosia oli havaittavissa 6-8 päivää ja ne entsymaattisesti hajotettiin yksittäisiksi soluiksi käytävien viikoittain. Selvät prototypical sferoidit muodostettiin 28 päivää pinnoitus. Tämä itseuudistuvien kelluva kasvain pallojen voitaisiin kuljetettiin sarjoittain ja kasvatettiin yli 3 kuukautta. Kun yksittäinen solujen sferoideja viljeltiin kiinnittynyt levyt täydellisessä väliaineessa (RPMI-1640, jossa on 10% FBS), kelluva solujen kiinni levyyn ja muodostettu järjestelmällistä pesäkkeitä, mikä osoittaa, epiteeli- solujen morfologia on samanlainen kuin vanhempien yksisolukerroksen C666-1-soluissa (kuvio . 1A, oikea paneeli).

(A) Vapaasti kelluva kasvain palloja muodostettiin EBV-positiivisten C666-1 soluissa (vasen paneeli) ja ne osoittivat kyky erilaistua verrattain jotta yksikerrossoluissa kun annetaan täydellisessä alustassa ( oikea paneeli). (B) By qRT-PCR, useita kantasolu liittyvien geenien (Oct4, Nanog, ALDH1, ckit, CD44, CD133) rikastuneet pallosia verrattuna vanhempien C666-1. Transkriptio Sox2 ei korotettu palloset. (C) Sox2 proteiini ilmaistaan ​​usein C666-1 alalla muodostavia soluja. Virtaussytometrillä, Sox2-positiivinen (Sox2 +) solujen havaittiin rikastettu ja muodostivat yli 60% palloja muodostavan solupopulaation. (D) yli 80% alan muodostavien solujen ilmaisi solunpintamarkkeria CD44 kun CD44 + solujen havaita vanhempien C666-1 ja muut NPC ksenografteissa olivat merkittävästi alhaisemmat (kaikki

P

0,001). Histogrammit ilmaiseva keskiarvo ± SE (n≥3) kanssa tilastollisen merkittävyyden lasketaan t-testi (*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001).

mittaamiseksi tuumorigeenistä kapasiteettia pallosia, eri määriä pallo muodostavien solujen ja valitsemattomat vanhempien C666-1 solua injektoitiin ihonalaisesti paljaiden hiirien kylkiin. Olemme havainneet, että 10000 pallo muodostavien solujen voisivat muodostaa kasvaimia kaikissa ympätty hiirillä (taulukko 1). Injektio 1000 sferoidiviljelmiä solujen satunnaisesti muodostettu yksi kasvain pois kuusi hiirtä. Kuitenkin vähintään 500000 valitsematta C666-1 solut olivat välttämättömiä kasvaimen muodostumisen. Rakeiden solut osoittivat ainakin 50 kertaa suurempi Tuumorigeenisuustutkimuksissa kuin solujen valinta. Edelleen tarkistaa, onko palloja muodostavan solut kykenevät sarjaan etenevät nude-hiirissä, ksenografteissa kehitetty sferoidit sarjoittain Siirto tehty nude-hiiriin. Kaikki ne osoittivat onnistunut sarjanumero elinsiirroissa ja kasvaimet olivat havaittavissa on 3-4 viikkoa (tuloksia ei ole esitetty).

tutki ekspressiokuviota useiden kantasolujen merkkiaineita ja pinta-antigeenejä näissä pallosia. By qRT-PCR-analyysi, huomasimme, että ilmaus useiden kantasolujen merkkiaineita (Oct4, Nanog, ALDH1, CD44 ja CD133) in pallosia oli huomattavasti suurempi kuin yksikerroksisten vanhempien C666-1 soluja (kaikki

P

0,05, Fig. 1 B). Lisääntynyt ilmentyminen ckit, Klf4 ja KLF5 vuonna pallojen oli myös huomattava. Vaikka emme havaitse säätely ylöspäin Sox2 transkriptio alalla muodostavia soluja, Sox2 ilmentäviä (Sox2 +) solujen osoitettiin olevan erittäin rikastettu pallojen (70,8 ± 2,16%) virtaussytometrialla (kaikki

P

0,001, Fig. 1 C). Olemme myös havainneet Sox2 ilmaisun 0,77 ± 0,13% soluista NPC ksenografteissa. Havainnot vahvistivat, että pallojen johdettu EBV-positiivisten C666-1 soluilla CSC fenotyyppejä.

palloja muodostavan CSCS Express solupintaproteiini CD44

Koska transkription CD44 ja CD133 lisääntyivät merkitsevästi in palloset, me tarkistaa sitten, onko ilmaus näiden CSCS pintamerkkiaineita oli spesifinen NPC palloja muodostavan soluissa. Virtaussytometrillä ja Immunofluoresenssivärjäystä olemme osoittaneet, että suurin osa soluista C666-1 pallosia (84,14 ± 1,12%) olivat CD44 positiivinen (Fig. 1 D ja kuvio. S1). CD44 + soluja havaittiin myös, koska alapopulaatio vanhempien C666-1 solut (5,28 ± 1,29%), ja kolme NPC ksenografteissa, xeno-666 (12,31 ± 1,97%), xeno-2117 (9,58 ± 1,80%), ja C17 (17,31 ± 1,76%) (Fig. 1 D). Kuitenkin, CD133-ilmentäviä soluja havaittiin vain 32,11 ± 2,35% sferoidien soluja ja 1,90 ± 0,84% vanhempien C666-1 soluja. Lisäksi CD133 + solut olivat täysin poissa 2 ksenograftien (xeno-666 ja ksenotransplantaatiolla 2117) (Kuva. S2). Niinpä ehdotetaan, että CD44 on yhteistä ehdokasta CSC pintamerkkiaine EBV-positiivisten NPC.

CD44 + solut Express Sox2 ja heillä esiintyy enemmän Clone- ja palloja muodostavan Efficiency

Expression kantasolujen transkription tekijä Sox2 johdonmukaisesti havaittu kasvainsolun väestöryhmästä ensisijainen NPC ja uskotaan olevan mahdollinen markkeri NPC CSCS [12]. Näin ollen, arvioimme koekspressio CD44 ja Sox2 in sferoideina ja valitsemattomat yksikerroksista C666-1 soluja, samoin kuin 3-ksenografteissa ja 5 primaareja kasvaimia virtaussytometrialla. Kuten kuvassa 2, yli 60% sferoidiviljelmiä soluista (66,57 ± 2,72%) ilmaistuna sekä CD44 ja Sox2. Sattumalta Sox2 ilmentymistä havaitaan harvoin CD44- osa C666-1 pallo muodostavien solujen, mikä viittaa etuoikeutettu ilmaisu tämän kantasolujen transkriptiotekijän CD44 + -soluissa. Co-ilmentymä CD44 ja Sox2 havaittiin myös 0,1-9% soluista NPC solulinjassa, ksenografteissa ja ensisijainen kasvaimia. Havainnot ymmärtää, että CD44 + Sox2 + solut ovat potentiaalisia CSCS NPC. Todistaa tämän hypoteesin, suoritimme toiminnalliset analyysit in CD44 + ja CD44- soluja eristettiin vanhempien C666-1 soluista. Edustavia luvut CD44 ilmaisun eristetyssä CD44 + ja CD44- solut on esitetty kuvassa S3. Kuten kuviossa 3A on esitetty, huomattavasti korkeampi klooni muodostumisen tehokkuutta havaittiin CD44 + -solujen osa kuin CD44- fraktio (

P

0,01). Lisäksi CD44 + solut voitaisiin tuottaa huomattavasti suurempi määrä pallosia verrattuna CD44- solut (

P

0,001, Fig. 3B).

virtaussytometrialla, Sox2 havaittiin olevan valikoivasti ilmentyy CD44 + soluihin ja sattumalta, Sox2 ilmentymistä havaitaan harvoin CD44- soluihin. Solut ilmensi sekä CD44 ja Sox2 todettiin rikastettu pallosia. Histogrammit ilmaiseva keskiarvo ± SE (n≥3) kanssa tilastollisen merkittävyyden lasketaan t-testi (*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001).

CD44 + -solujen osa osoitti merkittävästi korkeampi (A) klooni muodostumisen tehokkuus ja (B) palloja muodostavan tehokkuutta verrattuna CD44- solufraktio. Lisäksi (C) CD44 + solut osoittivat merkitsevästi korkeampi leviämisen nopeudella kuin CD44- soluja. (D) Developmental hierarkia ominaisuus CD44 + soluja. Prosenttiosuus CD44 + soluja jatkuvasti vähennetty eristetyn CD44 + solujen murto ajan. (E) CD44 + soluja oli korkeampi resistenssi 5-FU hoidossa verrattuna CD44- ja vanhempien C666-1 soluja. Kaikki graafit ilmaiseva keskiarvo ± SE (n≥3) kanssa tilastollisen merkittävyyden lasketaan t-testi (*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001).

leviämisen CD44 + solut

WST1 proliferaatioanalyysi, CD44 + solut osoittivat merkittävästi suuremman leviämisen nopeudella verrattuna CD44- ja vanhempien C666-1 soluja, kun taas CD44- solut osoittivat merkitsevästi vähemmän proliferaationopeus verrattuna vanhempien C666-1 soluihin (kaikki P 0,01, Fig. 3C).

Hierarkkinen suhde CD44 + ja CD44- solut

yhdenmukainen CSC ominaisuudet, me paljasti, että lajiteltu CD44 + C666-1 solut hallussaan kyky aiheuttaa sekä CD44 + ja CD44- soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 3D, lasku CD44 + solujen fraktio lajitellaan CD44 + soluja havaittiin virtaussytometrialla ajan. On todennäköistä, että lajitellaan CD44 + solut aiheuttavat heterogeeninen väestölle downregulation CD44 alaryhmässä näiden solujen viljelyn jälkeen

in vitro.

Ei kuitenkaan ole merkittäviä muutoksia prosenttiosuutta CD44 + solujen murto molemmissa lajittelemattoman vanhempien ja lajitellaan CD44- soluja havaittiin jälkeen 3-6 päivää of passage. Tulokset viittaavat siihen, että hierarkkisia suhteita CD44 + ja CD44- soluja EBV-NPC.

Chemoresistance of CD44 + solujen

tutkimiseksi chemoresistance of CD44 + solujen syövän kemoterapeuttiset aineet, teimme solujen selviytymisen määritykset CD44 + ja CD44- solufraktioiden käsiteltiin fluorourasiilin (5-FU), sisplatiini tai doksorubisiini. CD44 + -solujen osa C666-1 esillä vahvempi chemoresistance 5-FU verrattuna emo-valitsematta C666-1 solujen ja CD44- fraktio (kaikki

P

0,05) (Fig. 3E). Chemoresistance of CD44 + soluja kohti sisplatiini tai doksorubisiini oli samanlainen kuin CD44- ja vanhempien C666-1 soluja (tietoja ei esitetty).

differentiaalisesti ilmentyvien geenien NPC-johdettu Pallot

kattavasti karakterisoimiseksi ominaisuudet NPC CSCS selvitimme ilmentymistä solu- ja EBV geenien NPC palloja muodostavan soluissa käyttäen olignonucleotide mikrosirujen ja qPCR määrityksissä. Ensinnäkin arvioidaan EBV kopioluvun ja ilmentymistason EBV geenejä, mukaan lukien EBNA1, LMP1, LMP2A, BARF1, EBER1 ja BZLF1 in C666-1 pallosia. Palloja muodostavan solut osoittivat suurempi EBV kopioluvun ja piilevän geenin ilmentymistä kuin vanhempien C666-1 solut (Fig. 4A). Olemme havainneet merkittävää nousua EBER1, BARF1 ja LMP1 ilmaisun pallojen (kaikki

P

0,05). Ei merkittävää eroa ilmaus EBV välitön varhainen lyyttinen geeni BZLF1 välillä havaittiin pallojen ja vanhempien C666-1 soluja.

(A) By qRT-PCR, useita EBV-geenejä (Eber, BARF1, LMP1, LMP2A, EBNA1 ja BZLF1) havaittiin olevan yli-ilmentynyt pallosia verrattuna yksisolukerroksen C666-1 soluihin. EBV kopioluku näissä soluissa määritettiin qPCR. (B) valitut geenit poikkeuksellisesti ilmaistu sferoidit varmistettiin qRT-PCR. Merkittävästi voimistunut geenejä ovat kemokiinien ja reseptorit (CCR7, CCL4, CX3CL1 ja IL-8), adheesiomolekyyli SELE, molekyylejä (GLI1, FOXN4) ja ABC kuljettajat (ABCC3, ABCC11). (C) solun pinnalla ekspressoidun CCR7 havaittiin ilmaistaan ​​usein alalla muodostavien solujen ( 60%) virtaussytometrialla. CCR7- + solujen alaryhmästä havaittiin myös NPC linjat ja ensisijainen kasvaimia ( 5%). (D) CD44 + CCR7- + soluja havaittiin myös rikastettu pallosia. Histogrammit ilmaiseva keskiarvo ± SE (n≥3) kanssa tilastollisen merkittävyyden lasketaan t-testi (*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001).

Matkapuhelinverkko geenit ilmentyvät differentiaalisesti palloset ja yksikerroksisiin C666-1 solut tunnistettiin mikrosiruanalyysillä. Expression of 830 ja 260 geenien havaittiin olevan yli 5-kertainen lisäys ja vähennys alalla muodostavia soluja vastaavasti. Gene ontologia analyysi paljasti, että 5 suuret molekyyli toiminto luetteloita rikastettu ilmentyvät eri geenejä ovat: transkription säätely, immuunivasteen, apoptoosin säätelyyn, soluadheesion ja transmembraani- liikenne, joista jokaisella on merkittävä P-arvot (taulukko 2 ja taulukko S2). Valikoima eri tavalla ekspressoituneiden geenien lueteltu taulukossa 2. qRT-PCR: ää validoitu ekspressiota valittujen geenien ylläpitämiseksi kantasolujen ominaisuuksia palloset ja vanhempien C666-1 (Fig. 4B). Huomattavasti lisääntynyt ilmentyminen (

P

0,05) kemokiinien ja reseptorien (IL8, CCL4, CX3CL1, CCR7-), signalointireitin liittyvien geenien (FOXN4 ja GLI1), ja soluadheesiomolekyylit (SELE) vahvistettiin vuonna palloset (Fig. 4B). Erityisesti, kaksi ATP-sitovaa kasetti (ABC) kuljettajan geenejä (ABCC3 ja ABCC11) ovat myös hyvin ilmaistaan ​​pallojen (kaikki

P

0,01). Yli-ilmentyminen nämä geenit voivat olla vastuussa solunsalpaajaresistentti ominaisuus NPC CSCS (Fig. 4B).

ilmentäminen CCR7 in CD44 + CSCS NPC

joukossa differentiaalisesti ilmentyvien geenien, CCR7-, kemokiinireseptorin, osoitti korkeinta kertainen muutos ilmaisun pallojen microarray analyysi ja oli näin ollen valittu jatkotutkimuksiin. Virtaussytometrillä, on merkittävä rikastumista CCR7 + solujen havaittiin pallosia verrattuna emosoluista (kaikki

P

0,001, Fig. 4C). Olemme myös havainneet CCR7- ilmaisun 0,53 ± 0,14% ja 2,87 ± 1,53% solujen ksenografteissa ja primaarikasvaimia vastaavasti. Monivärinen virtaussytometrinen analyysi osoitti, että suurin osa CCR7 + solut ko-ilmaistaan ​​CD44. CD44 + CCR7 + solut rikastuneet pallosia verrattuna ksenografteissa ja primaaristen kasvainten (kaikki

P

0,001, Fig. 4D). Tämä ehdokas CSC jae havaittiin myös NPC tuumorilinjoja ja primäärikasvaimissa.

Koska CCR7- oli hyvin ilmaistu NPC alalla muodostavien solujen ja korreloivat imusolmuke etäpesäke erilaisissa ihmisen syövissä, me määritetään sitten yhdistyksen CCR7- ilmaisu kliinisen parametrit 39 ensisijaisen NPC tapauksissa. Edustaja CCR7 ekspressiomalleja ensisijainen kasvaimia esitetty kuviossa 5. CCR7 ekspressio korreloi merkitsevästi CD44 ekspressio näissä tapauksissa (Fig. S4). Niistä NPC näytteitä, 8 (20,5%) olivat negatiivisia CCR7 värjäystä. Heikko, keski- ja korkea ilmentyminen CCR7- havaittiin 13, 7 ja 11 ensisijaista tapausta vastaavasti. Mikä tärkeintä, olemme huomanneet, että CCR7- ilmaisu korreloi läsnäolon uusiutuva sairaus ja etäpesäkkeiden (taulukko 3). Havainto merkitsi, että CCR7- ilmentävien solujen saattavat myötävaikuttaa sairauden etenemiseen.

edustaja ensisijainen NPC tapauksissa korkea (A), keskipitkän (B), alhainen (C) ilmentymistä CCR7-. (D) Ensisijainen NPC puuttumiseen CCR7- ilmentymisen osoitettiin. CCR7 värjäytymistä havaittiin muutaman tunkeutuvia lymfosyyttejä, mutta ei syöpäsoluja. Ensisijainen kasvaimia korkea (E) ja keskipitkän (F) CD44-ilmeneminen on esitetty. In (G) ja (H), heikko CD44 ekspressiota havaittiin kasvainsoluissa, kun taas voimakas CD44-värjäyksen tunkeutuvia lymfosyyttejä oli yleisesti.

roolin tutkimiseksi CCR7 NPC CSC olemme hyödynsi CCR7–esto aineen neutralisoida tehtävänsä vanhempien, CD44 + ja CD44- C666-1 soluja. Solut käsiteltiin 0-250 ng /ml CCR7 estävää vasta-ainetta 24 tuntia ja solujen lisääntymistä mitattiin WST1 määrityksessä. Havaittavissa väheneminen solujen lisääntymisen havaittiin CD44 + -solujen osa verrattuna CD44- ja vanhempien C666-1 soluja. (Fig. 6A). Vähentynyt klooni muodostuminen tehokkuus todettiin myös C666-1 käsitellyissä soluissa CCR7- estävää vasta-ainetta (

P

0,05, Fig. 6B). Tärkeää on, palloja muodostavan kyky inhiboitui merkittävästi jälkeen CCR7- estävän vasta-aineen käsittely (

P

0,001, Fig. 6C). Tulokset säädetty todisteet osallistumisessa CCR7- ylläpitämisessä CSC toiminto NPC.

funktion CCR7- vuonna CSCS, C666-1 käsiteltiin CCR7- estävää vasta-ainetta ja sen leviämisen, klooni-muotoilu ja sphere- muodostavat tehokkuutta tutkittiin. (A) Leviämisen CD44 + solujen estyi hoidon jälkeen CCR7- estävän vasta-aineen. (B) Klooni muodostumisen tehokkuutta C666-1 solujen vähentynyt jälkeen CCR7 esto ja (C) nämä sferoidi muodostava kyky merkittävästi inihibited (

P

0,001), verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. Histogrammit ilmaiseva keskiarvo ± SE (n≥3) kanssa tilastollisen merkittävyyden lasketaan t-testi (*

P

0,05, ***

P

0,001).

keskustelu

Tämä tutkimus tarjoaa ensimmäisen näyttöä sellaisten korkeasti tuumorigeenisia CSCS EBV-positiivisten NPC. Olemme kehittäneet protokolla saamiseksi EBV-positiiviset NPC CSCS edelleen karakterisointia. Muodostuminen pallosia on tärkeä toiminnallinen ominaisuus CSCS ihmisen syövissä [17]. Tässä tutkimuksessa olemme menestyksellisesti eristetty mahdollisen CSC väestön EBV-positiivisten NPC solulinjan C666-1 kautta korjuu kasvain aloilla. Kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia in palloja muodostavan C666-1 subpopulaatio saatu vahvistettiin osoittamalla ylössäätöä useiden kantasolun liittyvien geenien ja korkea tuumorigeenisyyden nude-hiirissä [9], [18], [19]. Kautta kattava luonnehdinta NPC pallosia, tuumorilinjoja ja primaarikasvaimen, olemme paljastaneet, että CD44 ja Sox2 ovat mahdollisia CSC merkkiaineita NPC. Solunpintamarkkereiden ovat ratkaisevia määritettäessä CSCS joukosta heterogeenisen syöpäsoluja. CD44 on hyaluronaania reseptorin ja on osoitettu olevan markkeri CSCS pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [7]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että CD44 ilmentyminen rikastunut NPC CSCS. Osoituksena siitä huomattavasti korkeampi palloja muodostavan valmiudet CD44 + NPC soluja, CSC subpopulaatio vahvistettiin rikastettu tässä CD44 + fraktiossa. Vastus CD44 + solujen 5-FU hoito on yhdenmukaiset ehdotetun CSC ominaisuuksia. Lisäksi CD44, tutkimuksemme myös havaittu rikastumista Sox2 ilmentävien solujen palloset, toiminnallinen NPC CSCS. Mielenkiintoista, samantasoista Sox2 transkriptien todettiin sekä palloja muodostavan ja vanhempien C666-1 soluja. Mukaan meidän julkaisematon havainto, lisääntynyt Sox2 proteiinin ilmentyminen voi johtua menetys Sox2-tukahduttaa miRNA (miR-183 ja miR-203) in palloset. Sox2 on transkriptiotekijä, joka ohjaa pluripotenttisuus alkion ja aikuisen kudosten kantasolujen [20]. Se säätelee kantasolujen itseuudistumiseen ja erilaistumista ja on usein todettu olevan säädelty ihmisen syövissä [21]. Zhang

et al

. (2010) on ehdottanut, että Sox2 + soluilla stemness ominaisuuksia [12]. Ne ovat osoittaneet, että Sox2 ekspressoitiin ja yhteistyötä paikallistaa Oct4 perusterveydenhuollossa NPC. Yhdenmukaiset Zhang havainnoista, meidän tulokset osoittivat, että CD44 + Sox2 + solut rikastettu NPC CSCS.

eristäminen palloja muodostavan solujen EBV-positiivisten NPC solulinja antanut meille mahdollisuuden arvioida ilmaus EBV piilevä ja lyyttinen geenien CSC. Erityisesti kohonnut ilmentyminen EBV piilevä geenituotteiden, EBER1, BARF1 ja LMP1 havaittiin CSC alaryhmästä. Olemme aiemmin osoittaneet, että ilmaus Eberin antaa vastustuskyvyn apoptoottinen stressiä [22]. Korkea Eber ilmentyminen NPC CSCS viittaa siihen, että tämä solu alaryhmässä ehkä enemmän vastustuskykyisiä apoptoosin. Toisaalta, LMP1 voi aiheuttaa EMT kautta Twist tai Snail, joka on sama kuin hankinta CSC ominaisuuksista [23], [24], [25]. Lisäksi Kondo

et al

. ovat myös äskettäin osoittaneet, että LMP1 indusoi CD44 + CSC nenänielun epiteelisolujen [26]. Havainnot tarkoita, että LMP1 ilmaisu voi olla ratkaiseva merkitys CSC kunnossapidon tässä EBV: hen liittyvien maligniteetti.

Lisäksi EBV piilevä geenit, meidän microarray analyysi paljasti yli-CCR7- NPC-johdettu pallosia. Rikastamista CCR7 + solupopulaation alalla-muodostavien solujen vahvistettiin virtaussytometrialla. CCR7- on kemokiinireseptori, joka välittää soluvaelluksen vastauksena sen ligandin CCL21 [27]. On todennäköistä, että suuri CCR7 reseptorin ilmentymisen alalla muodostavien solujen parantaa sen herkkyyttä ligandien ja aktivoi alavirran signalointia. Poikkeava CCR7- ilmentyminen ihmisen maligniteettien on yhdistetty solujen selviytymiseen ja metastaattisen polkuja. CCL21 /CCR7- reitti voi olla ratkaiseva merkitys etäpesäkkeiden CCR7- + CSCS imusolmukkeisiin [28]. N yli-ilmentyminen CCR7- in CSCS on omiaan edistämään usein kohdunkaulan imusolmukemetastaaseja NPC potilailla [29]. Poistetun palloja muodostavan kyky NPC solujen jälkeen CCR7- neutraloinnin ehdotti CCR7- voi säädellä CSC ominaisuuksia NPC.

Lääkeaineresistenssi on tärkeä ominaisuus CSCS, joka muodostaa perustan kasvaimen uusiutumisen jälkeen kemoterapia-hoitojen [30 ]. Lisääntynyt ilmentyminen ATP-sitova kasetti (ABC) kuljettaja perhe vastaa ulosvirtausta terapeuttisten lääkkeiden ja on yhteinen mekanismi ylläpitämiseksi lääkeresistenssin CSCS [31], [32]. Kuten on esitetty meidän microarray tutkimuksessa merkittävä yliekspressio ABCC3 ja ABCC11 todettiin alalla muodostavia soluja. ABCC3 on jäsen monilääkeresistenssiin proteiinia (MRP) alaperheen ja sen osoitettiin olevan yli-ilmentynyt munasarjasyövän ja doksorubisiini-resistenttejä keuhkosyövän solulinjassa [33], [34]. ABCC3 yliekspressio voi osaltaan lääkkeille vastustuskykyiset ominaisuudet sisplatiinipohjaisen /doksorubisiini-resistenttejä C666-1 solulinjoissa (kuvio. S5). ABCC11 on toinen MRP perheenjäsen säädellään ylöspäin NPC-johdettu pallosia. Se on tärkein kuljettaja 5-fluorourasiilin (5-FU) [35], joka on yksi tärkeimmistä kemoterapeuttisten lääkkeiden NPC [3]. Yli-ilmentyminen ABCC11-alalla muodostavia soluja viittaa siihen, että CSC väestön NPC kestää kemoterapeuttisten ja siten edistää kasvaimen uusiutumisen.

Hedgehog signalointireitille on tärkeä säätelijä CSC huolto ja toiminta. Vuonna C666-1 sferoidit, microarray tutkimus on myös havainnut lisääntyneen ilmentymisen GLI1, merkittävä transkription aktivaattori hedgehog-signalointireitin. Munasarjojen syöpä, GLI1 raportoitiin säädellä kasvua CSCS [36]. Valaistaan ​​roolin GLI1 ja hedgehog-reitin NPC CSCS vaikutukset hiljentäminen GLI1 ilmaisun muodostumiseen ja tuumorigeenisen ominaisuuksiin pallo muodostavien solujen tutkitaan. Selvittäminen on signalointi sääntelymekanismeissa lisääntymistä ja apoptoosia NPC CSCS hyödyttää hoitojen kohdistetaan tämän alaryhmän huumeiden resistenttien solujen.

Yhteenvetona olemme tunnistaneet hyvin tuumorigeenisia CSCS EBV-positiivisten NPC ja tämän alaryhmän voisi olla rikastaa solun pinnalla CD44 ja tunnistettu yhdessä Sox2. Tutkimuksemme on löytänyt useita ratkaiseva molekyylejä kuten CCR7- ja ABCC11 mukana ylläpitoon NPC CSC toimintoja. Esillä olevat havainnot tarjosi perustan kehittämiseen Uusien hoitomuotojen kohdistaminen NPC CSC jotka voivat voimistaa tehoa nykyiset hoidot.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines, ksenoqraftit ja primaarikasvainten

EBV-positiivisten NPC solulinja (C666-1) ja 3 ksenograftit (xeno-666, ksenotransplantaatiolla 2117 ja C17) sisällytettiin tutkimuksessa [13], [14], [15]. Vanhempien C666-1 viljeltiin RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen). Kasvaimen alalla kulttuurin, soluja viljeltiin seerumivapaassa DMEM-F12 (Invitrogen) ultra-low kiinnityslevyt. Sferoidit hajotettiin ja siirrostettiin välein 6-8 päivää. Yhteensä 1 x 10

6 C666-1 solua siirrostettiin hyvin ja määrä pallosia muodostunut laskettiin.

Viisi endoskooppinen kasvainbiopsioissa FACS-analyysi saatiin NPC potilaalla on kirjoitettu suostumukset on Department of Korva-, Prince of Wales sairaalan, CUHK. Kaikki tapaukset olivat positiivisia

Eber

–

in situ

hybridisaatio- ja histologisesti diagnosoitu erilaistumaton tai huonosti eriytetty NPC. Olemme myös rekrytoitiin 49 arkistointiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut primaarikasvaimia kudoksesta pankin laitos Anatomical Cellular Pathology, CUHK immunohistokemiallista (IHC) värjäys. Tutkimuksen protokolla hyväksyi Clinical Research eettisen komitean Kiinan University of Hong Kong.

kvantitatiivinen Käänteinen transkriptio ja polymeraasiketjureaktiota (qRT-PCR) analyysi

Yhteensä-RNA: t eristettiin käyttäen Qiagen RNeasy-kittiä (Qiagen) ja käänteiskopioitiin cDNA: han käyttämällä SuperScript cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) valmistajan protokollaa. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin sitten erityisiä alukkeita (Invitrogen, alukesekvenssit on lueteltu taulukossa S1) ja Power SYBR® Green PCR-seosta (Applied Biosystems). β-aktiinin ilmentymistä käytettiin datan normalisointi. Kaikki qRT-PCR: t suoritettiin kolmena rinnakkaisena ABI 7500 reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems), kuten valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Fluoresenssi soluerotte- (FACS) analyysi

Yhden solun suspensioita saatu solulinjoista ja kasvainten kudokset huuhdeltiin kahdesti ja uudelleensuspendoitiin PBS: ssä (10

5-10

6 solua /100 ui). Solunsisäiseen värjäys, solut kiinnitettiin 70% etanolilla 24 tunnin ajan -20 ° C: ssa ennen rehydratoimalla PBS: llä.