Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hypoksia tiedetään olevan kriittiset rooleja solujen eloonjäämisessä, angiogeneesissä, kasvaimen invaasio, ja etäpesäkkeitä. Hypoksia välittyy-ilmentyminen hypoksia-indusoituva tekijä (HIF) on osoitettu liittyvän terapeuttisen vastus, ja edistää huonoon ennusteeseen syöpäpotilaita. Kehittyvät todisteet viittaavat siihen, että hypoksia ja HIF väyliä edistää hankintaan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), ylläpito syövän kantasolujen (CSC) toiminnot, ja myös ylläpitää noidankehä tulehduksen kaikille, jotka johtavat terapeuttiseen vastarintaa. Kuitenkin tarkka molekyylimekanismin (t), johon hypoksia /HIF ajaa nämä tapahtumat eivät ole täysin ymmärretty. Tässä osoitamme, ensimmäistä kertaa, että hypoksia johtaa lisääntyneeseen VEGF: n ilmentymistä, IL-6, ja CSC allekirjoitus geenit Nanog, Oct4 ja EZH2 sopusoinnussa lisääntynyt solumigraatioon /invaasion ja angiogeneesin, ja muodostuminen pancreatospheres, samanaikainen lisääntynyt ilmentyminen miR-21 ja miR-210 ihmisen haimasyövän (PC) soluja. Hoito PC-solujen CDF, uusi synteettinen yhdiste inhiboi VEGF: n ja IL-6, ja alas-säädellä ilmentymistä Nanog, Oct4, EZH2 mRNA: t, sekä miR-21 ja miR-210 hypoksiassa. CDF myös vähensivät solujen vaeltamiseen /invaasio, angiogeneesin, ja muodostuminen pancreatospheres hypoksiaolosuhteissa. Lisäksi CDF vähentynyt geenin ilmentyminen miR-21, miR-210, IL-6, HIF-1α, VEGF, ja CSC allekirjoitukset

in vivo

hiirimallissa ortotooppisten malli ihmisen PC. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että antituumorivaikutuksen CDF on osittain välittyvät vapautuminen kasvain hypoksinen polkuja, ja näin CDF voisi tulla uusi ja tehokas kasvainten vastaisen aineen PC hoitoa.

Citation: Bao B, Ali S, Ahmad A, Azmi AS, Li Y, Banerjee S et al. (2012) Hypoksia-aiheuttama aggressiivisuus haimasyöpäsoluissa johtuu kohonneista Expression of VEGF, IL-6 ja miR-21, joka voidaan vaimentaa CDF hoito. PLoS ONE 7 (12): e50165. doi: 10,1371 /journal.pone.0050165

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 elokuu 2012; Hyväksytty 22 lokakuuta 2012 Julkaistu: 13 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Bao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Cancer Institute, National Institutes of Health myöntää R01CA131151, R01CA132794 ja R01CA154321 myönnetty FHS, ja puolustusministeriön Exploration-hypoteesi Development palkinto PC101482 myönnetty Bin Bao. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Co-kirjailija Dr. Sarkar on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Haimasyöpä (PC) on yksi tappavan pahanlaatuisten sairauksien kanssa köyhimpien kliinisen tulos maailmassa. Vuonna 2012 on arvioitu, että 43, 920 koehenkilöitä hiljattain diagnosoitu PC, ja osuus on 37, 390 syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa [1]. Puuttumisen vuoksi erityisiä oireita, puute varhaiseen havaitsemiseen tekniikoita, ja erittäin aggressiivinen fenotyyppejä, PC diagnosoidaan yleensä edistyneessä-parantumaton ja metastasoitunut vaiheissa [2], [3]. Siten mediaani kokonaiselinaika on noin kuusi kuukautta kirurgisen ja Kemoterapia hoitoja paikallisesti levinneen ja metastasoituneen vaiheissa PC. Näin ollen viiden vuoden yleinen eloonjäämisaste on alle viisi prosenttia. Tällainen lyhyempi eloonjäämisaste johtuu ensisijaisesti myöhäinen diagnosointi ja terapeuttinen kestävyys, edistää kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäkkeitä.

Hypoksia on yksi tärkeimmistä biologisten ilmiöiden jotka liittyvät vahvasti kehittämiseen ja aggressiivisuus monenlaisia kiinteiden kasvainten kuten PC. Hypoksian indusoima tekijä (HIF) ovat keskeinen transkriptiotekijä, joka välittää hypoksian reagoiva geenejä ja on laajasti hyväksytty kriittisiä rooleja kasvaimen invaasio, etäpesäke, ja hoito kestävyys, koska sen lisääntynyt solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, angiogeneesiä ja solujen vaeltamiseen ja invaasio [4], [5]. Siksi kasvain hypoksia muuttuneisiin ilmaus HIF ja sen biologinen vaikutus tulokseen köyhemmillä kliininen tulos potilaiden diagnosoitu kiinteitä kasvaimia, jolloin lisääntynyttä kuolleisuutta, mikä viittaa siihen, että ymmärtäminen molekyyli suhde hypoksian muihin molekyyli- ja solutason ominaisuuksiin kasvaimen aggressiivisuus, olisi korvaamaton kehittää uusia terapeuttisia strategioita hoitoon kiinteiden kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen. On yleisesti hyväksytty, että syövän kantasoluja (CSCS) ja epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppinen solut ovat erittäin terapeuttiset kestävyys ja edistää aggressiivinen kasvaimen kasvua, invaasio ja metastaasi, ja yleisesti pidetään yhtenä tärkeimpiin syihin kasvaimen uusiutumisen ja uusiutumisen [6]. Tiedot määrän kasvu tutkimukset osoittavat, että hypoksia ja HIF-signalointireitin lukemiin rikastumista CSCS ja EMT solujen arvosteli äskettäin [7], myötävaikuttaa kasvaimen aggressiivinen fenotyyppejä, jotka voivat johtua myös vapauttamisen MikroRNA (miRNA).

miRNA tunnetaan hyvin pelata keskeisiä rooleja in monenlaisia ​​biologisten prosessien, kuten solujen erilaistuminen, proliferaatio, kuolema, selviytyminen, aineenvaihduntaa ja energia homeostaasin [8], [9]. Kertyvät todisteet viittaavat siihen, että miRNA saattaa olla kriittinen rooli kehityksen ja etenemisen pahanlaatuisten disaeses. Alternations miRNA ilmaisun on kuulemma liittynyt kliininen tulos kasvain potilaiden hoito vastus, kasvaimen uusiutumisen ja /tai uusiutumisen. Suuri määrä miRNA on raportoitu reagoivan hypoksia ja HIF-signalointireitin monenlaisia ​​solujen ja kudosten, mukaan lukien syöpäsolut [10] – [13]. On havaittu, että hypoksia vähentynyt ilmentyminen miR-101, mahdollinen anti-onkogeenisen molekyylin, ja lisääntynyt ilmentyminen miR-21 ja miR-210, pro-onkogeenisen molekyylien useita syöpiä, kuten PC: [14], [15]. Siten hypoksia välittämää sääntely miRNA voi olla tärkeä rooli kasvainten aggressiiviseen fenotyypit välittyvä modulaatio solun signalointireittien lukien HIF signalointireitin sisällä kasvain mikroympäristön. Siksi kohdentamalla hypoksia välittämää miRNA voisi tarjota käyttöön uusi ja tehokas terapeuttinen strategia ehkäisyyn ja /tai hoitoon kiinteiden kasvainten kuten PC.

Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutusta hypoksia solumigraation, invaasio ja angiogeneesi, ja VEGF: n ilmentymistä, IL-6, CSC allekirjoitus geenit, miR-21 ja miR-210 PC-soluja hypoksisissa olosuhteissa. Tutkimme myös roolia miR-21 säätelyssä VEGF, IL-6, muodostumista pancreatospheres, ja CSC allekirjoitus geenien PC soluissa. Lisäksi tutkimme vaikutus uusi synteettinen johdannainen curcumin (CDF) solun selviytymisen, muuttoliike, invaasio, angiogeneesi, muodostumista pancreatospheres, ja ilmaus HIF-1α, VEGF, IL-6, CSC allekirjoitus geenejä, ja miRNA PC soluja hypoksinen olosuhteissa. Lopuksi tutkittiin, mikä vaikutus CDF Mir-21, miR-210, HIF-1α, VEGF, ja CSC allekirjoitus markkereita

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja vasta

A novel curcumin johdettu analoginen CDF syntetisoitiin kuten kuvattu aiemmin julkaisussa [16]. Vasta-aineet CD44, EpCAM, ja HIF-1α saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineita Ki-67 ja VEGF ostettiin Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Vasta-aine EZH2 saatiin BD Biosciences (San Jose, Kalifornia). Alexa Fluor-488 vuohen anti-hiiri-IgG: n CD44 ja EpCAM värjäys saatiin Invitrogen. Mirna käänteistranskriptio (RT) alukkeet, PCR-koettimien, ja anti-miR-21-estäjä saatiin Applied Biosystems (Carlsbad, CA). Kristalliviolettia ja Matrigel liuos saatiin Sigma Chemicals (St. Louis, MO).

Soluviljely

Ihmisen haimasyövän (PC) solulinjat AsPC-1 ja MiaPaca-2-soluja pidettiin standardi kulttuurin ja happiolosuhteissa (21% O2 ja 5% CO2, 37 ° C), kuten aiemmin on kuvattu [17]. Hypoksinen (1% O

2) ja 5% CO

2 olosuhteet syntyvät valvonnan panos virtausnopeudet typen ja hiilidioksidin, vastaavasti. Kaikki solulinjat pidettiin yllä 10% FBS-DMEM-alustassa on vakio soluviljelmässä kunnossa. Kaikki solulinjat ole todistettu oikeaksi Applied Genomics Technology Center Wayne State University 13. maaliskuuta 2009, ja nämä todennettu solut pakastettiin myöhempää käyttöä varten. Menetelmää käytettiin testaamiseen oli lyhyt tandem-toisto profiloinnin avulla PowerPlex 16 System Promega. Gemsitabiini

Solun eloonjääminen määritys

MTT -koe sen vaikutuksen tutkimiseksi CDF solun eloonjäämiseen ihmisen PC-soluissa (AsPC-1 ja MiaPaca-2-solut) hypoksisissa olosuhteissa. 3000 solua siirrostettiin jokaiseen kuoppaan 96-kuoppaisille levyille ja niitä inkuboitiin vakio viljelyolosuhteissa (21% O

2 ja 5% CO

2) yön yli. Solut käsiteltiin sitten eri pitoisuuksilla CDF (0-0,5 uM) ja niitä inkuboitiin 8 h hypoksisissa olosuhteissa (1% O

2) ja tämän jälkeen 16 h happiolosuhteissa (21% O

2), joista kukin päivä. 3 päivän kuluttua hoidon jälkeen solut kerättiin standardin MTT-analyysi, kuten kuvattu edellisessä julkaisuissa [18], [19].

klonogeeninen määritys

klonogeeninen määritys suoritettiin tutkia vaikutus CDF solujen kasvua ja lisääntymistä PC-solujen hypoksisissa olosuhteissa, kuten aiemmin on kuvattu [18]. 5 x 10

4 solut maljattiin 6-kuoppalevylle. Jälkeen 3 päivää altistuksen 0,5 uM CDF (8 h hypoksisissa olosuhteissa ja 16 h happiolosuhteissa päivässä), solut trypsinoitiin, ja 1000 yhdessä elävät solut ympättiin 100 mm: n petrimaljoille. Sitten soluja inkuboitiin 10-12 päivä 37 ° C: ssa 5% CO

2/5% O

2/90% N

2-inkubaattorissa. Pesäkkeet värjättiin 2% kristalliviolettia, pestään vedellä, ja laskettiin.

invaasiomääritys

in vitro

invaasiomääritys PC soluja suoritettiin hypoksisissa olosuhteissa käyttäen Costar Transwell 24-kuoppalevyillä, joissa polykarbonaattikalvon (Corning Incorporated, Corning, NY), kuten aiemmin on kuvattu [19]. Lyhyesti, 4 x 10

4 ihmisen PC-solujen (AsPC-1 ja MiaPaca-2), jotka altistuivat 3 päivää inkuboinnin mukaisesti normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa, vastaavasti, ympättiin kuhunkin kuoppaan Matrigel esipäällystetty Transwell levyt FBS-vapaa elatusaineet. Pohja kuoppiin järjestelmän täytettiin 10% FBS: ää täydellistä kasvualustaa. 20 h kuluttua inkuboinnin joko puuttuessa tai läsnä ollessa CDF (0,5 uM), The hyökkäsi syövän solut värjättiin 4 ug /ml kalseiini-AM: n (Invitrogen) PBS-liuoksessa 37 ° C: ssa 1 h, sen jälkeen, kun valmistajan manuaalinen. Kuvat on otettu käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Nikon ECLIPSE TE2000-U) liitetty tietokoneeseen.

Haavan paranemista määritys

vaikutuksen tutkimiseksi CDF solujen migraatio PC solujen hypoksisissa olosuhteissa teimme haavojen määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, kun AsPC-1 solut saavuttivat 90-95% konfluentteja, haava saatiin aikaan raaputtamalla pinnan levyjen kanssa 10-200 ui pipetin kärjen. Sitten soluja inkuboitiin poissa ja läsnä ollessa CDF (0,5 uM) ja inkuboitiin hypoksisissa olosuhteissa 4 tuntia, jonka jälkeen 16 h happiolosuhteissa, ja valokuvattiin sitten käyttäen Nikon Eclipse TS100 mikroskoopilla.

putkenmuotoilu- määritys

vaikutuksen tutkimiseksi CDF angiogeneesiin

in vitro

käyttäen verisuonten endoteelisolujen hypoksisissa olosuhteissa, teimme putken muodostumiseen määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, 3 x 10

4 kaniinin verisuonten endoteelisolujen ympättiin kuhunkin kuoppaan Matrigel-esipäällystetty 96-kuoppaisen levyn 100 ui 10% FBS-DMEM-alustassa, ja altistettiin normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 4 tuntia inkuboinnin 37 ° C: ssa, jonka jälkeen 16 h happiolosuhteissa. Kuva on otettu 4 tuntia ja 20 h.

Sytokiinit VEGF ja IL-6-määritys

ELISA -koe sen vaikutuksen arvioimiseksi CDF happivajaus aiheuttama sytokiini tuotannoissa VEGF ja IL-6 ihmisen PC soluja. Elatusaineet soluista hypoksisissa tai happiolosuhteissa vastaavasti 16 tunnin kerättiin mittausta varten VEGF ja IL-6 käyttämällä ELISA-määritystä sarjat (R Invitrogen), ja altistettiin hypoksisissa olosuhteissa joka toinen päivä. Jälkeen 7 päivää, pallot, jossa halkaisija on suurempi kuin 50 μmeters kutsutaan nimellä ”pancreatospheres” kerättiin sentrifugoimalla (300 x g 5 min), ja laskettiin.

Immunovärjäys määrityksessä ja konfokaalimikroskopialla

10000 yhden solun suspensioita PC solua kuoppaa kohti ympättiin ja inkuboitiin 24 tuntia käyttäen ultra low tarttuva kuoppiin 6-kuoppalevyllä (Corning, Lowell, MA) alalla muodostumiseen väliaineessa, minkä jälkeen viljelemällä hypoksisissa olosuhteissa joka toinen päivä, kuten edellä on kuvattu. Jälkeen 7 päivää CDF hoidon pancreatospheres kerättiin sentrifugoimalla (300 x g 5 min), pestään 1 x PBS: llä, ja kiinnitettiin 3,7% parformaldehyde 10 min huoneen lämpötilassa. Monoklonaaliset CD44 ja EpCAM-vasta-aineita käytettiin immunovärjäyksessä määrityksessä, seuraten valmistajan protokollaa, kuten aiemmin on kuvattu [17], [21]. CD44 tai EpCAM-leimatun pancreatospheres valokuvattiin käyttäen konfokaali kuvantamisen mikroskoopilla (Leica TCS SP5) 200 x suurennus MIRL Core laitos, Wayne State University School of Medicine.

transfektio anti-miR-21 siRNA

2 x 10

5 solua /kuoppa (emo MiaPaca-2-solut) tai 10000-soluja (MiaPaca-2 pallo solut) kuoppaa kohti ympättiin kuudella-kuoppalevyille ja transfektoitiin anti-miR-21 siRNA tai negatiivinen kontrolli siRNA (Ambion, Austin, TX) lopulliseen konsentraatioon 20 nM käyttäen DharmaFECT transfektioreagenssia (Dharmacon), seuraten valmistajan protokollaa, kuten aiemmin on kuvattu [17].

Reaaliaikainen kääntää transcriptase- polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) mRNA: iden ja miRNA

määrittää suhteellinen mRNA-tasoja, kaksi mikrogrammaa kokonais-RNA: t uutettiin kustakin näytteestä käytettiin RT reaktiossa 20 ul: n reaktiotilavuudessa käyttäen käänteistranskriptio-järjestelmä (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden. SYBR Green PCR Assay Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) käytettiin reaaliaikaista PCR-reaktiolle käyttäen AB StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) seuraten valmistajan protokollaa. Sekvenssit PCR-alukkeet on kuvattu aikaisemmin [19]. Aineisto analysoitiin C

t menetelmä ja normalisoitiin GAPDH ilmaisun kussakin näytteessä. Ekspression määrittämiseksi ja miRNA soluissa, TaqMan MicroRNA Assay Kit (Applied Biosystems) käytettiin seuraavasti valmistajan protokollaa. Viisi ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio kuten aiemmin on kuvattu [19]. Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin sitten kokonaistilavuudessa 10 ui reaktioseosta käyttäen TaqMan PCR liuosta kuten aiemmin on kuvattu [17]. Aineisto analysoitiin C

t menetelmä ja normalisoitiin RNU48 ilmaisun kunkin näytteen.

Eläinkokeet

protokolla eläinkoeluvan hyväksyttiin Animal Investigation komitean, Wayne State University, Detroit, MI. Nainen CB17 sekamuotoinen immuunivajavaisissa (SCID) hiiriä iässä 4 viikkoa vanha hankittiin Taconic Farms (Germantown, NY) ja syötettiin Lab Diet 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN). 10 x 10

6 MiaPaca-2-soluja ortotooppisesti istutetaan haima hiirten, kuten on kuvattu aikaisemmassa julkaisussa [17], ja näin ollen antituumorivaikutus tietoja ei ole esitetty tässä. Kun hiirille kehittyi palpoitavissa kasvaimia, eläimet jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään: (1) käsittelemätön kontrolli; (2) CDF (5 mg /hiiri /vrk), mahan kerran päivässä 12 päivää. Kasvain mittaukset ja muutoksia painon tehtiin. Kasvainkudoksen kaikkien ryhmien eläimet poistettiin, jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä, ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten RNA: ta ja histologia tutkimuksessa on esitetty tässä käsin.

perustaminen MiaPaC-2 kasvaimen pallo solut

jotta voidaan tutkia vaikutuksen CDF tai anti-miR-21 VEGF, IL-6, CSC allekirjoitusta CSC kaltainen alipopulaatio kasvainsolujen kehitimme MiaPaca-2 kasvain alalla soluja hiiri ksenograftimallissa, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, noin 5000 pancreatospheres of MiaPaca-2-soluja istutettiin ksenograftissa hiirimallissa (4 viikon iässä) rikastamiseksi syövän kantasolujen (CSC) väestöstä. Kasvain poistettiin ja soluja viljeltiin alalla muodostumiseen väliaineessa, kuten edellä on kuvattu, kehittää toisen pancreatospheres, joka on tarkoitettu nimellä ”MiaPaca-2 kasvaimen alalla solut”. MiaPaca-2 kasvain alalla soluja ominaista myös aikaisemmassa julkaisuissa [17], [22].

immunohistokemia

Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut kasvainkudossektioista arvioitiin immunohistokemia ydin laitos, Department of Pathology, Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, 5-15 um kudos leikattiin ja kiinnitettiin gelatiinipäällystetyille histologisia dioja. Deparaffinizations dioja suoritettiin käyttäen ksyleeniä liuokseen, mitä seurasi pesu eri pitoisuuksilla alkoholin ja deionisoitua vettä. Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin käyttäen Ki-67 (1:400), HIF-1α (1:100), VEGF (1:100), EpCAM (01:50), ja EZH2 (01:50) ensisijainen vasta-aineiden sopivia laimennoksia ja käyttämällä isännän normaalin seerumin negatiivisten kontrollien seurasi värjäys asianmukaiset piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla, sen jälkeen, kun valmistajan ohjeen. Lasit kehitettiin liuoksessa diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia ja vastavärjättiin heikko ratkaisu hematoksyliinillä käyttämällä ABC-reagenssipakkausta (Vector Labs), jota seurasi tumavärjäystä käyttäen AEC -värjäyspakkausta (Vector Labs). Värjättyjä laseja poistettiin vesi ja asennettu Permount-peitinlaseilla liuokseen ja tutkittiin lisensoitu patologi. Kuvat on otettu käyttämällä Nikon ESLIPSE E800 20-kertainen suurennus. Immuunihistokemialliset värjäys sai yleisarvosanaksi perustuu värjäytymisen intensiteetti (ei värjäystä nolla; heikko 1+; kohtalainen 2+; vahva kuin 3+) lisättiin yhdessä prosenttia positiivisia soluja (ei värjäystä nolla; 25% kuten 1+; 25-50% 2+ ja yli 50% kuten 3+).

tilastollinen

keskiarvo ja keskihajonta (SD) dataa tässä tutkimuksessa valmistettiin käyttämällä GraPad Prism-ohjelmiston (versio 4.03). Vertailuja hoitotuloksia testattiin merkittävää eroa, jonka pariksi

t

testiä tai ANOVA. Tilastollinen merkitsevyys otetut

p

arvo on alle 0,05.

Tulokset

CDF lisääntynyt solujen eloonjäämistä ja kyky muodostaa klooneja PC solujen hypoksisissa olosuhteissa

tutkiakseen vaikutuksen CDF solun eloonjäämiseen ihmisen PC-soluissa hypoksisissa olosuhteissa, MTT määritys suoritettiin käyttäen ihmisen PC soluja (AsPC-1 ja MiaPaca-2-solut). Tulokset osoittavat, että CDF estettiin merkittävästi solujen selviytymisen AsPC-1 ja MiaPaca-2-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1A). Klonogeenisten määritys suoritettiin tutkimaan vaikutusta CDF (0,5 umol /l) solun kasvun ja lisääntymisen PC-solujen hypoksisissa olosuhteissa. Tulokset osoittivat, että CDF käsittely laski kyky muodostaa klooneja AsPC-1 ja MiaPaca-2-solut hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 1 B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että CDF estää solujen eloonjäämistä ja klonogeenisten kasvua PC-solujen hypoksisissa olosuhteissa.

paneelit A, B, C, ja D, edustavat solujen kasvua, kyky muodostaa klooneja, VEGF: n ja IL-6, vastaavasti. Esikäsitelty väliaine kerättiin soluista kasvatettu normoxic ja hypoksisissa olosuhteissa, kuten kohdassa menetelmät jaksossa. Mittaukset VEGF: n ja IL-6 tehtiin ELISA: lla. Palkit listoilla osoittavat keskihajonnan (SD) on vähintään n = 3 * osoittaa p 0,05.

vaikutus CDF on tuotannoissa VEGF ja IL-6 sytokiinien PC soluja hypoksinen olosuhteet

tutki myös vaikutusta CDF happivajaus aiheuttama VEGF ja IL-6 tuotannot PC-soluihin käyttäen ELISA-määritystä. Tulokset osoittavat, että AsPC-1 ja MiaPaca-2-soluja inkuboitiin hypoksisissa olosuhteissa lisäsi tuotannoissa VEGF: n ja IL-6, verrattuna soluja inkuboitiin happiolosuhteissa (kuvio 1C). CDF käsittely huomattavasti vähentynyt tuotanto hypoksian indusoiman VEGF: n ja IL-6: n PC-soluissa (kuvio 1C), mikä viittaa siihen, inhibitorinen rooli CDF tuotannoissa hypoksian indusoiman VEGF: n ja IL-6: n ihmisen haimasyövän soluja.

vaikutus CDF angiogeneesistä

in vitro

verisuonten endoteelisoluissa hypoksisissa olosuhteissa

jotta voidaan tutkia vaikutusta CDF angiogeneesiin

in vitro

hypoksisissa olosuhteissa teimme putken muodostumiseen määrityksessä käyttäen verisuonten endoteelisoluissa. Tulokset osoittavat, että hypoksisissa olosuhteissa huomattavasti putken muodostumista verisuonten endoteelisolujen 4 h ja 20 h inkubointeja, vastaavasti, verrattuna happiolosuhteissa (p = 0,0016 ja p = 0,016, vastaavasti; n = 3). CDF hoito inhiboi merkittävästi hypoksian indusoiman putken muodostumiseen verisuonten endoteelisolujen (p = 0,004; n = 3) (kuvio 2A). Sen arvioimiseksi, onko CDF välittämä molekyylejä tai CDF itsessään edistää estyminen putken muodostumiseen, keräsimme kuin CDF-käsiteltyjen (kontrolli) ja CDF-käsitelty elatusaine syöpäsoluista ja johdetaan putken muodostumista määrityksessä alle normoxic olosuhteissa. Kuten on esitetty kuviossa 2B, verisuonten endoteelisolujen inkuboitiin ohjattu kunnossa media oli kasvanut putken muodostumiseen 4 h ja 20 h, verrattuna soluihin inkuboitiin CDF-esikäsitelty väliaine (p = 0,029 ja p = 0,011; n = 3). Lisäksi CDF valvontaan elatusaine inhiboi merkittävästi putken muodostumiseen verrattuna soluja inkuboitiin sekä kontrolli- väliaine ja CDF-esikäsitelty väliaine (p = 0,0001, n = 3) (kuvio 2B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että CDF itsessään edistää inhibition putken muodostumista verisuonten endoteelisolujen.

paneelit A B, C solumigraation arvioitiin haavan paranemista määritys; invaasio arvioitiin kammio invaasiomääritys.

vaikutus CDF solun muuttoliikettä ja invaasiota in vitro PC soluissa hypoksisissa olosuhteissa

Haavanparantamislaite -koe sen vaikutuksen tutkimiseksi CDF solun migraatio PC solujen hypoksisissa olosuhteissa. Kuten kuviossa 2C on esitetty, hypoksian alttiina AsPC-1-solut oli lisääntynyt haavan paranemista kapasiteettia, verrattuna soluihin viljelty normaaleissa happiolosuhteissa (p = 0,0001, n = 3) (kuvio 2C). CDF hoito esti haavojen paranemista kapasiteettia syöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa (p 0,05; n = 3) (kuvio 2C ja D). Vaikutuksen tutkimiseksi CDF on invaasion PC solujen hypoksisissa olosuhteissa, teimme

in vitro

invaasiomääritys. Kuten on esitetty kuviossa 2E, sekä AsPC-1 ja MiaPaca-2-soluja altistetaan hypoksisissa olosuhteissa oli kasvanut kapasiteetti invaasio, verrattuna soluihin altistetaan happiolosuhteissa. CDF hoito esti kapasiteettia hypoksian aiheuttaman hyökkäystä PC soluja. Nämä tiedot viittaavat siihen, että CDF voi estää hypoksian aiheuttamaa solumigraation ja invaasion ihmisen PC soluja.

vaikutus CDF on geenien ilmentymisen CSC merkkiaineiden PC soluissa hypoksisissa olosuhteissa

reaaliaikainen RT-PCR-määritys suoritettiin tutkimaan vaikutusta CDF syövän kantasoluja (CSC) allekirjoitus geenejä AsPC-1 ja MiaPaca-2-solut hypoksisissa olosuhteissa. Kuten kuviossa 3 on esitetty, hypoksian indusoiman suhteellinen mRNA-tasoja ja Nanog, Oct4, ja EZH2 in AsPC-1 ja MiaPaca-2 soluissa, kun taas CDF laski tasot Nanog, Oct4, ja EZH2 mRNA PC-soluissa hypoksisissa olosuhteissa.

Reaaliaikainen RT-PCR käytettiin kuvatulla alla menetelmät jaksossa. Palkit listoilla osoittavat SD n = 3. * osoittaa p 0,05.

vaikutus CDF on microRNA (miRNA) ilmentymistä miR-21 ja miR-210 PC-soluissa hypoksisissa olosuhteet

jotta voidaan tutkia vaikutusta CDF on miRNA ilmentymistä PC-soluissa hypoksisissa olosuhteissa, mittasimme suhteelliset tasot miR-21 ja miR-210 hypoksisissa olosuhteissa reaaliaikaisella RT-PCR. Kuten kuviossa 3 on esitetty, hypoksian indusoiman suhteellinen miRNA tasot miR-21 ja miR-210 AsPC-1 ja MiaPaca-2 soluissa, kun taas CDF laski tasot miR-21 ja miR-210 PC-soluja hypoksisissa olosuhteissa, mikä viittaa siihen, että CDF on voimakas agentti lieventäviä hypoksian indusoima miR-21 ja miR-210 ihmisen PC-soluissa.

vaikutus CDF tai anti-miR-21 CSC kyky uusiutua ihmisen PC solut hypoksisissa olosuhteissa

sen arvioimiseksi vaikutuksen CDF tai anti-miR-21 CSC kyky uusiutua ihmisen PC solujen hypoksisissa olosuhteissa, teimme alalla muodostumista määrityksessä käytetään AsPC-1 ja MiaPaca-2-soluissa. Tulokset osoittavat, että anti-miR-21 vähensi muodostumista pancreatospheres in MiaPaca-2-soluissa (kuvio 4A). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-21 voi olla tärkeä rooli sääntelyn kyky uusiutua CSC-kuten PC-soluissa. Vastaavasti, CDF hoito vähensi muodostumista pancreatospheres in AsPC-1 ja MiaPaca-2-solut hypoksisissa olosuhteissa (kuva 4A).

paneelit A, B, ja C edustavat muodostumista pancreatospheres, ilmentymisen CD44 ja EpCAM, ja tuotanto VEGF: n ja IL-6, vastaavasti. Pallo muodostuminen -koe sen tutkia kyky uusiutua ja CSCS PC-soluissa, kuten on kuvattu alla Menetelmät jaksossa. Confocal kuvantaminen mikroskopia (200-kertainen suurennus) suoritettiin mittaamiseksi CSC solunpintamarkkereiden CD44 ja EpCAM että MiaPaca-2 kasvain alalla soluja, kuten on kuvattu alla Menetelmät jaksossa. Palkit listoilla osoittavat SD n = 3. * osoittaa p 0,05.

vaikutus CDF tai anti-miR-21 ilmentyminen CSC solunpintamarkkeria proteiinit CD44 ja EpCAM PC solut johdetut pallo solujen hypoksisissa olosuhteissa

Sen tutkimiseksi, onko CDF tai anti-miR-21 estää ilmentymistä CSC solunpintamarkkereiden CD44 ja EpCAM CSC kaltaisia ​​soluja johdettu PC soluista, teimme konfokaali kuvantaminen mikroskopia arvioimiseksi ilmentymisen CD44 ja EpCAM että MiaPaca-2-solut aloittanut kasvainperäinen pallo soluissa. Tulokset osoittavat, että anti-miR-21 väheni ilmaus CD44 ja EpCAM in MiaPaca-2 kasvain alalla solujen hypoksisissa olosuhteissa, yhdenmukaisia ​​tuloksia CDF hoitoon (kuva 4B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että CDF alas-säätelee muodostumista MiaPaca-2 kasvain pallo solujen yhdenmukainen down-regulation CD44 ja EpCAM ilme, joka on osittain välittyvät vähentynyt ilmentyminen miR-21.

vaikutus CDF tai anti-miR-21 VEGF: n ja IL-6-tuotannon MiaPaca-2 kasvaimen alalla soluja hypoksisissa olosuhteissa

Kuten on esitetty kuviossa 4C, MiaPaca-2 kasvaimen alalla solut tuottivat suhteellisesti suurempi määrä VEGF hypoksisissa olosuhteissa, verrattuna sen vanhempien MiaPaca-2-solut (2174 pg /ml /10

4 MiaPaca-2 kasvain alalla solujen vs 3248 pg /ml /10

6 MiaPaca-2-solut, kuvio 1C ja 4C), mikä viittaa siihen, että MiaPaca-2 kasvain aloilla voi edistää angiogeneesiä jopa säätelystä tuotannon VEGF. Olemme myös havainneet, että CDF hoito laski hypoksian aiheuttaman VEGF tuotantoa MiaPaca-2 kasvain alalla soluja. Samoin, MiaPaca-2 alalla solut tuottivat suhteellisesti suurempi määrä hypoksian indusoiman IL-6, verrattuna sen emosoluista (18 pg /ml /10

4 MiaPaca-2 alalla solujen vs 164 pg /ml /10

6 vanhempien MiaPaca-2-solut, kuvio 1D ja 4C). CDF hoitoon tai puute miR-21 anti-miR-21 transfektio vähensi tuotantoa hypoksian indusoiman IL-6 CSC kaltaisia ​​alalla soluissa (kuvio 4C).

vaikutus CDF tai miR-21 vajauksen geeni ilmaisuja HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, ja EMT fenotyyppi merkkiaineiden MiaPaca-2 kasvain alalla solujen hypoksisissa olosuhteissa

Kuten kuviossa 5A, CDF hoito pienensi suhteelliset mRNA tasot HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, ja EpCAM in MiaPaca-2 kasvain alalla soluja hypoksinen olosuhteissa. Vastaavasti alas-säätely miR-21 anti-miR-21 transfektio vähensi näiden geenien ilmentymistä in MiaPaca-2 kasvain alalla soluja hypoksinen olosuhteissa. Olemme myös tutkittava, ovatko CDF tai miR-21 puutos säätelee geenin ilmentymistä EMT merkkiaineiden MiaPaca-2 kasvain alalla soluja hypoksinen olosuhteissa. Huomasimme, että inaktivointi miR-21 ilmentyminen johti merkittävään suhteellinen lasku mRNA tasot EMT mesenkymaalisten merkkiaineiden ZEB1 ja vimentiinista, ja lisääntynyt suhteellinen mRNA-tasolla epiteelin merkki E-kadheriinin kasvaimen alalla solujen hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 5A ). Vastaavasti, CDF laski mRNA tasoilla ZEB1, vimentiinin, ja Twist kasvaimen alalla solujen hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 5A).

paneelit A ja B edustavat mRNA: iden ja miRNA, vastaavasti. Pallo-solut transfektoitiin Otsonin miR-21 käyttämällä transfektioreagenssia, seuraten valmistajan käsikirjan. Reaaliaikainen RT-PCR käytettiin kuvatulla alla Menetelmät jaksossa. Palkit listoilla osoittavat SD n = 3. * osoittaa p 0,05.

vaikutus CDF on miRNA ilmaisun MiaPaca-2 kasvain alalla solujen hypoksisissa olosuhteissa

Viimeaikaiset kokeelliset todisteet ovat osoittaneet, että hypoksia saattaa säätelemään useita miRNA, mukaan lukien anti-onkogeenisiä (let-7 ja miR-101), ja pro-onkogeenisiä (miR-21 ja miR-210) miRNA [10], [ ,,,0],12], [13], [15], [23], [24].