Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka farmakologinen esto Akt-kinaasin on pidetty lupaavana anti- syöpä strategia, useimmat Akt-inhibiittorit, jotka on kehitetty ovat entsymaattisia inhibiittorit, jotka kohdistuvat kinaasin aktiiviseen kohtaan Akt. Toinen keskeinen solua sääteleviä tapahtuma Akt-aktivointi on translokaatio Akt-kinaasin solukalvoon sytoplasmasta, joka toteutetaan läpi pleckstrin homologia (PH) domeenin Akt. Kuitenkin yhdisteitä nimenomaan vuorovaikutuksessa PH domain Akt estävän Akt aktivoituminen hetkellä rajoitettu. Täällä tunnistettu yhdiste, lancemaside A (LAN-A), joka sitoutuu spesifisesti PH domain Akt-kinaasin. Ensimmäinen, meidän massaspektrit analyysi solun Akt-kinaasin eristettiin soluista käsiteltiin LAN-A paljasti, että LAN-A sitoutuu spesifisesti PH-domeenin solun Akt-kinaasin. Toiseksi, havaitsimme, että LAN-A estää translokaatiota Akt kinaasin kalvolle ja siten Akt aktivointi, kuten tutkinut fosforylaatiota eri alavirtaan tavoitteet Akt kuten GSK3p, mTOR ja BAD. Kolmanneksi, co-viljelty solu malli, joka sisältää ihmisen keuhkojen epiteelin syöpäsolujen (A549) ja normaalin ihmisen ensisijainen keuhkojen fibroblastit, LAN-A erityisesti rajoittaa kasvua A549-solut. LAN-A näytetään myös antiproliferatiivisia vaikutuksia eri ihmisen syöpäsolujen linjat. Lopuksi A549-lusiferaasi hiiri siirremallissa, LAN-A tehokkaasti esti A549 solun kasvua vähän ilmeinen sytotoksisuutta. Todellakin, terapeuttinen indeksi LAN-A tässä hiirimallissa oli 250, joka tukee että LAN-A on mahdollinen lyijyn yhdiste PH verkkotunnukseen kohdistaminen turvallisena syöpälääkkeen Akt estäjä.

Citation: Joh EH, Hollenbaugh jA, Kim B, Kim DH (2012) Pleckstrin homologiadomeeni Akt Kinase: periaatteen todiste erittäin tarkoin määriteltyjä ja tehokas kuin entsymaattinen Anti-Cancer Target. PLoS ONE 7 (11): e50424. doi: 10,1371 /journal.pone.0050424

Editor: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 23 lokakuu 2012; Julkaistu: 26 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Joh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Institutes of Health A1077401 (BK), National Institutes of Health avustuksen T32 DA07232 (JAH), ja World Class University Program kautta National Research Foundation Korean rahoittama opetus-, Science and Technology ( R33-2008-000-10018-0). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät haluavat toteamaan Baek Kim on PLoS One toimitusneuvosto jäsen, mutta tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

pitkän aikavälin solujen selviytymistä fenotyypin perustettu tunnistus solujen eri tapahtumien , ja niihin liittyvistä mekanismeista tunnustuksena ja toimituksen stressin signaalit ovat erittäin säilyneitä nisäkässoluissa. PI3K /Akt-reitti on keskeinen sääntelyn verkko, joka hallitsee solutapahtumiin välttämättömiä transkription, solujen eloonjäämistä [1], kasvu [2], erilaistumiseen [3], muuttoliikettä [4], aineenvaihdunta [5], ja angiogeneesi [6] . Häiriöstä PI3K /Akt-reitin havaitaan yleisesti monissa ihmisen syövissä, mikä mahdollistaa pitkäaikaisen säilymisen ja seuraus [7], [8], [9]. Näin ollen farmakologinen inhibiittorit kohdistuvat tämän pro-selviytymisreittiin on tutkittu laajasti, koska mahdollisia syöpälääkkeitä [10]. Koska Akt on keskeinen säädin, joka ohjaa toimintaa useiden alavirran tavoitteiden kautta kinaasiaktiivisuuden, Akt-inhibiittorit ovat olleet painopiste useita tutkimuksia [10], [11], [12]. Kuitenkin useimmat Akt-inhibiittorit, jotka on testattu pääasiallisena tavoitteena kinaasin aktiiviseen kohtaan tai ATP: tä sitovaan kohtaan Akt [13], [14], [15], [16], ja niillä on mahdollisia ei-toivottuja off-tavoite vaikutuksia lukuisia muita solun kinaasit.

tärkeintä, Akt-kinaasin ja aktivoitua proteiini tarvitsee siirtyä sytoplasmasta solukalvoon, jossa NH

2-terminaalin pleckstrin homologia (PH) domeenin Akt vuorovaikutuksessa PI3K. Kerran solukalvolla konstitutiivisesti aktiivinen 3-fosfatidyyli- inositoli-riippuvaisen kinaasin 1 (PDK1), ylävirran kinaasi, aktivoi Akt fosfory- klo Thr

308, jota seuraa vielä fosforylaation Pa

473, joka voi tapahtua mTOR -rictor kompleksi [17], proteiinikinaasi Cβ [18], integriini-sitoutuvan kinaasin [19] ja autofosforylaatio [20]. PH domain löytyy useita solunsisäinen signalointi proteiineja ja on tarvitse matkustaa eri solukalvon osastoihin [21]. Tämä verkkotunnus helpottaa myös dimeerimuodostus mahdollistaa lipidien sitoutumisen ominaisuus, joka tunnistaa erityisesti fosforyloitu Fosfoinositidien [22]. Aikana PI3K /Akt aktivointi, PIP2 fosforyloituu PIP3 joita PI3K, ja sitten kohotetussa PIP3 kalvon pitoisuus aloittaa aktivoinnin PDK1 seuraa kalvon translokaatio Akt ja aktivointi Akt-kinaasin aktiivisuuden [22].

Various syöpäsolun malleja ja solut, jotka ekspressoivat onkogeenien, jotka osoittavat solua suojaavana fenotyyppi aktivoinnin kautta PI3K /Akt-reitillä, on käytetty seulonnan järjestelmiä mahdollisten Akt-inhibiittorit [23], [24], [25]. Olemme äskettäin perustettu ainutlaatuinen solu-pohjainen anti-PI3K /Akt-estäjän seulonta järjestelmä [26], joka käyttää ilmaisua ei-onkogeenisiä ihmisen immuunikatovirus (HIV-1) Tat. Toisin kuin muut viruksen onkogeenien, kuten E1A ihmisen papilomavirus [27], Tax ihmisen T-solun leukemiavirus [28] ja NS5A hepatiitti -viruksen C [29], HIV-1: n Tat ei suoraan aktivoi Akt-reitillä. Sen sijaan se vaikuttaa negatiivisesti säännellä PTEN, joka on fosfataasi, että negatiivisesti ohjaa PI3K alentamalla PIP3 pitoisuus solukalvon [30]. Johtuen PTEN negatiivisen säätelyn aktiivisuutta, Tat ilmentymistä ihmisen mikrogliaviljelmissä solulinja (CHME5) annetaan kohonnut solun suoja fenotyyppi aikana sytotoksisen LPS hoidon [31]. Tämä soluja suojaava fenotyyppiä Tat-pohjainen CHME5 järjestelmä äskettäin käytettiin seulontaan ja tunnistettu anti-PI3K /Akt yhdisteitä, jotka poisti Tat aiheuttama cytoprotective fenotyyppi [26]. Enemmän kiinnostavaa, nämä yhdisteet kohdennettu eri vaiheet PI3K /Akt-reitin, validointi PI3K /Akt-reitin estäjä seulonta järjestelmän kapasiteetin [26].

Täällä me tunnettu lancemaside A (LAN-A), joka on yksi monista yhdisteistä aiemmin tunnistetaan Tat ilmentävät CHME5 järjestelmän kirjastoista että satama ennalta valitun ei-myrkyllisiä yhdisteitä [26]. Tässä tutkimuksessa, LAN-A tutkittiin sen anti-Akt toimintamekanismi, selektiivinen syövän vaikutusta

in vitro

, ja syövän vaikutusta hiirimallissa. Todellakin, LAN-Ainutlaatuisen sitoutuu PH domain solujen Akt-kinaasin, estää translokaation Akt kinaasi, joka on välttämätön Akt aktivointia, ja näyttää anti-lisäkasvu /syöpälääkkeen vaikutuksia hiirimallissa, jossa on suuri terapeuttinen indeksi, joka tulokset myrkytön luonne yhdiste.

Materiaalit ja menetelmät

tasyöpäsolulinja kulttuurin ja mittaus sytotoksisuuden

A549 (ihmisen keuhkokarsinooma; KCLB No. 10185), KATO III (mahakarsinoo-; KCLB nro 30103), MCF-7, (rintasyöpä; KCLB nro 30022) hankittiin Korean solulinjasta pankki (Seoul, Korea) on 11.25.2010. A549-luc-C8 solulinja hankittiin Caliper Lifescience (Hopkinton, MA, USA) 2011-04-20. Kaikki solulinjat kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua vasikan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia ja 1 mM natriumpyruvaattia kostutetussa 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa. Solut maljattiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti, 24 tuntia ennen yhdisteiden lisäämistä. Yhdisteet liuotettiin 100% etanolia ja lisätään sitten ilmoitettuina pitoisuuksina. 24 tunnin inkubaation, kuolleet solut arvioitiin käyttäen FACS taussytometria (Accuri C6 virtaussytometrillä, Accuri). Kaikki tutkimukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Co-viljely ensisijainen ja kasvainsolujen

kulttuuri eri paria solutyyppejä, väliaine ensisijaisen solun tyyppi, ei kasvaimen solulinja, oli käyttää. For co-viljely ihmisen keuhkojen fibroblastit ja keuhkojen epiteelin kasvain A549-luc-C8, soluja viljeltiin minimal essential väliaineessa (Invitrogen), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. Kuvat otettiin 0, 6, 12 ja 24 h hoidon jälkeen käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Zeiss).

immunoblot-analyysi

solusupernatantti uutteet valmistettiin makrofagien erotettiin 10% SDS -sivulta ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridista kalvoja (PVDF). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivattua maitoa proteiinien 0,05% PBST, sitten vasta-aineilla. PBST: llä, proteiinit havaittiin HRP-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita 50 min. Kaistoja visualisoitiin parannetun kemiluminesenssin (ECL) reagenssi.

Analyysi Lancemaside A ja Akt sitova käyttäen MS /MS

A549-luc-C8-soluja viljeltiin 6-kuoppalevyille RPMI 1640 väliaineessa tai ilman lancemaside A 2 tuntia. Solut hajotettiin 300 pl hajotuspuskuria per 100 mm: n viljelymaljalle. Lysaatit (3 ml), johon oli lisätty 9 ml: NET-puskuria [50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA: ta ja 0,05% NP-40] ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa 10 ui Akt tai β-aktiini-vasta-ainetta (200 ug /ml). Saostamiseksi immuunikompleksien, lysaatit inkuboitiin 50 ul: n proteiini A /G Plus-agaroosi (Santa Cruz, L. A., USA) 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Helmi-sitoutuneet kompleksit pestiin kolme kertaa kylmällä NET-puskurissa, ja denaturoitu 5 minuuttia 100 ° C: ssa, sentrifugoitiin, ja havaittiin käyttäen MS /MS-järjestelmä, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Sähkösumutusionisaatiota massaspektrometrialla (ESI-MS) ja tandem MS /MS-analyysit suoritettiin LCQ DECA XP MS (Thermo Finnigan, CA, USA), joka on varustettu sähkösumutus ionilähteen. Kaikki ioni ansa analysaattorin parametreihin mukaan optimoitu valmistajan ohjeiden. Vuonna massa kokeissa spray jännite oli 4,5 kV positiivisessa tilassa ja 4 kV negatiivina alle N

2 tuppi kaasun virtaus 50 mielivaltaista yksikköä. Kapillaari lämpötila pidettiin 275 ° C: ssa. Kaksi mikrolitraa näytettä injektoitiin pylvääseen. Yhteensä ion kromatogrammit iältään

m /z

150-2000 ESI negatiivinen tilassa saatiin. Tandem massaspektrometria, maksimi ioni injektion aika, aktivointiajan, ja eristetyt ioni leveys asetettiin 500 ms, 30 ms ja 2,0 Th, vastaavasti. Törmäys energiaa helium on asetettu 30%: n radiotaajuisen (5 V) syötetään ioniloukku analysaattorin.

Kasvaimenvastainen vaikutus nude-hiirimallissa ksenograftimallissa

A549- luc-c8-solut kerättiin, suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, ja injektoitiin subkutaanisesti vasemman jalan (10

6 solua /jalka) 8-viikkoa vanhoja naaraspuolisia nude-hiirissä, kuten on raportoitu aiemmin [33]. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet noin 50 mm

3, eläimet satunnaistettiin ja annosteltiin oraalisesti 5, 10 ja 20 mg /kg /vrk lancemaside A tai vehikkeliä (0,2 ml 10% TWEEN 80) 6 päivää viikossa. Kukin ryhmä koostui 9 hiirillä. Lancemaside A suspendoitiin 10% TWEEN 80. kasvainten koot mitattiin 3-4 päivän välein saavutettuaan 50 mm

3. Lopuksi intraperitoneaalisesti lusiferiinin reagenssia (150 mg /kg, Etu Lifescience) viimeisen antamisen jälkeen on lancemaside A ja mitataan kasvainten koot

in vivo

luminesenssikuvantamisessa.

In vivo

luminesenssikuvantamisessa suoritettiin käyttäen Maestro In vivo multispektrikuvaussensoreita System (Woburn, MA, USA). Aineisto määrällisesti Maestro (versio 2.10.0, CRi Inc.) käyttäen absoluuttista fotoni laskee.

Ihmisen A549-soluja oli transfektoitu PH-GFP tai vektoreilla

A549-luc- c8 solut transfektoitiin PH-GFP tai GFP-vektorilla ja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä RPMI 1640 -alustassa kanssa tai ilman lancemaside A (1 uM) ja 100 min. Solut hajotettiin 300 pl hajotuspuskuria kuoppaa kohti. Lysaatit täydennetty 5 ml: NET-puskuria [50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA: ta ja 0,05% NP-40] ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa 10 ul: GFP-vasta-ainetta (200 ug /ml). Saostamiseksi immuunikompleksien, lysaatit inkuboitiin 50 ul: n proteiini A /G Plus-agaroosi (Santa Cruz, L. A., USA) 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Helmi-sitoutuneet kompleksit pestiin kolme kertaa kylmällä NET puskurilla ja denaturoitiin kuumentamalla 10 minuutin ajan 100 ° C: ssa ennen kuin sentrifugoitiin jätteiden poistamiseksi. Supernatantit haihdutettiin kuiviin ja suspendoitiin uudelleen 50 ul: aan MeOH: a.

Tulokset

aiemmin oli tunnistettu LAN-A anti-PI3K /Akt-reitin inhibiittori, käyttäen HIV Tat ilmentävät CHME5 solulinja [26]. Me ensinnäkin tutkinut kyky LAN-A estämään tämän reitin useissa eri kasvainsoluissa. Kuten kuviossa 1A on esitetty, kasvavien pitoisuuksien LAN-A vähensi solujen eloonjäämistä A549 (adenokarsinooma epiteelisolujen), KATO III (mahan karsinoomasolulinja) ja MCF-7 (rintasyöpä solu) soluja annoksesta riippuvaisella tavalla, mikä johtaa merkittäviin eroihin verrattuna kontrolliin (käsittelemätön) soluja, joilla on niinkin vähän kuin 2 uM lääkkeen. 20 uM LAN-A, korkein pitoisuus käytetään, on suurempi kuin 60%: n vähennys elinkelpoisuuden havaittiin kaikkien kolmen solulinjoissa. Lisäksi western blot-analyysi vahvisti väheneminen Pakt tasoilla kolmen solulinjoista (kuvio S1). A549-luc-C8-soluja käytettiin myös tässä tutkimuksessa, ja olemme vahvistaneet, että LAN-A hoito aiheutti myös verrattavissa väheneminen solujen elinkelpoisuuden (kuvio 1 B). A549-soluja on pyöreä morfologia, kuten kuviossa 1B alapaneelit, mikä on tärkeä näkökohta, kun tarkastellaan yhdessä viljelemisen kokeissa (alla).

(A) A549, KATO III ja MCF-7-soluja käsiteltiin 24 h puuttuessa tai läsnä ollessa eri pitoisuuksina LAN-A. Käsittelyn jälkeen solut otettiin talteen ja elävien solujen määritettiin FACS-analyysillä. (B) A549-luc-C8-soluja käsiteltiin 5 ja 10 uM LAN-A: ssa 24 tuntia. Kuvat osoittavat vähemmän yksisolukerroksena solujen LAN-A hoito. Solujen elinkyky määritettiin ja suhteelliset arvot piirretään verrattuna kontrollisoluihin (100%). ANOVA suoritettiin aineistoja, ja tilastollisesti merkittäviä eroja kontrolliryhmään on merkitty tähdellä (* =

p

0,05).

Edelleen vahvistaa LAN-A kuten PI3K /Akt-reitin estäjä A549-soluissa, western blot-analyysi suoritettiin fosforylaatiota tilan eri loppupään tavoitteet: PDK1, Akt, PTEN, GSK3p, IKK-α, mTOR ja BAD proteiineja. Kuten on esitetty kuviossa 2A-E (ja kuvio S2), fosforylaatio Akt ja loppupään tavoitteet Akt-kinaasin: p-GSK3p, p-mTOR, p-BAD ja p-IKK-α olivat vähentyneet huomattavasti annoksesta riippuvalla tavalla LAN -A hoito. Kuitenkin LAN-A hoito ei johda vähenemiseen solun tasojen PTEN (kuvio 2F), p-PDK1 (kuvio 2G) tai PI3K (kuvio 2 H). Lisäksi LAN-A vähensi PI3K A549-soluissa (kuvio S3), ja se esti Akt kaupan solukalvoon (kuvio S4). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​meidän julkaisemat tulokset [26], että LAN-A on PI3K /Akt-reitin estäjä.

(A) A549-solut jätetään hoitamatta tai hoidettiin 5, 10 tai 20 uM LAN-A 24 h. Western blot analyysi tehtiin solulysaateista (Täydennyskuvio 2) ja osoitti vähentäminen fosforyloidun Akt (Ser

473). (B-E) analyysi Akt alavirtaan tavoitteiden näkyy. Fosforylointireaktio tasot GSK3p, IKK-α, mTOR ja BAD tutkittujen ja pienennetään LAN-A käsitellyissä ryhmissä. (F) Cellular PTEN pysyi vakiona LAN-A hoito. (G) Phospho-PDK1 pysyi ennallaan LAN-A hoito. (H) PI3K pysyi ennallaan LAN-A hoito. Tietueet tehtiin kahtena kappaleena. ANOVA suoritettiin tietuekokonaisuudet * =

p

0,05, ** =

p

0,01 ja *** =

p

0,001 .

Seuraavaksi testasimme, onko LAN-A sytotoksinen vaikutus oli spesifinen kasvainsolujen. Tätä testiä varten yhteisrahoittaisimme viljelty 1) MRC-5, sikiön ensisijainen ihmisen keuhkojen fibroblastien [34], ja 2) A549-luc-C8, adenokarsinooma ihmisen keuhkorakkuloiden pohjapinta epiteelisolujen transdusoitu ilmaista lusiferaasia [35], eri pitoisuuksilla LAN-A: ssa 12 tuntia (kuvio 3A, ylhäällä). MRC-5-solut pysyivät kannattavia annosalueella LAN-Hoito (kuvio 3A, pohja kaavio), kun taas A549-luc-C8 soluissa havaittu merkittäviä kuoleman 10 ja 20 uM. Kineettinen analyysi käyttäen 10 uM LAN-hoidoilla 0, 6, 12 ja 24 tuntia tehtiin myös (kuvio 3B, ylhäällä). Jälleen, A549-luc-C8-solut olivat huomattavasti herkempiä solukuolemaa verrattuna MRC-5-soluissa (kuvio 3B, pohja kaavio). Senkin jälkeen 24 h LAN-Hoito, MRC-5-solut pysyivät toteuttamiskelpoinen kun taas A549-luc-C8 solujen elinkelpoisuus jatkoi laskuaan. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että LAN-A näyttää tietyn syövän vaikutusta ihmisen keuhkojen normaali ja syöpäsolujen yhdessä viljelemisen malli.

(A) Kuvat ovat eri hoitoryhmien vangittiin 12 tunnin kuluttua hoitoon. (B) Kuvaa kolmesta itsenäisestä kokeet käsin laskettiin elävien /kuolleiden solujen eri hoitoryhmissä. Tiedot piirrettiin ja näyttää prosentteina elävien solujen. Studentin t-testi suoritettiin datan asettaa määrittää merkittäviä eroja (* =

p

0,05). (C-D) Co-viljellyt solut altistettiin 10 uM LAN-A ja seurataan sitten solukuoleman eri aikoina käsittelyn jälkeen. Solukuolema määritettiin, kuten edellä on kuvattu. Tiedot ovat kolmen erillisen kokeen.

Seuraavaksi tutkimme toiminnan mekanismi LAN-A käyttämällä sarja massaspektrit teknologioita. Tätä varten A549-soluja pre-inkuboitiin LAN-A ennen lyysin ja immunosaostuksella (IP), Akt. Pull-alamäkiä analysoitiin massaspektrianalyysillä. Kuvio 4A esittää ESI-MS-analyysi LAN-A (standardi). Yhdisteen rakenne kuvattu ja pieni profiilin LAN-A MW 1190 on säädetty. IP Akt näyte LAN-A käsiteltyjen A549-solut analysoitiin (kuvio 4C), ja osoitti huippu LAN-A. Tärkeää on, että vertailunäytteet, ei LAN-A hoidossa A549-solut (kuva 4B) ja β-aktiini IP LAN-A käsittely (kuvio 4D), eivät osoittaneet huippuja LAN-A vuorovaikutus. Seuraavaksi edelleen vahvistaa, että LAN-A vuorovaikutuksessa Akt, tandem MS /MS-analyysi tehtiin. Olemme aikaisemmin kehittäneet herkän HPLC-MS /MS-analyysi LAN-A (MW 1190) ja sen metabolista johdannaiset, lancemaside X (MW 648) ja echinocystic happoa (MW 472) [32]. Standardi jälki profiilia LAN-A ainoastaan ​​esitetään kuviossa 4E, kun taas IP-Akt näyte osoittaneet selvästi kaksi fragmenttia – MW 648 ja MW 472 (kuvio 4F). Nämä tiedot osoittavat selvästi, että LAN-A fyysisesti vuorovaikutuksessa Akt solussa.

(A) Sähkösumutusionisaatio massaspektrometrialla (ESI-MS) LAN-A standardia esitetty. LAN-A molekyyli esitetään asumaan MW 1190. ESI-MS-analyysi IP Akt näytteitä käsittelemättä (B) LAN-A käsitelty (C) A549-soluja on esitetty. (D) ESI-MS-analyysi IP β-aktiini LAN-A käsitellyt solut näytetään. (E) Tandem MS /MS-analyysi LAN-A esittää kaksi aiemmin tunnistettu fragmentteja Lancemaside X (MW 648) ja echinocystic happoa (MW 472) LAN-A [32]. (F) Tandem MS /MS-analyysi IP Akt näytteen LAN-A käsitellyt solut.

Olemme aiemmin kuvattu, että LAN-A estää translokaatiota Akt välillä sytosolista plasmamembraanin ([26 ] Kuvio S4). Siksi me arveltu, että LAN-A suoraan vuorovaikutuksessa PH domain Akt. Tämän testaamiseksi PH domain-GFP fuusio ja GFP vektorit transfektoitiin A549-solut, jonka jälkeen IP GFP. Näytteitä käsitellään tämän jälkeen ja analysoitiin HPLC-MS /MS [32]. IP GFP näyte (kuva 5A) tuottanut monia huippuja, mutta yksikään ei ollut spesifinen LAN-A (kuvio 5B, standardi vain). Kuitenkin MS /MS-analyysi IP PH-GFP näyte tuotti oikean metaboliitti johdannaiset huiput (MW 648 ja MW 472) LAN-A (katso myös kuvio 4E ja F). Siksi nämä massaspektrit tiedot tukevat sitä mallia, jossa LAN-A suoraan vuorovaikutuksessa PH domain Akt, joka rajoittaa Akt muuttoliike ja myöhemmin estää Akt aktivoitumisen.

GFP ja PH domain-GFP vektorit transfektoitiin A549- luc-c8-soluja ja soluja käsiteltiin 100 uM LAN-A: ssa 1 tunti. IP vastaan ​​GFP tehtiin ja näytteet analysoitiin ESI-MS. (A) IP GFP näyte ei osoittanut näkyvästi huippu LAN-A, (B), kun taas IP PH domain-GFP näyte oli erityinen piikki LAN-A. (C) edelleen vahvistaa tätä oli LAN-A, tandem MS /MS-analyysi IP PH domain-GFP näyte osoitti kaksi fragmenttia LAN-A (katso myös kuvio 4E ja F).

Lopuksi testasimme vaikutus LAN-A A549-luc-c8 kasvua nude-hiirimallissa. Tätä testiä varten A549-luc-C8-soluja injektoitiin vasemman jalan nude-hiirten luoda kasvaimia. Kun kasvain saavutti 50 mm

3, hiiret satunnaistettiin ja käsiteltiin oraalisesti 10 ja 20 mg /kg /vrk lancemaside A tai vehikkeliä (10% Tween 80), 6 päivää viikossa. LAN-A on ED

50 = 4,09 mg /kg ja LD

50 = 1 g /kg. Siksi terapeuttinen indeksi on 250 (tuloksia ei ole esitetty). Kasvaimet mitattiin päivinä 10 45. LAN-A hoito kasvaimen kasvun taittumisesta kuvailema vähensi kasvainten tilavuudet verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 6A). Päivänä 45 hiiret IP injektoitiin lusiferiini reagenssilla

in vivo

kuvantaminen (kuvio 6B).

In vivo

luminesenssi on suurempi kontrolliryhmän verrattuna joko 10 tai 20 mg /kg LAN-A-ryhmien. Suhteellisten intensiteettien luminesenssin näkyvät (

n

= 5). Hiiret tapettiin ja kasvaimet poistettiin. Määrän suhde määritettiin ja piirrettiin (

n

= 9) kasvaimen massa (kuvio 6C). Kasvaimia värjättiin sitten anti-Pakt ja DAPI (kuvio S5) ja näytetään LAN-pitoisuudesta riippuva väheneminen Pakt sisällä kasvainkudoksessa. Kaiken kaikkiaan voimme päätellä, että LAN-A on anti-kasvain vaikutus

in vivo

.

(A) Kasvaintilavuudet mitattiin päivinä 10-45 nude-hiirissä hoidettu ohjaus (con) ja 10 tai 20 mg /kg /päivä LAN-A (9 hiirtä /ryhmä). (B) Päivänä 45 hiiret injektoitiin lusiferiini reagenssin luminesenssin elävinä. Suhteelliset intensiteetit 5 hiirtä /ryhmä on esitetty, ja suhteellinen intensiteetti osoitti verrattuna ohjaus (kontrolli = 1). (C) Hiiret tapettiin ja kasvaimet poistettiin. Kasvaimet mitattiin Maestro

In vivo

multispektrikuvaussensoreita System ja suhteellinen määrä piirretään. ANOVA suoritettiin aineistoja, ja tilastollisesti merkittäviä eroja kontrolliryhmään on merkitty tähdellä (* =

p

0,05).

Keskustelu

Aiemmin olemme seulotaan mahdollisten syöpälääkkeet, jotka osoittivat minimaalista sytotoksisuutta ja korkea luonnollinen runsaus, käyttämällä vahva cytoprotective fenotyyppi aiheuttama ilmentymistä HIV-1: n Tat-proteiinia [26], joka havaittiin sekä ensimmäisen ihmisen makrofageissa ja ihmisen microglia solulinjassa [30], [31]. Niistä seulotaan yhdisteitä, hoito LAN-A poisti Tat aiheuttama cytoprotective fenotyyppi CHME5 solua jälkeen LPS /CHX hoitoa, kun taas LAN-A yksinään ei aiheuttanut solukuolemaa CHME5 ohjaus solut eivät ilmennä Tat [26]. LAN-A kuuluu kemialliseen ryhmään kutsutaan saponiinit, jotka tiedetään olevan anti-inflammatorisia ja anti-kasvain ominaisuuksia [33], [36], [37], [38]. LAN-A: n on osoitettu estävän tehokkaasti koliitti kautta TLR-sidottu NF-KB: n aktivaation hiirillä, joilla ei ole havaittavaa sytotoksisuutta [39], [40].

Tässä tutkimuksessa edelleen karakterisoimiseksi syövän vaikutus LAN-A. Co-kulttuuri kokeita käyttäen A549 ja MRC-5-solut osoittavat, että LAN-A estää spesifisesti kasvaimen solulinja eikä alkusolut. Tämä oli erittäin jännittävä tulokseen ja ehdotti, että LAN-A oli syöpäsolun erityinen vaikutus. Osoitamme, että solujen käsittely LAN-A johtaa vähenemiseen fosforylaation Akt, mutta p-PDK1, joka vaaditaan Thr

308 fosforylaation, ja yhteensä PDK1 tasot eivät vaikuta LAN-A hoitoon. Lisäksi alavirran tavoitteita kuten p-GSK3p, p-mTOR, p-BAD ja p-IKK-α vähenivät, kun taas PTEN ja PI3K pysyivät ennallaan (kuvio 2). Yhdessä nämä tiedot tukevat aikaisempia havaintoja, LAN-A estää Akt aktivointi [26].

Useita erilaisia ​​mekanismeja Akt eston on raportoitu. Ensinnäkin, huumeet kuten wortmanniini, LY294002, PWT-458 [41] ja PX-866 [42], [43], SF-1126 [44], IC87114 ja TGX-115 [45] kohdistaa alkupään PI3K efektori, estämällä sukupolvi fosfatidyyli 3,4,5-trisfosfaatti, joka aktivoi PDK1 johtavat Akt fosforylaation ja aktivaation. Muut lääkkeet on kaksi kohdentamista varten PI3K ja mTORC2, mukaan lukien NVP-BEZ235 [46]. Useita lääkkeitä on kehitetty, että kohde PDK1 toimintaa. Toisin PI3K, jolla on useita isoformeja, PDK1 on vain yksi isoformi ihmisillä, joten se on houkutteleva kohde eston. UCN-01 on yksi tällainen lääke kehitteillä [47]. Toinen Akt fosforylaation Pa

473 katalysoivat mTORC2 [48] ja voidaan estää rapamysiini temsirolimuusi everolimuusi ja deforolimus [49].

Akt on kolme isoformia ja useat eri ryhmien Akt estäjät on kehitetty. Yksi ryhmä estäjät: GDC-0068 (Genetech; [50]) ja Akt Inhibitor IV (Millipore) on suunnattu ATP aktiiviseen kohtaan Akt [51]. Toinen ryhmä estäjien kohdistaa PH domain, mikä johtaa häiriöitä kalvon kohdistamista [52], [53]. Akt-I-1/2 ovat synteettisiä palautuvia allosteeristen estäjä, jotka kohdistuvat PH domain säilyttää sen aktiiviseen tilaan [54]. Perifosine on toinen PH domain huumeita ja estää Akt, mTORC1 ja mTORC2 [55].

spesifisyyden määrittämiseksi LAN-A, me aiemmin kehittänyt erityisen HPLC-MS /MS-analyysi LAN-A [32 ]. Käyttämällä tätä tekniikkaa, olemme päättäneet, että LAN-A suoraan vuorovaikutuksessa Akt kautta PH domain (kuva 5). Olemme aiemmin tutkinut suun kautta otettuna hiirten LAN-A ja totesi, että suoliston muuntaa LAN-A osaksi lancemaside X ja sitten echinocystic happoa, joka voi imeytyä vereen [32]. Voimme olettaa meidän tietojen echinocystic happo voi olla pienin rakenne aineenvaihduntatuotteen LAN-A tarvitaan PH domain sitovia ja Akt-kinaasin eston. Sekä lancemaside X ja echinocystic happo tutkitaan niiden terapeuttista tehoa tulevaisuudessa. Lisäksi meidän

in vivo

hiiren data on yhdenmukainen tulosten kanssa Jo

et al.

[53], jotka osoittavat, että kohdistaminen PH-domeenin Akt-kinaasin on erittäin tehokas hidastaa kasvaimen kasvua.

on ollut laajan tutkimuksen löytää estäjiä PI3K /Akt /mTORC2 reitin [56], [57]. Monet uudet lääkkeet on käsiteltävä myrkyllisyyden samalla terapeuttista tehoa. LAN-A tarjoaa alhainen myrkyllisyys ja tuumorin kasvua in vivo. Yhdessä tutkimuksemme vahvistaa massaspektrianalyy- että LAN-A on kohdistettu PH domain Akt ja ilmoittaa voimassa lähestymistavan jatkoi tutkimusta tästä syöpälääke.

tukeminen Information

Kuva S1.

Western blot-analyysi A549, KATO III ja MCF-7-soluissa. (A) Näkyy edustavat western blotit hyvää varten Pakt ja koko Akt kanssa ja ilman 10 uM LAN-A. (B) Tulokset kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta oli piirretään. ANOVA määrittämiseen käytettiin merkittäviä eroja ja on merkitty tähdellä (*** =

p

0,001).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0050424.s001

(TIF)

Kuva S2.

Western blot-analyysi. Tämä on yhdistetty yksi tai kaksi Western blot analyysiä käytetään tuottamaan datan Kuva 2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0050424.s002

(TIF)

Kuva S3.

PIP3 määrityksessä. A549-soluja esikäsiteltiin kanssa lancemaside A (Lan, 20 uM) tai wortmanniini (W, 0,1 uM) 20 minuutin ajan. Sitten soluja käsiteltiin LPS: llä varten lisäksi 60 min. Lysaatit valmistettiin käyttämällä compartmental proteiini Extraction Kit (Millipore, Bedford, MA, USA) yhtä suuret lukumäärät käsiteltyjen solujen. Kalvo uutetta lysaatit analysoitiin western dot blot-analyysi (Echelon, San Jose, CA, USA) ja visualisoitiin anti-PIP3 vasta-aine.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0050424.s003

(TIF)

Kuva S4.

määritys Akt kalvon translokaation. Olemme esittäneet GFP-proteiinia fuusioituna PH-domeenin Akt, joka on tunnettu kalvon muuttoliike, A549-luc-c8-soluja. Kun solut transfektoitiin plasmidilla, joka ilmentää PH-Akt-GFP-proteiinia, tämä fuusioproteiini havaittiin koko soluja, mutta pääasiassa paikallistaa solukalvon. LAN-Hoito näyttää GFP-signaali on siirtynyt solukalvon. Kirkas (BF) kuvat ovat vasemmassa sarakkeessa. Akt solukalvon lokalisointi tehtiin näkyväksi liikkeen Akt-PH-eGFP käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Zeiss).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0050424.s004

(TIF)

Kuva S5.

Immunohistokemia ja Pakt tuumorin sisällä. Immunolokalisoinnissa Pakt analysoitiin käyttämällä kaksivaiheista värjäyksen menettely, joka koostuu peräkkäisten inkubaation ensimmäisen ja toisen vasta-aineita ja DAPI. Kuvat otettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Zeiss).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0050424.s005

(TIF) B