Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat ei-proteiini-koodaavat sekvenssit, jotka voivat toimia onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille. Tämä tutkimus dokumentoi tuumorisuppressori roolia miR-1280 virtsarakon syöpä. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR ja

in situ

hybridisaatio analyysit osoittivat, että miR-1280 on merkittävästi säädellä vähentävästi virtsarakon syövän solulinjoissa ja kasvaimia verrattuna ei-pahanlaatuisen solulinjan tai normaali kudosnäytteistä. Tulkita toiminnallinen merkitys miR-1280 virtsarakon syöpä, me ektooppisesti yliekspressoitujen miR-1280 virtsarakon syöpä solulinjoissa. Yli-ilmentyminen miR-1280 oli antiproliferatiivisia vaikutuksia ja heikentynyt pesäkkeiden muodostuminen virtsarakon syövän solulinjat. FACS (fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu), analyysi paljasti, että uudelleen ilmentyminen miR-1280 virtsarakon syövän soluissa indusoi G2-M-solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Tuloksemme osoittavat, että miR-1280 esti muuttoliike ja hyökkäys virtsarakon syövän solulinjoista. miR-1280 vähenee myös ROCK1 ja RhoC proteiinin ilmentymiseen. Lusiferaasireporttiterilla analyysit osoittivat, että onkogeeni ROCK1 on välittömänä kohteena miR-1280 virtsarakon syöpä. Tämä tutkimus osoittaa myös, että miR-1280 voi olla diagnostisia ja prognostisia merkitys virtsarakon syöpään. Esimerkiksi ROC-analyysi osoitti, että miR-1280 ilmaisu voi erottaa pahanlaatuiset ja normaalin virtsarakon syöpätapausta ja Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että potilailla, joilla on miR-1280 korkea ilmentyminen oli korkeampi kokonaiselinaika verrattuna niihin, joilla on alhainen miR-1280 ilme. Kaiken kaikkiaan tämä on ensimmäinen tutkimus dokumentoida että miR-1280 toimii tuumorisuppressorina kohdistamalla onkogeenin ROCK1 tunkeutumis- /muuttoliikettä ja etäpesäke. Erilaisia ​​yhdisteitä parhaillaan käytetään ROCK1 estäjät; Näin ollen palauttaminen tuumorisuppressorin miR-1280 voi olla terapeuttisesti käyttökelpoisia joko yksin tai yhdistelmänä näiden yhdisteiden hoidossa virtsarakon syöpä.

Citation: Majid S, Riad AA, Saini S, Shahryari V, Arora S, Zaman MS, et al. (2012) MicroRNA-1280 Estää ja metastaasit mukaan kohdistaminen ROCK1 sisään virtsarakon syövän. PLoS ONE 7 (10): e46743. doi: 10,1371 /journal.pone.0046743

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 30 elokuu 2012; Julkaistu: 04 lokakuu 2012

Copyright: © Majid et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Center for Research Resources National Institutes of Health kautta Grant Number RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079 ja VA Merit Review ja VA Program Project. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Rajvir Dahiya on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat ei-proteiini-koodaavat sekvenssit ajatellaan säätelevän 90 % ihmisen geeneistä [1]. Vapauttaminen miRNA ilmentyminen on tunnistettu useita syöpiä [2], [3], ja kertynyt näyttöä siitä, että jotkut miRNA voivat toimia onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille. miRNA ilmaistaan ​​kudos-spesifisellä tavalla, ja voi olla tärkeä rooli soluproliferaation apoptoosin ja erilaistumisen [4], [5]. Inaktivointi onkogeenisten miRNA [6], [7] tai palauttaminen kasvaimeen vaimennin miRNA [8], [9], [10] voi olla suuret mahdollisuudet syövän hoitoon.

A) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi Mir-1280 solulinjoissa. B)

Fluoresenssi in situ

-hybridisaatio (FISH) solulinjoissa. C) Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi mir-23b ilmentymisen Hyväksytty Laser-Captured mikropaloitelluista kudosnäytteistä. (T /N- kasvain /Normaali).

Muutokset solun toimintoja, kuten solujen lisääntymisen, adheesio ja liikkuvuus perustuu morfologiset muutokset, jotka johtuvat aktiinisytoskeletonin uudelleenjärjestely. Rho proteiinit vuorovaikutuksessa aktiinisytoskeletonin säännellä muodostumista stressin kuitujen ja paikallisia tarttumista solujen sisällä. Rho-liittyvät seriini-treoniini proteiinikinaasi, ROCK [11], [12], joka on yksi parhaiten karakterisoitu alavirran efektoreja Rho, aktivoituu, kun se sitoutuu selektiivisesti aktiivisen GTP-sitoutunut muoto rho. Aktivoidut ROCK vuorovaikutuksessa aktiinisytoskeletonin edistää stressi-kuitu muodostumista ja kokoonpano paikallisissa kontakteissa [13]. Rearrangements aktiinisytoskeletonin ovat osallisina syövän solujen vaeltamiseen joka on keskeinen prosessi etäpesäke. Tang et al [14] tutki vaikutuksia ROCK1 estoa aktiivisuuden ylävirran RhoA ja Rac1. ROCK1 epäsuorasti vähentää aktiivisuutta alkupään RhoA stimuloimalla Tiam1 aiheuttama Rac1 aktiivisuutta. ROCK1 tarjoaa palautemekanismi, välittävä ylävirtaan Rac1 ja RhoA toimintaa, mikä heijastaa erilaisia ​​vaikutuksia ROCK1 toiminnalliseen tasapainoon pieni GTPaaseja [14]. Järjestämällä aktiinisytoskeletonver- proteiinien vastauksena Rho on tärkeää, kyky kasvainsolujen etäpesäkkeitä [15]. Rho /ROCK-reitillä on rooli syövän etenemisen säätelemällä aktiinisytoskeletonin uudelleenjärjestely ja erityinen ROCK estäjän havaittiin tukahduttaa kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden [16], [17]. Vuonna eturauhassyövän PC-3-solut, RhoA on kriittinen endogeeninen promoottori soluinvaasion ja muuttoliike [18]. Esto RhoA tai sen tärkeimpien alavirtavaikuttajainhibiittorit, ROCK1, vähentää liikkuvuutta eturauhasen karsinoomasoluja [18]. Virtsarakon syöpä, Rho /ROCK koulutusjakso on raportoitu olevan osallisena esiintyminen ja eteneminen virtsarakon syöpään [19]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että Rho /ROCK reitti voi olla molekyylitasolla syövän ehkäisemiseksi ja metastaasit. Tässä ensimmäistä kertaa kerromme kasvaimen suppressoriaktiivisuutta mikroRNA-1280 (miR-1280) virtsarakon syöpä ja osoittaa, että virtsarakon syöpä muuttoliikettä ja hyökkäyksen välittömänä päämääränä ROCK1.

A) kliinis ominaisuudet potilaan kohortti. B) ROC-käyrä analyysi osoittaa suorituskykyä miR-1280 ilmaus syrjiä pahanlaatuiset ja ei-pahanlaatuiset kudosnäytteistä. C) Kaplan-Meier-analyysi eloonjäämiseen perustuu miR-1280 ilmaisua.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja Cell Culture

SV-HUC-1 , T24 ja J82-solut ostettiin American Type Culture Collection (ATCC), ja niitä kasvatettiin mukaisesti ATCC-protokollia. SV-HUC-1-soluja viljeltiin F-12K Medium (ATCC), jossa oli 10% FBS: ää. T24-soluja viljeltiin McCoyn 5A-väliaine, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja J82-soluja viljeltiin Minimal Essential Media (MEM), jota oli täydennetty 10% FBS: ää.

A) Ohimenevä transfektio miR-1280 esiaste merkittävästi lisääntyneen ekspression miR-1280 virtsarakon syövän soluissa. B) Leviämisen J82 ja T24-solujen jälkeen miR-1280 transfektio oli merkittävästi vähentynyt verrattuna jatkuu-miR. C) miR-1280 over-ilmentyminen estää merkittävästi pesäkkeenmuodostuskyvyn virtsarakon syöpäsoluja.

Plasmidit, lähtöaineita ja transfektio

Taqman ja esiasteita HSA-miR-1280 ja negatiivinen ohjaus ennalta miR hankittiin Applied Biosystems (Foster City, CA). pmir-GLO Dual-Luciferase miRNA Target ilmentämisvektori hankittiin Promega. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) käytettiin kaikkiin transfektioiden.

RNA uuttaminen

miRNA ja kokonais-RNA uutettiin solulinjoista käyttämällä miRNeasy Mini Kit ja RNeasy Mini Kit (Qiagen). miRNA kliinisistä näytteistä uutettiin käyttäen laser kaapata mikrodissektion tekniikoita, joiden on miRNeasy FFPE (Qiagen).

AB) FACS-analyysi osoittaa miR-1280 over-ilmentyminen indusoi G2-M solukierron pysähtymisen J82 ja T24-solujen kanssa vastaava lasku S-vaiheessa olevien solujen. Arvot näkyvät kolminkertaisista kokeista ± SD.

A-B) miR-1280 over-ilmentyminen aiheuttaa apoptoosia J82 ja T24-solujen kanssa samanaikaisesti väheneminen elinkelpoisten solujen määrä. Arvot ovat peräisin rinnakkaisessa kokeessa ± SD.

Ihmisillä tehdyt kliiniset näytteet

Kliiniset näytteet on saatu San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja tutkimuksen hyväksyi UCSF komitean Human Research (Hyväksyntänumero: H9058-35751-01).

Quantitative Reaaliaikainen PCR

Kypsät miRNA määritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA Analyysit mukaisesti valmistajan ohjeiden (Applied Biosystems). Kaikki RT reaktiot, mukaan lukien ei-templaattikontrollien ja RT miinus valvonta, ajettiin 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). RNA-pitoisuudet määritettiin kanssa NanoDrop (Thermo Scientific, Rockford, IL). Näytteet normalisoitiin RNU48 (Applied Biosystems). Geenien ilmentyminen kvantitoitiin käyttäen 7500 Fast Real Time Sequence tunnistusjärjestelmä Software (Applied Biosystems). Vertaileva reaaliaikainen PCR suoritettiin kolmena kappaleena, mukaan lukien ei-templaattikontrollien. Suhteellinen ekspressio laskettiin käyttäen vertailevaa Ct.

In situ

-hybridisaatio

In situ

-hybridisaatio suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti solulinjat värjättiin käyttäen DIG-leimattua lukittu nukleiinihappo (LNA) -pohjaisen koettimia, jotka ovat spesifisiä mir-1280 noudattamalla valmistajan protokollan (Exiqon, Inc Woburn, MA), ja havaittiin käyttäen anti-DIG-Fluoreseiini, Fab-fragmentit (Roche Applied Science , Indianapolis, IN).

A) Migration määrityksistä J82 ja T24 transfektoitujen solujen miR-1280. B) edustaja kuvaa migraatiokokeessa.

A) Invasion määritys osoittaa merkittävä väheneminen hyökkäävän J82 ja T24 transfektoitujen solujen miR-1280. B) edustaja kuvaa invaasiomääritys.

elinkykyyn ja Clonability Pitoisuus

Solun elinkelpoisuus määritettiin 24, 48 ja 72 h käyttämällä CellTiter 96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan protokollaa. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä käyttämällä SpectraMAX 190 (Molecular Devices). Data esitetään keskiarvo ja rinnakkaisessa kokeessa verrattuna negatiiviseen kontrolliin. Pesäkkeiden muodostumista määrityksessä, solut ympättiin alhaisen tiheyden (1000 solua /levy) ja annettiin kasvaa kunnes näkyvissä pesäkkeitä ilmaantui. Sitten solut värjättiin Giemsa ja pesäkkeet laskettiin.

Muuttoliike ja Invasion Analyysit

Cytoselect 24 kuopan solumigraation ja invaasiomääritys sarjat (Cell Biolabs, Inc.) käytettiin muuttoliikkeen ja invaasio määrityksissä mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, T24 ja J82-solut transfektoitiin Pre-miR miRNA prekursori- tai negatiivinen kontrolli kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen ja suspendoitiin uudelleen seerumittomaan Opti-MEM. Solut (10 x 10

4 per 300 ui media ilman seerumia) lisättiin ylempään kammioon, ja alempi kammio täytettiin 500 ui väliainetta, joka sisälsi 10% FBS. Soluja inkuboitiin 16 tuntia 37 ° C: ssa 5% CO 2: kudosviljelyinkubaattorissa. 16 tunnin kuluttua ei-siirretyn /ei-tunkeutuvat solut poistettiin yläpuolen Transvvel kalvosuodatin insertit käyttämällä pumpulipuikolla moppi. Siirtynyt /hyökkäsi solujen alapinnan puolella värjättiin ja absorbanssi luettiin 560 nm: ssä mukaan, valmistajan protokollan.

A) sisältyvät miR-1280 sitovia sekvenssejä ROCK1 3’UTR. B) Western blot-analyysi osoittaa, että miR-1280 tukahduttaa käännös onkogeenien ROCK1 ja RhoC. C) Lusiferaasimäärityksiä osoittaa vähentynyt reportteriaktiivisuutta kotransfektion jälkeen joko villityypin tai mutantti Src-3’UTR kanssa miR-1280 J82 ja T24 soluja. Mut mutaation 3’UTRROCK1 sekvenssi. D) Kaaviokuva roolin miR-1280 virtsarakon syöpä.

Immunoblottausmääritys

Proteiini eristettiin 70-80% konfluentteja levyt viljeltyjen solujen avulla M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Pierce Biotechnology, Rockfield, IL) noudattaen valmistajan ohjeita. Proteiinipitoisuudet määritettiin Bradfordin menetelmällä. Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 4-20% natriumdodekyylisulfaattia (SDS)-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle jännitegradientti siirtoa. Saatu blotteja estettiin 5% rasvatonta maitoa ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden. Blotteja inkuboitiin sitten asianmukaiset peroksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita ja visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

Luciferase Reporter Assay

pmirGLO Dual-Luciferase miRNA tavoite ekspressiovektori käytetään 3′-UTR Lusiferaasimäärityksiä (Promega, Madison, WI). Tavoitteena onkogeeni on miRNA-1280 valittiin perusteella verkossa mikroRNA kohdetietokantaan https://www.microrna.org/microrna/home.do. Alukesekvensseissä villityypin 3’UTR olivat: Forward 5 ’CGCGGCCGCTAGTCTGTGGAATCGTGTGGGAT 3’ ja Reverse 5 ’ctagatcccacacgattccacagactagcggccgcgagct 3’. Sillä mutantti 3’UTR, alukesekvensseissä olivat: Eteenpäin 5 ’CGCGGCCGCTAGTCTGTGGAATCGTTCATACT 3’ ja reverse 5 ’ctagagtatgaacgattccacagactagcggccgcgagct 3’. Sillä lucifease määritystä, T24 ja J82-solut kotransfektoitiin HSA-miR-1280 ja pmirGLO Dual-Luciferase miRNA tavoite ekspressiovektorit villityypin tai mutantti-kohdesekvenssin käyttäen Lipofectamine 2000 Firefly lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI) 18 tuntia transfektion jälkeen ja tulokset normalisoitiin kanssa Renilla lusiferaasin. Kukin toimittaja transfektoitiin vähintään kolme kertaa (eri päivinä), ja kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism 5 ja MedCalc versio 10.3.2 . Kaikki määrälliset tiedot edustaa keskimäärin vähintään kolmesta näytteestä tai yleisesti. Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa keskiarvosta. Kaikki kokeet suoritettiin kaksi pyrstö ja

p-

arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Vastaanotin toimii käyrät (ROC) laskettiin määrittämiseksi potentiaali miR-1280 erottamaan pahanlaatuiset ja ei-pahanlaatuiset näytteitä. Sairauden etenemisen, Kaplan-Meier (log-rank-testi) analyysi suoritettiin.

Tulokset

Expression of miR-1280 rakkokasvaimista ja syöpäsolulinjat

Expression of miR-1280 tutkittiin reaaliaikaista PCR virtsarakon syövän solulinjoissa J82, T24 ja verrattuna ei-pahanlaatuisen solulinjan SV-HUC1. Tulokset osoittivat, että miR-1280 säädeltiin vähentävästi syöpäsolulinjoissa (kuvio 1A).

In situ

-hybridisaatio vahvisti myös läsnäolon miR-1280 ilmaisu (vihreä signaali) SV-HUC1 solujen verrattuna syöpäsolulinjoista (kuvio 1 B). Tutkia biologisen merkityksen miR-1280, sen ilmentyminen analysoitiin laser jää microdissected (LCM) ihmisen virtsarakon kasvain kudosten ja verrattuna normaaliin sovitettua kontrolli kudoksen. Ekspression miR-1280 havaittiin merkittävästi vaimentua kaikissa tuumorinäytteissä verrattuna niiden vastaaviin normaaleihin näytteistä (kuvio 1C). Nämä tulokset osoittavat oletetun tuumorisuppressoriproteiinia roolia miR-1280 virtsarakon syöpä.

ja ennustavia merkitys miR-1280 virtsarakon syövän

Clinical Väestörakenne potilaan kohortin on esitetty yhteenvetona kuviossa 2A . Vastaanotin toiminta käyrä (ROC) analyysit suoritettiin arvioimaan kyky miR-1280 ilmaisua erottamaan normaalin ja kasvaimen tapauksissa käyttämällä kudosnäytteiden. Alue ROC-käyrän alla (AUC) 0,886 (P 0,0001; 95% CI = 0,775-0,998) (kuvio 2B) saatiin viittaa siihen, että miR-1280 ilmentyminen voi syrjiä pahanlaatuiset ja ei-pahanlaatuiset näytteitä ja näin ollen sitä voidaan käyttää diagnostisena markkerina virtsarakon syövän vaikka lisänäytteitä voidaan vahvistaa nämä tulokset. Sen määrittämiseksi, onko miR-1280 on mitään ennustetekijöiden merkitystä, jaoimme tapauksissa matalan miR-1280 (lauseke T /N 0,8-kertainen) ja korkea miR-1280 (lauseke T /N 0,8-kertainen), ja se toteutettiin Kaplan-Meier selviytymisen analyysi . Kaplan-Meier-analyysi, korkean miR-1280 oli merkittävästi korkeammat yleistä eloonjäämistä verrattuna matalan miR-1280 ryhmä (logrank Test p 0,02) (kuvio 2C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-1280 on potentiaalia olla diagnostinen ja prognostinen markkeri virtsarakon syöpään.

MicroRNA-1280 Yliekspressio vaimentaa virtsarakon syövän Cell Proliferation ja Colony Formation

määrittää toiminnallisen merkityksen Mir-1280 yli-ilmentymisen virtsarakon syövän, me transfektoitu virtsarakon syöpä solulinjoja J82 ja T24 kanssa miR-1280 esiasteita. miR-1280 oli merkittävästi yli-ilmennetään J82 ja T24 solulinjoissa ohimenevän transfektion miR-1280 esiaste verrattuna jatkuu-miR esiaste (kuvio 3A). Ektooppinen ilmentyminen miR-1280 laski merkittävästi solujen lisääntymistä verrattuna soluihin, jotka ilmentävät jatkuu-miR (kuvio 3B). miR-1280 transfektoitujen solujen oli myös alhainen pesäkkeiden muodostumisen mahdollisuuden, koska määrä pesäkkeiden miR-1280 ilmentävät solut vähenivät verrattuna jatk-miR transfektoiduissa soluissa (kuvio 3C). Nämä tulokset osoittavat antiproliferatiivista vaikutusta miR-1280 virtsarakon syöpä.

miR-1280 Triggers solusyklin pysähtymiseen ja indusoi apoptoosia virtsarakon syövän solut

FACS (fluoresenssi soluerottelun) analyysi paljasti että uudelleen ilmentyminen miR-1280 johtaa merkittävään lisääntymiseen solujen G2-M-vaiheen solusyklin (17%: sta 35%), kun taas S-faasin määrän väheneminen 15%: sta 8% J82 solut (kuvio 4A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin T24-solujen lisääntyminen G2-M-solujen populaatio (6%: sta 19%) ja väheneminen S-vaiheen väestöstä (12%: sta 6%), mikä viittaa siihen, että miR-1280 laukaisee G2-M- pidätys miR-1280 transfektoiduissa soluissa verrattuna jatkuu-miR. FACS-analyysi apoptoosin suoritettiin käyttäen anneksiini-V-FITC-7-AAD väriainetta. Prosenttiosuus koko apoptoottisten solujen (varhainen apoptoottiset + apoptoottinen) lisääntyi merkitsevästi (4%: sta 12%) vastauksena miR-1280 yliekspressio verrattuna jatk-miR vastaavalla 10% lasku elävien solujen väestön J82 soluissa (kuvio 5A). In T24-soluissa, ja se kasvoi (2% 12%) apoptoottisia soluja havaittiin miR-1280 yliekspression verrattuna jatkuu-miR (kuvio 5B). Nämä tulokset osoittavat tuumorisuppressorina rooli miR-1280 virtsarakon syöpä.

Anti-muuttoliike /Invasion Effects of miR-1280 virtsarakon syövän

yli-ilmentyminen miR-1280 oli anti-muuttavien ja anti-invasiivinen vaikutus virtsarakon syövän solulinjoissa. Vähemmän absorbanssi todettiin 560 nm: ssä, jossa miR-1280 transfektoitujen solujen verrattuna jatkuu-miR in migraatiokokeessa (kuvio 6) ja miR-1280 yliekspressio vähensi merkitsevästi myös invasiivisuus virtsarakon syövän solujen (kuvio 7).

miR-1280 Suoraan tavoitteet Oncogene ROCK1

ROCK1 on raportoitu olevan tärkeä molekyyli, joka ajaa virtsarakon syöpä muuttoliikettä ja invaasiota. Käyttämällä online microRNA kohdetietokannassa löysimme onkogeeni ROCK1 kuten oletetun kohteena miR-1280 täydentäviä 3’UTR sivustoja siemenen sekvenssin miR-1280 (kuvio 8A). Suoritimme Western-analyysi ROCK1 ilmentymisen miR-1280 transfektoiduissa soluissa ja havainneet, että miR-1280 heikennetty proteiinin ilmentymistä ROCK1 verrattuna jatkuu-miR (kuvio 8B). Olemme myös löytäneet lasku proteiinin tasot ROHC toinen onkogeeninen proteiini, joka on ylävirtaan ROCK1. Voit tarkistaa, onko suora vuorovaikutus on mukana välillä miR-1280 ja sen tavoite onkogeeni ROCK1 teimme lusiferaasireportterilla määrityksiä. Huomasimme, että kotransfektoimalla miR-1280 yhdessä villityypin 3’UTR onkogeenin ROCK1 aiheutti merkittävän laskun lusiferaasiyksiköt kontrolleihin verrattuna (kuvio 8C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-1280 tavoitteet onkogeeni ROCK1 suoraan.

Keskustelu

Vaikka tiedetään vain vähän microRNA-1280, yksi tutkimus on osoittanut, että miR-1280 ilmentyy paksusuolen ja haiman syövät perustuvat ilmentymiseen analyysiin 19 peräsuolen ja 17 haimasyövän ihmisen syövän näytteitä [21]. Täällä ensimmäistä kertaa raportin että miR-1280: lla tuumorisuppressorina ja on ja ennustavia mahdollisten virtsarakon syöpään. Olemme myös suorittaa toiminta-analyysejä vahvistaa kasvaimen vastaisen vaikutuksia miR-1280 ja osoittavat, että miR-1280 suoraan suunnattu onkogeenin ROCK1 tärkeä molekyyli virtsarakon syövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

Havaitsimme myös, että asennuspalveli- 1280 merkittävästi vaimentua virtsarakon syövän solulinjoissa ja kasvaimen kudokset verrattuna ei-pahanlaatuisen solulinjan tai normaaleissa kudoksissa viittaa siihen, että miR-1280 voi olla tuumorisuppressori virtsarakon syöpä. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että MikroRNA ovat erittäin kudosspesifisiä ja ne voivat toimia kasvaimia estävä tai onkogeenien [5], [6]. MikroRNA hallussaan useita ominaisuuksia, jotka tekevät niistä houkuttelevia ehdokkaita uusiksi prognostisia biomarkkereita ja tehokkaita työkaluja varhaiseen toteamiseen syöpä [22]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-1280 oli ennustava kokonaiselinaika siten, että potilaat, joilla on korkeampi miR-1280 ilmaisu oli pidempi kokonaiselinaika verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen miR-1280 ilme. MicroRNA-1280 ilmaisu myös erottaa pahanlaatuinen normaaleista kudoksista osoittaa diagnostinen merkitys miR-1280 virtsarakon syöpä, vaikka tämä tulee varmistaa suuremmassa kohortin kudosnäytteistä. Meidän toiminnalliset analyysit paljastivat, että miR-1280 on antiproliferatiivisia vaikutuksia, asiakkuutta solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin virtsarakon syöpään. Se osoitti myös anti-muuttavien ja anti-invasiivisen vaikutus virtsarakon syöpäsoluja.

Koska ROCK1 on tärkeä molekyyli, joka osallistuu virtsarakon syövän muuttoliike ja invaasiota [19], tutkimme onko ROCK1 on tavoite miR -1280 virtsarakon syöpään. Yliekspressio ROCK1 on raportoitu esiintyvän eri syöpiä [14], [19], ja Rho /ROCK-reitin on havaittu liittyvän etenemisen virtsarakon syöpä [19]. ROCK välittää vasteita koulutusjakson aloittaman Rho, ja säätelee uudelleenjärjestely cytosleletal proteiinien, kuten muodostumista stressin kuitujen ja paikallisia tarttumista [23]. Järjestämällä solun tukirangan proteiinit, on tärkeää, kyky kasvainsolujen etäpesäkkeitä [15] ja myös tutkimus osoitti, että miR-1280 heikennetty ilmentymisen onkogeenin ROCK1. Lusiferaasimäärityksiä paljasti myös suoraa vuorovaikutusta miR-1280 ja ROCK1. Sen vuoksi nämä tulokset osoittavat, että miR-1280 inhiboi muuttoliike /invaasion ja täten etäpesäke virtsarakon syöpä, joka välittyy downregulation onkogeenin ROCK1 (kuvio 8D). Olemme myös todettu, vähentyneen ilmentämisen onkogeenin RhoC, joka on ylävirtaan ROCK1. Aikaisempi tutkimus on raportoitu, että ROCK1 vähentää aktiivisuutta sen alkupään RhoA perheenjäsenten epäsuorasti [14]. Samasta pääasiallinen esto ROCK1 by miR-1280 voi olla epäsuora estävä vaikutus on RhoC onkogeeni.

Yhteenvetona Tutkimuksemme on ensimmäinen raportti dokumentoida tuumorisuppressorigeenin roolia miR-1280 virtsarakon syöpä. miR-1280 suoraan suunnattu onkogeenin ROCK1, estävä vaikutus /invaasion, jotka ovat keskeisiä prosessin etäpesäke. Erilaiset yhdisteet, kuten Y-27632, on havaittu estävän ROCK1. Tuloksemme osoittavat, että palauttaminen tuumorisuppressorin miR-1280 voisi olla hyödyllistä terapeuttisesti joko yksinään tai yhdistelmänä näiden yhdisteiden hoidossa virtsarakon syöpään.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Roger Erickson varten hänen tukea ja apua valmisteluun käsikirjoituksen.