Krooninen sairaus

tiivistelmä

hypoksinen microenvironment kasvaimissa on tunnustettu aiheuttaa pahanlaatuisten kasvainten tai kestävyyttä erilaisia ​​syöpähoitojen. Toisin kuin äskettäin ymmärtää paremmin akuuttia syöpäsolujen hypoksia, ominaisuudet kasvainsolujen kroonisen hypoksian edelleen epäselvää. Olemme tunnistaneet haimasyöpä solulinja, AsPC-1, joka on poikkeuksellisen hengissä viikkoja alle 1% happea olosuhteissa samalla Testatuimmat syöpäsolulinjoja kuolla jälkeen vain muutaman päivän näissä olosuhteissa. Kroonisessa hypoksia, AsPC-1-solujen tullut lepotilaan ominaista no proliferaatiota, kuolemaa, ja metabolisen tukahduttaminen. He reversiibelisti siirtynyt aktiiviseen tilaan, kun on sijoitettu uudelleen optimaalisissa viljelyolosuhteissa. ATP liikevaihdon indikaattori energiantarve, oli selvästi vähentynyt ja mukana vähennetään AKT fosforylaatio. Pakko aktivointi AKT lisännyt ATP liikevaihdon ja massiivinen solukuolema

in vitro

ja määrän laskua lepäävien solujen

in vivo

. Toisin kuin useimmat syöpä solulinjoja, ensisijainen-viljeltyjen peräsuolen syövän solut helposti tuli lepotilan kanssa AKT tukahduttaminen hypoksiaolosuhteissa yhdistettynä kasvutekijä köyhdytetyn olosuhteissa. Ensisijainen peräsuolen syövän solut lepotilan olivat resistenttejä kemoterapiaa. Siten kyky selviytyä huonokuntoinen mikroympäristön solmimalla lepotilamuotoja alle krooninen hypoksia saattaa olla yhteinen ominaisuus keskuudessa syöpäsoluja. Kohdistaminen sääntelymekanismi asiakkuutta tämän lepotilan voisi tarjota uuden strategian syövän hoitamiseen.

Citation: Endo H, Okuyama H, Ohue M, Inoue M (2014) dormanssi syöpäsolut tukahduttaminen AKT Activity Auttaa Survival in Krooninen Hypoksia. PLoS ONE 9 (6): e98858. doi: 10,1371 /journal.pone.0098858

Toimittaja: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 tammikuu 2014; Hyväksytty: 08 toukokuu 2014; Julkaistu: 06 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Endo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain KAKENHI (25461937) (www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/, HE, MI), Charitable Trust Osaka Cancer tutkija-Todettu (HE), Japan Foundation for Applied Enzymology (www.mt- pharma.co.jp/jfae/, HE, HO, MI), Takeda Science Foundation (www.takeda-sci.or.jp/, MI), ja The Naito Foundation (www.naito-f.or.jp/, MI). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mikroympäristön sisällä kiinteän kasvaimen voi olla erittäin heterogeeninen [1]. Koska epätäydellinen verisuonen verkkoja ja epätasapaino leviämisen ja angiogeneesin, mikroympäristön joissakin osissa kiinteän kasvaimen voi olla hypoksinen ja huonosti mukana ravinteita [2], [3]. Riippuen niiden mikroympäristön, syöpäsolut voivat näyttää aivan erilaiset ominaisuudet solujen aktiivisuuden, kuten solujen lisääntymisen, onkogeeniset reitin aktivointi, ja aineenvaihdunta [4]. Kasvain solujen hypoksinen alueella kaukana verisuonista osoittavat vähentynyt proliferaatio [5] ja kestävyys kemo- tai sädehoidon [6], [7]. Äskettäin käyttäen

in vivo

geeni-koodaus menetelmä, osoitettiin, että kasvainsolujen hypoksinen alueet voivat olla peräisin toistumisen sädehoidon jälkeen [8]. On myös raportoitu, että muutos geenin ilmentymisen kroonisen hypoksian liittyi korkea uusiutuminen kolorektaalisyövässä potilailla [9]. Tutkiminen biologia kasvainsolujen hypoksisissa olosuhteissa saattaa olla kriittinen parantaa terapeuttista tehoa ja hävittämiseksi syöpään. Havaitsemisen jälkeen hypoksian indusoituva tekijä-1α (HIF-1α), kopioinnin säätely vastauksena akuutissa hypoksia on varsin hyvin selvitetty [10]. Toisin kuin vasteita syöpäsolujen akuutti hypoksia kuitenkin miten syöpäsolut vastata tärkeitä, mutta eri olosuhteissa kroonisen hypoksian [11] edelleen heikko.

PI3K /AKT signalointi on keskeinen rooli selviytymisen, leviämisen, ja aineenvaihdunta syöpäsoluissa [12]. Koska sopimatonta aktivaation reseptori tyrosiinikinaasin (RTK) tai PI3K tai menetykseen PTEN toiminto, konstitutiivinen aktivointi AKT havaitaan usein usean ihmisen syövissä [12]. Aktivoidut AKT edistää glykolyyttisissä tai biosynteesireiteissä aktivoimalla GLUT1, heksokinaasi 2, tai ATP-sitraattilyaasi. Yksi loppupään molekyylien PI3K /AKT on mTOR monimutkainen 1 (mTORC1), joka edistää proteiinisynteesiä ja solujen kasvua. Siten AKT /mTORC1 reitit tärkeitä rooleja kasvaimen kasvua ja aineenvaihduntaa; kuitenkin käytettävissä materiaalit biosynteesin eivät aina runsaasti heterogeeninen kasvain microenvironment. Vuonna hypoksinen alueella kaukana verisuonia, jatkuva aktivointi AKT /mTORC1 polku voi johtaa kriittiseen ravintoaineiden häviämiselle ja energiakriisi.

Kyky estää pohjapinta aineenvaihdunta kiihtyy ja solmia hypometabolisen tila on hengenpelastajaa monien eliöiden kun energianlähde kuten hapen ja ravinnon rajoittuvat [13], [14]. Todellakin, downregulation mTORC1 toiminnan akuutissa hypoksia on laajalti tunnettu [15] – [17], ja tukahduttaminen mTORC1 on kuulemma tärkeä kasvainsolujen eloonjäämisen stressaavissa olosuhteissa [4], [18], [19]. Kuitenkin, kuten todettu, krooninen vaste syöpäsolujen ymmärretä hyvin.

Yksi haittaava tekijä parantanut ymmärrystä vasteen syöpäsolujen krooninen hypoksia on puute vakiintunut

in vitro

malleissa . Useimmat tutkimukset käyttäen syöpä solulinjoja on tehty 24 tunnin tai jopa muutaman päivän, koska useimmat syövän solulinjoissa voi selviytyä vakavia ehtyminen hapen tai ravinteita pidempään. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että haimasyövän solulinja, AsPC-1, voivat stabiilisti hengissä tekemällä inaktiiviseksi tila, lepotilamuotoja, viikkoja hypoksisissa olosuhteissa. Tutkiessaan soluvasteen tälle krooninen hypoksia, huomasimme, että fosforylaatio AKT säädeltiin vähentävästi, joka mahdollistaa AsPC-1-solujen vähentää energian kysyntää ja hengissä stressaavissa olosuhteissa. Lisäksi olemme havainneet, että ensisijainen peräsuolen syöpä solujen voisi helposti tulla lepotilan hypoksisissa ja kasvutekijä-riistää olosuhteet, joissa ne osoitti huomattavaa solunsalpaajaresistentti merkkiä.

Tulokset

Survival solulinjojen alle krooninen hypoksia

vaikutuksen tutkimiseksi pitkäaikainen hypoksia syöpäsoluihin

in vitro

, tutkimme useita haimasyöpä ja peräsuolen syöpä solulinjoja viljeltiin 1% happea yli viikon edustamaan krooninen kunnossa, toisin kuin lyhyempi runko päivässä tai niin, että akuutti ehto (kuva S1). Suurin osa testatuista solulinjoista ei osoittanut mitään merkittävää laskua solujen lisääntymisen ja kuolivat 7 päivän kuluessa. Siten oli yleensä vaikeaa kulttuuriin syöpäsolun linjat yli viikon hypoksisissa olosuhteissa.

Sen sijaan, AsPC-1, haimasyöpä solulinja, oli poikkeuksellisen hengissä alle pitkäaikaisen hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 1A ja C). Akuutissa vaiheessa, AsPC-1 solujen hypoksia kasvoivat sekä happiolosuhteissa, mutta leviämisen nopeus vähitellen laski asti päivänä 7, ja solujen määrä tasaantui noin päivänä 10 alle 80% konfluenssiin koeolosuhteissa. Solut normoksia osoittivat massiivisen solukuolemaa 14 päivän jälkeen, luultavasti siksi, että ehtyminen kasvutekijöiden tai ravinteita (kuvio 1 B ja C). Sitä vastoin solut hypoksia olivat elinkelpoisia yli kolme viikkoa ilman mitään merkkiä solukuoleman, kun väliaine ei muuttunut lainkaan. Solusyklin analyysi paljasti, että S-vaiheessa olevien solujen huomattavasti vähentynyt 7. päivänä vuonna hypoksia verrattuna 1. päivänä vuonna normoksia tai hypoksia (kuvio 1 D). Solut kerättiin joko G0 /1 tai G2 /M vaiheessa. Tämä vähentynyt proliferaatio oli palautuva; kerran uudelleen oxygenized ja uudelleen pinnoitettu tuoreeseen liuoksesta ja AsPC-1-solut osoittivat elpymisen leviämisen nopeudella ohjaamaan tasolle pienellä viiveellä, jopa sen jälkeen, kun on viljelty 14 päivän ajan hypoksian (kuvio 1 E). Nämä tulokset osoittivat, että AsPC-1-solut voivat palautuvasti syöttää aktiivinen tila, lepotilamuotoja mukaisesti pitkittynyt hypoksinen olosuhteissa.

Elävät solujen määrä (A) ja prosenttia solukuolemaa (B) AsPC-1-soluja viljeltiin normoksia ( 20% O

2) tai hypoksian (1% O

2). C) Phase-kontrastin ja PI-värjätään kuvia AsPC-1-soluissa viljelty ilmoitettu olosuhteissa. Mittakaava = 50 pm. D) Solusyklianalyysiä of AsPC-1-solut päivänä 1 normoksia tai päivinä 1 ja 7 hypoksia. Soluja pulssitettiin BrdU 2 tuntia ja analysoitiin virtaussytometrialla värjäyksen jälkeen anti-BrdU-vasta-aineen ja PI. Prosenttiosuudet soluista S-vaiheessa on osoitettu. E) uudelleen kasvu AsPC-1 solujen lepotilan. AsPC-1-soluja viljeltiin hypoksia 14 päivää, ja solujen määrää seurattiin jälkeen uudelleen kylvö in normoxic olosuhteissa.

Koska useimmat kemoterapiaa huumeita kohdistaa lisääntyvien syöpäsolujen solut viipyvä lepokauden olisi resistenttejä näiden sytotoksisten reagenssien. Todellakin, AsPC-1-soluja viljeltiin hypoksinen olosuhteet olivat resistenttejä kaikille kolmelle chemo huumeita tutkittiin (kuvio S2A). Sekä happipitoisuus ja proliferaationopeus tehoon vaikuttavat sädehoidon [20]. AsPC-1-solujen lepotilan olivat vastustuskykyisempiä röntgensäteilytysjakso verrattuna soluihin normoksia tai akuutin hypoksian (kuvio S2B). Siten AsPC-1-solujen lepotilan oli resistenttejä tavanomaisille kemo- tai radio terapia.

Arviointi energia-aineenvaihdunnan alle krooninen hypoksia

arvioitava tarkemmin asemaa energia-aineenvaihdunnan syöpäsolujen lepotilassa. Kuten odotettua, AsPC-1-soluissa kulutetaan enemmän glukoosia ja tuottanut enemmän laktaattia akuutissa vaiheessa hypoksian verrattuna normoksia. Sen sijaan sen jälkeen, kun 7 päivää hypoksian, glukoosin otto ja laktaatin tuotannon vähitellen heikennetty (kuvio 2A, S3A ja S3B). Hapenkulutuksen myös laskenut alle krooninen hypoksia (kuvio 2A). Laskimme ATP liikevaihto laktaatin ja hapenkulutuksen (kuvio 2A) ja totesi, että ATP liikevaihto laski alle krooninen hypoksia. Tämä havainto tuki myös hitaampi lasku solun ATP-tasot lisäyksen jälkeen cocktail inhibiittoreiden Glykolyysivaiheen ja oksidatiivisen fosforylaation (kuvio S3C ja S3D) [21].

A) laktaatin (vasemmalla) laskettiin laktaattipitoisuus ja kiinteä solujen määrä on ilmoitettu aikoja. O

2 kcal (keskellä) mitattiin käyttämällä Clark tyyppi happielektrodia. ATP vaihtuvuus (oikealla) laskettiin laktaatin ja O

2 kcal (tummanharmaa: laktaatti, vaaleanharmaa: happi). N1, normoksia 1 päivää; H1, hypoksia 1 päivää; H7, hypoksia 7 päivää. **

p

0,01, ***

p

0,001. B) Kvantitatiivinen RT-PCR on glukoosin kuljettajan ja glykolyyttiset entsyymit AsPC-1-soluja viljeltiin hypoksia varten osoitettu päivää.

Lisäksi näissä määrityksissä, tutkimme geenin ekspressiotasot glykolyyttisten entsyymien ja kuljettajat (kuvio 2B). Altistuksen jälkeen akuutin hypoksian, ilmaus

GLUT1

,

HK2

, ja

PDK1

lisääntynyt. Sitä vastoin ilmentymistasot näiden geenien väheni syöpäsoluja lepotilaan. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​vähentynyt glukoosin sisäänottoa kroonisen hypoksian (kuvio S3A). Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että lepotilassa syöpäsolut tuottivat vähemmän ATP ja kuluttaa vähemmän ATP verrattuna aktiivisesti jakautuvia soluja, mikä viittaa vähentynyt energiantarve. Siten tukahduttaminen aineenvaihduntaa on toinen ominaisuus syöpäsolujen lepotilassa.

Solunsisäiset signalointi solujen lepotilan

Seuraavaksi tutkimme solunsisäistä signalointia lepotilassa tilan syöpä soluja (kuvio 3A). Fosforylaatiota AKT väheni 7 vuorokauden hypoksian, jopa jatkuva aktivoituminen alkupään RTK (kuvio S4A). Fosforylaatiota S6, alavirran molekyyli mTORC1, vähennettiin sitä ennen, kuten raportoitu aiemmin [15], [16]. Ylössäätely fosfo-p38MAPK ja downregulation fosfo-ERK on raportoitu olevan molekyyli kytkin induktioon lepotilan useissa syöpäsolulinjoissa [22], [23], mutta havaitsimme vain vähän muutoksia niiden tasojen ja fosfo-p38MAPK oli melko väheni krooninen hypoksia. Fosforylaatiota eIF2α, joka myöhemmin downregulates globaali proteiinisynteesiä [24], oli upregulated akuutissa hypoksia mutta vähensi kroonisen hypoksian (kuvio S4A), mikä viittaa kriittinen ero soluvasteen alle nämä kaksi ehtoa. Tasot PHLPP, AKT- Ser473-spesifinen fosfataasi [25], [26], ovat rakenteellisesti kasvanut AKT de-fosforylaatiota (kuvio 3A).

A) Immunoblot että AKT /mTORC1 tai ERK /p38 MAPK väylän AsPC-1-soluja viljeltiin hypoksia. B) Immunoblotti AKT signalointi ja HIF-1α in AsPC-1-solut ilmentävät vektorisäätö, AKT-p-, tai AKT-3A (aktiivinen). C) Cell cycle tila solut päivänä 7 hypoksian. Prosenttiosuudet soluista S-vaiheessa on merkitty yläpuolelle juoni ja oikeassa kaavion. D) ATP liikevaihto mitattiin lisäämällä inhibiittorikoktailia glykolyysille ja oksidatiivisen fosforylaation. N1, normoksia 1 päivää; H1, hypoksia 1 päivää; H7, hypoksia 7 päivää. E, F) Elävät solujen määrä (E) ja prosenttia solukuolemaa (F) AsPC-1-soluja viljeltiin hypoksia. *

p

0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001.

Koska pieneni AKT fosforylaatio samaan aikaan induktion lepotilassa tutkimme toiminnallista roolia AKT fosforylaation lepokauden. Me transdusoidut kolme AKT rakentaa osaksi AsPC-1-soluissa: wt-AKT, AKT-3A (inaktiivinen muoto AKT), ja AKT-mΔPH (konstitutiivinen aktiivinen muoto AKT) [27]. Kun paino-AKT tai AKT-mΔPH yliekspressoitui, AKT fosforylaatio oli jatkunut myös kroonisen hypoksian (kuvio 3B, S4b). Kontrollisoluissa, ilmaus GLUT1 kasvanut akuutin hypoksian, mutta laski pitkäaikainen hypoksia, jälleen esiin vastakkaisen vaste kaksi ehtoa. Sen sijaan paino-AKT-yliekspressoivia soluja, GLUT1 pysyivät korkealla jopa kroonisen hypoksian (kuvio 3B), mukana jatkuva glukoosin kulutuksen (kuvio S4C). Toisaalta, S6 fosforylaatio kroonisen hypoksian väheni jopa paino–AKT-yli-ilmentäviä soluja (kuvio 3B). Solusyklin analyysi paljasti, että WT-AKT yli-ilmentäviä soluja kroonisen hypoksian oli suurempi lisääntymisnopeus kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 3C, kuvio S4d). In AsPC-1-solut ilmentävät kontrollivektorille tai passiivinen AKT-3A, ATP liikevaihto laski 7 päivän jälkeen kulttuurin hypoksian (kuva 3D); kuitenkin, wt-AKT ilmentävien solujen jatkuva korkea ATP vaihtuvuus jopa krooninen hypoksia. Nämä tulokset osoittivat, että jatkuva aktivointi AKT signaloinnin inhiboi AsPC-1 soluja pääsemästä lepotilaan kroonisen hypoksian, mikä rooli AKT tukahduttaminen päästä lepokauden. Elävien solujen määrä väheni taas kuolleisuus nousi 14 vuorokauden kuluttua paino-AKT-ilmentäviä soluja (kuvio 3E ja F). AKT-mΔPH ilmentävien solujen osoitti massiivinen solukuolema varhaisessa ajankohtina hypoksisissa olosuhteissa (kuvio S4E ja S4F). Lopuksi, kun PTEN, fosfataasi PI3K, joka pudotettiin, hieman lisääntynyt AKT fosforylaatio havaittiin, mukana lisääntyminen solukuoleman kroonisen hypoksian (kuva S5). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että tukahduttaminen AKT fosforylaatio toimii valitussa selviytymisen syöpäsolujen lepotilan.

HIF-1a osittain myötävaikuttaa induktioon lepotilan kroonisen hypoksian

Seuraavaksi tutkimme osuus HIF-aktiivisessa syöpäsoluissa (kuva S6). Proteiini tasojen HIF-1α korotettiin altistuksen jälkeen hypoksia ja yllä kunnes päivä 7 (kuvio S6D). Kun HIF-1α tasot väkisin laskivat shRNA (kuvio S6A), elävien solujen määrä väheni 7 päivän jälkeen taas kuolleisuus kasvoi (kuvio S6b ja S6c), mikä viittaa siihen, että jatkuva HIF-1α myös osaltaan solujen selviytymiseen alle krooninen hypoksia. Pudotus HIF-1α oli vähän vaikutusta AKT /mTORC1 signaloinnin ja jonkin verran kasvanut PS6 tasoilla (kuvio S6D), mutta yliekspressio AKT ei ollut vaikutusta induktioon HIF-1α (kuvio 3B). Nämä tulokset osoittivat, että HIF-1α ja AKT itsenäisesti säännelty lepotilassa tila kroonisen hypoksian.

muuttaminen lepotilan

in vivo

pakotetulla aktivoituminen AKT

tutkittiin sitten ominaisuuksia kasvaimia, jotka ovat peräisin AKT-mΔPH ilmentävien AsPC-1-solut

in vivo

(kuvio 4). Fosforylaatio AKT oli havaittavissa vain AKT-mΔPH kasvaimia, mutta ei kontrollien tuumoreiden (kuvio 4A). Havaitsimme downregulation S6 fosforylaation ja bromideoksiuridiinia (BrdU) sisäänottoa pimonidatsoli-positiivinen alue ja sen proksimaalinen alue kontrollituumoreilla, vastaa meidän edellisessä raportissa käyttäen toista tasyöpäsolulinja [4]. Nämä alueet viittaavat olemassaoloon vyöhyke hypoksian aiheuttaman lepotilamuotoja

in vivo

. Sen sijaan AKT-mΔPH ilmentävien kasvainten harvoin sisälsi lepotilassa vyöhyke pimonidatsoli-proksimaalisen alueen. PS6- tai BrdU-positiivisia soluja havaittiin myös rajalla kuolion (kuvio 4A).

A) Immunohistokemia on xenotumors of AsPC-1 solut, jotka ilmentävät kontrollivektorin (ylempi) tai AKT-mΔPH (alempi) . N, nekroosi; asteikko bar = 100 pm. B) Prosenttia BrdU-positiivisten solujen alueella distaalisen tai proksimaalisen ja pimonidatsoli-positiivinen vyöhyke. C) leveys pimonidatsoli-positiivisten vyöhykkeen kasvaimissa tartuntaa tai AKT-mΔPH; *

p

0,05, ***

p

0,001.

tarkemmin määrällisesti BrdU-positiivisten solujen alueilla proksimaalinen tai distaalinen pimonidatsoli-positiivinen vyöhyke (kuvio 4B). Prosenttiosuus BrdU-positiivisten solujen huomattavasti vähentynyt alueella proksimaalinen pimonidatsoli alueella suurempi distaalisen alueen valvontaa kasvaimia. Sen sijaan, AKT-mΔPH-ilmentävien kasvainten suuria pitoisuuksia lisääntyvien solujen jopa proksimaalisen alueen. Lisäksi AKT-mΔPH kasvaimia, pinta-ala pimonidatsoli-positiivisten solujen vähentynyt verrattuna kontrolliin kasvaimia (kuvio 4C), mikä osoittaa, että AKT-mΔPH soluja ei voinut solmia lepotilan

in vivo

ja olivat alttiimpia kuolemaan hypoksisissa olosuhteissa.

induktio lepotilan primaarisissa peräsuolen syövän solut

Seuraavaksi tutkittiin, induktio lepotilassa asema krooninen hypoksia havaittiin myös ensisijainen viljellyissä syöpäsoluissa . Olemme hiljattain perustettu uusi ensisijainen kulttuuri järjestelmä, CTOS (syöpä kudos-alkunsa sferoidi), peräsuolen, keuhko-, ja uroteelisyöpä [28] – [30]. Valmistimme CTOS näytettä peräsuolen syöpäpotilaiden ja viljeltiin niitä

in vitro

(kuvio 5A ja B). CTOS kasvu inhiboitui täysin alle yhdistelmä hypoksia ja kasvutekijä-riistää olosuhteissa, vaikka hypoksia yksinään ole riittävää poistamaan kasvua. Testasimme CTOS kolmelta peräsuolen syöpäpotilaiden ja kaikki näytteet uudelleen kasvoi hyvin heti uudelleen altistus hapelle ja kasvutekijä sisältävässä väliaineessa (kuvio 5C). Siten induktio lepotilan ei rajoitu AsPC-1-soluissa, mutta myös havaittiin ensisijainen syöpäsoluja.

A) CTOS kasvu mitattiin koko suhteessa päivänä 0. C45 CTOS näytteet viljeltiin väliaineessa, jossa oli (GF +) tai ilman (GF) kasvutekijöitä. B) Kuvat ovat C45 CTOS viljellään ilmoitettu olosuhteissa. Asteikko bar = 100 pm. C) Regrowth of CTOS vuonna lepotilan jälkeen uudelleen hapetuksen ja altistuminen kasvutekijä sisältävää väliainetta. D) Immunohistokemia C45 CTOS viljeltiin merkitty edellytykset 1 päivä. TUNEL värjäys oli päivä 14. Mittakaava = 50 pm. E) Immunoblotti AKT /mTORC1 signalointi ja HIF-1α in C45 CTOS viljellään merkitty olosuhteissa.

Lisäksi tarkastelimme solunsisäinen signalointi in CTOS immunohistokemiallisesti ja immunoblottauksella (kuvio 5D ja E). Hypoksia yhdistettynä kasvutekijän ehtyminen täysin tukossa AKT signalointi. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​CTOS kasvua (kuvio 5A). Olemme myös mitattiin hapen ja glukoosin kulutus CTOS näytteissä (kuvio S7). Hypoksia ja kasvutekijä-riistää olosuhteissa vakavasti vaimentunut nämä aineenvaihduntaan, kuten myös havaittiin AsPC-1-soluissa.

tutki kemiallis-herkkyys CTOS Lepäävässä tilassa (kuva 6). CTOS näytteitä esi-viljeltiin hypoksia ja kasvutekijä-riistää edellytykset 7 päivää. Sen jälkeen he olivat altistuneet 5FU tai SN38, aktiivisen metaboliitin irinotekaanin, 7 päivää, minkä jälkeen pestiin ja viljelemällä tuoreen StemPro hESC. CTOS näytteet lepotilan osoitti regrowth jälkeen palautetaan optimiviljelmäolosuhteissa klo 10 kertaa suurempi annos kuin CTOS näytteet aktiivisessa tilassa (kuva 6A ja B). Nämä tulokset osoittivat, että syöpäsolut lepotilassa olivat vastustuskykyisempiä chemotherapies kuin aktiivisessa tilassa.

A) CTOS näytteet viljeltiin väliaineessa (GF +) tai ilman (GF) kasvutekijöitä, ja alle 20% O

2 tai 1% O

2 olosuhteissa. 5FU tai SN38 lisättiin keskipitkän ja käsitellään 7 päivän ajan (merkitty mustat palkit). 7. päivänä alusta vaihdettiin tuoreeseen StemPro kantasoluja, jotka sisältävät kasvutekijöitä (mustat nuolet), ja CTOS näytteiden annettiin kasvattavat alle 20% O

2. B) edustavat kuvat CTOS näytettä (A). Asteikko bar = 100 pm.

Keskustelu

Osoitimme tässä tutkimuksessa, että yksi tasyöpäsolulinja ja ensisijainen peräsuolen syövän solut muuttavat lisääntymistä ja metabolisen asema pitkäaikainen hypoksinen olosuhteissa. Under krooninen hypoksia, solut voisivat tulla lepotilaan käsittävät neljä ominaisuudet: 1) ei proliferaatiota, 2) kuolemaa, 3) aineenvaihdunnan tukahduttaminen, ja 4) hyödyntämistä aktiiviseen tilaan, kun palauttaminen optimiviljelmäolosuhteissa.

AKT on keskeinen molekyyli säätelevä solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja aineenvaihduntaa. On yleisesti hyväksytty, että aktivointi AKT edistää solujen selviytymiseen ja lääkeresistenssin akuutissa hypoksia [1], [31] – [33]. Sitä vastoin, kuten tässä osoitettiin, kroonisen hypoksian, tukahduttaminen AKT-vaikutusta on tarpeen induktio lepotilan ja eloonjäämisen syöpäsoluja. Koska tarjonta sekä happea ja ravinteita olisi rajoitettu alueelle pois verisuonten pahanlaatuinen kasvain, säilyttäen energianlähde vähentämällä energian kysyntää voisi olla strategia syöpäsolujen hengissä kroonisesti huonontunut mikroympäristön.

mekanismi, jolla AKT-vaikutusta vaimennetaan krooninen hypoksia edelleen avoin kysymys. Mahdollisia ehdokkaita ovat 1) inaktivaation ylävirran kinaasien kuten RTK ja PI3K, 2) palaute silmukka S6K aktivointia, tai 3) aktivoitumista fosfataaseja kuten PTEN ja PHLPP. Ensimmäiset kaksi vaihtoehtoa eivät todennäköisesti annetaan seuraavat havainnot nykyisessä työssä: 1) fosforylaatio erbB-perheen RTK ja MET pysyivät korkeina jopa kroonisen hypoksian (kuvio S4A), ja 2) mTORC1 aktiivisuus estyy sekä akuuttien ja kroonisten hypoksia (kuva 3A). Kolmas mahdollisuus tukee havaintomme, että tasot PHLPP lisääntyi samanaikaisesti AKT inaktivaatiota (kuvio 3A) ja joka pakotti tukahduttaminen PTEN edistetään kuolema kroonisen hypoksian (kuvio S5B). Lisäksi tutkimus valottaa tarkkaa mekanismia.

stressivasteeseen hypoksia, downregulation of mTOR toiminnan avatulla proteiinivaste, ja transkription aktivoituminen HIF on hyvin tutkittu [10], [34]. REDD1 estää mTORC1 aktiivisuuden kautta TSC1 /2 hypoksia, ja estää siten Cap-riippuvaisen mRNA käännös [15], [16]. Levitetyssä proteiinivaste, ER asuva kinaasi, PERK, fosforyloi eIF2α ja tukahduttaa mRNA käännös [24]. Koska proteiinisynteesi on energiaa kuluttava prosessi, polut tukahduttamalla se voisi olla rooli induktioon lepokauden mukaisesti kroonisten hypoksinen olosuhteissa. Todellakin, havaitsimme tukahduttaminen mTORC1 aktiivisuus ja lisääntynyt fosforylaatiota eIF2α akuutin hypoksian (kuvio 3A, kuvio S4A). Koska solujen lisääntymistä ja aineenvaihduntaa pysyivät akuuteissa hypoksian, he saattavat olla tarpeen, mutta ei riitä aiheuttamaan lepotilan kroonisessa hypoksia. HIF-1α ja HIF-2α ovat keskeisiä transkriptiotekijöitä, jotka säätelevät hypoksinen vastausta [10]. Akuuteissa hypoksia, HIF proteiinit vakiintunut ja aktivoi transkription eri loppupään geenejä. Toisaalta, pitkäaikaiseen hypoksia, HIF proteiinit kuulemma vaimentua palautteen mekanismeja. Meidän tulokset kuitenkin ilmaus HIF-1α ylläpiti lepotilan aikana pitkittynyt hypoksian (kuva S6D), ja knockdovvn HIF-1α lisännyt solukuoleman kroonisen hypoksian (kuvio S6A ja S6b), mikä osoittaa, että jatkuva ilmentyminen HIF-1α oli välttämätöntä selviytymisen AsPC-1-soluilla krooninen hypoksia.

Vaikka hallitsematon leviäminen on tunnusmerkki syöpä, ihmisen kasvaimissa sekä ksenografteissa ihmisen kasvaimista näytteille proliferatiivista indeksit niinkin alhainen kuin 20% [ ,,,0],35]. Näitä ei-jakautuviin soluihin kasvaimissa on joskus kutsutaan lepotilassa olevat solut. Äskettäin, syöpä kantasolujen teoriaa, jossa kasvaimet oletetaan ylläpitää omia kantasoluja, on intensiivisesti testattu [36]. Koska liikkumattomuus on tunnusmerkki normaalin aikuisen kantasoluja, lepotilassa syöpä kantasolut on spekuloitu, mutta niiden olemassaolo ihmisen kiinteiden kasvainten ei ole suoraan tutkittu [36]. Aikuisilla kantasoluja, liikkumattomuus määritellään solukierron vaiheessa G0 [37], kun taas AsPC-1 solujen lepotilan olivat läsnä nykyisessä työssä sekä G1 /G0 ja G2 /M vaiheissa (kuvio 1 C). Lepotilassa tila tässä tutkimuksessa saattaa poiketa liikkumattomuus, mutta yhdistysten pysyvät avoimia kysymyksiä.

Kasvain lepotilamuotoja on tutkittu kunnossa, jossa kasvaimet ovat edelleen oireeton pitkään, vuoden joissakin tapauksissa [37], [38]. Kaksi mallia olemassa kasvaimen lepotilan Kasvainmassaa lepotilan ja kasvainsolun lepotilan. Entinen olettaa tasapainotila välillä solujen lisääntymisen ja solukuoleman, kun taas jälkimmäisessä tapauksessa kasvainsolujen anna solusyklin pysähtymiseen ja pysyvät lepotilassa. Hypoksian aiheuttamaa lepotilan tunnistettu tässä tutkimuksessa, joka johtuu kroonisista sijasta akuutin hypoksian, saattaa jakaa ominaisuuksia sen kanssa, mutta avainmolekyylejä tunnistettu täällä vaihdella. Eräässä epidermoidikarsinooma solulinja, esimerkiksi, tasapaino fosfo-ERK ja fosfo-p38 MAPK on raportoitu olevan molekyyli kytkin induktioon kasvainsolujen lepotilasta joh tuen [39]. Signaloinnin epäsuotuisa mikroympäristön tai solun pinnan reseptoreihin ylössäätelee fosfo-p38 MAPK, ja solut anna G1 /G0 vaihe. Sen sijaan keskeinen tapahtuma induktioon aktiivinen asema nykyisessä työssä oli downregulation Pakt muttei aktivoitumista p38 MAPK (kuvio 3A).

Viidestä solulinjoissa testasimme vain AsPC-1-soluissa voisi syötä lepotilan olosuhteissa kroonisen hypoksian (kuva 1 ja S1). Sen sijaan kaikki kolme ensisijaista peräsuolen syövän solut tutkittiin voisi solmia lepotilan alle yhdistelmä hypoksia ja kasvutekijän ehtymisen (kuva 5). Koska syöpä solulinjat valitaan solut kasvuetua viljelyolosuhteissa korkea happi, ravinto, ja kasvutekijät, he ovat menettäneet kyvyn estää proliferaatiota alle heikkeni olosuhteissa. Siten CTOS voisi tarjota alustan tutkimaan lepotilan syöpäsoluja. Vaikka lepotilassa syöpäsolut eivät suoraan edistää kasvaimen kasvua, ne voivat olla säiliön ja lähde tuumorigeenisiä soluja ja chemoresistance. Mekanismi Pakt downregulation alle krooninen hypoksia voisi olla kohde uusien lääkkeiden suunniteltu voittamaan terapeuttisia vastus.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

valmistelu ja kulttuurin ensisijainen peräsuolen syöpä potilailta oli hyväksynyt eettinen komitea, Osaka Medical Center for Cancer ja Cardiovascular Diseases (OMCCCD), ja kirurgisista näytteistä saatiin heti kirjallinen lupa. Eläinkokeet oli hyväksynyt OMCCCD Institutional Animal Care ja käyttö komitea, ja suoritetaan noudattaen vakiintuneiden ohjeiden.

Solut ja soluviljelmä

haimasyöpä solulinja, AsPC-1, oli saatu American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). AsPC-1 viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. Hypoksinen kulttuuri saavutettiin inkuboimalla soluja 1% O

2 ja 5% CO

2 monikaasupesu Incubator (ASTEC, Fukuoka Japani). Solut ympättiin tiheydellä 1 x 10

5 solua 35 mm lautasen laskemiseen solujen määrä ja 2,5 × 10

5 solua 60 mm lautasen RT-PCR ja Western blottauksella. Solujen elinkelpoisuus arvioi trypaanisinivärin syrjäytymistä määrityksen tai propidiumjodidi (PI) värjäys.

Ensisijainen kulttuuri paksusuolisyövän

valmistelu ja kulttuurin ensisijainen peräsuolen syövän soluja suoritettiin käyttäen CTOS menetelmää [28]. Lyhyesti, kirurgiset näytteet tai ksenograftikasvaimissa NOD /SCID pilkottiin osittain LiberaseÖ DH (Roche, Mannheim, Saksa) ja suodatetaan solun-. Fragments on 100 um tai 40 um solusiivilän (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) kerättiin ja viljeltiin StemPro hESC (GIBCO). Sillä hypoksinen kulttuuri, CTOS näytteet upotettiin BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced (GFR) (BD Biosciences, San Jose, CA) ja viljeltiin StemPro hESC tai perus (DMEM F12 /Glutamax, 0,1 mM 2-mercapthoethanol, 2% naudan seerumialbumiinia). Sillä kemosensitiivisyys määritystä aikana aktiivinen aikana, CTOS näytteet esiviljellään peruselatusaineessa alle 1% O

2 ehdot 7 päivää, ja sitten käsiteltiin 5-FU tai SN38. Jälkeen 7 päivää altistuksen näiden lääkkeiden, The CTOS näytteet uudelleen hapetettu, ja viljelyväliaine vaihdettiin tuoreeseen StemPro kantasoluja.

Solusyklianalyysiä

AsPC-1-soluja viljeltiin ilmoitettuun ajanjaksoja ja leimattiin 10 uM BrdU viimeisen tunnin kunkin hoidon. Solut värjättiin 5 ug /ml PI: n ja anti-BrdU-vasta-ainetta (BD Pharmingen). Solut analysoitiin käyttäen virittyä Acoustic Tarkennus Cytometer (Life Technologies, Carlsbad, CA).

mittaus glukoosin ja laktaatin pitoisuus

glukoosipitoisuus elatusaineessa mitattiin käyttämällä Glucose Test 2 (Wako Pure Chemical, Osaka, Japani). Laktaatti mitattiin käyttämällä F-Kit L-maitohappoa (Roche, Darmstadt, Saksa).

Measurement hapen kulutuksen

Liuennut happi mitattiin käyttäen Clark-tyyppinen hapen elektrodi (Model 203 , Instech Laboratories). **

p

0,01.