Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kattava etsiä DNA metyloitua geenit tunnistettu ehdokas tuumorisuppressorigeeneille jotka ovat osoittautuneet olla mukana apoptoottisen prosessin

p53

kautta. Tässä tutkimuksessa selvitettiin

p53

mutaatio tällaisiin epigeneettiset muutos ensisijainen mahasyövässä.

Methods

metylaatio profiilit 3 geeneistä:

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

, ja

CCNA1

, jotka osallistuvat p53 tuumorisuppressorin reitin yhdistelmänä

p53

mutaatio, olivat tarkasteltu 163 ensisijainen syöpien. Vaikutus epigeneettiset palautuvaa yhdessä kemoterapeuttisten lääkkeiden apoptoosin arvioitiin myös mukaan kasvain

p53

mutaatiostatus.

Tulokset

p53

geeni mutaatiot löydettiin 44 ensisijaisen mahalaukun kasvaimet (27%), ja super-korkea metyloinnin tahansa 3 geenien havaittiin vain niissä tapauksissa, joissa villityypin

p53

. Korkeampi

p53

reitin poikkeamaa havaittiin tapauksissa miessukupuoli (p = 0,003), suoliston tyyppi (p = 0,005), ja ei-tunkeutuva tyyppi (p = 0,001).

p53

reitin poikkeamaa ryhmä näytteillä vähemmän uusiutumisen imusolmukkeisiin, etäinen elimet, ja vatsakalvon kuin

p53

ei poikkeamaa ryhmä. Vuonna NUGC4 mahasyövän solulinja (

p53

villityypin), epigeneettiset hoito täydennetty apoptoosin kemoterapeuttiset lääkkeet, osittain kautta

p53

transkription aktiivisuutta. Toisaalta, että KATO III syöpäsolun rivi (

p53

mutantti), epigeneettiset hoito yksinään indusoi vankka apoptoosin, ilman trans-aktivoitumisen

p53

.

johtopäätös

mahasyövän,

p53

olennaiset ja ainoastaan ​​asiaan reittejä olemassa, ja kasvaimet joko polku tyyppi näytteillä ainutlaatuisia kliinisiä piirteitä. Epigeneettiset hoidot voivat aiheuttaa apoptoosin osittain läpi

p53

aktivointia, mutta niiden apoptoottiset vaikutukset voidaan selittää paljolti mekanismilla muuten kuin

p53

polkuja.

Citation: Waraya M, Yamashita K, Ema A, Katada N, Kikuchi S, Watanabe M (2015) Exclusive ry

p53

Mutation Super-High metylointi tuumorisuppressorigeeneille

p53

Pathway ainutlaatuisella Mahalaukun syöpä Fenotyyppikuvaus. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10,1371 /journal.pone.0139902

Editor: Qian Tao, Kiinan University of Hong Kong, HONGKONG

vastaanotettu: 31 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 18 syyskuu 2015; Julkaistu: 08 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Waraya et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat osittain Grant-in tuki Cancer Research terveysministeriön, Labour and Welfare Japanin ja jonka Japani säätiö monitieteinen syövän hoitoon. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu, tai analysointia varten; että tulosten tulkinta; valmisteluun käsikirjoitus; tai päätös jättää käsikirjoituksen julkaistavaksi.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

DNA: n metylaatio on keskeisessä asemassa geenien kasvainten synnyssä ihmisen syövässä. Syöpä-erityinen metylaatio geeni on harvinainen kokonaisuus, ja usein poikkeamaa metylaation Primaarikasvaimen kudoksissa on vielä harvinainen [1, 2]. Havaitsimme syöpää erityisiä metyloituja geenejä kussakin elimessä käyttäen farmakologisia paljastumista mikrosirulla (PUM) [1, 2] ja muunnetun PUM [3-5]. Havaitsimme monta ehdokasta tuumorisuppressorigeeneille (APT), kuten

PGP9

.

5

pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [2], ruokatorven SCC (ESCC) [6] , mahasyöpä [4], ja muut syövät [7],

NMDAR2B

in ESCC [3] ja mahasyövän [8], ja

CCNA1

in HNSCC [2]. Metylointi profiileja Näiden geenien on validoitu muiden ryhmien ja /tai jopa muissa syövissä [9-14]. Geenit, jotka osoittivat yli 60% metylaation kasvainkudoksissa nimettiin erittäin tärkeitä metyloitua geenejä (HRMGs) [15]. Lisäksi olemme edelleen verrattuna taajuuden tällaisten poikkeavasta metylaation ehdokkaan HRMGs muiden raporttien mahasyövän [16], ja geeni ehdokasta kaventamaan tiettyihin geeneihin.

Mikä tärkeintä, nämä ehdokas tuumorisuppressorigeeneille oli raportoitu olevan

p53

kasvain vaimennin polku (kuvio 1). Esimerkiksi

PGP9

.

5

suoraan vuorovaikutuksessa

p53

ja vakauttaa

p53

estämällä sen hajoamista läpi ubikinaa- väylän hepatosellulaarinen [17] , rintojen [18], ja nenänielun syöpä [19].

NMDAR2B

indusoi apoptoosin kautta suora vuorovaikutus

DAPK

[20], joka puolestaan ​​on osoitettu vastapainoksi onkogeenin aiheuttaman muutoksen aktivoimalla

p19ARF Twitter /

p53

riippuvan apoptoottinen tarkastuspiste [21].

CCNA1

on

p53

indusoimaan geenin, joka välittää apoptoosia G2 /M pidätys, ja mitoottisten katastrofin ihmisen munuaisen, munasarja- ja keuhkosyövän soluihin [22]. Näin ollen

p53

-systeemi ablatoitu kasvainkudoksissa ensisijaisen syöpien epigeneettisestä tavalla yhdessä villityypin

p53

, mutta ei ole raportti koskien yhdistyksen

p53

mutaatio ja epigeneettiset muutoksiin primaarikasvaimen kudoksissa.

tässä tutkimuksessa tutkimme DNA metylaatiostatuksen geenien

p53

polku, joka on poikkeuksellisen säännelty epigeneettisestä tavalla perusasteen mahasyövän, ja verrattiin niiden metylaatiokuvion kanssa

p53

mutaatiostatusta määrittämiseksi kliinistä merkitystä

p53

poikkeamaa fenotyyppejä.

Methods

solulinjat ja kudosnäytteiden

mahalaukun syövän solulinjat, KatoIII, NUGC4, AZ521, ja SH10 ostettiin RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japani). Ja maksasyövän HepG2 hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Nämä solulinjat, paitsi AZ521 ja HepG2 kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (GIBCO, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. AZ521 ja HepG2 kasvatettiin DMEM-alustassa (GIBCO), johon oli lisätty 10% FBS: ää.

Pairs (n = 163) ja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kasvainkudoksen ja vastaavassa normaalissa limakalvon yksilöitä saatu vähintään 5 cm: n kasvain reunasta saatiin leikkauspotilaiden välillä 01 tammikuu 2000, ja 31. joulukuuta 2010. Kaikki potilaat vaiheen II /III GC oli läpikäynyt mahdollisesti parantava resektio ensisijaisen GC, ja tehtiin adjuvantti S -1 kemoterapiaa leikkauksen jälkeen (S-1 tavallinen hoito). Neo-adjuvanttihoidon ei suoritettu tässä potilasryhmässä kohortissa. Kasvaimet luokitellaan joko TNM luokituksen mukaan 7

painos Unionin International Cancer ohjaus (UICC) ja 14

th painos Japani luokittelu mahakarsinooman (JCGC). Potilaiden ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Kaikki kudosnäytteet kerätään Kitasato yliopistollisen sairaalan, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja terveiltä luovuttajilta ennen näytteen keräämistä. Tämä tutkimus oli hyväksynyt eettinen komitea Kitasato yliopistosta.

Analyysi mutatoitunut

p53

geenejä käyttäen yksijuosteisen konformaation (SSCP) B

mutaatiot eksonit 5, 6, 7 ja 8

p53

geeni seulottiin ei-radioaktiivinen yksijuosteisen konformaation (SSCP) analyysiä, joka tehtiin käyttämällä aikaisemmin vakiintuneita menetelmiä [23]. PCR-tuote näytteitä 10 ui laimennettiin kolminkertaisesti geeli-latauspuskuria (95% deionisoitua formamidia, 20 mmol /L EDTA, 0,01% bromifenolisinistä ja 0,01% ksyleenisyanolia) ja kuumennettiin 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen reaktio pysäytetään jäällä. Alikvootit 3 ui pantiin muutettu polyakryyliamidigeeleillä (PAFG: 18% polyakryyliamidi-bis (49: 1), 0,5 x TBE, 10% glyserolia, 10% formamidia, 0,05% ammoniumpersulfaattia ja 30 ml TEMED) ja mitat 120 mm x 150 mm x 0,35 mm. Elektroforeesi suoritettiin 1,5 x TBE-ajopuskurissa 500 V ja 30 mA 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Vyöhykkeet havaittiin värjäämällä geelit käyttämällä hopeavärjäystä ja kit (Bio-Rad, Hercules, CA), jota seurasi kiinnitys, huuhtelu, kehitys, ja pysähtymistä reaktion. Mutatoitu bändejä havaittiin PCR-SSCP olivat ilmeisiä 1:64 laimennoksena mutatoituja alleeleja.

bisulfiittikäsittelyn uutettua DNA

Genominen DNA FFPE kudoksia ja solulinjoja eristettiin käyttäen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN Sciences, Maryland, MD) ja QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) mukaan valmistajan protokollia. DNA denaturointia, 2 ug genomista DNA: ta inkuboitiin 5 ug lohen sperman DNA: ta 0,3 mol /l NaOH: ta 20 minuutin ajan 50 ° C: ssa. DNA-näyte laimennettiin sitten 500 pl liuosta, joka sisälsi 2,5 mol /l natriummetabisulfiitilla (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l hydrokinonia (Sigma) /0,4 mol /l vesiliuosta, ja inkuboitiin 70 ° C: ssa 1,5 tunnin ajan. Sitten näyte pylvääseen, (Wizard DNA Clean-UP System, Promega Inc., Madison, WI), inkuboitiin 0,3 mol /l NaOH: ta 10 minuutin ajan, ja sen jälkeen käsiteltiin 3 mol /l ammoniumasetaattia 5 minuuttia. Näyte saostettiin 100% etanolia, ja DNA suspendoitiin uudelleen 50 ul: LOTE, joka sisälsi 10 uM Tris-HCI, pH 8, ja 2,5 uM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), pH 8, ja sen jälkeen monistettiin polymeraasiketjureaktion (PCR). Bisulfiitti käsittely johtaa kemialliseen modifiointiin metyloitumattoman, mutta ei metyloidut, sytosiinit urasiilit, jolloin ero metyloituneiden ja metyloitumattomien genomista DNA: ta.

Quantitative-metylaatiospesifinen PCR (Q-MSP) B

Kvantitatiivista metylointianalyysi, TaqMan metylaatiospesifisen PCR (Q-MSP) suoritettiin käyttäen iQ ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) kolmena kappaleena annetun iCycler iQ ™ Real-Time PCR Detection järjestelmän (Bio-Rad). PCR-olosuhteet ja sekvenssit annetaan S1 taulukossa. Sarjalaimennoksia bisulfiitin muutettu CpGenome universal metyloitua DNA: ta (Chemicon International, Temecula, CA) käytettiin kalibrointikäyrän kullekin levylle, kuten metylointi positiiviset kontrollit ja CpGenome Universal metyloimattoman DNA: n (Chemicon International) käytettiin negatiivisena kontrollina. Metylointi arvo (TaqMeth arvo) määritettiin suhteena metyloitu

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

,

CCNA1

, tai

DAPK

normalisoitu metyloitunut

β-aktiini

, joka kerrottiin sitten luvulla 100.

immunohistokemiallinen värjäys PGP9.5, NMDAR2B, ja CCNA1

immuunivärjäystä antigeeni peittymisen suoritettiin autoklaavissa liotuksen, endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estettiin inkuboimalla 3% H

2O

2 /metanoli 5 minuuttia, ja epäspesifistä vasta-aineen sitoutuminen estettiin inkuboimalla 1% laimennettua normaalia hevosen seerumia 30 minuutit. Leikkeitä inkuboitiin sitten 4 ° C: ssa yön seuraavilla vasta-aineilla: kanin PGP9.5 polyklonaalinen vasta-aine (laimennus 1: 200, Nonus Biogenesis.), Kanin NMDAR2B polyklonaalinen vasta-aine (laimennus 1: 100, Millipore), tai hiiren sykliini monoklonaalinen vasta-aine (6E6, laimennus 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd). Immuuni- komplekseja ei havaittu Vectastain Elite ABC -kittiä (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Nämä immuunijärjestelmän kompleksit detektoitiin käyttäen 3,3′-diaminobentsidiiniä substraattina (Vector) kromogeenina (PGP9.5 1,5 minuuttia, NMDAR2B 6 minuuttia, CCNA1 10 minuuttia). Osiot vastavärjättiin hematoksyliinillä.

Epigeneettiset hoito 5-atsa-dC ja TSA, ja kemoterapian kanssa CDDP

Solut jaettiin ja ympättiin pienellä tiheydellä (1×10

6 /T-75 pulloon) 24 tuntia ennen käsittelyä. Sitten soluja käsiteltiin 24 tunnin välein 4 päivän ajan joko 1 tai 5 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) liuotetaan 50% etikkahappoa tai jotka mock käsiteltiin PBS: llä, mukaan lukien sama määrä etikkahappoa. Kuten on osoitettu, 100 nM trichostatinA (TSA; Sigma-Aldrich) ja /tai 12,5 uM cis-diaminedichloroplatinum (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japani) lisättiin lopullisen 24 tuntia.

Western blotting -analyysi

Yhteensä proteiini uutettiin solulinjoista, joita epigeneettiseltä käsiteltiin kanssa /ilman kemoterapeuttisen hoidon, ja tehtiin Western-blottaus-analyysi käyttäen seuraavia vasta-aineita: hiiren anti-p53-monoklonaalista vasta-ainetta (1C12, laimennus 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) tai hiiren anti-β-aktiini-IgG:

2a monoklonaalista vasta-ainetta (laimennos 1: 10000, Sigma-Aldrich).

p53 reportterimääritys

solut (2 x 10

4 solua /96 kuoppaisella levyllä), jotka epigeneettiseltä hoidettiin /ilman kemoterapian transfektoitiin

p53

toimittaja vektori (Qiagen) käyttäen Signal ™ Pathway Reporter Kit ( QIAGEN) ja Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen). 24 tunnin inkubaation, toimittaja aktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-lusiferaasi Reporter Assay System (Promega). Transfektiot suoritettiin kolmena kappaleena ja analysoitiin käyttämällä Softmax Pro -ohjelmaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

apoptoosimäärityksessä

Käsitellyt solut (1 x 10

5 solua /näyte) värjättiin anneksiini V: ja 7-AAD (Guava neksiini reagenssi, Guava Technologies, Hayward, CA) syrjinnän varhaisen ja myöhäisen apoptoottisia soluja, tässä järjestyksessä. Koe suoritettiin käyttäen Guava PCA System, suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja analysoitiin CytoSoft 2.1.5 ohjelmistoa (Guava Technologies).

Tilastollinen

Fisherin testiä tai Mann-Whitney U testiä käytettiin kategorinen muuttujia, ja Opiskelijan

t

-testi käytettiin jatkuvien muuttujien. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± standardipoikkeama (SD). Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin arvioitaessa kumulatiivinen eloonjäämisaste, ja erot selviytymisasteet arvioitiin käyttäen log-rank-testi. Relapse elinaika (RFS) ja kokonaiseloonjääminen (OS) mitattiin alkaen operaation päivämäärän toistumisen ja kuolema, tai Viimeisessä seurannassa. Mitä tulee RFS tai OS, potilaat, jotka selvisivät yli 60 kk (5-vuotiaat) analysoitiin eloonjääneitä. P 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkittävyyttä. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin SAS ohjelmistopaketteja (SAS Institute, Cary, NC).

Tulokset

p53

geenin asema ja metylaatio profiilit

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

,

CCNA1

, ja

DAPK

in pStage II-III mahasyövän

p53

mutaatioita tunnistettiin 44 163 ensisijainen mahasyöpäpotilaista (27%), jonka SSPC-analyysi.

p53

geenimutaation ei ollut prognostista merkitystä (kuvio 2A). Sitten analysoimme metylaatio profiilit

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

,

CCNA1

, ja

DAPK

näihin kudoksiin käyttäen Q-MSP. TaqMeth arvo kaikkien geenien oli korkeampi ensisijainen kasvaimia mahasyövän villin tyypin

p53

kuin niillä, joilla on mutantti

p53

(geenin metylaatio järjestyksessä:

PGP9

.

5

NMDAR2B

CCNA1

DAPK

) (kuvio 3A ja S1 ja S2 kuviot). Metylointi promoottori DNA oli merkittävästi suurempi

CCNA1

(p 0,0001) ja

PGP9

.

5

(p = 0,03), ja marginaalisesti huomattavasti suurempi

NMDAR2B

(p = 0,10) ja

DAPK

(p = 0,05) ensisijainen mahasyövän verrattuna vastaaviin normaalin limakalvon. Tärkeää on, super-high metylaatio taso

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

, ja

CCNA1

oli yksinomaan todettu primaarikasvainten ilman

p53

mutaatio, cut-off TaqMeth arvot olivat 50, 163 ja 133, tässä järjestyksessä (kuvio 3A). Tällainen erittäin korkea metyloinnin

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

ja

CCNA1

löytyi 14, 19, ja 8 näytettä vastaavasti, ja joitakin näistä näytteistä päällekkäin (kuvio 3B).

DAPK

ei näytä tätä suuntausta, koska

DAPK

metylaatio taso oli melko korkea vastaavassa normaalissa limakalvon kudoksissa huomattava osa tapauksista (S2 Kuva).

(A) mukaan

p53

geenimutaatio tila ja (B) mukaan

p53

poikkeaman ryhmää.

(A) metylointi ilmoitettu geenien analysoitiin käyttämällä Q-MSP ja TAqMeth arvot kasvaimissa

p53

villityypin verrattiin kanssa

p53

mutaatio. Kynnysarvon määrittämiseksi, että geeni oli metyloitu määritettiin suurin TaqMeth arvo

p53

villityypin. (B) kasvaimista

p53

villityypin tai

p53

mutaatio verrattiin kannalta läsnäollessa super-korkea metylaation osoitettu geenejä. Super-high-metylaatio on määritelty, että ainakin yhden geenin osoitti suurempi TaqMeth arvoa kuin kunkin kynnysarvot joukossa kolme geeniä.

immunohistokemiallinen analyysi PGP9.5, NMDAR2N, ja CCNA1 proteiinin ilmentymisen ensisijaisen mahasyövän

immunohistokemiallinen värjäys PGP9.5, NAMDR2B ja CCNA1 proteiinin ilmentyminen suoritettiin sitten molemmissa tapauksissa super-korkea metylaatio ja heikosti metyloinnin näistä geeneistä. Vahva vähentäminen ilmentymisen PGP9.5, NMDAR2B, ja CCNA1 havaittiin ensisijainen mahasyövän kudoksissa, kun promoottori-DNA: n metylaatio oli erittäin korkea (kuvio 3). Toisaalta, ei laskua proteiinin ilmentymisen PGP9.5, NMDAR2B tai CCNA1 havaittiin, kun promoottori-DNA: n metylaatio oli alhainen (kuvio 4).

immunohistokemiallinen värjäys PGP9.5, NMADR2B, ja CCNA1 in primaarikasvaimen tai ilman hypermetylaatiota promoottorialueen vastaavan geenin (alkuperäinen suurennos, X100, mittakaava baareja, 100 m).

kliinis analyysi ensisijainen mahasyövän patologisen vaiheen II /III mahasyövän standardin hoitoon

kliinis-ja ennusteen (5 vuoden RFS ja OS) analysoitiin sitten joka univariable tavalla mahasyövän patologisen vaiheen II /III mahasyövän standardin hoitoon (leikkaus plus leikkauksen jälkeinen S- 1 hallinto) (taulukko 1). Me luokitteli mahasyöpäpotilaista 3 ryhmään, joka perustuu

p53

mutaatiostatus sekä DNA metylaatiostatuksen

PGP9

.

5

,

NMDAR2B

ja

CCNA1

, jota nimetty genomista ja epigeneettiset luokkia, vastaavasti (GEC). Nämä kolme ryhmää olivat

p53

mutantti,

p53

villityypin super-korkea metylaatio (SHM) edellä 3

p53

reitin geenien (

p53

WT /SHM), ja

p53

villityypin ilman (w /o) SHM (

p53

WT w /o SHM).

Mielenkiintoista, potilasryhmiä luokitusta on GECs merkittävästi korreloivat sukupuoli (p = 0,0003), ikä (p = 0,08), Lauren: n histologia (p = 0,005) ja tunkeutuminen kuvio (p = 0,001), mutta ei ennustetekijöiden kuten lavastus tekijöitä. Potilasryhmät luokiteltu perustuen GECs osoitti myös, että

p53

mutantti ja

p53

WT /SHM ryhmät olivat samanlaiset mitattuna potilaan numero kunkin kliinisen ominaisuuden mutta erosivat tässä suhteessa verrattuna

p53

WT w /o SHM ryhmä. Niinpä äskettäin nimetty entinen ryhmät (

p53

mutantti plus

p53

WT /SHM ryhmiä), kuten

p53

poikkeavuus ryhmä, ja jälkimmäisen ryhmän (

p53

WT w /o SHM) nimettiin

p53

ei poikkeavuus ryhmä.

Vaikka ennuste ei ollut merkitsevästi erilainen eri ryhmissä luokiteltava GEC (kuvio 2B ), lisää toistuminen löytyivät

p53

poikkeavuus ryhmässä verrattuna

p53

kuin poikkeamia ryhmä (taulukko 1, ei tilastollisesti merkitsevä ero). Tämä suuntaus on säilynyt kannalta toistumisen rakenteessa kunkin imusolmukkeiden, vatsakalvon ja kaukainen elimet (taulukko 2), mikä viittaa siihen, että

p53

poikkeavuus ryhmä todennäköisesti näytteille kliinisesti ainutlaatuinen fenotyyppi jopa alkaen prognostisia näkökulmasta. Kun vain tapauksissa toistuminen analysoitiin,

p53

poikkeavuus ryhmä jälleen merkitsevästi yhteydessä Laurenin histologia (taulukko 2, P = 0,01), ei kuitenkaan todettu uusiutumisen malleja, jotka olivat ainutlaatuisia

p53

poikkeama.

Toisaalta, hajanainen tyyppi mahasyövän verrokkeja paremmin ennustetta kuin suolistosta tyyppi mahalaukun syövän

p53

poikkeaman ryhmää (kuvio 5A). Koska tällaisia ​​potilaita yleensä jaetaan pitemmälle, nämä selviytymisen tiedot osoittivat, että S1 postoperatiivinen adjuvanttihoitoa on tehokkaampi hajanainen tyyppi mahasyövän kuin suoliston tyyppi mahasyövän tapauksissa

p53

reitin poikkeama (kuvio 5B).

(A) Eloonjäämiskäyrät suolen tyyppiä verrattiin hajakuormituksen tyyppiä mahasyövän kanssa pStage II /III. (B) Syöpä vaiheessa jakelun mukaan

p53

poikkeavuus ryhmä ja histologinen havainnoista.

Lopuksi vertailutiedot (taulukko 1), univariable ennustetekijöitä analyysi RFS ja OS Kaikkien potilaat tunnistetaan kliinisesti merkittävä potentiaali ennustetekijöiden edustavat huono selviytyminen kuten sukupuoli (P = 0,03, P = 0,1), ikä ≥67 vuotta (P = 0,009, P = 0,001), ylempi kasvaimen sijainti (P ​​= 0,06, P = 0,1), 14

th JGCA /7

th UICC pT (P = 0,08, P = 0,4), 14

th JGCA pN (P = 0,001, P = 0,06), ja 14

th JGCA /7

th UICC vaiheessa (P 0,0001, P = 0,03).

Epigeneettiset indusoi p53-proteiinin ilmentymisen, yhtäpitävä p53 transkriptioaktiviteettia

Epigeneettiset hoidossa NUGC4 mahasyövän solu linjat (villityypin

p53

) 5 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiinin tai 5 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiinin ja trikostatiini robustisti aiheuttaman apoptoosin ilman kemoterapeuttisen aineen CDDP. Muita hoito CDDP edelleen merkittävästi lisätyn nämä apoptoottisia vaikutuksia (kuvio 6C). Mielenkiintoista on, CDDP yhdessä epigeneettisiä hoitojen voimakkaasti lisääntynyt p53-proteiinin tasoa, joka osittain, mutta ei kokonaan, mikä näkyy

p53

transkriptionaalista aktiivisuutta lusiferaasireportterigeeniin (kuvio 6A ja 6B). Nämä havainnot ehdottivat, että

p53

transkription aktiivisuutta voidaan aktivoida uudelleen epigeneettiset hoitoja, mutta se osoittaa myös, että apoptoosin vain osittain indusoi kautta

p53

reitin.

NUGC4 ja KATOIII soluja käsiteltiin demetyloiva aineen, 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC): n läsnä tai poissa ollessa histonideasetylaasi (HDAC) estäjä, trikostatiini A (TSA), ja kun läsnä tai poissa kemoterapeuttisen reagenssi, CDDP. 1A ja 5A, 1 ja 5 uM 5-atsa-dC; T, TSA. Tämän jälkeen solut analysoitiin: (A) p53-proteiinin ilmentymisen Western blotting -tekniikalla. (B) Dual reportterianalyysi vahvista

p53

transkription aktiivisuutta. Katkoviiva osoittaa optimaalisen raja-arvo (0,15) määrittämiseen p53 aktiivisuuden. (C) Cell apoptoosi määritettiin käyttäen neksiini Assay. Edustava kuva näytetään. Data näytetään prosenttiosuus alussa ja lopussa apoptoottisia soluja. * P 0,05, ** 0,001, *** 0,0001.

Lisäksi epigeneettiset hoidossa KATOIII mahasyövän solulinjoissa (

p53

null), jossa on 1 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiinin tai 1 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiinin ja trikostatiini robustisti aiheuttaman apoptoosin ilman CDDP, mutta lisäksi CDDP hoito ei vielä merkittävästi lisätä apoptoottista vaikutusta (kuvio 6C). CDDP yhdistettynä epigeneettisellä hoitoja ei suurentanut p53-proteiinin tasoa, mikä heijastui puute

p53

transkriptionaalista aktiivisuutta lusiferaasireportterigeeniin (kuvio 6A ja 6B). Nämä havainnot ehdottivat, että

p53

transkription aktiivisuutta ei vaadita apoptoosi epigeneettiset hoitoja KATOIII soluissa (

p53

null-solut).

Keskustelu

Tämä nykyinen tutkimus on ensimmäinen raportti, joka SHM kasvainten synnyssä

p53

reitin löytyy yksinomaan patologinen vaiheen II /III mahasyövän villin tyypin

p53

(kuva 3). Valitsimme pStage II /III mahasyöpäpotilaista standardin hoitoja

p53

koulutusjakson analyysi, koska monitieteellinen hoitojen näillä potilailla on parhaat mahdollisuudet saavuttaa ennustetekijöiden parannus täydellinen kovettuvuuteen [24, 25]. Tämä näkökohta tulisi olla ensisijainen tavoite, kun otetaan huomioon edelleen kehittää uusia hoitostrategioita.

Lähes täydellinen metylaatio promoottori DNA CpG-saarekkeiden tarvitaan täydellinen geenien, ja pienetkin osuudet metyloitumattomien alleelien uskottavasti aiheuttaa geeniekspression [ ,,,0],1-5]. Ensisijaisen kasvaimen kudokset, SHM on muodostettava lähes täydellinen metylointi syöpäsoluissa, ja SHM ensisijaisen kasvaimen kudokset todellakin liittyy alentunut proteiinin sellaisten geenien ekspression (kuvio 4). Tämä tulos viittasi siihen, että SHM geenien

p53

reitti voisi olla toiminnallisesti vastaava

p53

toiminnallinen poikkeavuus, joka tapahtuu seurauksena

p53

mutaatio, koska nämä 3 molekyylien toimivat samalla

p53

reitin.

mahasyövän,

p53

poikkeavuus ryhmä merkitsevästi yhteydessä ainutlaatuinen kliinis fenotyypit, kuten Lauren suoliston histologia, miessukupuoli, vanha ikä, ja vähemmän infiltroiva kasvun (taulukko 1). Nykyinen havainnot voivat liittyä Aiempien raporttien, joka osoitti, että

p53

mutaatio korreloi varhaisessa vaiheessa suoliston tyypin mahasyöpä, tai myöhäisessä vaiheessa hajanainen tyyppi mahasyövän [26, 27], tai korkeasta iästä [ ,,,0],28], mutta meidän kliinis analyysi koostuivat pääosin keskivaiheen mahasyövän. Mielenkiintoista, polku poikkeavuus on ainutlaatuinen ja kestävä jopa toistuvia potilailla (taulukko 2).

positiivinen ennustetekijöiden merkitystä

p53

mutaatio mahasyövän on kiistanalainen sekä kannattajien [29] ja toisinajattelijoita [30 ] tästä mahdollisuudesta. Ensi silmäyksellä tietomme näyttävät tukevan jälkimmäiseen ryhmään, mutta se on otettava huomioon, että selviytyminen data on todennäköisesti muutettu leikkauksen jälkeinen adjuvanttihoitoa (tavanomaista hoitoa Japanissa). Katsovat, toisin kuin esillä olevassa tutkimuksessa, hajanainen tyyppi mahasyövän osoitti huonompi ennuste kuin suolistosta tyyppi mahasyövän meidän sairaalassa vuosikymmeniä sitten [15, 31], päivitettyä selviytymisen tiedot tukevat päinvastaista tulosta (eli suoliston tyyppinen mahasyöpä näyttää huonompi ennuste kuin hajanainen tyyppi mahalaukun syöpä), joka on oletettavasti johtuu S-1 postoperatiivinen adjuvanttivaikutukset [32]. Leikkauksen jälkeisen adjuvantti S-1 kemoterapia on ehdotettu olevan merkitsevästi tehokkaampia vatsakalvon tauti kuin kaukainen organ etäpesäke [24], ja se on todennäköisesti tehokkaampi hajanainen tyyppi mahasyövän kuin suoliston tyyppi mahasyövän [32] . Näistä syistä, viimeisin selviytyminen analyysi osoittaa, että ennusteen hajanainen tyyppi mahalaukun syöpä on parantunut, että suolen tyyppiä mahasyövän.

ei ollut tilastollista eroa toistumisen määrä tai ainutlaatuinen toistuminen sivustojen välillä

p53

poikkeavuus ryhmä ja

p53

ei poikkeavuus ryhmä, mutta enemmän toistuminen havaittiin kussakin toistumisen sivustoja

p53

ei-poikkeavuus ryhmässä verrattuna

p53

poikkeama ryhmä. Nämä havainnot saattavat ehdottaa, että

p53

ei poikkeavuus ryhmä on aggressiivisempi fenotyyppi kuin

p53

poikkeavuus ryhmä kokonaisuutena. Tutkimuksessamme hajanainen tyyppi mahasyövän verrokkeja paremmin ennustetta kuin suolistosta tyyppi mahalaukun syövän

p53

poikkeama ryhmä. Koska tällaisia ​​potilaita yleensä jaetaan pitemmälle, nämä selviytymisen tiedot osoittivat, että S1 postoperatiivinen adjuvanttihoitoa on tehokkaampi hajanainen tyyppi mahasyövän kuin suoliston tyyppi mahasyövän tapauksissa

p53

reitin poikkeamaa. Nämä löydökset olivat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien että mutantti

p53

ja /tai immuno- p53-proteiinin voisi ennustaa biomarkkereita myönteisiä vaikutuksia suuren annoksen neoadjuvanttikemoterapian mahasyövän [30].

lopuksi arvioitiin epigeneettiset hoidon vaikutuksia yhdistelmänä kemoterapeuttisen aineen, jotta voidaan verrata, kuinka tärkeää on

p53

väylän epigeneettiset väylän mahasyövän käsitellyissä soluissa CDDP. Yllättäen kävi ilmi, että

p53

polku tuskin olla hyvin kriittinen rooli apoptoosin induktion CDDP (Kuva 6). Äskettäin osoitettiin, että epigeneettisellä syövän synty on todellakin mahdollista. Tässä järjestelmässä, systeeminen iPS indusoi uudelleenohjelmoinnin tekijät johtaa systeeminen syövän esiintyminen dynaamisilla epigeneettiset muutokset, vaikka systeeminen palautuminen näistä uudelleenohjelmointi tekijöiden palaa syöpäsolujen normaaliin soluihin [33]. Mahasyöpä todennäköisesti satama vähemmän mutaatioita kuljettajan geenejä [34] kuin peräsuolen syöpä [35], ja vastaavasti mutaatiot muita kuin

p53

geeni ovat harvinaisia ​​rintasyövän [35], mikä viittaa siihen, että epigeneettisten karsinogeneesiä on mahdollinen merkittävä etiologia kautta krooninen infektio Helicobacter pylori [36-38]. Olemme äskettäin osoittaneet hyper-metyloinnin

Reprimo

[39], joka taas on geenin

p53

reitin, mutta joita ei voitu sisällyttää tässä tutkimuksessa, ja

HOPX

[16] ja

CDO1

[40], jotka molemmat osallistuvat apoptoosiin, mutta oletettavasti ei läpi

p53

kautta. Perustuvat tämänhetkiseen toiminnallisia kokeita,

p53

reitin osuus epigeneettiset hoidon vaikutuksia on todennäköisesti paljon pienempi kuin muut reitit (kuvio 5). Käytimme muita solulinjoja (2 mahasyövän solulinjoista ja 1 hepatosellulaarinen syöpä solulinja) määritellä tarkasti panos

p53

polku indusoiman apoptoosin CDDP yhdessä epigenetic hoitoja. Ylimääräiset suoritetuissa kokeissa on esitetty S3 kuvassa. AZ521 ja HepG2 solulinjat ovat

p53

villityypin ja SH10 solulinja on

p53

mutantti.

p53

aktiivisuutta havaittiin

p53

villityypin soluissa, mutta sen aktiivisuus riippui kustakin solulinjasta. Siten

p53

aktiivisuutta havaittiin NUGC4 solujen CDDP hoitoon sekä AZ521 ja HepG2-soluissa ilman CDDP hoitoa. Vahva apoptoosin arvioituna apoptoosimäärityksessä (kaspaasi 3 tai neksiini Pitoisuus) ei välttämättä asteinen

p53

transkription aktivaation. In

p53

mutantti (SH10) tai

p53

null-soluissa,

p53

transkriptionaalista aktiivisuutta ei indusoi lainkaan, mutta apoptoosi havaittiin olevan samanlainen kuin