Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cell plastisuus säätelee tasapaino mesenkymaalisten ja epiteelin siirtymistä (MET) ja vastakkaisen ohjelma, EMT, on kriittinen Metastasoituneessa Cascade. Useat transkriptiotekijät (TF: t) tiedetään säännellä EMT, vaikka mekanismit MET jäävät epäselviksi. Osoitamme uusi funktio kaksi TF: ien, OVOL1 ja OVOL2, kriittisenä indusoijia MET ihmisen syövissä. Meidän tulokset osoittavat, että OVOL-TF: t ohjaus tyydyttää sääntely takaisinkytkentäsilmukan kanssa EMT-asiakkuutta TF ZEB1, ja sääntelyn mRNA indusoimalla epiteelikasvaimet Jatkaminen Regulatory Protein 1 (ESRP1). Hiirellä eturauhasen kasvain malleja osoitamme, että ilmentyminen OVOL-TF: iä in mesenkymaalisten eturauhassyövän solut vaimentaa metastasoituneeseen potentiaalia. Rooli OVOL-TF: t kuten indusoijia MET tukee lisäksi ilmaisun analyysit 917 syöpäsolulinjoissa, mikä viittaa niiden rooli ratkaiseva sääntelyviranomaisten epiteelisolujen mesenkyymisoluyhteisviljelmissä plastisuus syövässä.

Citation: Roca H, Hernandez J , Weidner S, McEachin RC, Fuller K, Sud S, et ai. (2013) transkriptiotekijät OVOL1 ja OVOL2 indusoivat mesenkyymikasvaimia on epiteelikasvaimet Transition Human Cancer. PLoS ONE 8 (10): e76773. doi: 10,1371 /journal.pone.0076773

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 28 elokuu 2013; Julkaistu: 04 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Roca et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat U54-CA163124, U01-CA143055, P50-CA69568 ja PO1-CA093900 National Institutes of Health. KJP tuetaan kuin American Cancer Society Clinical tutkimusprofessori minkä Taubman Research Scholar of Michiganin yliopistosta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

yli 90% syöpään liittyvien kuolemien johtuvat etäpesäke [1]. Näin ollen meidän on edelleen meidän mekanismien ymmärtämistä ajo syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT), ja päinvastaisen prosessin MET, ovat ratkaisevia ohjelmien mukana haavan paranemista ja varhaisen urut kehitystä [2]. EMT ja MET voi myös kriittisiä rooleja sekä syövän etenemiseen ja perustamalla metastaattisen pesäkkeiden [3]. Kun syöpäsolut tehdään EMT, ne saavat kyvyn erottaa primaarikasvaimen ja lasketaan liikkeeseen. Nämä verenkierrossa solut ovat sitten kykenevät levittämään ja meneillään MET, jolloin etäpesäkkeitä. Ymmärtäminen tämä fenotyypin plastisuus on yksi avain estää syövän etenemisen [4].

EMT liittyy muutoksiin geenien ilmentymistä ja morfologia ja liittyy downregulation soluadheesion proteiineja, kuten E-kadheriinin (E-cad ). Tämä prosessi mahdollistaa syöpäsolujen irtoavan naapureitaan samalla kasvattaa niiden liikkuvuutta [5]. On ehdotettu, että EMT säätelee vastavuoroinen takaisinkytkentäsilmukoiden välillä ZEB1 /ZEB2 TF: t ja jäsenten MicroRNA miR-200 perhe [6,7]. Erityisesti ZEB1 voi aiheuttaa EMT by tukahduta epiteelin proteiineja ja vähen- tämisessä oman miR-200 repressors. Samaan aikaan, miR-200s tukahduttavat ZEB1 sekä kantasolujen tekijät ja epigeneettiset sääntelyviranomaisten mukana EMT. Uskotaan, että nämä vastavuoroisesti palaute silmukat ovat vastuussa, osittain, että fenotyyppinen plastisuus näytteillä syövän ja etäpesäkkeitä [4].

Muut proteiinit voivat toimia sääntelyviranomaisten /indusoijia EMT tai mahdollisia biomarkkereita mesenkyymisolujen. Induktio EMT on liittynyt TGFli ilme [8]. Osittain tämä tapahtuu kautta säätelyä ZEB1 /2, mikä puolestaan ​​estää epiteelin silmukoinnin säätelyproteiineihin (ESRP) [9]. Downregulation turvallisuustutkimusohjelman, ja tuloksena tukahduttaminen vaihtoehtoisen silmukoinnin, on osoitettu olevan ratkaiseva EMT. Esimerkiksi rintasyöpä, tukahduttaminen turvallisuustutkimusohjelman johtaa kytkimen CD44 isoformin ilmentyminen, joka on kriittinen induktio EMT ja syövän etenemistä [10].

Huolimatta kasvava tietämys EMT, mekanismit välittävät MET ovat paljon vähemmän ymmärretty. Käyttämällä kahta mallia eturauhasen ja rintasyövän mesenkyymisolujen, huomasimme, että TF: iä OVOL1 (OVO kaltainen 1, Entrez Gene ID 5017) ja OVOL2 (Gene ID 58495) liittyvät MET meidän malleissa sekä muissa syövissä. OVOLs ovat sinkki sormella TF: ille, jotka toimivat sääntelyviranomaiset alkionkehityksen [11-13]. Ensin analysoidaan miten OVOLs hallita ilmentymistä EMT-asiakkuutta TF: ien ja ESRPs. Sitten tutkittiin, miten MET, aiheuttama OVOL-TF: iä, korreloi avaintekijöitä epiteelisolujen kehitys 917 syövän solulinjoja, jotka noudattavat Human Cancer Cell Encyclopedia [14], ja tutki vaikutukset MET säätelyssä syöpäsolun invaasio ja metastaasi.

tulokset

Stable mesenkyymisolujen eristettiin vakaa epiteelin syöpäsolujen viljeltiin yhdessä makrofagien

mekanismien selvittämiseen EMT eturauhasen syöpäsolujen leviämiseen ensin tuotti epiteelin malli solulinja on peräisin lusiferaasin positiivinen eturauhassyövän epiteelisolujen PC3-soluissa. Olemme eristetty alapopulaation solut, jotka ilmentävät lusiferaasia, jotka osoittivat vakaata epiteelin fenotyypin kulttuurin ja nimetty niiden PC3-Epi. Nämä solut valittiin kahden kriteerin perusteella: bioluminescent intensiteetti ja epiteelisolujen morfologia. Yhdenmukainen epiteelin valtion, PC3-Epi soluista säilyy korkea E-cad, alhainen vimentiinistä, ja havaita ilmaus EMT-aktivaattori ZEB1 (kuvio 1A ja 1B).

(A) Kirkas-vaiheen mikroskopia: morfologia muutokset mesenkyymisolujen PC3-EMT1, PC3-EMT12 ja PC3-EMT14 verrattuna epiteelin PC3-Epi eturauhasen syöpäsoluja. Mittaviivat ovat 200 mikrometriä.

(B) Immunoblot: Expression of EMT merkkiaineiden mesenkymaalisten syöpäsolulinjoissa PC3-EMT1, -EMT2, -EMT12, -EMT14 ja -EMT17 verrattuna epiteelin PC3-Epi.

(C) Microarray: Geenien ilmentyminen analyysit vertaamalla mesenkymaalisten epiteeli- syöpäsolun linjat. Venn-kaavio-I (VD-I) kuvaa yhteinen EMT liittyvä allekirjoitus ilmaistu mesenkymaaliset syöpälinjojen PC3-EMT1, -EMT12 ja -EMT14 verrattuna epiteelin PC3-Epi. VD-II – Gene allekirjoituksensa VD-I leikkaavat allekirjoituksella ZEB1 vaiennettu solujen PC3-EMT1 ja -EMT14 käyttäen shRNA-sh4 suhteessa muokkaamaan (SCR) valvonta shRNA.

(D) Valoisuus vaihe mikroskopia: PC3-EMT14 transfektoitujen solujen ZEB1-shRNAs: SH2, SH4 tai Scr. Mittaviivat ovat 100 pm.

(E) Immunoblot: Expression of EMT merkkiaineiden PC3-EMT1 ja -EMT14 transfektoitu ZEB1-shRNAs verrattuna Scr tai ei-transfek- valvontaa.

(F ) Heat kartta: 50 geenien allekirjoitus tunnistettu VD-II (paneeli C). Yliaktiivista geenit ovat punaisia, vaimentua sinisellä. Kertainen muutokset mesenkymaaliset syöpäsolut ovat suhteessa epiteeli- PC3-Epi ja SH4-transfektoiduissa soluissa ovat suhteessa Scr valvontaa.

immunoblot Esitetyt tulokset edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta samoin tuloksin. Katso myös kuva S1 ja Taulukko S1.

Seuraava kehittäneet mesenkymaalisten malli PC3-Epi solujen vuorovaikutusten kautta makrofagien. Oletimme, että tämä olisi mahdollista, koska makrofagit ovat yksi suurimmista tulehdussolujen-infiltraatit kasvaimen mikroympäristössä ja ne ovat sekaantuneet etäpesäkkeitä [15,16]. Co-kulttuuri IL4 saaneista CD14 + monosyyttien (M2-makrofagit) ja PC3-Epi neljä päivää aiheuttama voimakas morfologisia muutoksia yhdenmukaisia ​​EMT, samanaikaisen lasku ilmentyminen E-cad ja kasvu vimentiinista (kuviot S1A ja S1B). Näistä soluista me eristetty mesenkymaaliset osapopulaatiosta nimetty PC3-EMT1, PC3-EMT2, PC3-EMT12, PC3-EMT14 ja PC3-EMT17. Nämä mesenkymaaliset solut osoittivat silmiinpistävää fenotyypin muutoksen ja ilmentyminen ZEB1, joka säilyy pysyvästi viljelmässä (kuvio 1A ja 1 B). Verrattuna emo-epiteelin PC3-Epi mesenkymaaliset solut ilmensivät alemmille tasoille epiteelisolujen adheesiomolekyyli EpCAM; kuitenkin edelleen noin 45% soluista ilmaistu EpCAM solussa pinnalla osoituksena virtaussytometrialla (kuvio S1C).

arvioimiseksi geenien ilmentymisen muutoksia liittyvät EMT teimme kolme microarray analyyseja, vertaamalla PC3-EMT1, PC3-EMT12 ja PC3-EMT14 ja PC3-Epi. Olemme tunnistaneet allekirjoitus 867 geenejä, jotka osoittavat muutoksia ilmaisun (2-kertaisesti tai enemmän) kaikissa kolmessa vertailussa (VD-I, kuvio 1C). Käytimme Nerokkuus Pathway Analysis (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com) selvittämään merkittävimmin rikastettu molekyyli liittyvät toiminnot tämän allekirjoituksen: ”cellular liike”, ”solujen kasvun ja lisääntymisen”, ”solu-solu-signalointi ja vuorovaikutus” ja ”solukuolema” kaikki ovat sopusoinnussa EMT (taulukko S1). ZEB1, joka upregulated kaikissa kolmessa vertailuissa, on laajalti liitetty EMT ja ylläpito mesenkymaalisten valtion [2,7]. Muut EMT-asiakkuutta transkriptiotekijöitä kuten Snail, Slug tai Twist1, usein tuumorigeneesiin ja etäpesäkkeiden [2], joita ei ole tunnistettu joukossa yhteistä EMT allekirjoitus 867 yllä kuvatuista geeneistä. Näin ollen ymmärtää rooli ZEB1 on EMT-solun ohjelman, transfektoimme kaksi mesenkymaaliset riviä (PC3-EMT1 ja PC3-EMT14), jossa yksi kahdesta lentiviruksen ZEB1-shRNAs vektorit: SH2 ja SH4, sekä salattu ohjaus (SCR). Yhdenmukainen ZEB1 rooli EMT ja ylläpito mesenkymaalisten tilan, vaimentaminen ZEB1 aiheuttama MET PC3-EMT1 ja PC3-EMT14, vastaavat muutokset solun morfologiassa (kuvio 1 D). Lisäksi SH2 ja SH4 aiheuttama silmiinpistävää lasku ZEB1, joka vastaa säätelyä E-cad (kuvio 1 E). Nämä kokeet viittaavat vahvasti siihen keskeinen rooli ZEB1 vuonna EMT tilassa näiden solujen. Kun joukko eri tavalla ilmaistuna geenien sh4-transfektoiduissa soluissa oli sovitettu EMT allekirjoituksen (VD-I), löysimme ilmaisun muutoksia 50 geenejä, jotka korreloivat MET transformaatio (VD-II, kuvio 1C). Tämä allekirjoitus osoitti vastapäätä asetus, kun solut transfektoitiin ZEB1-shRNA sh4 suhteessa salattu ohjaus (kuvio 1 F). Tämä lähestymistapa myös määritetty 4 TF: iä merkittävästi vaimentua siinä mesenkyymisolujen ja voimistuvan ZEB1-shRNA: IRF6, ANKRD22, EHF ja OVOL2.

OVOL1 ja OVOL2 säädellä MET eturauhasen syöpä malli

koska havaitut muutokset ilmentymä IRF6, ANKRD22, EHF ja OVOL2 vuonna EMT sekä havaitun palaute välillä ZEB1 ja näiden TF: iä, me arveltu, että vakaa EMT ominaisuudet säilyvät leviämistä PC3-EMT1 ja PC3-EMT14 soluissa ovat seurausta sääntelyn takaisinkytkentäsilmukan. Samoin koska nämä geenit vaimentua vuonna EMT, joka yli-ilmentää niitä voivat aiheuttaa MET. Arvioimme rooli kunkin 4 voimistunut TF: ille erikseen transdusoimalla PC3-EMT14 solujen lentiviral yliekspressoivien konstruktioita. Ilmaisu Näiden 4 TF: iä on EMT soluissa osoitti, että OVOL2 näytti säädellä MET, jonka havaitsee muutoksen solun morfologiassa. Koska paljon yhtäläisyyksiä välillä OVOL2 ja OVOL1 sekä OVOL2 ilmeinen rooli MET, olemme edelleen tutkittava OVOL1 voi olla rooli MET. Vaikka OVOL1 ei täytä 2-kertainen kynnys sisällytetään microarray-geenin allekirjoitus ZEB1 knockdown-soluja, qPCR analyysi osoitti, että se on erittäin ylössäädelty epiteeli- PC3-Epi-solujen ja seuraavat ZEB1 hiljentäminen verrattuna mesenkymaaliset PC3 EMT14 (kuvio 2A ja kuvio S2A). Siksi tutkimme myös ilmentymisen OVOL1, että mesenkymaaliset PC3-EMT14 soluja. Yliekspressio Sekä OVOL1 ja OVOL2 aiheuttama huomattava muutos solujen morfologia ja samalla lisääntynyt E-cad ilmaisu (kuvio 2B ja 2C). Lisäksi sekä OVOLs lisääntyneen ekspression ESRP1 (kuvio 2C, vasen paneeli) [17]. By qPCR me analysoidaan muutokset ilmaus useiden EMT-asiakkuutta transkriptiotekijöitä: ZEB1, ZEB2, Etana, Slug ja Twist1 (kuvio 2C, oikea paneeli). Näistä tekijöistä ZEB1, ZEB2 ja Slug paljasti merkittävä lasku ilmaisua, joka korreloi MET. Olemme vahvistaneet, että ilmaisu havaitut muutokset OVOL1 ja OVOL2 vastaavat muutokset proteiinin tasot Western blot (kuvio 2D). Sitten verrataan solulysaatteja OVOL1 ja OVOL2 yli-ilmentäviä soluja PC3-Epi, PC3-EMT14-EV, ja solut yli-ilmentävät TF: ien IRF6 ja ANKRD22, säännellään myös ZEB1 (kuvio 1 F). Rescue of E-cad ja menetys vimentiinista indusoitiin sekä OVOL yli-ilmentäviä soluja, kun taas mitään merkittävää muutosta ei havaittu soluissa, jotka ilmentävät muita TF: ien (IRF6 ja ANKRD22) (kuvio 2E). Vaikka qPCR heijastuu merkittävä muutos Slug ilmaisua, Länsi eivät osoittaneet muutosta proteiinin tasolla OVOL yli-ilmentävät solut, mikä viittaa siihen, että translaation sääntely saattaa olla merkitystä Slug tasoilla. Viidestä TF: ien testattu, nämä tulokset osoittavat, että OVOL1 ja OVOL2 ovat keskeisiä indusoijia MET näissä soluissa.

(A) qPCR: mRNA: n ekspression PC3-EMT14-sh4 suhteessa PC3-EMT14-Scr.

(B) Kirkas-vaiheen mikroskopia: PC3-EMT14 soluja, jotka ilmentävät OVOL1 ja OVOL2 osoittavat epiteelin fenotyyppi verrattuna emo-PC3-EMT14. Scale palkit ovat 100 um.

(C) qPCR: n ilmentyminen epiteelisolun markkereita E-cad ja ESRP1 ja EMT-indusoiva TF: ien ZEB1, ZEB2, Slug, Snail, ja Twist1 PC3-EMT14 solujen ilmentävät OVOL1 ja OVOL2 suhteessa tyhjän vektorin (EV) kontrolli.

(D) Immunoblot: OVOL1 ja OVOL2 proteiinin ilmentyminen transfektoiduissa soluissa varmistettiin käyttämällä OVOL1 tai V5-spesifisten vasta-aineiden, vastaavasti.

(E) Immunoblot: Expression of epiteelin merkki E-cad ja mesenkymaalisten markkereita ZEB1 ja vimentiinista. Muutokset Slug ilmaisun olivat vähäisiä ja ei korreloinut MET. PC3-EMT14 soluja, jotka ilmentävät IRF6 tai ANKRD22, EV ja epiteelin PC3-Epi ovat valvontaa.

(F) Invasion /migraatiokokeessa: Kuvat ovat ja kaavioita syöpäsoluinvaasiota käyttämällä Boyden kammion määritystä. Pylväsdiagrammeja OVOL1 ja OVOL2 ilmentävät PC3-EMT14 solujen suhteellinen EV. Prosenttia invaasio edustaa suhdetta hyökkääviä /vaeltavat soluja. Kuvaaja edustaa yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta.

(G) qPCR: Expression of PC3-Epi transfektoitujen solujen OVOL1-shRNAs (a, b, c) tai OVOL2-shRNAs (d, e, f), suhteessa ei-hiljentäminen ohjaus PC3-Epi-NS (jota edustaa katkoviiva).

(H) Immunoblot: PC3-Epi transfektoitu sekä OVOL1 ja OVOL2 shRNAs (sh-OVOL1 /2) osoittaa lasku E-cad ja kasvu vimentiinista, mikä viittaa osittaiseen EMT muutosta.

(I) Kaavamainen: Tällä ZEB1 promoottori mahdollisten OVOL2 sitoutumiskohtia (oranssi kolmiot) mukaan yleinen yksimielisyys: 5′-A (A /T) (A /T) (C /A) (T /C) GTTA (T /A). Suunniteltu TaqMan alukeparit näkyvät mustat nuolet. Numerointi on suhteessa transkription aloituskohdan (+1). Sekvenssi oletetun OVOL2 sitoutumiskohdan, joka vastaa ChIP DNA OVOL2 ilmentävät solut on +320.

(J) ChIP qPCR: (vasen) esittää tulon kromatiiniin PC3-EMT14-OVOL2 suhteessa EV, ja osoittaa, että samanlaisia ​​määriä DNA: ta käytettiin (oikea). kuvaa ChIP DNA käyttäen OVOL2 vasta-ainetta. Alukkeet nimetty niiden forward-aluketta (katso paneeli I). Tulokset normalisoitiin tulo valvontaa. Käyrä esittää yhdessä edustavassa kokeessa kolmesta samanlaisin tuloksin.

qPCR tulokset normalisoitiin p-aktiinin. Käyrät osoittavat keskimääräistä +/- sem; p-arvot edustettuina * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. QPCRs ja immunobloteilla edustavat kaksi erillistä koetta samoin tuloksin. Katso myös kuva S2.

Ymmärtääksemme seuraus OVOL välittämää markkinatalouskohtelu invasiivisia potentiaalin mesenkymaalisten PC3-EMT14 soluja, käytimme Boyden chamber määrityksessä soluihin yliekspressoivien OVOL1 /2. Molemmat OVOLs vaikutti merkittävästi hyökkäys kapasiteettia PC3-EMT14. Kun kyseessä on OVOL1, havaitsimme alentunut solujen vaeltamiseen, joka vaikutti suhde hyökkäyksen vs. muuttoliike (invaasio index) (kuvio 2F). OVOL2 yli-ilmentävät solut osoittivat merkittävää laskua sekä hyökkäyksen ja maahanmuutto, erittäin pienentää hyökkäyksen indeksi. Nämä tulokset tukevat roolia OVOL1 ja OVOL2 alenevassa muuttoliike ja invaasio, odotetusti markkinatalouskohtelupyyntö ohjelmoida uudelleen soluja.

seuraavaa käyttöä shRNAs varten OVOL1 (shOVOL1-a, -b, -c) ja OVOL2 (shOVOL2- d, -e, f), vähentää ilmaisun epiteelin PC3-Epi soluissa (kuvio 2G). Mikään shRNAs vaikuttanut E-cad ilme. Kuitenkin solujen vähentynyt OVOL2 ilmaisua, havaitsimme merkittävää voimistumista (jopa 3-kertainen) ZEB1 mRNA. Nämä tulokset viittaavat siihen, että 3-kertainen muutos ZEB1 ilmaisu ei ole riittävä indusoimaan EMT PC3-Epi-soluja. Lisäksi, kuten havaita qPCR: n ilmentyminen ZEB1 on yli 20 kertaa suurempi PC3-EMT14 verrattuna PC3-Epi-soluja (kuvio S2A). Ottaen huomioon myös samanlainen toiminto OVOL1 ja OVOL2 induktioon MET on houkuttelevaa spekuloida, että ne voivat korvata toisensa. Tämä voi selittää, miksi pudotus on vain yksi OVOL ei ole riittävä indusoimaan merkittävä muutos E-cad. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi suoritimme kaksinkertainen knockdown kanssa shRNAs kullekin OVOL-TF: iä. Vaikka ei transfektoitujen solujen valinnan oli mahdollista (molemmat shRNA konstruktit ilmaisivat GFP), joka on koko väestöstä transfektoitujen solujen shOVOL1-a ja shOVOL2-d (shOVOL1 /2-a /d) osoitti merkittävää voimistumista vimentiinista ja osittainen lasku E-cad kontrolliin verrattuna PC3-Epi-NS-soluja (kuvio 2H). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, on kriittinen rooli sekä OVOLs ylläpitämisessä epiteelin tila näiden solujen ja siten, kaksinkertainen pudotus olisi tarpeen saada aikaan ja ylläpitää mesenkymaaliset tilaan. Näin ollen suurempi knockdovvn OVOL1 ja OVOL2 saisivat aikaan täydellisempi EMT transformaatio syöpäsoluissa.

Muut kokeet eturauhassyöpäsoluissa saada läpikäymään EMT johti samanlaisia ​​havaintoja, jotka koskevat sääntelyn OVOL ja ZEB1 TF: iä. Esimerkiksi transmembraaniproteiini Tetraspanin-8 (TSPAN8) tunnistettiin allekirjoitus kuvassa 1F geeninä yläreguloituja EMT soluissa ja vaimentua by ZEB1-shRNA. Yliekspressio TSPAN8 on epiteelin PC3-Epi ja DU145-soluissa johti osittaiseen EMT muutoksen, tunnettu siitä, että ylösajon ZEB1 ja vaimennussäätely OVOL TF: iä sekä solulinjoissa (kuvio S2B-E).

transkription repressori funktio OVOL2 on aiemmin esitetty keratinosyyteissä, jossa OVOL2 tukahdutettu c-Myc ja Notch1 [18]. Koska ZEB1 ilmaisu merkittävästi lisääntynyt solujen vähentynyt OVOL2 (kuvio 2G), testasimme jos OVOL2 suoraan vuorovaikutuksessa ZEB1 promoottori. Suoritimme chromatin immunosaostuksella (chip) kohdistaminen ZEB1 promoottorin PC3-EMT14-OVOL2 ja ohjaus solujen kahdella vasta, anti-OVOL2 ja anti-V5-tag. Suunnittelimme 7 TaqMan alukkeita ja koettimia ulottuen promoottori -4848-530 bp (kuvio 2 I) ja löysi useita mahdollisia OVOL2 sitoutumiskohtia: 5′-A (A /T) (A /T) (C /A) (T /C) GTTA (T /A) [18]. Sekä vasta-aineet, havaitsimme yli 50-kertainen rikastuminen on sama aluke /koetin-asentoon (+ 382 /+ 530), kun verrataan OVOL2-ilmentävien ja kontrollisolut (kuvio 2J ja kuvio S2B). Sen sijaan panos chromatin sekä solutyyppejä osoitti samanlaista vahvistusta kaikkien alukeparit. Nämä tulokset osoittavat spesifistä sitoutumista OVOL2 että ZEB1 promoottori on +325 alueella, jossa yksi OVOL2 konsensus-tunnistettiin (kuvio 2I). Lisäksi, koska mitään erityistä kromatiinin fragmentti monistettiin -115 /+ 29-alukkeita, on epätodennäköistä, että OVOL2 sitoutuu +115 sivuston, toinen mahdollinen sivusto proksimaalisen alueen (kuvio 2I). Fragmentti +123 – (- 115) = 238 bp on huomattavasti pienempi kuin +530 – (+115) = 415 bp; mutta suunnilleen yhtä suuri kuin + 530 – (+325) = + 205 emäsparia. Siksi sitoutumalla +115 sivuston merkitsisi tietyn avattavan on kromatiinin fragmentti, joka tulisi havaita kanssa -115 /+ 29-alukkeita. Yhdessä shRNA ja ekspressiotietojen nämä havainnot viittaavat siihen, että OVOL2 toimii suoraan transkription repressori ZEB1.

mesenkyymisolujen muodostavat mesenkymaaliset kasvaimia in vivo

määrittämiseksi Tuumorigeenisuustutkimuksissa PC3-EMT12 ja PC3-EMT14, me ihon alle ympätty immuunipuutteisilla NSG hiirillä. Molemmat mesenkymaalisten syöpäsolulinjoja valmistaa pääasiassa mesenkymaaliset-tyypin kasvaimet ominaista alhainen E-cad ja korkea ZEB1, kun taas PC3-Epi kasvaimia osoitti korkean E-cad ja alhainen ZEB1 lauseke (kuva S3A). Näimme ei ole merkittäviä eroja kasvaimen kasvun ryhmien välillä (kuva S3B). Arvioida metastaattisen potentiaalin mesenkymaalisten solujen, käytimme intrakardiaalisella injektio (ICI) hiirimallissa syövän etäpesäkkeiden [19]. Havaitsimme enemmän hiiriä etäpesäke useita sivustoja ryhmissä injektoitu PC3-EMT12 tai PC3-EMT14 soluja (kuvio 3A). He osoittivat myös suurempaa yleistä tuumorikuorma (noin yhtä suuruusluokkaa) ja väheni hiiri selviytymisen, verrattuna hiiriin ruiskutettiin vanhempien PC3-Epi soluissa (kuvio 3B ja kuvio S3C). Samanaikainen värjäys E-cad ja ZEB1 vasta osoittivat, että metastaattinen PC3-EMT12 ja PC3-EMT14 kasvaimet näkyvät tyypilliset mesenkymaaliset ominaisuudet (alhainen E-cad ja korkea ZEB1), kun taas etäpesäkkeitä päässä PC3-Epi soluilla pääasiassa epiteelin ominaisuudet (korkea E- cad ja matala ZEB1) (kuvio 3C ja kuvio S3D-E). Tulosten perusteella näyttää, että mesenkymaaliset solut (PC3-EMT12 ja PC3-EMT14) muodossa etäpesäkkeitä ylläpitävää mesenkymaaliset fenotyypin. Huomattakoon, että joitakin etäpesäkkeitä päässä PC3-Epi-solut osoittivat sekä mesenkymaalisten ja epiteelin ominaisuudet, vaikka suurin osa PC3-Epi kasvaimia osoitti epiteelin fenotyypin (kuvio 3C). Kuvio 3C esittää hiiren injektoitu PC3-Epi soluihin, missä kasvain vasemmassa reisiluu oli pääasiallisesti mesenkymaalisten tyyppi, kun kasvain oikeassa näkyy erittäin epiteelin fenotyyppi. Mikä tärkeintä, löysimme samanlainen mesenkymaalisten-epiteelisolujen plastisuus on etäpesäkekasvainten eristetty reisiluusta potilaan kanssa edenneen eturauhassyövän. IHC värjäys tuumorisektioiden E-cad ja ZEB1 vasta osoittivat alueilla sekä erittäin epiteelin (korkea E-cad, matala ZEB1) sekä mesenkymaalisten ominaisuudet (alhainen E-cad ja korkea ZEB1) (kuvio 3D).

(A) etäpesäke: prosenttiosuus ICI-ympätty hiirten useita lusiferaasin signaalien 21 ja 35 päivää.

(B) Kasvaimen taakan: hiiret saivat ICI ja oli kuvattu viikoittain 35 päivän ajan. Lusiferaasiekspressiota on edustettuna kiinnostavat alueet (ROI-fotonit /s).

(C) IHC: Samanaikainen ZEB1 ja E-cad värjäys metastaasien havaittu reisiluun ja maksan PC3-Epi tai PC3-EMT14 ruiskutetaan hiiriin. Huomaa mesenkymaaliset (ZEB1

high /E-cad

matala) (mustat nuolet) ja epiteelin (ZEB1

low /E-cad

korkea) (vihreät nuolet) syöpäsoluja, kuvaa EMT /MET plastisuus alaryhmien PC3-Epi ja PC3-EMT14. Mittaviivat ovat 100 um (musta) ja 20 um (punainen).

(D) IHC: ZEB1 tai E-cad värjäystä etäpesäke reisiluusta potilaan kanssa edenneen eturauhassyövän. Huomaa mesenkymaaliset kaltainen (ZEB1

korkea (mustat nuolet) /E-cad

pieni (keltainen nuolet)) ja epiteelin (ZEB1

low /E-cad

korkea (vihreät nuolet)) syöpä solut. Mittaviivat esitetty edustavat 100 um (musta palkki) ja 50 um (punainen palkki).

(E) Etäpesäke: prosenttiosuus ICI-ympätty hiirten useita lusiferaasin signaalien 21 ja 35 päivää.

(F) Tuumorirasitusta: Hiiret saivat ICI ja oli kuvattu viikoittain 35 päivän ajan. Lusiferaasiekspressiota on kuvattu kiinnostavat alueet (ROI-fotonit /s).

(G) IHC: ZEB1 tai E-cad värjäys metastaasien ICI-hiirillä. Huomautus korkeamman E-cad ja alempi ZEB1 ilmaisun metastaattisen soluissa, jotka ilmentävät OVOL1 tai ZEB1-shRNA (SH4). Mittakaava edustaa 100 um.

Käyrät osoittavat keskimääräistä +/- sem; p-arvot laskettiin ja edustettuina * p 0,05; ** P 0,01. Kaikki IHC kuvat edustavat yksi kolmesta osasta osoittavat samanlaisia ​​tuloksia. Katso myös kuvio S3.

Tulosten mukaan on esitetty kuviossa 2B-E, vaikutus OVOL1 yliekspression on samanlainen OVOL2. Molemmat aiheuttaa MET ja ZEB1 downregulation. Lisäksi ZEB1-shRNA indusoi sekä OVOL1 ja OVOL2 ja MET on mesenkymaaliset PC3-EMT14 soluissa (kuvio 2A). Valaista rooli OVOL TF: iä on metastaattisen potentiaalin solujen, me inokuloitiin hiiret kautta ICI epiteelisolujen yli-ilmentävät OVOL1 (PC3-EMT14-OVOL1), ZEB1-shRNA (PC3-EMT14-sh4) tai sekoitettua kontrollipeptidiä (PC3 EMT14-Scr). Arvioimme kasvaimen etenemisen bioluminenssina ja totesi, että aiheuttama MET PC3-EMT14 solujen vähensi metastaattista potentiaalia. Sekä ZEB1-shRNA ja OVOL1 ilmaisun vähensi hiirten kasvainten etäpesäkkeitä useita sivustoja (kuvio 3E). Lisäksi yleinen kasvaintaakkaa laski merkittävästi verrattuna hiiriin ruiskutettiin PC3-EMT14-Scr säätökennoja (kuvio 3F). IHC värjäys etäispesäkekasval- E-cad ja ZEB1 paljasti, että MET oli tapahtunut kasvainsoluissa, jotka ilmentävät OVOL1 tai ZEB1-shRNA, kuten on osoitettu positiivinen E-cad ja laskea ZEB1 ilmaisun toisin mesenkymaaliset kontrollisoluihin (kuvio 3G).

OVOL aiheuttama MET vähentää metastaattisen potentiaalin mesenkymaalisten syöpäsolujen

tutkimiseksi edelleen metastaattista potentiaalia OVOL ilmentävien solujen, käytimme ortotooppisten hiirimallissa eturauhassyövän [20]. Vuonna bioluminesenssi analyysi, näimme samanlainen yhteensä tuumorikuorma (ROI) kaikissa ryhmissä (kuvio 4A). Kaksikymmentäkahdeksan päivää inokulaation jälkeen, määrä hiirten etäpesäkkeitä oli merkitsevästi pienempi ryhmässä injektoitiin OVOL-ilmentäviä soluja (kuvio 4B ja 4C). Me resektoitiin primaarikasvainten 42 päivää istutuksen jälkeen, kirjataan painoja, ja analysoitiin tuumorisektioiden IHC. Orthotopic eturauhassyövän painot olivat merkittävästi korkeammat hiirillä, jotka inokuloitiin PC3-EMT14-OVOL2, kun taas hiiret injektoitiin kontrolli PC3-EMT14 solut osoittivat pienin paino (kuvio 4D). Havaittu väheneminen metastaattisen potentiaalin OVOL ilmentävien solujen mallissamme korreloi aiemman raportin osoittaa, että hiiret suurempia potilaalle tehdä eturauhasen kasvaimia oli alennettu metastaattinen rasitusta [20].

(A) Tuumorirasitusta: Lusiferaasiekspressiota on kuvattu kiinnostavat alueet (ROI-fotonit /s) hiirillä potilaalle tehdä injektioita.

(B) etäpesäke: (vasen) prosenttiosuus ortotooppisesti ympätty hiirten useita lusiferaasin signaalien 21 ja 28 päivää (Oikea ). kuvaa kokonaismäärä etäpesäkkeiden ryhmää kohti jaettuna hiirten (n) ryhmää kohti 28 päivää.

(C) Imaging: Kuvat ovat lusiferaasin ilmentymistä hiirissä 28 päivää sen jälkeen, kun vastaanottava ortotooppisten injektioita. Etäpesäkkeitä kustakin ryhmästä ympyröity punaisella joko vatsa-, selkä- kuvia ja lukuun ottamatta epäillään vastaavat samaa kasvain.

(D) Kasvaimen Paino: keskimääräinen painot potilaalle tehdä (eturauhasen) kasvaimia resekoitu 42 päivää (n = 4).

(E) IHC: E-cad, ja ZEB1 värjäys etäispesäkekasval- hiirillä, jotka saivat ortotooppisten injektioita kustakin ryhmästä inokuloitiin OVOL ilmentävien solujen tai valvontaa PC3-EMT14. Huomautus korkeamman E-cad ja alempi ZEB1 ilmaisun OVOL ilmentäviä syöpäsoluja. Mittakaava edustaa 100 um. IHC näyttää edustavan värjäytymisen yksi kolmesta osasta samanlaisin tuloksin.

Käyrät osoittavat keskimääräistä +/- sem; p-arvot laskettiin ja edustettuina ** p 0,01. Katso myös kuva S4.

IHC värjäys kasvainten paljasti, että PC3-EMT14 kasvaimet (potilaalle tehdä ja etäpesäkkeet) ovat pääasiassa mesenkymaalisten ja ovat enimmäkseen negatiivisia E-cad ilmaisun ja positiivinen ZEB1 (kuvio 4E ja Kuva S4A). Nämä mesenkymaaliset solut voivat lisääntyä ja muodostaa etäpesäkkeitä. Tämä osoitettiin edelleen Ki67 positiivista värjäytymistä E-cad negatiivinen solujen etäpesäkekasvainten osissa PC3-EMT14 hiirissä (kuvio S4b). Vaikka emme voi sulkea pois mahdollisuutta ohimenevä MET seuraa EMT nämä havainnot viittaavat siihen, että mesenkymaaliset solut eivät tarvitse suorittaa MET asuttaa kasvain. Sen sijaan OVOL-ilmentävät solut muodostivat ortotooppisten kasvaimia ja etäpesäkkeitä, joilla on vahva epiteelin fenotyyppi, jolle on ominaista korkea ilmentyminen E-cad ja lasketaan ZEB1; mikä viittaa vahvasti siihen, että OVOL-TF: t indusoivat ja vakauttaa MET näissä soluissa (kuvio 4E ja kuvio S4A).

OVOL TF: iä orchestrate transkription ja silmukoinnin sääntelyyn ohjelma, joka indusoi MET ihmisen syöpäsoluissa

seuraava etsineet johdonmukaisia ​​tuloksia käyttämällä kudos- cDNA paneelit jaksoja ihmisen eturauhassyövän kasvaimia (n = 40), arvioimalla ilmentyminen E-cad, OVOL1, ja OVOL2. Osoittaakseen korrelaatio E-cad ja OVOL-ilmaisun me normalisoitu kunkin näytteen arvon keskiarvo kaikkien kasvainnäytteestä. Havaitsimme vahvan korrelaation E-cad ja OVOL1 (r = 0,66) ja OVOL2 (r = 0,7), kaikilla testatuilla eturauhassyövän kudoksissa (kuvio 5A).

(A) qPCR: cDNA ihmisen ensisijainen eturauhassyövän kudosten (n = 40; Origene) analysoitiin ilmentyminen E-cad, OVOL1 ja OVOL2. Tulokset normalisoitiin p-aktiini ja esitetään suhteessa keskimääräiseen kaikkien syövän näytettä kutakin geeniä:.

log ((arvo Gene (X) on Sample) /(arvo Gene (X ) ja keskiarvo Cancer)). Näyte arvot näkyvät pistekuvioita ja korrelaatio OVOL1 tai OVOL2 ilmaisu E-cad laskettiin (r). Kuvaaja kuvaa edustava koe kahdesta samanlaisin tuloksin.

(B) Venn-kaavio: esittää RNA-seq tulokset differentiaalisesti ilmentyvien geenien yleistä OVOL ilmentävät solut ja PC3-Epi suhteessa PC3 EMT14. Risteyksessä A ja B on yhteinen epiteelin transkription allekirjoitus 277 geenejä. RNA-seq analysoitiin vähintään kahdesta biologisesta rinnakkaisnäytettä kustakin solulinjasta.

(C) Dot plot: Expression korrelaatio analyysit 277 geenien tunnistettu epiteelin allekirjoituksen paneeli (B). Korrelaatio on esitetty välillä PC3-Epi, PC3-EMT14-OVOL1 tai PC3-EMT14-OVOL2.

(D) Venn-kaavio: Vertaa tulokset paneelin (B), jossa geenejä, jotka korreloivat ilmaus OVOLs 917 ihmisen syöpäsolujen linjat. Alkaen 129 geeniä, jotka korreloivat (r 0,5) kanssa OVOLs ekspression 917 syöpäsolulinjoissa, 67 geenit indusoi ilmentymistä sekä OVOL1 ja OVOL2 PC3-EMT14 (C leikkauskohdassa D).

(E) Heat kartalla: ConceptGen analyysi 67 geenin-allekirjoituksen paneeli (D) paljasti luettelo 18 selityksin geenejä liittyviä toimintoja epiteelin tilan soluja.

(F) Taulukko: 45 geenit korreloivat negatiivisesti OVOL2 ilme (r -0,5) poikki 917 syöpäsolun linjat. Näistä 45 geenit, 10 esitetään myös vaimentua mukaan OVOL2 ilmentyminen PC3-EMT14. §§2.086.13/4.812.91/2.31+NM_016351ADAM221.000.400.4+NM_014324AMACR5.292.350.45+NR_036556ANKRD540.9900+NM_001010986ATP11C4.321.500.35+NM_174957ATP2A30.2600+NR_024597C11orf7300.46INF+NM_001001389CD440.395.1313.20+NM_001185177CES300.31INF+NM_203356CTAGE50.550.130.24+NM_001085460CTNND112.895.420.42+NM_133375DIS3L1.5000+NM_004432ELAVL21.450.370.26+NM_001135023ELMOD3*0.352.497.06+NM_001135022ELMOD3*3.761.850.49+NM_203343EPB4100.97INF+NM_001184939EPB41L5*1.493.662.47+NM_020909EPB41L5*1.740.620.36+NM_017848FAM120C1.860.920.5+NM_001015045FAM13A3.331.560.47+NM_001134456FAM55C5.552.650.48+NM_000802FOLR10.060.325.44+NM_001018100GCOM11.144.523.96+NM_001193322IKBKE0.9000+NM_016291IP6K26.1000+NM_177535_1MAGED4B9.113.070.34+NM_145687MAP4K422.7410.810.48+NM_001042453MST400.31INF+NM_022764MTHFSD1.670.750.45+NM_203318MYO18A2.385.782.43+NM_001098623OBSCN0.220.673+NM_001128629PAK63.016.252.07+NM_001166109PALLD1.846.803.69+NM_001146105PARP95.5311.412.06+NM_001184917PCYT21.103.142.85+NM_153321PMP2213.015.040.39+NM_182948PRKACB3.740.900.24+NM_001164758PRKAR1B*1.404.293.06+NM_001164759PRKAR1B*5.132.190.42+NM_002840PTPRF1.696.523.85+NM_144489RGS35.161.430.28+NM_138484SGOL100.41INF+NM_001135054SIGIRR15.506.130.4+NM_020428SLC44A2*5.8922.833.88+NM_001145056SLC44A2*28.715.320.19+NM_001104590SLFN111.800.600.33+NM_001184749SLITRK40.280.090.32+NM_001128210SPRED24.300.370.09+NM_001198531TCF7L22.050.740.36+NM_001167912VEPH14.4100+NM_014667VGLL42.556.172.41+NM_139119YY1AP12.084.912.36+NM_001145448ZNF2000.500.150.3+Table 0,01; Kaikki virhe palkit kuvaavat ± SEM.