Krooninen sairaus

tiivistelmä

Host immuuni peptidejä, kuten cathelicidins, on raportoitu olevan syövän vastaisen ominaisuudet. Olemme aiemmin raportoitu, että LL-37, vain cathelicidin ihmisillä, estää kehitystä paksusuolen syöpä. Tässä tutkimuksessa, mahdollinen syövänvastainen vaikutus FK-16 fragmentti, LL-37, joka vastaa tähteitä 17-32, viljellyissä koolonkarsinoomasoluissa arvioitiin. FK-16 indusoi ainutlaatuinen kuvio solukuoleman, merkitty samanaikaisesti kaspaasi-riippumattoman apoptoosin ja autophagy. Entinen oli välittyy tumaansiirtymiseen vaihtoehtoisten ja EndoG taas jälkimmäinen oli ominaista parannettu ilmentyminen LC3-I /II, Atg5 ja Atg7 ja lisääntynyt muodostuminen LC3-positiivisten autophagosomes. Knockdovvn Atg5 tai Atg7 heikennettyjä sytotoksisuutta FK-16, mikä osoittaa, FK-16 aiheuttama autophagy oli pro-kuolema luonnossa. Mekanistisesti FK-16 aktivoidaan ydinvoiman p53 upregulate Bax ja downregulate Bcl-2. Pudotus p53, geneettinen ablaatio Bax, tai yliekspressio Bcl-2 päinvastaiseksi FK-16: n indusoiman apoptoosin ja autophagy. Tärkeää on, poistaminen AIF /EndoG-riippuvaista apoptoosia parannettu FK-16 aiheuttama autophagy taas poistamisesta autophagy lisätyn FK-16 aiheuttama AIF- /EndoG-riippuvaista apoptoosia. Yhdessä FK-16 indusoi kaspaasi riippumattoman apoptoosin ja autophagy kautta yhteisen p53-Bcl-2 /Bax kaskadin koolonkarsinoomasoluissa. Tutkimuksemme paljasti myös aiemmin tuntemattomia vastavuoroisesti asetuksen näiden kahden solukuolemareittejä.

Citation: Ren SX, Shen J, Cheng ASL, Lu L, Chan RLY, Li ZJ, et al. (2013) FK-16 Johdettu Syövän Peptide LL-37 indusoi kaspaasi-Independent Apoptosis ja Autophagic solukuoleman koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 8 (5): e63641. doi: 10,1371 /journal.pone.0063641

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 marraskuu 2012; Hyväksytty: 04 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 20, 2013

Copyright: © 2013 Ren et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Antimikrobiset peptidit (AMPS), joka tunnetaan myös isäntänä puolustus peptidejä, esiintyy eukaryoottisoluissa kuin konservoituneen komponentti luonnollinen immuniteetti. Vahvistimet suorittaa ensilinjan puolustuslinja infektiota toimimalla ”luonnollinen antibiootteja” suoralla tappaminen patogeenisten mikrobien [1], [2]. Valikoivuus ampeeriin bakteerisolujen vetoaa niiden kationiset rakenteisiin, jotka ovat ratkaisevan tärkeitä vuorovaikutuksessa negatiivisesti varautuneiden bakteerien kalvoja [3], [4]. Kehittyvät todisteet osoittavat, että Vahvistimet voidaan myös sitoutuvat selektiivisesti syöpäsoluja yli transformoimattomien solujen, koska lisääntynyt pinnan altistuminen negatiivisesti varautuneen fosfatidyyliseriinin syövän [5]. Kohonneeseen O-glykosyloidun musiineja, negatiivinen kalvo potentiaali, ja lisääntynyt kalvo sujuvuus ja solu-ala syöpäsoluissa voi myös edistää tätä valikoivuus [6]. Lukuisat ampeeria ihmisen (esim β-definsin, LL-37) ja ei-ihmisen (esim BMAP-28, laktoferrisiini B, magainiini II, melittiini, tachyplesin I) alkuperä on osoitettu aiheuttavan sytotoksisuus syöpäsolujen kautta erilaisten mekanismien [6 ]. Esimerkiksi naudan laktoferrisiini B indusoi mitokondrioiden reitin apoptoosin ihmisen leukemian ja syöpäsolulinjoissa, mutta ei transformoimattomista soluihin reaktiivisten hapen lajien [7]. Magainiini II indusoi myös solukuoleman virtsarakon syövän soluissa, mutta ei normaalien fibroblastien läpi huokosten muodostumisen solukalvon ja myöhemmät solujen hajoamisen [8]. Ihmisen β-definsin-1, joka osoitti syövän vahinkofrekvenssejä ilmaisun munuaisten selvää karsinooma, indusoi kaspaasi-3-välitteisen apoptoosin munuaissyövän solulinja SW156 [9]. Mukaan AMP-tietokantaan (https://aps.unmc.edu/AP/main.php), yli 130 tällaisten peptidien tiedetään olevan syövän vastaisia ​​ominaisuuksia, [10].

Cathelicidins ovat perheen evolutiivisesti konservoituneita ampeeria. hCAP-18 on vain cathelicidin ihmisillä. Tämä 18 kDa: n prepro koostuu N-terminaalista signaalisekvenssiä, joka on kateliini-kaltaisen domeenin ja C-terminaalisen AMP domeenin. Proteolyyttisen hCAP-18 vapauttaa 37-tähteen, amfipaattinen, kierteiset peptidi tunnetaan LL-37. Tämä peptidi erittyy luuytimen solut, kiertävien leukosyyttien, ja lukuisia eri epiteelikudosten, kuten ihon ja suoliston limakalvon. LL-37 ei ainoastaan ​​osoittaa hallituksen antimikrobisen toiminnan (esim. Bakteerit, sienet ja virukset), mutta on myös kyky neutraloida bakteerien lipopolysakkaridit. Tärkeää on, LL-37 voisi välittää luontaisen immuniteetin kautta säädellään kemotaksista leukosyyttien (esim neutrofiilit, monosyytit, T-solut, eosinofiilit ja syöttösolut) ja sytokiinien paikoissa infektion ja tulehduksen sekä edistämään uudelleen epiteelin haavan paranemisen aikana [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. Kumulatiivinen todisteita tuumoribiologiassa tutkimuksista osoittaa, että LL-37: lla on keskeinen rooli syövän synnyn [15]. Esimerkiksi LL-37 saa aikaan syöpää ehkäisevistä vaikutuksista mahasyövän ja T leukemiasoluja [16], [17]. C-terminaalinen fragmentti LL-37 osoittaa myös sytotoksisuutta kohti sekä huumeiden vastustuskykyisten ja huumeisiin herkkä suun epiteloidikarsinooman soluihin [18]. Aikaisemmat tutkimus osoitti myös, että ilmaus LL-37 oli huomattavasti vaimentua ihmisen paksusuolen syöpä kudoksiin taas eksogeeninen LL-37 indusoi apoptoottista solukuolemaa viljellyissä koolonkarsinoomasoluissa. Tärkeää on, cathelicidin-hiirillä osoittivat lisääntynyttä alttiutta azoxymethane aiheuttamaa paksusuolen syövän synty [19]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että LL-37 on sisäsyntyinen kasvain alentavaa peptidi.

Koska sen merkitys immunologian ja syöpätutkimuksessa, ponnistelut ovat ojensi tutkia rakenteellisia ja biofysikaalisten ominaisuuksien LL-37. Moon

et al.

Kuvattiin ensimmäisen kerran käyttöön glutationi-S-transferaasin fuusioproteiinin järjestelmä ilmentämiseen ja puhdistukseen isotooppileimattua LL-37

Escherichia coil

[20]. Rakenneanalyysi NMR-spektroskopialla osoitti, että LL-37 on ominaista pitkä heliksipeptidin kattavat tähteet 2-31 kanssa koko molekyylin kierteisen juna hydrofobisten sivuketjujen [21]. Ramamoorthy

et al.

Osoitti, että LL-37 Orients pinnan lähellä fosfolipidin bilayers ja muodostaa oligomeerisen rakenteita [22]. Tätä varten, LL-37 on kyky häiritä solukalvon [23], [24], [25].

liittyvät kustannukset kemiallinen synteesi on yksi rajoittavista tekijöistä, jotka haittaavat käyttöä peptidien terapeuttisina aineina. Tämän vuoksi on tärkeää tunnistaa toiminnallisen alueen LL-37 siten, että lyhyemmät fragmentit, jotka säilyttävät biologisen aktiivisuuden täysipituisen peptidin voidaan valmistaa pienemmin kustannuksin. Edellinen rakenne-toiminta-analyysi eri LL-37-fragmentit on osoittanut, että LL7-27, 21 tähteen peptidin, jotka ovat peräisin tähteet 7-27 LL-37, osoittaa voimakasta aktiivisuutta mikrobeja vastaan ​​(erityisesti gram-positiiviset bakteerit) kautta häiriöitä lipidikaksoiskerrosrakenteeksi [26]. Toinen tutkimus osoitti, että N-terminaalinen fragmentti LL-12, joka vastaa tähteitä 1-12 LL-37 on aktiivinen bakteereja vastaan ​​tai syöpäsolujen taas FK-16 vastaa tähteitä 17-32 säilyttää antibakteerisia ja antituumorivaikutukset [27]. Tämä fragmentti on jopa parempi aktiivisuus prokaryooteissa ja tumalliset solut kuin täyspitkä peptidi [28], mikä viittaa siihen, että FK-16 voi olla lupaava ehdokas lisäkarakterisointia uutena syöpälääkkeiden peptidi. Esillä olevassa tutkimuksessa

in vitro

syövänvastainen vaikutus FK-16 tutkittiin.

Tulokset

FK-16 vs. LL-37 induktio solukuoleman koolonkarsinoomasoluissa

cytotoxicities FK-16 ja täyspitkän LL-37 alun perin tutkittu kahdessa ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa (LoVo ja HCT116) MTT: llä. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, sekä FK-16 ja LL-37 vähensi merkittävästi elinkelpoisuuden LoVo ja HCT116-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla. Huomattavasti, FK-16 näkyvät paremmin tehoaa koolonkarsinoomasoluissa kuin LL-37. Lisäksi FK-16 oli minimaalinen vaikutus elinkelpoisuudesta ihmisen normaalia paksusuolen limakalvon epiteelin NCM460 soluja. Kontrolli peptidiä salattu sekvenssin FK-16 oli myös vähäinen vaikutus LoVo ja HCT116, mikä osoittaa FK-16 välittämää selektiivisen tappamisen syöpäsoluja. Kuten HCT116 oli herkempi kuin LoVo FK-16, HCT116 valittiin myöhempää mekanistinen tutkimus ja käsiteltiin joko 20 uM tai 40 uM FK-16, jossa -20% ja -50% sytotoksisuuden tapahtunut.

(A) vaikutukset LL-37, FK-16, ja salattu FK-16 (48 h) elinkelpoisuuteen paksusuolen syövän soluja (HCT116, LoVo) määritettiin MTT-määrityksellä. Sytotoksinen vaikutus FK-16 oli myös määritettiin ihmisen normaalia koolonin limakalvon epiteelin NCM460 soluja. (B) Phosphotidylserine ulkoistamisen HCT116 käsiteltyjen solujen kanssa tai ilman FK-16 määritettiin virtaussytometrialla PI /anneksiini V-värjäytyneiden solujen. (C) Effects of FK-16 PARP pilkkominen ja kaspaasin aktivaatio HCT116-soluja määritettiin Western blot. Sisplatiini käytettiin positiivisena kontrollina kaspaasin aktivaation. (D) Pre-hoitoon HCT116-solujen kanssa pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk: ssa 1 tunti ei estänyt FK-16-indusoidun solun elinkyvyn menetykseen määritettynä MTT-määrityksellä (24 h). (E) Nuclear ilmentymä AIF ja EndoG in HCT116-solut analysoitiin Western blot-analyysi hajanaisten proteiineja. GAPDH ja Lamin A /C käytettiin sisäisen valvonnan varten sytosolin (Cy) ja ydin- (Nu) proteiineihin. (F) Effects of FK-16 (6 h) on solunosasijaintia AIF (vihreä) ja EndoG (punainen) in HCT116 määritettiin konfokaalisella immunofluoresenssilla (400 x). (G) knockdovvn AIF ja EndoG osa poistuu phosphotidylserine ulkoistamisen aiheuttama FK-16 (40 uM; 24 h) HCT116. Soluja altistettiin FK-16 48 tuntia transfektion jälkeen ja AIF- ja EndoG-siRNA. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. *,

p

0,05; **,

p

0,01, poikkeaa merkittävästi vastaavista kontrolliryhmään.

induktio AIF /EndoG riippuvaa Apoptosis FK-16

ovat aiemmin osoittaneet, että LL-37 voi indusoida kaspaasi-riippumattoman apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa [19]. Sen määrittämiseksi, apoptoosin välittämää sytotoksisuutta FK-16, menetys fosfatidyyliseriinin epäsymmetria, joka on tunnusmerkki apoptoosin, kvantifioitiin sytometrialla propidiumjodidia /anneksiini V double-värjäytyneiden solujen. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, FK-16 aiheuttama fosfatidyyliseriinin ulkoistamista nostamatta osuutta propidiumjodidin

+ soluja, mikä osoittaa, että FK-16 aiheuttaman apoptoosin mutta ei nekroottisen solukuolemaa. Sekä 24 tunnin ja 48 tunnin aikapisteissä, FK-16 hoito ei lisätä PARP pilkkominen eikä aktivoida kaspaasit-3 ja 7 (Fig. 1 C). Yhtäpitävästi, yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä z-VAD-fmk ei häviämisen pysäyttäminen solujen elinkelpoisuuden aiheuttama FK-16 (Fig. 1 D). Nämä havainnot ehdotti, että FK-16 indusoi apoptoosin kaspaasi-riippumattomalla tavalla. AIF ja EndoG, alunperin lokalisoitu mitokondrioita ja kulkeutua tumaan aktivoinnin jälkeen, ovat tunnettuja välittäjäaineita kaspaasin riippumattoman apoptoosin [29]. Immunoblottauksella käyttämällä fraktioitua proteiinilysaattien osoittivat, että FK-16 lisäsi ydinvoiman tasot AIF ja EndoG (Fig. 1 E). Immunofluoresenssikoe vahvisti, että AIF ja EndoG jaetun sytosoliin tumaan in FK-16-käsiteltyjen HCT116-solut (Fig. 1 F). Toiminnallinen osallistuminen AIF ja EndoG in FK-16: n indusoiman apoptoosin varmistettiin lisäksi RNA-interferenssi kokeita, joissa knockdovvn AIF tai EndoG heikennettyjä fosfatidyyliseriini ulkoistamisen aiheuttama FK-16 (Fig. 1G). Nämä havainnot osoittivat, että samanlainen LL-37, FK-16 aiheuttama AIF /EndoG riippuvaisen mutta kaspaasi riippumaton apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa.

induktio Autophagic solukuoleman FK-16, mutta ei LL-37

vaikutuksen määrittämiseksi FK-16 toisen kaspaasi-riippumattoman solukuoleman reaktiotien, nimittäin autophagic solukuolemaa [30], olemme analysoineet ilmentymisen LC3 proteiinin (erityisesti LC3-II, jonka tiedetään korreloivan laajuus autophagy) ja kaksi muuta autophagy liittyviä proteiineja, eli Atg5 ja Atg7. Tulokset osoittivat, että FK-16 lisäsi LC3-I ja LC3-II sekä Atg5 ja Atg7 proteiinin ilmentymisen (Fig. 2A 2B). FK-16 indusoi myös muodostumista LC3

+ autophagic vacuoles in HCT116 (Fig. 2C). Sekä induktio LC3-I /II ilmentymisen ja muodostumista LC3

+ autophagic vacuoles FK-16 voitaisiin estää 3-metyyliadeniini, luokan III fosfoinositidi 3-estäjä. Sitä vastoin, täyspitkä LL-37-peptidi oli vain vähäinen vaikutus LC3-I /II ilmentyminen (dataa ei esitetty). Mikroskooppitutkimus analyysi elektronimikroskoopilla paljasti, että 48 h-altistuminen FK-16 aiheuttama massiivinen vakuolisaation vuonna HCT116-soluissa, joissa lamellitiiviste ja myeliinin kaltaisia ​​rakenteita muistuttava myöhään autophagic vacuoles havaittiin (Fig. 2D). Muodostuminen happamien vesicular soluelimiin, joka on tärkeä tunnusmerkki autophagy, parantavat lisäksi FK-16 määritettynä elintärkeä värjäämällä HCT116 solujen akridiinioranssin, väriaine, joka päästää kirkkaan punaisen fluoresenssin happamaan rakkulat mutta fluoresoi vihreänä sytoplasmassa ja tumassa (Fig. 2E). Muodostuminen autolysosomes lisääntyi myös FK-16-käsitellyissä soluissa, kuten visualisoitiin monodansylcadaverine värjäytymistä (data ei ole esitetty). Lisäys autophagic vuon aiheuttamien FK-16 vahvistettiin käsittelemällä HCT116 soluja FK-16 ja bafilomysiini

1 (a lysosomotropic aine), yksin tai yhdistelmänä. Inhibitio lysosomaalisen toiminnon bafilomysiini

1 nostivat sekä LC3-I ja -II aiheuttama FK-16 (Fig. 2F), viittaa siihen, että FK-16 lisäsi autophagic vuon. Riippuen solun yhteydessä autophagy voi toimia pro-kuolema tai pro-selviytymismekanismi. Määrittää toiminnallista roolia autophagy aiheuttama FK-16, joka on RNA-interferenssi lähestymistapaa on käytetty poistamaan autophagy kohdistamalla Atg5 ja Atg7, jotka molemmat vaaditaan muodostumista autophagosomes varhaisessa vaiheessa. Knockdovvn Atg5 tai Atg7 vähensi merkittävästi sytotoksista vaikutusta FK-16 (Fig. 2G), viittaa siihen, että FK-16 indusoi autophagic solukuoleman paksusuolen syöpäsoluissa.

(A) HCT116-soluissa ilmeni kohonneita proteiinin ilmentymistä LC3-I /II-käsittelyn jälkeen FK-16: ssa 24 tuntia ja 48 tuntia. LC3 ilmaisun aiheuttama FK-16 poisti autophagy estäjä 3-MA (5 mM, 1 h esikäsittely). (B) FK-16 indusoi myös Atg5 ja Atg7 proteiinin ilmentymiseen. (C) Hoitoon HCT116 FK-16 24 h tai 48 h näkyvästi parantaa muodostumista autophagic vacuoles määritettynä immunofluoresenssivärjäyksellä varten LC3 (400 x). Muodostuminen LC3

+ autophagosomes aiheuttama FK-16 esti 3-MA. (D) Ultrastructural analyysi elektronimikroskoopilla paljasti muodostumista autophagosome tai toissijainen lysosomeihin kanssa jäljellä hajotettujen materiaali FK-16-käsiteltyjen HCT116-solut (40 uM; 48 h). (E) kertyminen happamien vesicular soluelimiin, joka vapautuu kirkkaan punainen fluoresenssi, aiheuttama FK-16 (40 uM) tehtiin näkyväksi värjäämällä akridiinioranssilla (400 x). (F) Lisääntynyt autophagic vuon vahvistettiin yhteistyössä käsittelemällä HCT116-solujen FK-16 ja bafilomysiini

1. Hoito bafilomysiini

1 (10 nmol /l) ei estänyt säätelyä LC3-I /II soluissa inkuboitu FK-16 (40 uM). (G) knockdovvn Atg5 tai Atg7 heikennettyjä sytotoksista vaikutusta 48-h hoito FK-16 (40 uM) in HCT116. Data esitetään keskiarvoina ± S.D. Kolmen erillisen kokeen. *,

p

0,05; **,

p

0,01 eroaa merkittävästi vastaavista kontrolliryhmään.

†,

p

0,05;

††,

p

0,01 merkittävästi erilainen ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa, joita käsiteltiin FK-16.

Vaatimus p53 FK-16: n indusoiman apoptoosin ja Autophagic Cell Death

tuumorisuppressoriproteiinia p53 tiedetään osallistua sekä kaspaasiriippuvaisen ja riippumattaman solukuoleman, kuten AIF /endo-riippuvaista apoptoosia ja autophagy [31], [32]. Täällä, osoitimme, että FK-16 suoraan aktivoida p53 välittävän sekä solukuoleman polkuja. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, FK-16 lisäsi ydinvoiman taso p53 ja voimistunut ilmentyminen PUMA ja Bax. Johdonmukaisesti, FK-16 vähensi Bcl-2. Valaista toiminnallinen osallistuminen p53 AIF /Endo-riippuvaista apoptoosia ja autophagic solukuolemaa laukaisi FK-16, p53, joka pudotettiin siRNA. Knockdown p53 paitsi palautettu ilmaus Bax ja Bcl-2, mutta myös vähensi huomattavasti FK-16 aiheuttama LC3-I /II, Atg5 ja Atg7 ilmaisun sekä ydin- ilmaus AIF ja EndoG, mikä viittaa siihen, että p53 oli yleinen aktivaattori sekä solukuolemareittejä (Fig. 3B). Näin ollen, pudotus p53 vähentää fosfatidyyliseriinin eriyttämispolitiikan (Fig. 3C), muodostumista LC3

+ autophagic vakuoliin (Fig. 3d) ja solun elinkyvyn menetykseen (Fig. 3E) aiheuttama FK-16.

(A) HCT116-soluja inkuboitiin FK-16 24 h tai 48 h. Soluliman ja ydin- p53 ja Bcl–2 jäsentä (PUMA, Bcl-2, Bax ja Bak) määritettiin Western blot. GAPDH ja Lamin A /C käytettiin sisäisenä säätimet sytosolin ja tumaproteiinit, vastaavasti. (B) knockdovvn p53 kumosi säätelyä pro-autophagic tekijät (Atg5 ja Atg7) ja pro-apoptoottinen tekijät (Bax, Bak, ydin- AIF ja ydinvoiman EndoG) sekä downregulation Bcl-2 FK-16. (C) FK-16 ei indusoi phosphotidylserine ulkoistamisen p53-köyhdytettyä HCT116-soluissa. Transfektion jälkeen ohjaus- tai p53-siRNA: ssa 48 tuntia, soluja käsiteltiin kanssa tai ilman FK-16 (40 uM) vielä 24 tuntia, minkä jälkeen propidiumjodidilla /anneksiini V-kaksoisvärjäystä. (D) knockdovvn 53 merkittävästi vähentänyt LC3

+ autophagic vacuoles in FK-16-käsitellyt solut (40 uM; 48 h) määritettynä konfokaalisella immunofluoresenssilla (400 x). Ytimet (sininen) värjättiin DAPI. (E) knockdovvn p53 osittain päinvastaiseksi estävää vaikutusta FK-16 solujen elinkelpoisuutta HCT116 määritettynä MTT: llä. Data esitetään keskiarvoina ± S.D. Kolmen erillisen kokeen. *,

p

0,05; **,

p

0,01 eroaa merkittävästi vastaavista kontrolliryhmään.

†,

p

0,05;

††,

p

0,01 merkittävästi erilainen ohjaus siRNA-transfektoiduissa soluissa, joita käsiteltiin FK-16.

Altered Expression of Bcl-2: n ja Bax aikana FK- 16-indusoitu apoptoosi ja Autophagic Cell Death

Koska Bcl-2-perheen on raportoitu säädellä sekä kaspaasi-riippumattoman apoptoosin ja autophagy muissa biologisissa yhteyksissä [30], [32], seuraavan kerran kyseenalaiseksi, jos FK- 16-indusoimaa paksusuolen syövän solukuolemaa välittyy Bcl-2: n ja Bax, jotka molemmat olivat alavirtaan p53 (Fig. 3B). Tulokset osoittivat, että palauttaminen Bcl-2: n ilmentymisen transfektoimalla Bcl-2-koodaava plasmidi tai geneettinen ablaatio Bax käyttäen Bax

– /- HCT116-solut poistetaan FK-16-indusoidun ilmentymisen LC3-I /II, Atg5 ja Atg7 sekä ydin- ilmentymisen AIF ja EndoG (Fig. 4A B), mikä viittaa siihen, että downregulation Bcl-2 ja säätelyä Bax tarvittiin FK-16-indusoidun autophagic ja apoptoottisten signalointia. Mukaisesti Näiden havaintojen palauttaminen Bcl-2: n ilmentymisen tai geneettinen ablaatio Bax vähensi muodostumista LC3

+ autophagic ontelon (Fig. 4C) ja menetys solujen elinkykyä (Fig. 4D) aiheuttama FK-16. Nämä havainnot osoittavat, että FK-16 toimi kautta p53-Bcl-2 /Bax polku samanaikaisesti aiheuttaa AIF /EndoG-riippuvaista apoptoosia ja autophagy välittämä solukuolema.

(A) palauttaminen Bcl-2 ilmentyminen transfektion Bcl-2-koodaus plasmidin käänteinen säätely pro-autophagic (Atg5, Atg7 ja LC3-I /II) ja pro-apoptoottinen (ydin- AIF ja ydinvoiman EndoG) tekijät aiheuttama FK-16 (40 uM; 48 h) in HCT116. (B) Genetic ablaatio Bax (Bax KO) in HCT116 päinvastaiseksi FK-16 aiheuttama apoptoottisia ja autophagic signaaleja. Bax

+/- HCT116 käsitelty tai ilman FK-16 käytettiin kontrollina. (C) palauttaminen Bcl-2: n ilmentymisen tai geneettinen ablaatio Bax vuonna HCT116 poisti muodostumiseen LC3

+ autophagic vacuoles aiheuttama FK-16 (40 uM; 48 h) määritettynä konfokaalisella immunofluoresenssilla (400 x). (D) palauttaminen Bcl-2: n ilmentymisen tai geneettinen ablaatio Bax osittain päinvastaiseksi estävää vaikutusta FK-16 solujen elinkelpoisuutta HCT116 määritettynä MTT: llä. Data esitetään keskiarvoina ± S.D. Kolmen erillisen kokeen. *,

p

0,05; **,

p

0,01 eroaa merkittävästi vastaavista kontrolliryhmään.

††,

p

0,01 poikkeavat huomattavasti tyhjän vektorin transfektoidut tai Bax

+/- soluja käsiteltiin FK-16.

vastavuoroinen asetuksen välillä kaspaasi riippumaton apoptosis ja autophagic Cell Death

Valaistaan ​​mahdollisia välinen ylikuuluminen autophagic solukuoleman ja AIF /EndoG riippuvan apoptoosin toiminnan FK-16, nämä kaksi soluprosesseissa luovuttiin RNA-interferenssi. Knockdown tehokkuusvertai- Atg5-, Atg7-, AIF- ja EndoG-siRNA: t vahvistettiin Western blot (kuvio. 5A). Esto autophagy mukaan Atg5- tai Atg7-siRNA merkittävästi täydennetty ydin- ilmaus AIF ja EndoG aiheuttama FK-16 (Fig. 5B). Yhtäpitävästi, knockdovvn Atg5 tai Atg7 myös parannettu FK-16 aiheuttama fosfatidyyliseriini ulkoistamiseen (Fig. 5C), mikä viittaa siihen, että esto autophagy tehostetun FK-16 aiheuttama AIF /EndoG-riippuvaista apoptoosia. Vastavuoroisesti poistaminen AIF /EndoG riippuvaisen apoptoosin AIF- tai EndoG-siRNA parannettu Atg5 ja Atg7 ilmaisun aiheuttama FK-16 (Fig. 5D), mikä osoittaa, että inhibitio AIF /EndoG-riippuvaista apoptoosia suurennettu autophagic signaalin FK- 16-käsiteltyjen paksusuolen syöpäsoluissa. Yhtäpitävästi, AIF- ja EndoG-siRNA tehostettu ilmentyminen LC3-I /II. Nämä havainnot osoittivat olemassaoloa ilmoittamattoman vastavuoroinen sääntelyn välillä autophagic solukuoleman ja AIF /EndoG-riippuvaista apoptoosia.

(EN) knockdown tehokkuusvertai- AIF-, EndoG-, Atg5- ja Atg7-siRNA: t vahvistettiin downregulation proteiinin tasot vastaavien tavoitteiden HCT116. (B) knockdovvn Atg5 tai Atg7 parannettu pohjapinta ja FK-16 aiheuttama (40 uM; 6 h) ydin- ilmentymä AIF ja EndoG. (C) knockdovvn Atg5 tai Atg7 lisääntynyt FK-16 aiheuttama (40 uM; 48 h) phosphotidylserine ulkoistamisen määritettynä anneksiini V värjäys ja virtaussytometria. (D) knockdovvn AIF tai EndoG parannettu pohjapinta ja FK-16 aiheuttama (40 uM; 48 h) Atg5 ja Atg7 proteiinin ilmentymiseen. (E) knockdovvn Atg5 tai Atg7 poistettava taas Knockdown AIF tai EndoG parannettu FK-16 aiheuttama (40 uM; 48 h) LC3-I /II ilmentymistä HCT116. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Keskustelu

Apoptoosin kasvainsoluissa on jo pitkään tunnustettu olennaiseksi lähestymistapa syövän hoidossa [33]. Kuitenkin, luontainen vastus joidenkin kasvainsolujen apoptoosia ja nopean kasvaimen uudelleenkasvun jälkeen ensimmäinen vastaus kemoterapeuttiset aineet ovat edelleen merkittäviä kliinisiä mutkikkaita. Siksi on olemassa kasvavaa kiinnostusta tiedeyhteisössä tutkittaessa koko kirjo kaspaasin riippumattomia solukuoleman ja tunnistaa aineet, jotka toimivat ensisijaisesti kaspaasin riippumaton mekanismi. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että hoidon syövän vastaisen peptidi FK-16 vähensi voimakkaasti elinkelpoisuuden paksusuolen syövän solujen puuttuessa kaspaasin aktivaatio tai kalvo läpäiseväksi, mikä viittaa siihen, että ei ole klassinen kaspaasi-riippuvaista apoptoosia eikä nekroosia on vastuussa sytotoksisuuden . Tätä varten, FK-16-käsitellyt solut osoittivat biokemiallisten ja morfologisten piirteiden mukainen AIF /EndoG-riippuvaista apoptoosia ja autophagic solukuolemaa. Ennen kaikkea knockdown geenien keskeinen näiden kahden solun prosessit heikennetty sytotoksisuutta FK-16. Nämä havainnot viittaavat siihen, että FK-16 on dual-mode aktivaattori kaspaasi-riippumattoman solukuoleman. On kuitenkin myös syytä huomata, että joissakin koeasetelmia (Fig. 1 G 3C), FK-16 hieman korkeampi propidiumjodidivärjäys. Tämä havainto saattaa selittyä kohonnut solustressiä liittyy siRNA transfektion, jotka voisivat tehdä soluja herkempiä kalvo-häiritseviä vaikutusta FK-16.

Useat solun rasitukset mukaan lukien DNA-vaurioita ja onkogeeni aktivointi, on osoitettu aktivoivan p53. Riippuen alkuperäisen ärsykkeen että matkapuhelinverkon yhteydessä p53 aktivointi voisi laukaista ohjelmistoon vasteita, kuten solukierron pysähtymisen, apoptoosin, solujen vanhenemista, erilaistumista ja autophagy [34]. Koska menetys p53 ilmaus on yleinen ihmisen syövissä, palauttaminen p53 aktiivisuus on houkutteleva lähestymistapa syövän hoidossa. Tässä suhteessa useita p53-palauttaa kokeellista syöpälääkkeiden kanssa (esim. CP-31398 ja Nutlin) on tunnistettu [35]. Tässä osoitamme, että FK-16 on uusi aktivaattori p53 signaloinnin. FK-16 ei vain lisääntynyt ydinvoiman p53 kertymistä, mutta myös indusoi ilmentymisen PUMA ja Bax, jotka molemmat ovat tunnettuja transkription tavoitteet p53 [36], [37]. Knockdown p53 myös käänteinen FK-16 aiheuttama AIF /EndoG-riippuvaista apoptoosia ja autophagic solukuolemaa. Lisäksi pro-apoptoottisten ja pro-autophagic vaikutusta FK-16 vaaditaan p53-riippuvaista säätelyä Bax ja downregulation Bcl-2. Linjat Näiden havaintojen keskeinen roolit p53-Bax /Bcl-2 kaskadin AIF /EndoG-riippuvaista apoptoosia ja autophagy on raportoitu. Esimerkiksi analoginen DNA-vahingoittavat lääke syklofosfamidi ja suuri vihreä tee polyphenol on osoitettu aktivoida p53 ja Bax laukaisemaan ydin- siirtäminen AIF ja EndoG välittävän apoptoosia kasvainsoluissa [32], [38]. p53 transkriptiotekijän myös stimuloi autophagy kautta indusoimaan useita pro-autophagic geenejä, mukaan lukien

DRAM

,

SKP2

,

SESN2

, ja

ULK1 /2

lisäksi

PUMA

ja

BAX

[30]. Lisäksi p53 aktivointi voisi edistää dissosiaatiota Bcl-2-Beclin-1 monimutkainen ja siten disinhibiting Beclin-1-riippuvaisia ​​autophagy [39].

Mielenkiintoinen havainto nousemassa tästä työstä on löytö vastavuoroisen sääntelymekanismina kahden kaspaasin riippumattoman solukuoleman polkuja. Tuloksemme osoittavat, että poistaminen AIF /EndoG-riippuvaista apoptoosia tehostaa autophagic solukuolemaa ja päinvastoin, mikä osoittaa, että nämä kaksi reittejä välittävät sytotoksisuutta FK-16 yhteistoimintaan tavalla. Vaikka FK-16-indusoidun autophagy on todettu olevan pro-syöttämällä luonteeltaan estyminen autophagy paradoksaalisesti aiheuttaa kaspaasi-riippumattoman apoptoosin FK-16-käsitellyt solut. Selitys tähän arvoitus on että saarto FK-16 aiheuttama autophagy estää solukuolemaa mutta silti aktivoi kaspaasi riippumaton apoptoosin kompensoiva tavalla ja verkko tulos on säilyttäminen solujen elävyyden verrattuna soluihin, joissa molemmissa solukuoleman reitit ovat aktivoitu. Tätä varten suora osuus autophagy solukuolemaan on laajalti raportoitu huolimatta viime kiistat olemassaoloa ”autophagic solukuoleman” [40], [41], [42], [43]. Vaikka yhteistyössä aktivointi autophagy ja kaspaasin riippumaton apoptoosin on dokumentoitu erilaisissa biologisissa yhteyksissä [44], [45], [46], on vain satunnaisia ​​tutkimuksia kirjallisuudessa, jotka ovat yrittäneet valaista suhde näiden kahden prosessin. Vastaa meidän havaintojen Zheng

et al.

Ja Eimer

et al.

Havaittu, että autophagy voisi suojata kaspaasi riippumaton apoptoosin Hoechst 33342-käsiteltyjen HeLa-soluista ja erlotinibin käsiteltyjen glioblastoomasoluista, vastaavasti [47], [48]. Inhibitio autophagy 3-metyyliadeniini kiihdyttää myös rottlerin aiheuttama kaspaasi-riippumattoman apoptoosin HT1080 ihmisen fibrosarkoomasoluissa [49].

tunnistaminen syöpälääkkeiden peptidien nykyisten AMP-tietokanta on tehokas lähestymistapa kehittää uusia syövän terapeuttisia. Tässä tutkimuksessa, FK-16 fragmentti, LL-37, osoittaa parempaa syövän vastainen aktiivisuus kuin täyspitkä peptidi. FK-16 tekee myös ylimääräinen solukuolemareittiin, nimittäin autophagic solukuolemaa. Lyhennetty pituus FK-16 saattaa myös vähentää tuotantokustannuksia liittyvät peptidisynteesillä. Yhdessä syövänvastainen peptidi FK-16 indusoi AIF /EndoG-riippuvaista apoptoosia ja autophagic solukuolemaa kautta yhteisen p53-Bax /Bcl-2 kaskadin koolonkarsinoomasoluissa (Fig. 6). Tuloksemme esitellään myös uusi vastavuoroinen asetus näiden kahden kaspaasin riippumattoman solukuoleman polkuja.

Materiaalit ja menetelmät

Peptidit

Synteettinen LL-37 (LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES ), FK-16 (FKRIVQRIKDFLRNLV) ja salattu FK-16 (DQVLRFRNFRIKLVKI) peptidien puhtaus 95% ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).

Soluviljely ja solunelinkykyisyysmääritys

ihmisen paksusuolen syövän solulinjat HCT116 ja LoVo saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Bax

– /- ja Bax

+/- HCT116-solut syntyvät geenikohdistus [50] ja toimittanut professori Bert Vogelstein (Ludwig Centerissä Johns Hopkins). Ihmisen hormal paksusuolen limakalvon epiteelisolujen linja NCM460 hankittiin INCELL Corporation. Soluja ylläpidettiin niiden suositellaan elatusaineita, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ja 95% ilmaa . Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi] määritys. Lyhyesti, 5000 solua maljattiin kuoppaa kohti 96-kuoppalevyillä. Hoidon jälkeen MTT-liuosta liuotettiin viljelmän elatusaineeseen lopullinen pitoisuus 0,5 mmol /l, lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin vielä 4 tuntia. Dimetyylisulfoksidia lisättiin sitten liuottamaan MTT tetratsolium kide. Lopuksi optinen tiheys määritettiin aallonpituudella 570 nm käyttämällä Benchmark Plus mikrolevylukijalla (Bio-Rad, Hercules, USA).

kvantitointi fosfatidyyliseriinin Externalization

mittauksessa fosfatidyyliseriinin ulkoistamismallin, käsitellyt solut suspendoitiin uudelleen värjäysväliaineeseen puskuriin, joka sisältää propidiumjodidia ja anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (Invitrogen, USA). Inkuboitiin 15 minuutin ajan pimeässä, double-leimatut solut analysoitiin FACSCalibur System ja CellQuest ohjelma.

Nuclear Protein Extraction ja Western Blot

Eristäminen ydin- ja sytosolin proteiinit tehtiin käyttäen NucBuster Protein Extraction Kit (EMD Biosciences, Darmstadt, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Eristämiseen kokosolu-proteiinia, solut kerättiin radioimmunosaostus, joka sisälsi proteinaasi ja fosfataasi-inhibiittorit.