Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ultraääni teknologiat tunkeutua lääketieteen alalla: niin vakiintunut kuvantamismodaliteetin kliinisessä diagnostiikassa; ja, että syntyy kohdennettujen korkean intensiteetin keskityttiin ultraääni, keinona termisesti ablatoimiseksi kasvaimia. Samanaikaisesti mahdollisuudet [ei-terminen] väli- intensiteetti ultraääni kuin vähän invasiivisia hoito ollaan myös tarkasti arvioida. Täällä, apoptoosin induktio syöpäsoluissa on havaittu, vaikka lopullinen tunnistus oleva mekanismi on toistaiseksi pysynyt hämäräksi. Todennäköinen ehdokas prosessi on ehdotettu ottamaan sonokemiallisella toimintaa, jossa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) välittävät sukupolven yksittäisen DNA-säikeen katkoksia. Täällä kuitenkin tarjoamme saatu uutta näyttöä siitä, että tukee voimakkaasti puhtaasti mekaaninen mekanismi. Lisäksi, yhdistämällä erityisiä määrityksiä (neutraali komeetta hännän ja värjäytyminen γH2AX pesäkkeet muodostuminen) osoitamme ensimmäistä kertaa, että Yhdysvaltain altistukseen jopa kohtalainen intensiteetti esiintyy genotoksisia, kautta mahdollisuus tuottaa DNA-vaurioita useille syöpälinjojen. Erityisesti rinnakkaispaikantumisen määrityksiä korostaa, että ionisoiva säteily ja ultraääni on selvästi erilainen allekirjoituksia niiden γH2AX pesäkkeitä muodostumista malleja, todennäköisesti heijastaa eri jännitysjakautumat aloittaneen vaurioita muodostumista. Lisäksi rinnakkainen immunoblottaus viittaa siihen, että DNA-PKcs on etuoikeutettu asema korjaus ultraääni-aiheuttamaa vahinkoa.

Citation: Furusawa Y, Fujiwara Y, Campbell P, Zhao QL, Ogawa R, Ali Hassan M , et ai. (2012) DNA Double-Strand Breaks indusoima Cavitational mekaaniset vaikutukset Ultraääni Cancer Cell Lines. PLoS ONE 7 (1): e29012. doi: 10,1371 /journal.pone.0029012

Editor: Martin G. Marinus, University of Massachusetts Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 syyskuu 2011; Hyväksytty: 18 marraskuu 2011; Julkaistu: 03 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Furusawa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki tämän tutkimuksen antamien Grant-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (B) (22390229), Japani Society for Promotion of Science. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ultraääni (US) on välttämätön useimmilla lääketieteen aloilla: (i) US hyvin alhaisilla intensiteettiä ( 0,1 MPa äänenpaineen) selvästi alle kynnysarvojen poseeraa lämpö- ja /tai Cavitational haittavaikutusten käytetään lääketieteelliseen diagnoosi; (Ii) korkean intensiteetin keskityttiin Yhdysvaltain (HIFU, 10 MPa akustinen paine) käytetään lämpö- ablaatio kasvaimia; ja (iii) ei-terminen matalan intensiteetin Yhdysvaltain (0,1-1,5 MPa akustinen paine kahden edellä mainitun) mahdollisena syövän hoito on parhaillaan tutkimus [1]. Kudokset altistettiin US-energiaa voidaan saada aikaan spektri biologisen vasteen, joista jokaisella on erillinen terapeuttista potentiaalia [1] – [6], mukaan lukien otto eksogeenisen molekyylien [7] – [14], nekroosi ja apoptoosi [1], [3] [6], [15], [16]. Biofyysisten muotoja US jaetaan kolmeen luokkaan, lämpö, ​​Cavitational, ja ei-terminen ei-onteloivia vaikutuksia. Kavitaatio johtaa erilaisia ​​mekaanisia rasituksia, kuten leikkausjännitys, paineaalto, korkea paine, ja kemiallisen rasituksen takia vapaat radikaalit muodostumista, jotka molemmat ovat päätellä toimimaan samanaikaisesti kaikille biologisten aineiden [15] – [17]. Kertyvät todisteet osoittavat, että voimakas Yhdysvaltain sekä matalan intensiteetin Yhdysvaltain ilman lämpövaikutus aiheuttaa reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto, solukalvon liikkuvuus, yksittäisen DNA katkeamisen (SSBs) ja useat aikaisemmat tutkimukset hiljaista tärkeyttä SSBs johtuvien sonochemically tuotettu ROS kuin DNA-vaurioita aloittamista US aiheuttama soluntappokyky /kuolema [2] – [4], [6], [15]. Tämä näkemys on kyseenalainen, koska lukuisat SSBs aiheuttama, esimerkiksi, jonka mmol /L-H

2O

2 lukemiin lainkaan tai erittäin vähän double-säikeen katkoksia (DSB: t), eniten sytotoksinen vaurioiden DNA [18]. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole suoraa näyttöä DSB induktio ja onko myöhemmin aktivoinnin DNA-vaurioita vastaus (DDR) väyliä saattaa esiintyä altistumisen jälkeen USA. Sen ilmeinen sijaan tiedot soluvasteen ionisoiva säteily (IR), mukaan lukien induktio DSB ja alavirran DNA-vaurioita vastaus (DDR) on laajemmin raportoitu [19]. Täällä me käsittelemme tässä vaiheessa arvioida mahdollisen genotoksisuuden matalan intensiteetin Yhdysvalloissa. Tutkimuksessamme arvioimme useita lopullista päätepisteiden mukana muodostumista ja käsittelyä DNA-vaurioita, kuten DSB, altistumisen jälkeen Yhdysvaltain joukko koe suoritetaan samanaikaisesti IR säteilytys sering positiivisena kontrollina.

Tulokset ja keskustelu

Neutraali komeetan hännän määrityksiin (NCTA) käytettiin DNA: n detektoimiseksi n DSB: ihin esiintyy neljässä eri leukemian riviä (U937, Molt-4, Jurkat, ja HL-60), joka oli tehty joko IR ( 10 Gy, ellei toisin mainita), tai USA (saamisia käyttäen intensiteettejä 0,3 tai 0,4 W /cm

2 kestävät 1 minuutti). Positiiviset tulokset, suhteen laajennetun komeetta hännät verrattuna ei säteilytetty valvonta, havaittiin kaikissa solulinjoissa mitattuna vuosina välittömästi altistumisen jälkeen (t = 0) (kuvio 1A). Määrällinen vertailu, mitattuna keskimääräinen suhteellinen komeetan pyrstö hetkellä (RCTM) aiheutuvat (kuvio 1 B) tuotti seuraavat suuntaus kaikissa solulinjoissa: RCTM

0.4US RCTM

IR RCTM

0.3US, joka korostaa vertailukelpoisuus kunkin Yhdysvaltojen ja IR annokset valittiin tässä tutkimuksessa, mitä tulee niiden mahdollisuus aiheuttaa samankaltaisia ​​tasoja DNA-vaurioita. Mielenkiintoista kuitenkin huomasimme, että IR tuotti keskimäärin RCTMs pääasiallisesti alueella 1,1-3, kun taas Yhdysvaltain vastuut aiheuttaa laajempaa tuloksena RCTM, jakelussa ja joka oli myös funktio US intensiteetti (kuvio 1C ja kuvio S1).

(A) SYBR green-värjätään neutraalilla komeetta hännät välittömästi altistuksen jälkeen U937 (

U

), Jurkat (

J

), Molt-4 (

M

) ja HL-60 (

H

) soluja Yhdysvaltain (0,3 tai 0,4 W /cm

2) tai IR (10 Gy). (B) Suhteellinen tail hetkiä (

n

= 100 solua, keskiarvot ± SD), normalisoitu vastaaviin käsittelemättömiin kontrolleihin (= 1,0). (C) heterogeeninen jaettavaksi 3,0, 1.1~3.0 ja 1 (= kontrolli taso) tarkoittaa suhteellisen hännän hetkiä, kun USA, mutta tasaisen jakelun 1,1-3 suhteellinen takaosan liike jälkeen 10 Gy ~90% U937-soluissa (

n

= 100 solua). Katso kuva. S1 muita solulinjoja. (D) Vihreä-fluorescentγH2AX kuvia U937, Jurkat, Molt-4 ja HL-60-solujen 30 min kuluttua 0,3 W /cm

2 USA (säätökennotyyppi kuvaa ei saanut, koska mitään γH2AX + soluja). (E) induktio γH2AX + solujen funktiona US intensiteetti ylittää kynnyksen 0,1-0,2 W /cm

2 (

n

= 3, keskiarvo ± S.D.). (F) γH2AX + solujen kuvien ja (G) FCM histogrammit γH2AX + U937-soluissa 30 minuutin kuluttua 0,3 W /cm

2 ja 10 Gy IR. Musta, vihreä ja punainen profiilit ovat valvontaa, USA, ja IR, jossa rahalaitoksille γH2AX + solujen (5-100 γH2AX log)). (H) induktio /laskua γH2AX + U937-soluissa (FCM) ajalla jälkeen 0,3, 0,4 W /cm

2 (i) ja 10 Gy IR (ii). (I) vähentäminen hännän hetkiä 3 h post 0,3 W /cm

2 USA (i) tai 10 Gy IR (ii). zVAD-fmk 50 umol /l käytettiin poistamaan apoptoottisten n DSB: ihin.

katsoo, NCTA analyysejä pidetään DSB, läsnä erillisten γH2AX pesäkkeitä voi myös edustaa lopullista allekirjoitusta varten DSB [20]. Havaitsimme tällaisia ​​γH2AX värjäytymistä kaikissa soluissa altistettiin 10 Gy (kuvio 1 F), ja tärkeintä, kaikilla solulinjoilla alttiina USA (kuvio 1 D) ylittäne intensiteetti noin 0,1-0,2 W /cm

2 (Kuva 1 E ja kuvio S2, S3), joka osoittaa, ensimmäistä kertaa, että Yhdysvaltain altistuminen saattaa aiheuttaa DSB ja on näin ollen konkreettinen genotoksinen riski.

Post-altistus havainto soluihin alttiina IR hyvin verrattuna aikaisempien raporttien [21 ] että γH2AX + solut osoittivat erillisiä pesäkkeitä jakautuneet nucleus (kuvio 1 F), ja että myöhemmät ajallinen profilointi γH2AX + väestöstä osoittivat korkeimmillaan 30 minuuttia altistuksen jälkeen, jota seurasi vähittäinen hajoaminen (kuva S4). Erityisesti tämä jälkimmäinen vähennys yhteensä γH2AX + väestö sopii yhteen laadullisesti trendejä havaittiin myös käyttämällä NCTA (kuviot 1H (ii) ja 1I (ii)), mikä tukee korjaus IR aiheuttama DSB.

US-alttiina ( insonated) solujen suhteellinen osa γH2AX + oli selvempi, mikä vahvistettiin virtaussytometrialla, jossa γH2AX + tasot noin kolminkertaisiksi suurempi kuin IR-altistetuissa soluissa (kuvio 1G). Vaikuttavat soluissa oli myös yleiseurooppalaisen ydin- γH2AX + jakelu, satunnaiset mutta erillisiä pesäkkeitä päällekkäin (kuvio 1 F). Mielenkiintoista, γH2AX + väestöstä oli suurimmillaan 60 minuutin kuluttua altistuksen sekä 0,3 ja 0,4 W /cm

2: ssa tapauksista USA palveluksessa, jota seuraa toipumisaika, joka tasaantui 6 h (kuva 1 H (i) ja kuvio S4).

ilmeisiä eroja tyypilliseen γH2AX + coverages aiheutuvat IR- ja Yhdysvaltain altistuneet solut yhdessä erottavat suhteellisen komeetan pyrstö hetkellä jakaumat (kuvio 1 C), ja merkittävästi erilaiset γH2AX + korkeimmillaan kertaa, viittaa siihen, että niiden DDR signalointipolkujen ovat luonteeltaan erilaisia. Lisäksi tapauksissa, joissa Yhdysvaltain altistuminen sovellettiin, työllisyys yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä z-VAD-fmk tukahduttaa apoptoosin näytti olevan mitätön vaikutus (kuvio 1 I (i) ja kuvio S5), kun taas TRAIL aiheuttama γH2AX (kaspaasivälitteinen γH2AX) esimerkiksi voitaisiin poistaa (kuva S5): vakuuttavaa näyttöä siitä, että havaitut induktio ja post-peak menetys γH2AX kaikissa tapauksissa on todennäköisesti liittyy DNA-vaurioita ja korjaus.

tutkimiseksi, me sitoutui yhteistyössä lokalisointi tahrat γH2AX kaksi suurta kinaasien vastuussa H2AX fosforylaatiota, ataksia-telangiektasia-mutatoitunut (ATM) ja DNA-PKcs [22]. Kuviot. 2A-B osoittavat, että suurin osa fosfo-NBS1 ja atm pesäkkeet colocalized sen γH2AX pesäkkeitä jälkeen sekä USA

ja

IR vastuut, mikä viittaa yleisesti ja koordinoitu rekrytointi NBS1 ja ATM korostaa aiheuttamaa DSB [23] , [24]. Yleiseurooppalaisen tumavärjäystä of γH2AX joka tapahtuu vasta US altistus voi syntyä maailmanlaajuisen ATM aktivaation, kenties kautta chromatin remontin [25] vastauksena luonteesta USA stressiä.

(A) rinnakkaispaikantumisen erillisten NBS1 pS343 pesäkkeitä erillisille γH2AX pesäkkeitä; (B) rinnakkaispaikantumisen ATM pS1981 pesäkkeitä on γH2AX pesäkkeitä; (C) DNA-PKcs pT2609 pesäkkeitä pitkälti riippumaton γH2AX pesäkkeitä. (D) US- ja IR aiheuttama DNA-PKcs pS2056 ja γH2AX pesäkkeitä. US aiheuttama peri-ydin- korkean fluoresoiva DNA-PKcs pS2056 pesäkkeitä (

oikea

) tai olivat yleiseurooppalaisen ydinvoiman diskreetti pesäkkeitä

(vasemmalla) B, kun taas sekä pesäkkeitä jälkeen IR olivat erillisiä ja colocalized. Fluoresenssikuvia hankittiin 30 minuutin kuluttua 0,3 W /cm

2 USA ja 3 Gy IR U937-soluissa.

Lisäksi värjäys tutkimukset kahden suuren fosforylaatiota klustereita (T2609 ja S2056) saataville DNA-PKcs (loppukäyttäjien käsittelyä DSB kautta ei-homologisen end liittymällä (NHEJ) [26] – [29]) paljasti (kuvio 2C), että DNA-PKcs-pT2609 pesäkkeitä pitkälle riippumattoman γH2AX jälkeen USA ja IR vastuita , tukevat aiemmin ehdotettu, että NHEJ tapahtuu erillään homologisen rekombinaation HR [30], [31]. Toisaalta, kaikki IR-alttiina soluilla diskreetti, co-lokalisoitu DNA-PKcs-pS2056 /γH2AX + ydin- pesäkkeitä (kuvio 2D), myös vahvistaa aiemmissa raporteissa, että DNA-PKcs täydentää H2AX vastauksena IR [22]. Mielenkiintoista, havaintoja USA aiheuttamaa γH2AX + populaatioiden myös näytteillä päällekkäisiä alueita kolokalisaation DNA-PKcs, mutta lisäksi erillinen allekirjoitus ei-colocalized peri-tuman DNA-PKcs-pS2056 (kuvio 2D). Siten etuoikeutetut fosforylaatio DNA- PKcs-pS2056 voi välittää sekä NHEJ korjaus irtotavarana-ydin- US aiheuttama DSB, mutta myös merkki siitä γH2AX läsnäolon ympärille ydinaseiden reuna (katso myös kuva S6). Mekanismi, jonka DNA-PKcs S2056 on jaettu kehälle ytimen edelleen epäselvä, mutta tämä lokalisointi kuviot DNA-PKcs S2056 voi olla yksi ominaisuus soluvasteiden US-indusoidun DSB.

Arvioimme lisäksi biokemiallisia rooleja ATM ja DNA-PK soveltamalla vastaavia farmakologisia estäjät KU55993 (KU) ja NU7026 (NU). Immuno-blot-paljasti, että IR sai aikaan suuremman ATM fosforylaatio kuin teki Yhdysvaltain (kuvio 3A), hieman mikä aikaisemmassa NCTA havainnon (kuvio 1A). Erityisesti kuitenkin huomasimme, että KU, mutta ei NU, vähentää selektiivisesti fosfo-ATM tasot jälkeen USA ja IR (kuvio 3A). Täällä, fosforylaatio DNA- PKcs-S2056 (pS2056) oli suurempi, kun Yhdysvalloissa kuin IR. Kuten odotettua, NU esti S2056 fosforylaation merkittävästi, kun taas KU vähensi ATM-riippuvaista T2609 fosforylaatio [26], kun Yhdysvalloissa ja IR. Lisäksi KU osittain pelkistetty US aiheuttama DNA-PKcs-pS2056 sekä immunoblottaus ja immunovärjäys (kuvio 3B, D), mikä viittaa välistä ylikuulumista ATM ja DNA-PKcs-S2056 vastauksena Yhdysvaltain altistumista.

(A) immunobloteista U937 otteita 30 min jälkeen Yhdysvalloissa tai IR ja vaikutusten KU ja NU ATM pS1981 ja DNA- PKcs pS2056 /pT2609. (B) Suurempi tukahduttaminen US aiheuttaman γH2AX NU kuin KU jopa 6 h kuluttua US U937 solujen WB analyysiin. (C) vaikutukset KU ja /tai NU: suurempi tukahduttaminen US aiheuttaman γH2AX + solujen NU kuin KU, ja kumottua KU-plus-NU in FCM analyysiin. (

n

= 3, keskiarvo ± S.D.). *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001. Soluja käsiteltiin KU ja /tai NU (10 umol /l) kanssa 1 tunti, ennen altistusta ja sen jälkeen 0,3 W /cm

2 US (i) tai 10 Gy IR (ii). (D) DNA-PK edeltää ATM γH2AX induktion Yhdysvaltain: etuoikeutettu asema DNA-PK γH2AX induktio määritettiin immunovärjäyksellä. Soluja käsiteltiin kuten kuviossa. 4C. ATM pS1981 (AT), DNA-PKcs pS2056 (PK), ja γH2AX (H2) positiiviset /negatiiviset solut laskettiin vähintään 100 solua kussakin kokeessa. Tulokset osoittavat keskiarvot 2 itsenäisestä kokeesta.

Koska Yhdysvaltain näyttää aktivoimaan DNA-PK mieluummin ATM, se ei ehkä ole yllättävää, että NU oli tehokkaampi vähentämään US aiheuttamaa γH2AX proteiini tasoilla kuin oli KU (kuten on kuvattu tapaukselle, U937-soluissa (kuvio 3B), ja muut solulinjat testattiin (kuvio S7)) -an havainto, että vahvistui edelleen täydentäviä virtaussytometrialla mittaukset (kuvio 3C ja kuvio S8), mikä myös osoitti täydellisen inhibition, kun käytetään KU /NU yhdistelmä (kuvio 3C (i)). Tällainen farmakologinen estoja vahvistettiin myös immunovärjäyksessä ja toistettu kaikissa soluissa (Figue 3D ja kuviot S7, S9). Riippuvuuden DNA-PKcs USA indusoiman H2AX fosforylaatio vahvistettiin myös vertaamalla US-vaste DNA-PKcs viallinen glioblastoomasolulinjoissa (M059J) ja että sen kantasolulinjoista (M059K) (kuvio S10). Yhteenvetona nämä löydökset tukevat vahvasti etuoikeutettu asema DNA-PKcs ATM, mahdollisesti ilman osallistumista ATR, alussa signalointi US aiheuttama DSB on γH2AX, mutta vastapäätä tunne signaloinnin IR aiheuttama DSB: t (kuva 3A, C) kuten on osoitettu aiemmin [22].

Lopuksi halusimme tutkia fysikaalis-kemiallinen mekanismi US aiheuttama bio-vaikutuksia lisätestejä oletusta, että sonochemistry on hallitseva asema. Täällä me arvioida suhdetta Yhdysvaltojen aiheuttama OH • radikaalien ja DSB induktio. Huomasimme, että Yhdysvaltain aiheuttama OH • tasot (DMPO-OH addukteja) aerobisen DMPO ratkaisu suurenivat -intensiteetin, ja altistuminen aikaa, riippuvaisella tavalla (kuvio 4A), jossa induktio ylittää 1 ja 2 DMPO-OH adduktit per 0,3 ja 0,4 W /cm

2 /min, vastaavasti, olivat kertaluokkaa pienempi kuin 30 addukteja per 10 Gy (kuvio 4A) havaittiin tapauksessa IR altistumista. Siten solunulkoinen OH • taso jälkeinen USA oli alle 10% jota esiintyy leikkauksen jälkeen IR, vaikka vastaavia annoksia sovellettu (mitattuna niiden mahdollisuudet tuottaa DNA-vaurioita (

nimittäin

Kuva 1A). edelleen lisääminen radikaalinpoistajat DMSO ja NAC on vastaavasti korkea tai matala pitoisuuksina DMPO ratkaisu, joko poistettava tai osittain pelkistetty US aiheuttama OH • tasot (kuvio 4A, katso kuvateksti, ja menetelmät lisätietoja). Seuraavaksi määritetään solunsisäisen OH • tasoilla heti USA käyttäen hydroksifenyyli fluoreseiini (HPF) määritys [32]. Tässä keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti (MFI) alkaen siirtynyt virtaussytometria histogrammi oli 1,57 ± 0,07 välittömästi altistuksen jälkeen 0,3 W /cm

2 (kuva 4B), siis alhainen sekä ekstra- ja solunsisäisessä OH • syntyvät vastauksena USA voi täysin selittää USA induktion DSB. Lisäksi yksikään radikaalipuhdistajia oli tehokas tukahduttaa US aiheuttama γH2AX (kuvio 4C). päinvastoin, N

2O kaasua, jonka tiedetään tukahduttaa inertiaan kavitaatiota US [3], täysin poistetuiksi, induktio DMPO-OH-adduktit, γH2AX + soluja, ja solukuolemaa (kuvio 4D-F ). Nämä havainnot otetaan kokonaisuudessaan pakottavat siihen tulokseen, että Yhdysvaltain välittämä mekaanista rasitusta, eikä niinkään sonochemically syntyy radikaali toimintaa luo genomista DSB.

(A) EPR havaitseminen US- tai IR aiheuttama ulkoinen ja solunsisäisiä tasoja OH • kuin DMPO-OH adduktit (katso menetelmät); Kasvua OH • tasoilla DMPO liuokseen (10 mmol /l) funktiona insonation ajan 0,3 (

jäljellä

) ja 0,4 (

keskellä

) W /cm

2 USA , tai IR annoksella 5-20 Gy (

oikea, suljettu ympyrä

). Induktio DMPO-OH addukteja 0,3 tai 0,4 W /cm

2 vähenivät osittain 50 mmol /l DMSO (

kolmio ylöspäin

) tai 5 mmol /l NAC (

kolmio alaspäin

), ja tyhjäksi 10 kertaa suurempia pitoisuuksia: 50 mmol /L NAC tai 500 mmol /l DMSO (

suljettu timantti

molemmille). Sisäkkeet osoittavat amplitudit EPR signaalien DMPO-OH. (B) FCM-pohjainen HPF määritys solunsisäisen OH • tasoilla heti 0,3 W /cm

2 USA U937-soluissa. Histogrammi siirtyminen kohti korkean HPF fluoresenssin OH • hapetus oli pieni, ja siten kasvu fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) oli 1,57 ± 0,07 kertainen ohjaus (

n

= 3, keskiarvo ± sd), jossa osittainen suoja esikäsittelemällä 5 mmol /l NAC 3 h ennen ultraäänen avulla. (C) N: o suojaavia vaikutuksia 5 mmol /l DMSO: ssa tai 5 mmol /l NAC (puhdistavien) lisättiin viljelmiin välittömästi ennen 0,3 ja 0,4 W /cm

2 US, tai muiden 3 h-esikäsittely 5 mmol /l NAC (NAC-pre) vastaan ​​induktion γH2AX + U937-soluissa 30 min jälkeisen Yhdysvalloissa. (

n

= 3, keskiarvo ± S.D.

ns

keinoin

ei merkittäviä

). (D-F) Kylläinen N

2O kaasu aiheutti kumoamisen Yhdysvaltain aiheuttama tapahtumia seuraavasti: (D) USA altistumiseen aikariippuvainen induktion OH • 10 mmol /l DMPO liuosta 0,3 ja 0,4 W /cm

2 (

n

= 3, keskiarvo ± sd). : (E) induktio γH2AX + U937-soluissa 30 minuutin kuluttua 0,3 ja 0,4 W /cm

2 (

n

= 3, keskiarvo ± S.D.). : (F) 20% ei-elinkelpoisia soluja (trypaanisini- -ekskluusiotestillä) ja 30% menetys solumäärät vertailuryhmään nähden U937-soluihin 6 h kuluttua 0,3 tai 0,4 W /cm

2 USA (

n

= 3, keskiarvo ± sd).

Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, että mekaanisen toiminnan US käyttävät keskitason intensiteetin voi aiheuttaa DSB, joka ilmoitetaan läsnäolo neutraali komeetta hännän ja γH2AX pesäkkeet keskuudessa huopa yleiseurooppalainen ydinvoiman γH2AX kanssa peri-tuman DNA-PKcs S2056. Lisäksi esillä oleva Yhdysvaltain intensiteettiä 0,3 ja 0,4 W /cm

2, joka aiheutti 0,132 ja 0,144 MPa huippu akustisia paineita vastaavasti [16], eivät kuulu diagnostinen USA alue ( 0,1 MPa) [1 ] ja varmistimme, että USA: ssa 0,1 W /cm

2 (0,082 MPa) ei indusoi DSB (Fig. 1 E). Nämä tulokset korostavat turvallisuutta diagnostisten USA, varsinkin jos seuraavat kolme pistettä otetaan huomioon: (i) hyvin lyhyitä pulsseja (pari mikrosekunnin) käytetään diagnosoinnissa, (ii) seisovat aallot ovat epätodennäköisiä in

vuonna vivo

vastuut, ja (iii) vaimennus akustisten aaltojen ihmiskehossa. Lopuksi toivomme, että nämä uudet ja pakottavia havainnot tarjoavat paitsi yrityksen biofysikaalisten ja biokemialliset perusta ymmärtämiseksi genotoksisia USA, mutta myös ohjata tulevaisuudessa käännös turvallisuuden kannalta kynnysarvot.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja solut

DNA-PK-estäjä NU7026 ja ATM estäjä KU55933 hankittiin Calbiochem (Cambridge, UK). Ihmisen leukemiasolulinjoja U937, Molt-4, ja Jurkat-T-hankittiin kaupallisesti (japanilainen Collection of Research Bioresources (JCRB) Cell Bank [32]. HL-60-saatiin myös JCRB Cell Bank (IFO50022). Soluja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. Rekombinantti TRAIL /Apo2L oli peräisin PeproTech (Lontoo, Yhdistynyt kuningaskunta), pan-kaspaasi-inhibiittori zVal-Ala-DL-Asp-fluorimetyyli ketoni (zVAD-fmk) oli Peptide Institute (Osaka, Japani);

N

-asetyyli-L-kysteiini (NAC) ja propidiumjodidilla (PI) olivat Wako Pure Chemical (Tokyo, Japani); 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) ja 5,5-demetyyli-1-pyrroline-

N

oksidi (DMPO) olivat Dojindo (Kumamoto, Japani).

Sonikaatio ja Säteilytys

Low–intensiteetin pulssi US 100 Hz kiinteä pulssintoistotaajuudella ja 10%: n tekijä (tämän jälkeen nimetty US) tuotettiin käyttäen 1,0 MHz akustinen setup [16], [33]. sen insonation kokeissa 2 ml-näyte kiinteällä tiheydellä 1 x 10

6 solua /ml 35 mm: n polyeteeni viljelyastia (Corning, NY) käsiteltiin ultraäänellä 0,1-0,4 W /cm

2 (suunnittelemaan-aiheinen intensiteetit) 1 min. Nämä neljä intensiteettiä vastasi 0,061, 0,105, 0,132 ja 0,144 MPa huippu akustisia paineita vastaavasti [16]. Nousu keski- lämpötilan insonation oli alle 1 ° C [16]. IR hoito, soluja säteilytettiin 3 Gy (tuottamaan diskreetti IRIFs) tai 10 Gy (lähes isoeffect annos neutraali komeetta hännät aiheuttama 0,3 ja 0,4 W /cm

2) annoksena nopeudella 5 Gy /min käyttäen Model MBR-1520R-3 röntgenyksikkö (Hitachi Medico Technology, Kashiwa, Japani).

Neutral comet

Neutral komeetta hännät (DSB: t) arvioitiin US-alttiina -soluista käyttämällä Comet määrityskittiä ja elektroforeesi yksikkö (Trevigen) mukaisesti valmistajan ohjeen. Vähintään 50 solua kohti analysoitiin käyttämällä Comet määritys IV ohjelmisto (Leica). Suhteellinen takaosan liike antoivat suhde komeetan hännän hetkiä (keskiarvo ± SD) käsiteltyjen solujen kuin tarkastusten (ratio = 1,0).

immunodetektio

immuunifluoresenssivasta kuvia, paraformaldehyde- kiinteä ohjaus ja käsitellyt solut tehtiin läpäiseviksi /blokattiin 2% BSA /0,05% Triton X-100 /Tris-puskuroitua suolaliuosta, ja immunovärjättiin 2 h primaarista monoklonaalista vasta-ainetta (mAb): anti-fosfo-H2AX S139 (γH2AX, Milipore) , 1:400 tai anti-ATM pS1981, 1:250 (Upstate Biotechnology) tai ensisijainen polyklonaalista vasta-ainetta (pAb), anti-fosfo-H2AX S139 (γH2AX, Active motiivi), 1:500, anti-NBS1 pS343, 1:1000 (Novus Biologicals), tai anti-DNA-PKcs pT2609 tai pS2056, 1:250 tai 1:600 ​​(Abcam), vastaavasti. Sitten solut värjättiin 1,5 tuntia sekundaarisen vasta-aine: Alexa Fluor 488 anti-hiiri-F (ab ’) IgG- tai Alexa Fluor 555 anti-kanin F (ab’) IgG (Cell Signaling Technology), 1:400. Lopuksi, tumat vastavärjättiin 2 ug /ml DAPI, ja näytteet asennettu mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää ™ (Molecular Probes). Fluoresenssikuvia hankittiin käyttäen BX-50 fluoresenssimikroskopiaan (Olympus Optics).

virtaussytometrialla (FCM), solut kiinnitettiin 70% kylmällä metanolilla yön yli, sitten blokattiin 2% BSA /0,05% Triton X-100 /Tris-puskuroitua suolaliuosta, ja saatetaan reagoimaan γH2AX mAb /Alexa Fluor 488 anti-hiiri-IgG (1:400) värjäämiseksi γH2AX + solut, jonka jälkeen inkuboitiin 1 mg /ml RNaasi A: ta ja 50 ug /ml PI jaettaessa γH2AX + solut kullekin PI-pohjainen solusyklin vaiheissa. Näytteet lopuksi ajettiin Epics XL virtaussytometrillä (Beckman Coulter).

immunoblot-analyysillä, koko-solu-uutteet valmistettiin RIPA lyysipuskuria, joka sisältää natriumortovanadaattia ja proteaasi-inhibiittorien (Nacalai Tesque). Korkea molekyylien ATM ja DNA- PKcs erotettiin 5% betonielementtien SDS-PAGE-geelien, kun taas muut alemman molekyylipainon proteiinit erotettiin 15% betonielementtien SDS-PAGE-geelien. Siirron jälkeen proteiinit Immobilon-P kalvoja (Millipore) oli western-blotattiin käyttämällä ensisijaista vasta: γH2AX mAb, ATM pAb (Santacruz), ATM pS1981 mAb (Epitomics), DNA- PKcs pAb (Epitomics), DNA- PKcs pS2056 pAb, DNA-PKcs pT2609 mAb, kaspaasi 3 pAb (Soluviestintä) tai GAPDH mAb (loading viittaus, Organon Teknika), ja toissijainen HRP-konjugoitua anti-hiiri tai anti-kani-lgG: illä (Cell Signaling). Proteiinin ekspressiotasoja tehtiin näkyviksi parannetun kemiluminesenssi (ECL) havaitsemisjärjestelmä (Nacalai Tesque), ja kuvat hankittiin jonka LAS-4000 luminoiva kuva-analysaattorilla (Fuji Film).

havaitseminen ekstra- ja solunsisäisen ROS

tasot US- tai IR aiheuttama OH • ekstrasellulaarisissa nesteissä kvantitoitiin elektronien paramagneettinen resonanssi (EPR) spin-pyyntimenetelmä [3], [16]. Näiden, 2-ml: n erillä 10 mM DMPO jaettiin 35 mm: n annoksia ja altistetaan 0,3 ja 0,4 W /cm

2 1-5 min tai lajitellut IR annoksilla (5-20 Gy), ja sen jälkeen havaita välittömästi DMPO-OH adduktia signaaleja käyttäen RFR-30 EPR spektrometri (Radical Research). DMPO-OH adduktit (OH •) ilmaistiin suhteelliset määrät sisäiseen viite (Mn

2 +). Havaita solunsisäinen OH •, solu läpäisevä hydroksifenyyli fluoreseiini (HPF) (Sekisuin Medical) käytettiin, joka tunnistaa pääasiallisesti OH • ja marginaalisesti ONOO

– (~ 1/10 OH • määrä) [31]. Solut ladattiin 5 nM HPF 15 minuuttia 37 ° C: ssa, ja altistettiin 0,3 W /cm

2, jonka jälkeen välittömästi FCM-analyysi US-indusoidun solunsisäisen OH •. Mean fluoresenssin intensiteetti (MFI) hapettuneen koetin oli määrällisesti arvioida kertainen lisäys kontrolliin nähden.

Tilastot

Tulokset esitettiin keskiarvoina ± S.D. Tilastollinen merkitys minkä tahansa kahden aineistoja analysoitiin parittomia Studentin

t

-testi Microsoft Excel 2007

tukeminen Information

Kuva S1.

määritys neutraali komeetta hännät Jurkat, Molt-4 ja HL-60-solujen heti 0,4 W /cm

2 USA paljasti epätasainen laajempi jakautuminen 25-30, 35-50% ja 10-23% soluista ja valikoimia 3, 1,1-3, ja 1 suhteellinen hännän hetkiä, vastaavasti, verrattuna melko tasainen jakautuminen 80-90% enemmistön solujen pienemmän valikoiman 1,1-3 suhteellisen hetki sen jälkeen 10 Gy IR. Suhteellinen pyrstö hetki 1,0 edustaa ole aiheuttamaa DSB kuin kontrolliryhmässä soluissa. Sen jälkeen 0,3 W /cm

2, vastaavasti 10-25, 30-40% ja -50% soluista syntyneet 3, 1,1-3 ja 1 (ei DSB: t) suhteellinen hännän hetkiä, vastaavasti. Nämä tulokset kerrata havainnot U937-soluissa (kuvio. 1A, C).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0029012.s001

(PDF) B Kuva S2.

Fluoresenssikuvat osoitti yleiseurooppalainen ydin- γH2AX kuvio 30 min kuluttua 0,4 W /cm

2 USA, mutta ei γH2AX + solujen jälkeen 0,1 W /cm

2 U937-soluissa. Solut 10 Gy IR käytettiin positiivisena kontrollina γH2AX värjäystä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0029012.s002

(PDF) B Kuva S3.

Fluoresenssi kuvia γH2AX U937, Jurkat, Molt-4 ja HL-60-soluja ilman US- tai IR-altistuksen. Määrälliset tulokset on esitetty kuviossa. 1E.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0029012.s003

(PDF) B Kuva S4.

Edustavia FCM histogrammit osoittivat induktion ja lasku γH2AX + U937-soluissa ajan jopa 6 h jälkeen 0,3 tai 0,4 W /cm

2 (1 min) Yhdysvaltojen tai 10 Gy IR. Time-kurssi muutoksia γH2AX + soluissa jälkeen Yhdysvalloissa tai IR (Fig. 1h) tuli fluoresenssin histogrammien (varjostaa). Huomautus maksimaalinen γH2AX + jakeet 0,5 tai 1 h, jonka jälkeen niiden vähenee myöhemmin, joitakin pysyviä γH2AX + jakeet noin 6 h jälkeinen stressi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0029012.s004

(PDF)

Kuva S5.

Eri H2AX vastauksia Yhdysvaltojen ja kuolema-reseptoriligandilla TRAIL U937, Jurkat, Molt-4, ja HL-60-solujen. (A) aika-riippuva nousu γH2AX proteiinin ilmentymiseen ja p17 /p19: n aktiivisia muotoja pilkottiin kaspaasi-3, on olennainen apoptoottisen markkeri, kun on lisätty 0,1 mg /ml TRAIL. (B) zVAD esti kaspaasi-3 lohkaisu U937, Jurkat, Motl-4 ja HL-60-solut: esto kaspaasi-3 lohkaisu käsittelemällä zVAD-fmk 6 tunnin kuluttua 0,3 W /cm

2 USA ( ylempi) tai 3 tuntia sen jälkeen TRAIL (alhaalla). Z-VAD FMK esikäsiteltiin 1 tunti ennen TRAIL treatement. (C) TRAIL aiheuttama, apoptoottiset DSB-odotuksiin γH2AX + soluja, mutta ei DSB-odotuksiin γH2AX + solujen alussa 30 min kuluttua 0,3 W /cm

2 USA, kumottiin käsittelemällä kaikkien solulinjojen 100 mikromol /l zVAD-fmk . Blue DAPI väri muuttui punaiseksi helppo keltainen visualisointiin Yhdistämisen vihreillä γH2AX kuva käyttämällä Adobe Photoshop Elements 2.0. (Adobe Systems).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0029012.s005

(PDF) B Kuva S6.

Immunofluoresenssikoe analyysit US- ja IR aiheuttama DNA-PKcs pS2056 ja γH2AX pesäkkeitä. Pan-ydin- vihreä γH2AX pesäkkeet ja erittäin puna-fluoresoiva DNA-PKcs pS2056 pesäkkeitä, kun USA, mutta matala-loisteputki erillisiä γH2AX ja DNA- PKcs pS2056 pesäkkeitä jälkeen IR. Punaiset nuolet osoitti solujen reuna-tuman DNA-PKcs pS2056 pesäkkeitä havaittiin sonikoidaan soluissa, mutta ei säteilytetty soluissa. Suurennettu kuvat olivat kuvassa. 2D.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0029012.s006

(PDF) B Kuva S7.

Western blot-analyysit osoittavat vaikutukset Ku55933 (KU) ja /tai Nu7026 (NU) on γH2AX 1 h kuluttua US Jurkat, Molt-4, ja HL-60-solujen. Soluja esikäsiteltiin 10 mmol /l KU ja /tai NU 1 h ennen USA.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0029012.s007

(PDF) B Kuva S8.

Tyypillisiä FCM histogrammien US-indusoidun γH2AX läsnä ollessa tai poissa ollessa Ku55933 (KU) ja /tai Nu7026 (NU). Jakaumia solusyklin vaihe määritettiin värjäämällä propidiumjodidilla. Huomaa, että Yhdysvaltain aiheuttama γH2AX eivät rajoitu S-vaiheessa ja tukahduttava vaikutus KU ja /tai NU päällä γH2AX tunnistettiin koko solusyklin vaiheissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0029012.s008

(PDF )

Kuva S9.

Tyypillisiä kuvat osoittavat US-indusoidun γH2AX, fosfo-ATM S1981, fosfo-DNA-PKcs on S2056: n läsnä tai poissa ollessa Ku55933 (KU) ja /tai Nu7026 (NU). Vaikutus KU tai NU ekspressioon näiden proteiinien kvantitoitiin kuten kuviossa. 4D.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0029012.s009

(PDF) B Kuva S10.

Tyypillisiä FCM histogrammien US-indusoidun γH2AX DNA-PKcs taitavia M059K soluissa, mutta ei DNA-PKcs puutteellinen M059J soluja. Nämä kiinnittyneet solulinjat resuspendoitiin trypsinisaatiolla ja sitten sonikoitiin 0,4 W /cm

2 60 sekunnin viljelyväliaineessa. Solut kerättiin muoviputkiin heti sonikoimalla sitten inkuboidaan 30 minuuttia, mitä seurasi kiinnitys.