Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Mahasyöpää edelleen yksi tappavimmista syövistä maailmassa ja siksi tunnistaakseen uusia lääkkeitä kohteekseen syöpätyyppi on siten huomattavaa merkitystä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa ja vahvistaa terapeuttista ainetta, joilla voidaan parantaa tuloksia mahasyövän potilaille tulevaisuudessa.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käyttäen sirutekniikalla, me syntyy geeni ilmentymisprofiili ihmisen mahasyövän-geenit ihmisen mahasyöpä kudosnäytteistä. Käytimme tätä profiili Broad instituutin Connectivity Kartta analyysi tunnistaa ehdokas terapeuttisten yhdisteiden mahasyövän. Löysimme histonideasetylaasi estäjä vorinostat johtavana yhdiste ja siten mahdollisia terapeuttisia lääke mahasyövän. Vorinostat aiheuttama sekä apoptoosin ja autophagy mahasyövän solulinjoissa. Farmakologinen ja geneettinen inhibitio autophagy kuitenkin lisääntynyt terapeuttinen teho vorinostat, mikä osoittaa, että yhdistelmä vorinostat kanssa autophagy inhibiittorit voivat terapeuttisesti olla enemmän hyötyä. Lisäksi geeni-ilmentymisen analyysi mahasyövän tunnistettu joukko geenejä (

ITGB5, TYMS, MYB, APOC1, CBX5, PLA2G2A,

ja

KIF20A

), jonka ekspressio kohosi mahakasvaimen kudosten ja vaimentua yli 2-kertaisesti vorinostat käsittely mahasyövän solulinjoissa. Sen sijaan

SCGB2A1, TCN1, CFD, APLP1,

ja

NQO1

ilmaisseet käänteinen kuvio.

Johtopäätökset /merkitys

Osoitimme, että analyysi geeniekspressiota allekirjoitus voi edustaa syntymässä lähestymistapaa löytää terapeuttisia aineita mahasyövän, kuten vorinostat. Havainto muuttuneen geeniekspression jälkeen vorinostat hoito voi antaa vihjeen tunnistaa molekyylitason mekanismi vorinostat ja ne potilaat hyötyvät todennäköisesti vorinostat hoitoa.

Citation: Claerhout S, Lim JY, Choi W, Park YY, Kim K, Kim SB, et ai. (2011) Gene Expression Allekirjoitus analyysi jakautuu Vorinostat ehdokkaaksi Therapy mahasyövän. PLoS ONE 6 (9): e24662. doi: 10,1371 /journal.pone.0024662

Editor: David L. McCormick, IIT Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 16 elokuu 2011; Julkaistu: 09 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Claerhout et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus SC kuin Odyssey Fellow tukivat Odyssey ohjelma ja Theodore N. lain Endowment for Scientific Achievement yliopistossa Texas MD Anderson Cancer Center. Tätä työtä tuki myös varoja 2009 sisätautien Academic Research Fund ja Basic Science Research Program kautta National Research Foundation Korean rahoittama opetus-, Science and Technology (nro 2010-0024248). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuoleman maailmassa [1], joiden eloonjäämisaste noin 10 kuukautta [2] – [4]. Hoito mahasyövän voivat sisältää kemoterapian, kirurgian ja sädehoitoa. Valitettavasti nykyinen kemoterapia-pohjainen hoitoja edennyt mahasyöpä osoittaa heikot tulokset [2] – [4]. Todellakin, täydellinen remissiot ovat harvinaisia ​​tai vain kestä kovin pian.

Useat kohdennetut aineita, jotka antavat selviytymisen etuja muihin syöpätyyppeihin ollut tutkittavana mahasyövän. Vaikka jotkut aikaisen vaiheen kliinisissä tutkimuksissa käyttäen verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptori (VEGFR) ja epiteelin kasvutekijän reseptorin (EGFR) -1-inhibiittorit, kuten setuksimabi ja bevasitsumabi, ovat osoittaneet jonkin verran aktiivisuutta, on harvoin todellinen selviytyminen etuun potilaille [5] , [6]. Yksi syy voi olla, että näissä tutkimuksissa ei valita potilaat mukaan läsnäolo biomarkkereita. Äskettäin Trastutsumabi mahasyövän (TOGA) tutkimus totesi, että lisäämällä trastutsumabi kemoterapiaan johti tilastollisesti merkittävää parannusta ilman taudin etenemistä (PFS) ja kokonaiselossaoloaika (OS) on noin 20%: lla potilaista, joilla levitetään mahalaukun ja gastroesophageal (GE) risteykseen kasvaimet yli-ilmentävät HER2 [7]. Tämä korostaa tarvetta kohdennettuja biologinen hoito ja etsiä biomarkkerit valita potilaita kliinisiin tutkimuksiin, jotka voivat hyötyä selviytymistä. Vaikka joitakin todisteita mahdollisia kohteita, kuten HER2 [8], [9], tehoa näiden biologisesti kohdennettujen hoitojen ei tiedetä ja on puute standardin täsmähoitoihin mahasyövän. Koska biologinen heterogeenisuus mahasyövistä, on epätodennäköistä, että on vain yksi ”ihmelääke” hoito. Molekyylimerkit on siis tärkeää tulevaisuudessa ennustaa potilaiden tuloksia ja räätälöintiä hoidot yksilöllisten biologiaan.

etsittäessä biomarkkereiden geenien ilmentymisen allekirjoituksen analysointi on käytetty erilaisissa sovelluksissa, kuten voidaan selvittää mekanismit biologisten reittien [10], luokittelemalla alatyyppejä taudin [11], ennustavat syövän ennuste [12] ja profilointi geeniekspression vastaavat erityisiin huumeiden [13], [14]. Geenien ilmentyminen allekirjoitus analyysi voidaan tehdä käyttämällä Broad-instituutin Connectivity kartta (https://www.broadinstitute.org/cmap). Yhteys Kartta tavoitteena on tuottaa kartan joka yhdistää geeniekspressiomalleja liittyy tautiin vastaavaan kuvioita tuottaman lääkekandidaatteja ja geenimanipulaatiot [15], [16]. Tämä järjestelmien lähestymistapa mahdollistaa yhdisteitä voidaan seuloa vastaan ​​genominlaajuisten tauti allekirjoituksia, pikemmin kuin ennalta valitun joukko kohdegeenien. Lääkkeet ovat parina sairauksiin käyttämällä kehittyneitä kuvio-matching menetelmiä korkean resoluution ja spesifisyys. Vaikka se jättää monia avoimia kysymyksiä, Yhteys-Map on osoittanut, että genomista allekirjoituksen analysointi voidaan käyttää tunnistamaan lääkkeiden kanssa yhteisiä toimintamekanismeja, löytää tuntemattomia vaikutusmekanismit ja tunnistaa mahdollisia uusia terapeuttisia [15], [16].

tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa mahdollisia uusia hoitomuotoja hoitoon mahasyövän. Voit tehdä tämän, ensin analysoidaan genomisen allekirjoitus ihmisen mahasyöpä. Tuloksena mahasyöpä geeni allekirjoitusta käytettiin sitten

in silico

käyttämällä Connectivity Map analyysi löytää hoitoaineita, jotka voivat olla tehokkaita tämä syöpä. Olemme edelleen validoitu alkuun huumeita sen tehon mahasyövässä solulinjoissa. Huomasimme, että vorinostat, mahdollisen uuden lääkkeen, aiheuttama sekä apoptoosin ja autophagy mahalaukun syöpäsoluja. Yhdessä tämä tutkimus osoittaa, että Connectivity Map analyysiä voidaan käyttää tunnistamiseen terapeuttisia aineita, jotka voivat olla onnistunut hoidossa osajoukon syöpien.

Methods

analyysi microarray data

Connectivity Map analyysi, käytimme microarray data 65 mahasyövän potilaalla, joista 65 syöpiä ja 19 normaali mahan kudoksissa, jotka on saatu aikaisemmista työstä, Yonsei data [17]. Kasvaimen näytteet kerättiin mahalaukun syöpäpotilailla gastrectomy ensisijaisena hoitoon. Kudosnäytteet tutkittiin patologit aikaan keräämisen ja varastoidaan -80 ° C kudospankki alkuun asti kokeen. Kokonais-RNA uutettiin tuoreista-jäädytetty kudoksista käyttäen Mirvana RNA: n eristämistä -leimauskitillä (Ambion, Inc.). Ensisijainen microarray data on saatavilla NCBI: n Gene Expression Omnibus julkisen tietokannan (microarray alusta, GPL6884; microarray data, GSE 13861). Toinen geeniekspressioprofiili saatiin 69 mahalaukun kudosnäytteistä, mukaan lukien 38 syöpä ja 31 ei syöpä strooman, Stanford Microarray Database (https://smd.stanford.edu, GSE13911), Stanford tietoja. Mahasyöpä-geenit valittiin BRB-ArrayTools versio 3.6.1 (Biometrinen Research Branch, National Cancer Institute, Bethesda, MD). Luokan vertailun kahdella otoksen t-testiä (merkittävyys 0,001, 10000 satunnainen permutaatio) tunnistettu mahasyövän geenien ja geenejä, joiden keskimääräinen ilmaisu intensiteettiä muutettiin vähintään kaksinkertaisesti verrattuna tarkoittaa normaalia kudosta geeniekspressiota valittiin.

Yhteydet Kartta analyysi

tunnistamaan mahdolliset lääkkeet kohdistaminen mahasyövän, geeni luettelot top 500 ylös säänneltyä ja 500 alas geenien päässä mahasyövän-geenit käytettiin (taulukko S1). Yhteys Kartta analyysi tehtiin WWW-käyttöliittymän kautta (https://www.broadinstitute.org/cmap) käyttäen versio, rakentaa 02, joka sisältää yli 7000 ekspressioprofiilit edustavat vaikutukset 1309 yhdisteiden useaan viljellyissä ihmisen soluissa [15], [16]. Connectivity Kartassa toiminnallisia yhteyksiä huumeiden, geenien ja sairauksien. Lääkkeet, jotka tuottavat sairaus kaltaiset geeni allekirjoitukset auttavat tunnistamaan polkuja, jotka edustavat mahdollisia terapeuttisia kohteita että tauti. Toisaalta, lääkkeet, jotka saavat aikaan ”käänteinen” allekirjoitus, eli muutoksia geenien ilmentymisen vastakkaiseen suuntaan, joka havaittiin tautitilan, voisi edustaa uusia terapeuttisia aineita. Kandidaattiaineet vastaan ​​tiettyä tautia voidaan tunnistaa soveltamalla tautikohtaisten geeniekspressioprofiili että Connectivity Map analyysi. Valitsimme lääkekandidaatteina validoitavaksi

in vitro

perusteella connectivity pisteet, korrelaatio, ja P-arvo.

Kemikaalit ja soluviljelmissä

Vorinostat saatiin Merck ja valmistettiin kantaliuoksesta (DMSO). Klorokiini ja bafilomysiini A1 (Sigma) liuotettiin vastaavasti veteen ja DMSO. Ihmisen mahasyövän solulinjat AGS, NCI-N87, ja KATO III saatiin American Type Culture Collection ja pidettiin niiden suosituksia. Soluja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 100 U penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

solukasvun, elinkelpoisuuden ja solusyklin määritykset

3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), MTT liuotettiin PBS: ään 5 mg /ml. Noin 5 x 10

3-solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Elatusaine korvattiin sitten tuoreella elatusaineella, joka sisälsi ilmoitetut pitoisuudet vorinostat tai DMSO. 72 tunnin jälkeen, 20 ui MTT-liuosta lisättiin, ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Inkubaation jälkeen 100 ui DMSO: ta lisättiin liuottamaan formatsaani, ja absorbanssi luettiin 570 nm: ssä käyttäen spektrofotometristä mikrolevylukijaa (Vmax kineettinen mikrolevynlukijaa, Molecular Devices). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

kristallivioletin värjäystä, soluja käsiteltiin 12 tuntia, elatusaine poistettiin ja solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin sitten 30 min 0,5% kristallivioletilla (in 20% metanolia ja 80% kahdesti tislattua vettä). Sitten solut pestiin kolme kertaa PBS: llä. Jäljellä oleva kristallivioletti uutettiin etikkahapossa 5 min, ja absorbanssi mitattiin 595 nm: ssä käyttäen spektrofotometristä mikrolevylukijaa.

solujen elinvoimaisuuden määrittämiseen, soluja inkuboitiin vorinostat 72 tuntia. Kiinnittyneet solut irrotettiin sitten viljelmälevyiltä trypsinisaatiolla ja yhdistetään kelluvat solut, sentrifugoitiin ja suspendoitiin 500 ui propidiumjodidia (PI) -exclusive liuosta (ei solukalvoon läpitunkeva) 15 min 4 ° C: ssa. Värjätään solut seurattiin virtaussytometrialla (Beckman Coulter Cytomics FC 500).

solusyklin analyysi, soluja inkuboitiin vorinostat 24 tuntia, kerättiin ja suspensoitiin 500 ul: aan hypotonista liuosta (0,1% natriumsitraattia, 0,1% Triton X-100, 100 ug /ml RNaasi ja 50 ug /ml PI) 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. PI-värjätyt solut seurattiin virtaussytometrialla. Solukierron analysoitiin multicycle AV ohjelmisto.

RNA: n eristys ja mikrosirujen kokeita

RNA: n eristys ja mikrosirujen kokeet suoritettiin protokollan mukaisesti kuten aikaisemmin on kuvattu [17]. Kokonais-RNA uutettiin mahasyövän solulinjojen kanssa tai ilman vorinostat hoitoa käyttäen Mirvana RNA: n eristys-kittiä (Ambion, TX, USA). Eheyden suurten RNA jae määritettiin kanssa Experion® Bioanalyzer (Bio-Rad, CA, USA) korvikkeena mRNA laadunvalvontaan. Kokonais-RNA leimattiin ja hybridisoitiin ihmisen HT12 v.3 ilmaisu BeadChips mukaan valmistajan protokollien (Illumina, CA, USA). Kun BeadChips skannattiin kanssa Illumina BeadArray Reader, microarray data normalisoitiin käyttämällä quantile normalisoinnin menetelmää Linear Models for Microarray Data paketti R kieliympäristössä [18]. Ilmaisu taso kunkin geenin muutettiin log

2 base ennen tarkempaa analyysiä. Cluster-analyysi tehtiin klusterin ja Puunäkymäikkuna [19].

Western blot-analyysi

Solut kaavittiin keskipitkällä ja pyöritettiin alas, ja proteiinit eristettiin käyttäen lyysipuskuria (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA: ta ja 10 mM natriumpyrofosfaattia (pH 7,4)), joka sisälsi 100 mM NaF: ää, 10% glyserolia, 1,5 mM MgCl

2, 1% Triton X-100 ja proteaasi-inhibiittorin (Roche). Uutteet inkuboitiin jään päällä 20 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 20800 g: llä 20 minuutin ajan. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-proteiinimääritysreagenssilla (Pierce). Yhtä suuret määrät proteiinia kustakin näytteestä erotettiin elektroforeesilla SDS-PAGE: lla ja siirrettiin Hybond-C super kalvo (Amersham Pharmacia Biotech). Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween-20 ja 5% rasvatonta kuivamaitoa. Membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen laimennetaan 5% rasvatonta maitoa tai 5% BSA: ta 1 x Tris-puskuroitua suolaliuosta plus 0,1% Tween-20. Vasta-aineita LC3 (Novus Biologicals), aktiivinen kaspaasi-3 (Epitomics) ja p62 (BD Biosciences) käytettiin. Vasta-aineita a-tubuliinia ja beclin-1 olivat Cell Signaling Technology; vasta-aine p-aktiini oli Sigmalta. Sitten membraanit pestiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Cell Signaling Technology). Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin kuten valmistaja on kuvannut (GE Healthcare).

siRNA transfektion

siRNA kohdesekvenssi beclin-1, nontargeting siRNA (Risc Free) ja Dharmafect 1 olivat ostettu Dharmacon. Solut ympättiin 10-cm: n maljoihin ja transfektoitiin siRNA: lla 24 tuntia myöhemmin mukaan valmistajan protokollaa. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin trypsiinillä ja ympättiin 6 cm: n tai 96-kuoppaisille levyille saada sama transfektion tehokkuutta. Proteiinin ekspressiotasot määritettiin Western blot -analyysillä.

Transmissioelektronimikroskopia

Näytteet kiinnitettiin liuoksella, joka sisälsi 3% glutaraldehydiä ja 2% paraformaldehydiä 0,1 M kakodylaattipuskurissa, pH 7,3, 1 tunnin. Kiinnityksen jälkeen näytteet pestiin ja käsiteltiin 0,1%: Millipore-suodatettua dylaatissa puskuroitu parkkihappo, jälkikiinnitettiin 1% puskuroidussa osmiumtetroksidissa 30 minuuttia ja värjättiin en bloc 1% Millipore-suodatettua uranyyliasetaatilla. Näytteet poistettiin vesi oli kasvavia määriä etanolia, suodattunut, ja upotettu LX-112 väliaineessa. Näytteet polymeroitiin 70 ° C: ssa uunissa 2 päivää. Ultraohuet leikkeet leikattiin Leica Ultracut mikrotomi (Leica, Deerfield, IL), värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla on Leica EM stainer, ja tutkitaan JEM 1010 lähetyksen (JEOL, USA, Inc., Peabody, MA ) kiihtyvällä jännitteellä 80 kV. Digitaaliset kuvat saatiin käyttämällä AMT Imaging System (Advanced Microscopy Techniques Corp., Danvers, MA).

Tulokset

Geenien ilmentyminen allekirjoitus mahasyövän

Taulukko 1 edustaa ominaisuudet potilaat alkaen Yonsei data [17]. Mahasyövistä käytti enimmäkseen sijaitsevat distaalisen vatsaan ja vaiheen III /IV. Käyttäen geenien ilmentyminen microarray tiedot niistä potilaista, löysimme 3360 kasvain-geenit, joiden tarkoittaa ilmaus voimakkuudet muuttanut ainakin kaksinkertaiseksi verrattuna tarkoittaa normaalia kudosta geenin ilmentymistä (

P

0,001, kuva S1 ). Tämä joukko 3360 geenien (eli mahalaukun syövän erityinen allekirjoitus) käytettiin edelleen

in silico

seulonta mahdollisten terapeuttisten lääkkeiden mahasyövän.

Yhteydet Kartta analyysi tunnistaa mahdollisia huumeita kohdistaminen mahasyöpä

tunnistamaan mahdolliset lääkkeet kohdistaminen mahasyövän, mahasyövän erityinen allekirjoitusta käytettiin panos kyselyn Connectivity Map kuvatun ”Method” osiossa. Me nimenomaan etsitty yhdisteitä, jotka oli allekirjoitus korreloi käänteisesti mahasyövän erityisiä allekirjoitus ja tunnistettu useita lääkkeitä, jotka on koottu taulukkoon 2. sijoitusta ehdokasaineille perustettiin perustuu käänteinen korrelaatio arvon ja p-arvo. Taulukko 2 (sarakkeet 2-4) esittää korkein yhdisteitä Yonsei tiedot. Connectivity Kartta analyysi paljasti, että histonideasetylaasi (HDAC) estäjiä, mukaan lukien vorinostat ja trikostatiini edustavat mahdollisia ehdokkaita kohdentamiseksi mahasyövän. Fosfatidyyli-3-kinaasi-inhibiittori LY294002, fenotiatsiini, trifluoperatsiini ja lämpöshokkiproteiinia inhibiittori tanespimycin todettiin myös ehdolla kohteena aineina syöpään. Seuraavaksi validoitu meidän havainnot käyttämällä riippumaton sarja geeniekspressioprofiili tietoja Stanford Microarray Database (taulukko 2; Stanfordin data, pylväät 5-7). Connectivity Kartta analyysi tämän tietojoukon vahvistivat vorinostat kuin alkuun sijoittui ehdokas. Lopuksi, Connectivity Kartta analyysi tunnistaa vorinostat mahdollisena terapeuttisena aineena syöpään.

Vorinostat osoittaa terapeuttista tehoa

in vitro

mahasyövän solulinjoissa

arvioida terapeuttinen teho vorinostat, arvioimme kasvun perustettu mahasyövän solulinjoissa (AGS, KATO-III, ja NCI-N87) jälkeen 72 h vorinostat hoitoon käytetään MTT-määritystä. Käsittelemättömiin soluihin verrattuna, vorinostat estivät merkittävästi solujen elävyys annoksesta riippuvalla tavalla kaikissa mahasyövän solulinjoissa (kuvio 1A). Olemme vahvistaneet vähennys solujen elinvoimaisuuden solusyklin analyysi AGS ja KATO-III syöpäsoluja. Osoitimme, että hoito vorinostat (5 uM) 24 tunnin ajan indusoi selvän kasvun sub-G1 osuus AGS solujen verrattuna kontrolli (2,3 ± 0,07% vs. 39,2 ± 0,99%, vastaavasti;

P

P

= 0,044), ohjeellisia solusyklin pysähtymisen. Testasimme lisäksi solujen elinkelpoisuus käyttäen PI-syrjäytymistä. Käsittelimme AGS ja KATO-III solujen 5 uM vorinostat 72 tuntia ja arvioi niitä virtaussytometrialla (kuvio 1 C). Määrä kuolleita soluja, joilla on alhainen sirontamittari ja korkea puolella hajonta, lisääntyi merkitsevästi AGS soluissa (12,4 ± 4,3% vs. 79,4 ± 5,7%), ja myös KATO-III soluja verrattuna ohjata soluihin (8,7 ± 0,6% vs. 46,8 ± 2,1%). Olemme lopuksi analysoitiin apoptoosin induktion jälkeen vorinostat hoidon AGS ja KATO III mahasyövän solulinjoissa käyttämällä immunoblot. Vorinostat lisääntynyt apoptoosin, arvioituna kaspaasi-3 pilkkominen, vuonna AGS soluissa ja vähäisemmässä määrin KATO III soluissa (kuvio 1 D).

(A) MTT määritykset suoritettiin inkuboinnin jälkeen AGS, KATO- III, ja NCI-N87 osoitetuilla pitoisuuksilla vorinostat 72 tuntia. (B) muutos solun syklin vorinostat määritettiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) analyysi PI värjättyjen solujen käsiteltiin 5 uM vorinostat 24 tuntia. (C) Elinkelpoisuus testissä käytetään PI yksinomainen ratkaisu. AGS ja KATO III-soluja käsiteltiin 5 uM vorinostat 72 tuntia ja määritettiin FACS: llä. Vuonna edustaja juoni, kuolleet solut ilmenee pisteinä alhainen sirontamittari ja korkea sivusirontavirtaussytometriaa. (D) Western blot-analyysi aktiivinen kaspaasi-3: AGS ja KATO-III mahasyöpä soluja ilman tai 5 uM vorinostat hoitoa. Solulysaatit analysoitiin ilmoitettuina ajankohtina. Aktiini käytettiin latauskontrollina. *,

P

0,05. Vuonna pylväskaavion tiedot edustavat keskiarvoa + SD (keskihajonta).

Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että vorinostat on antiproliferatiivinen vaikutus mahasyövän solulinjoissa indusoimalla apoptoosin AGS soluissa ja G2 /M solukierron pysähtymisen Kato-III soluissa.

Global geeniekspressioanalyysiä mahasyövän solulinjoista AGS ja KATO-III jälkeen vorinostat hoidon

vaikutuksen analysoimiseksi vorinostat globaaliin geenin ilmentymisen, AGS ja KATO III mahasyövän soluja käsiteltiin 5 uM vorinostat 48 tuntia ja mikrosirujen analyysi suoritettiin. Valvomaton klusterin analyysi microarray tietojen jälkeen vorinostat hoidon osoitti, että AGS ja KATO III solujen klusteroitu samalla solulinjan riippumatta sen vorinostat hoitoon (kuvio 2A). Koska autophagy on raportoitu olevan rooli vorinostat aiheuttaman vaikutuksia muissa syövissä [20], [21], teimme valvottua analyysi autophagy liittyvän geenin set (80 geenit ja 149 antureista, taulukko S2). Vorinostat-käsitelty mahasyövän solulinjat ryhmittyivät yhteen (kuvio 2B), mikä osoittaa, että induktio autophagy on tärkeä ominaisuus vorinostat mahasyövän linjat.

(A) valvomaton hierarkkinen klusterointi geeni-ilmentymisen tietojen AGS ja KATO III ennen ja jälkeen 5 uM vorinostat hoidon 48 tunnin ajan. Geenejä, joiden ekspressiotaso, joka on vähintään 2-kertainen ero suhteessa mediaanin yli solulinjoja ainakin 2 paneelit valittiin hierarkkinen klusterointi analyysi (3646 geenin ominaisuuksia). (B) Valvottu hierarkkinen klusterointi kanssa autophagy liittyvien geenien (149 antureista) AGS ja KATO III jälkeen vorinostat hoidon.

esto autophagy parantaa vorinostat tehon mahasyövässä soluissa

Koska autophagy voi olla rooli sekä syövän solujen eloonjäämistä ja syöpäsolun kuoleman jälkeen lääkehoitoa [22], [23], me arvioidaan edelleen panos tämän prosessin vaikutus vorinostat mahalaukun syövän solulinjoissa. Me toiminnallisesti arvioinut tätä prosessia immunoblot analyysi autophagy merkki mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (LC3). Vorinostat saaneilla KATO III soluja, ja vähäisemmässä määrin AGS soluja, osoitti selvästi kertynyt nopeammin liikkuvasta lipidoitunut muoto LC3 (LC3-II) (kuvio 3A). Kertyminen LC3-II voi johtua joko säätelyä autophagosome muodostumisen tai tukos autophagic hajoamisen LC3-II [24], [25]. Siksi analysoitiin vorinostat-käsiteltyjen solujen p62 hajoamista, merkkiaine autophagic flux [24], ja havaitsimme lasku p62-proteiinin tasojen vorinostat käsitellyissä soluissa verrattuna aikaan, joka täsmäsi käsittelemättömien syöpäsolujen (kuvio 3A). Lisäksi, yhteiskäsittely on vorinostat kanssa bafilomysiini A1 (BafA1), estäjä autophagosome-lysosomifuusio, entisestään LC3-II kertymistä (kuvio 3B), joka on yhteensopiva vorinostat indusoivan autophagic vuon sijaan estää hajottavien kapasiteetti autophagolysomes. Elektronimikroskopialla (EM) on herkkä, kvantitatiivinen ja lopullinen menetelmä havaitsemiseen autophagy [24]. Yhdenmukainen western blot data, EM-analyysi osoitti, että vorinostat lisääntyi merkittävästi autophagosome muodostumista AGS-soluissa (kuvio 4B ja B ’) verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 4A ja A’).

(A) AGS ja KATO -III käsiteltiin 5 uM vorinostat varten ilmoitettuina ajankohtina. Proteiini tasot LC3 ja p62 analysoitiin immunoblot-analyysillä. Aktiini käytettiin latauskontrollina. P62 mitattiin densitometrisellä analyysi western pyyhkii ja verrattuna aktiini tasolle. p62 tasot käsittelemättömien AGS ja KATOIII soluja pidetään 1. (B) AGS-soluja käsiteltiin 12 h 5 uM vorinostat kanssa tai ilman 50 nM bafilomysiini A1 (BafA1). Solulysaatit analysoitiin immunoblot-analyysi LC3 ja aktiinin.

12 tunnin kuluttua hoidon DMSO (A, A ’) tai 5 uM vorinostat (B, B’) (vasemmanpuoleiset paneelit, pienellä suurennuksella, asteikko bar: 2 um), EM analyysi. Korkea suurennos kuvia boxed alueilla Av kuvaa autophagic vacuoles (vasemmanpuoleiset paneelit, asteikko bar: 500 nm; N: ydin, M: mitokondrioita).

Sen tutkimiseksi, kertymistä autophagosomes suojaa soluja vastaan solustressiä aikaansaama vorinostat, me esti autophagy jossa käytetään farmakologisen estäjä klorokiini ja sirna (siRNA) vastaan ​​beclin-1. Lisäksi klorokiinin ja vorinostat käsitellyn AGS ja KATO III-solujen johti annoksesta riippuva väheneminen elinkelpoisuuden (kuvio 5A). Väheneminen elinkelpoisuus varmistettiin KATO III-solujen käsiteltiin beclin-1 siRNA (kuvio 5B). Yhdessä tiedot viittaavat siihen, että inhibitio vorinostat aiheuttama autophagy voi parantaa tehoa vorinostat mahahaavahoidon syöpäsoluja.

(A) AGS ja KATO III-soluja käsiteltiin 5 uM vorinostat ja eri klorokiinin (CQ). Solujen elinkelpoisuus arvioitiin 12 tunnin kuluttua käyttäen kristalliviolettia värjäystä ja ohjaus (Ctr) asetettiin 100%. (B) KATO-III-solut transfektoitiin siRNA vastaan ​​Beclin 1 (siBeclin1) tai ei-kohdistuksen Risc Free siRNA tai käsitelty Dharmafect I yksin (mock). siRNA tehokkuus varmistettiin western blot-analyysi Beclin 1 ja Risc Free kontrollina. α-tubuliinin käytettiin osoittamaan yhtä suuri kuormitus proteiineja. Elinkelpoisuus mitattiin 12 tunnin vorinostat hoitoon käytetään kristalliviolettia värjäystä. Elinkelpoisuus käsittelemätön kontrolli (Ctr) solut asetettiin 100%. *,

P

0,05.

Vorinostat muuttuu geeni allekirjoitus ihmisen mahalaukun syöpäsoluissa

Ymmärtää vaikutuksia vorinostat geenien ilmentymistä mahasyövän solussa linjat, teimme microarray analyysi vorinostat käsiteltyjen AGS ja KATO-III mahasyövän solulinjoissa (Fig. 2). Meidän analyysi paljasti huomattavia genomista eroja käsittelemättömien ja vorinostat käsiteltyjen mahalaukun syöpäsolujen (AGS ja KATO-III). Jälkeen vorinostat hoito, ilmentyminen 1014 geenien lisättiin ja ilmentyminen 760-geenien oli vähentynyt AGS solulinja. Kato-III solulinja, 164 geenit kasvoi ja 191 geenien säädeltiin (kaksi-kertainen ero;

P

0,001). Vorinostat muuttunut merkittävästi ilmentymistä 140 geenien sekä AGS ja KATO III solulinjoja (vorinostat erityinen geeni allekirjoitus). Geenit, jotka eniten muuttuneet, kun vorinostat hoidon todettiin

SPANXA1, SPANXA2, VGF, DHRS2, ENTPD8, PNPLA7, STX1A, ARRDC4, KRT13, PRPH, NEU1, TXNIP, CCK

( 4-taittaa -regulation) ja

MUC1, IFITM1, ANKRD37

( 4-taitettava-asetus).

Seuraavaksi tarkoituksena on tunnistaa biomarkkereiden ehdokkaat, jotka voivat ennustaa vorinostat herkkyyttä ihmisen mahalaukun syöpäpotilaiden . Siksi yhdistimme joukko muuttunut geenien vorinostat käsitelty mahasyövän solulinjoissa (vorinostat erityinen geeni allekirjoitus) ja kaksi ihmisen mahasyövän allekirjoitukset syntyvät Yosei ja Stanfordin dataa Venn kaavio analyysi. Olemme havainneet, että suhteellisen ekspressiotasot 12 geenien palautettiin vorinostat käsittely (kuvio 6). Näistä 12 geenit, 7 geenit erittäin ilmaistaan ​​mahasyövässä kudoksista alassäädetty (

ITGB5

,

TYMS

,

MYB

,

APOC1

,

CBX5

,

PLA2G2A

,

KIF20A

) ja 5 matalan ilmaistuna geenejä säädellään ylöspäin jälkeen vorinostat hoidon (

SCGB2A1

,

TCN1

,

CFD

,

APLP1

,

NQO1

(taulukko 3).

Venn kaavio geenien valittu yhden muuttujan testi (kahden otoksen t-testi). Genes valittiin p 0,001 välillä verrattuna ryhmiin. punainen ympyrä (geeni lista A) edustaa mahasyöpä erityisiä geenejä Yonsein tiedot. sininen ympyrä (geeni lista B) edustaa mahasyöpä geenit Stanfordin data. keltainen ympyrä (geeni lista C) edustaa vorinostat geenistä allekirjoituksensa sekä AGS ja KATO III solulinjoissa (

P

0,001, 2 kertainen muutos).

keskustelu

Tuloksemme osoittavat, että maailmanlaajuinen ihmisen mahasyövän geenin allekirjoitus voi olla hyödyllistä löytää terapeuttisia aineita, jotka pikemminkin kohdistaa genominen allekirjoitus mahasyövän sijasta kohdistaminen yksi tai kaksi geenit. Käyttämällä Connectivity Map, huomasimme, että HDAC-inhibiittorit, kuten vorinostat ja trikostatiini A oli korreloi käänteisesti geeni allekirjoitus verrattuna mahasyövän erityinen geeni allekirjoitus ja siksi saattaa olla lyijyä terapeuttista ehdokkaita mahasyövän.

In vitro

arviointi terapeuttista tehoa vorinostat kävi ilmi, että tämä hoitava lääke kasvun estyminen eri mahasyövän solulinjoissa. Vieressä sen antiproliferatiivisia vaikutuksia, vorinostat myös upregulated autophagy-geenit. Esto vorinostat aiheuttaman autophagy johti lisävähennys elinkelpoisuuden. Lisäksi yhdistetty analyysi mahalaukun syövän solulinjat käsiteltiin vorinostat ja näytteitä mahasyöpäpotilaista osoitti, että vorinostat muuttanut ekspressiotasot joukko kahdentoista mahasyövän geenejä.

havainnot osoittivat, että HDAC-inhibiittorit, vorinostat ja trikostatiini A, olivat alkuun terapeuttinen ehdokkaita mahasyövän, joka yhtyy käsitykseen, että HDAC yliekspressoituu mahasyövässä kudoksissa [26]. HDAC-inhibiittorit ovat osoittautuneet lisätä asetylointi histonien, siis vaikuttaa geenin ilmentymisen. Nämä inhibiittorit ilmeinen syöpää ehkäisevistä vaikutuksista indusoimalla ulkoisen ja sisäisen apoptoosireitin [27], [28], estämällä kasvaimen angiogeneesi [29], ja estämällä intrasellulaarisen stressivaste reittejä [30]. Koska HDAC-inhibiittorit ovat maailmanlaajuisia vaikutuksia geenien ilmentymistä, ne voivat vaikuttaa vielä unrevealed soluprosesseissa [31], [32]. Kliinisissä yhteyksissä, HDAC-inhibiittorit ovat enimmäkseen sovellettu hematologisia syöpäsairauksia, mutta kliinisissä tutkimuksissa kiinteitä kasvaimia ovat käynnissä. Tuoreessa tutkimuksessa, joka tukee meidän

in vitro

havainnot osoittivat terapeuttista tehoa HDAC-inhibiittorit ihmisen mahasyövän näytteitä käyttäen histoculture lääkettä vastemääritystä [33]. On kuitenkin vielä olla unrevealed onko tietty molekyyli määriteltyjä alaryhmiä voi ennustaa vaste tai vastustuskykyä HDAC-inhibiittorit.