Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

T-solujen tiedetään osallistua vastauksena kasvainsoluihin ja reagoivat sytotoksisuus ja sytokiinien vapautumista. Samalla kasvaimet perustettu monipuolinen mekanismeja hiljentäminen immuunivastetta. Vuorovaikutus on läheskään täysin tunneta. Tässä tutkimuksessa osoitamme yhteyksiä kasvainsolujen ja lymfosyytit paljastaa uusia ominaisuuksia vuorovaikutusta T-solujen ja syöpäsolujen, joita ei ole aiemmin kuvattu.

Methods /arviointi

Kokeet perustuvat käyttö hydrofiilisen fluoresoiva väriaine, joka esiintyy vapaana sytosolissa ja siten siirto fluoresoivan sytosolin yhdestä solusta toiseen voidaan havaita käyttäen virtaussytometriaa. Kasvainsolujen solu- linjat eri alkuperää tai ensisijainen maksasolusyövän (HCC) soluja inkuboitiin lymfosyyttien ihmisen ja hiirillä. Tämä altistuminen aiheutti kontakti riippuvainen otto Kasvaimen aiheuttamien sytosoliin lymfosyytit – jopa CD4

+ T-solut ja hiiren B-solut – joita ei voitu havaita inkuboinnin jälkeen lymfosyyttien terveisiin soluihin. Vuorovaikutus oli suora yksi, ei vaadi läsnäoloa apusoluja, mutta riippumaton sytotoksisuuden ja TCR.

elektronimikroskopialla paljastaa 100-200nm suuria aukkoja solukalvon liitetyn soluja, jotka erotettiin elinkelpoisia ja paljasti hämmästyttävää tulokset. Kun taas lymfosyytit indusoidaan lisääntymään pitkän aikavälin tavalla, kasvainsolut tehtiin tilapäinen katkos solun jakautumisen.

in vitro

tulokset vahvistettiin

in vivo

käyttäen hiirten akuutti lymfaattinen leukemia (ALL) malli. Pidätys kasvaimen leviämisen johti merkittävään pidentynyt eloonjääminen hiiriin.

Johtopäätökset

raportoitiin solu-solu kontakteja paljastavat uusia ominaisuuksia eli mahdollistaa sytosolia virtauksen solujen välillä, kuten biologisten aktiivisia proteiineja, jotka vaikuttavat solusyklin ja biologista käyttäytymistä vastaanottajan soluja. Tämä lisää täysin uusi näkökohta kasvaimen indusoiman immunologian.

Citation: Hardtke-Wolenski M, Kraus L, Schmetz C, Trautewig B, Noyan F, Vondranin FWR, et ai. (2013) vaihto Sytosoliset Sisällön välillä T Solut ja tuumorisoluissa Aktivoi CD4-T-solut ja vaikeuttaa syövän kasvua. PLoS ONE 8 (10): e78558. doi: 10,1371 /journal.pone.0078558

Toimittaja: R. Lee Mosley, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 19 syyskuu 2013; Julkaistu: 24 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Hardtke-Wolenski et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Novartis Pharma GmbH: n ja Hilf myöntäminen Hannover Medical School. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Työtä rahoittavat Hilf myöntäminen Hannover Medical School ja Novartis Pharma. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Syöpä on kuin piilosilla hakea välillä kasvainsolujen ja immuunivasteen . Immuunijärjestelmä kun riitauttanut syöpä on kuitenkin ongelmana, että MHC itsensä ilmentäviä soluja on tarpeen valvoa niiden maligniteetti. Kuitenkin, kytkimen normaalien solujen kasvainsoluihin on liitetty ilmentyminen kasvaimen spesifisten peptidien pystyy aktivoimaan T-soluja (katsaus [1]). Useimmat näistä peptideistä polveutuu proteiineista ei yksinomaan tuotettu kasvainsoluja, mutta muutettu niiden rakenteessa. T-soluvasteen pitää kasvain tasaista tai lepotilaan [2,3]. Se on hyväksytty hypoteesi, että useimmat anti-kasvain vasteita välittävät CD8

+ T-solujen ja CD4

+ T-solut on rajoitettu joko auttamaan CD8

+ T-solujen tehokkaan sytotoksisuuden [4, 5] tai prime dendriittisolut (DC) parantaa vaste CD8

+ T-solujen [6,7].

Vastakohtana tätä oppia viimeaikaiset raportit paljasti osallistumista CD4

+ T-solut kuin voimakas efektorisolujen kapasiteetiltaan kanne suoraan kasvainsoluja johtaa kasvain häviää [8-10]. On osoitettu, että siirto kasvaimeen antigeenispesifisten CD4

+ T-solujen altistettiin, mutta immuuni-hiirillä voi aiheuttaa täydellisen kasvaimen regression ilman CD8

+ T-solu, NK-solujen tai B-solujen apua [10 ]. Kuitenkin olettamus kaikkien kuvattu tehokas T-soluvasteita on joko siirtogeenisiä spesifisyys T-solureseptorin (TCR) vastaan, tunnettu kasvaimen antigeenejä tai eristäminen ja laajentaminen kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL).

Näin ollen, aktivointi immuunivaste voidaan havaita, mutta aikana kasvaimen kasvun editointi immuunivasteen tapahtuu. Tämä sisältää tasapainotuspuskurilla ja lopuksi immuuni paeta kasvainsolujen vastustuskyvyn [11]. Tämä tehokas immuuni kiertäminen kasvaimia johtuu luominen mikroympäristön joka houkuttelee tukahduttava myelooisessa peräisin olevia soluja ja säätelijä-T-solujen. Lisäksi sytokiini ja kemokiinin koostumus sekä ilmaisun eräiden ligandien kasvainsoluihin voi muuntaa efektorisolujen osaksi sääntely- soluihin tai ajaa heidät anergy ja apoptoosin (katsaus [11,12]). Tieto tästä edestakaisin immuunijärjestelmää ja syövän

in vivo

on edelleen täynnä aukkoja siten jokainen ylimääräinen vuorovaikutus T-solujen kasvainsolujen auttaa ymmärtämään vasteen ja paeta mekanismeja.

tässä tutkimuksessa me raportoimme, joka ei tähän mennessä ole kuvattu vuorovaikutusta kasvainsolujen ja T-solut, sekä CD4

+ ja CD8

+ T-soluja. Tämä sisältää kosketus muodostumisen erilaiset ominaisuudet immunologista synapsi. Muodostumista synapsi on tutkittu laajasti ja käsittää useita vaiheita kuten valejalka, mikrotubulusten muodostumista ja kolokalisaation mitokondrioita ja Endoplasmakalvosto [13]. Kaikki nämä ominaisuudet puuttuvat kontaktit havaitsimme. Sen sijaan koskettimet johtavat sytosoliin välistä lymfosyyttien ja kasvainsolujen

in vitro

ja

in vivo

aiheuttaa tauon leviämisen kasvaimen soluihin. Toisin kuin aiemmissa raporteissa näitä yhteyksiä tapahtuu itsenäisesti läsnä antigeeniä esitteleviä soluja. Seurauksena näiden vuorovaikutusten, jatkuvaa T-solujen jakautumista indusoidaan lymfosyyttejä, jotka sisältävät kasvaimen peräisin sytosoliin. Tämä erityinen ilmiö on uusi näkökohta vuorovaikutuksesta immuunijärjestelmän kanssa syöpäsoluja.

Tulokset

Ota muodostumisen välillä kasvainsolujen ja T-solut indusoivat virtausta sytosolin unassociated kanssa cytotoxocicity

Lyhyt huomautus: Kokeet esitetty kuvassa 1 osoittavat vuorovaikutus ihmisen PBMC kanssa sian B soluleukemialinja L23. Aluksi kysyimme soluja tämän Sian solujen ovat tavoitteita ihmisen NK ja sytotoksisten T-solujen ja tarkoitus analysoida virtaussytometriassa kuin olemme suorittaneet aikaisemmin käyttämällä loisia kohteina NK-soluissa [14,15]. Koska sattuma löysimme sovitus fluoresenssin T-solujen altistuksen jälkeen L23 soluihin. Lisäksi kävi ilmi, että tämä vaikutus ei ole ksenogeenisen erityinen ilmiö, mutta voidaan havaita ihmisen ja hiiren lymfosyyttien ja useita kasvaimia eri alkuperää. Kuitenkin tämä malli paljasti merkittävimmät tulokset ja siten sopii parhaiten heijastaa tätä uutta vuorovaikutusta T-solujen ja kasvaimen soluihin. Olemme tietoisia keinotekoinen järjestelmä, sillä ihmisen PBMC ja sian kasvainsolut eivät todennäköisesti löytyvät yhdessä luonnollisissa olosuhteissa. Niinpä rajoitettu data käyttämällä sian soluja kuvioon 1 ja sen jälkeen kytketään hiirimallissa.

(A) 2×10

6 ihmisen PBMC: tai puhdistettu CD4

+ T-soluja inkuboitiin 2×10

6 CMFDA-leimattua L23-solujen 4 h, tämän jälkeen värjättiin CD3, CD4 ja CD8 ja analysoitiin virtaussytometrialla, vastaavasti. Altistuminen lymfosyyttien L23 soluihin johti sisällyttämistä fluoresenssin lukuisissa T-soluissa.

(B) Yhteenveto neljästä itsenäisestä kokeesta, jotka suoritettiin kuten edellä on kuvattu. Taajuus vihreä fluoresoiva T-solujen liittyy suurin väestö PBMC.

(C) PBMC: t esi-inkuboitiin 5 mM strontiumkloridia aiheuttaa degranulaation ennen altistumista L23 soluihin. Adpation Fluoresenssin arvioitiin CD4

+ ja CD8

+ T-soluja.

(D) 2×10

6 puhdistetaan T-solut ja 2×10

6 L23 inkuboitiin 4 tunnin ajan yhdessä tai erotetaan siirtoaltaat (TW), leimatun L23 solut pohjaan 96-kuoppaiset pyöreän pohjalevyn ja T-solujen sijoitetaan siirtoaltaat.

(E) Puhdistettu CD4

+ T-soluja inkuboitiin L23-solujen 4 h, kiinteät ja valmis elektronimikroskoopilla (EM). Skannaus (i) ja siirto EM (ii-iv) paljasti voimakkaan kontakteja. Lähetyksessä EM virtausta sytosoliin tehtiin näkyväksi elektroni tiheän sytosoliin lymfosyyttien jakaneen sivuston kontakteja kasvainsolun (nuolet (ii) ja (iii)). Korkein suurennus aukot solukalvojen voitiin havaita (nuolet iv). Aukot dehisced pituus jopa 200 nm sallii vapaan virtauksen sytosoliin ja liukoisten komponenttien, mutta ei solun rakenteita esim. mitokondrioita. Kuitenkin yhdistäminen mitokondrioiden alalla yhteyshenkilö muodostumisen saattavat viitata energiaa vieviä prosesseja.

(F) CD4

+ T-solut lajiteltiin inkuboinnin jälkeen CMFDA-leimatun lusiferaasi-transgeenisiä L23 soluissa vihreä-fluoresoiva ja ei-fluoresoivia T-soluja. 5×10

4 erotettu T-soluja viljeltiin sen jälkeen väliaineessa, jota oli täydennetty 100 ug /ml lusiferiini in 96-kuoppaiset pyöreäpohjaisessa levyille. Luminenssi arvioitiin 30 min inkubaation avulla IVIS analyysiä. 5×10

4 transgeenisiä L23 solut toimivat kontrollina luminesenssin intensiteetin.

Tulokset esitetään edustavina kuvia ja scatter-grammaa tai yhteenveto 4 erillisen kokeen keskiarvona ± SEM.

sillä fluoresoivia soluja käytettiin CellTracker Green (5-kloori-methylfluorescin diasetaatti [CMFDA]). CMFDA aluksi on ei-fluoresoiva molekyyli pystyy kulkemaan solukalvon. Vuonna elävää solua CMFDA pilkkoutuu fluoresoiva, voimakkaasti hydrofiilinen muoto rakentaminen vieviä vettä tuppi. Tämä averts julkaisunsa kautta ehjä solukalvon elävien solujen. CMFDA voidaan käyttää markkerina elinkelpoisuutta, koska siinä tapauksessa, että sytotoksisten lysis, leimatut solut tulevat ei-fluoresoiva häviämisen vuoksi CMFDA sisältävien sytosoliin [14]. Analyysin virtaussytometrialla on toteutettavissa, jos efek- ja kohdesoluja eroavat merkittävästi koon ja näin ollen voidaan erottaa eteenpäin-sivullepäin-hajonta (Kuva S1). Sen sijaan, että menetys fluoresenssin havaitsimme oton fluoresenssin lymfosyyttien jälkeen yhdessä viljelemisen kasvainsolujen kanssa PBMC: t ilmaisee siirto CMFDA molekyylien yhdestä solusta toiseen (kuvio 1A). Omaksumista Fluoresenssi lähes yksinomaan rajoitu T-soluihin, koska vain hyvin pieni osa CD3

– soluja tuli loisteputki. On huomioitava, että havaitut vuorovaikutus T-solujen kasvainsolujen tarvita mitään sivustakatsoja solujen esimerkkinä altistuminen erittäin puhdistettujen CD4

+ T-solujen L23 soluihin. Myös tämä asetus aiheutti selvä suhde vihreä-fluoresoivia soluja (kuvio 1A).

Koska piste blot osoittaa, tämä vuorovaikutus koski huomattava määrä T-solujen: Keskimäärin 20% CD4

+ ja 7% CD8

+ T-solujen joukossa suurin PBMC tuli vihreä fluoresoiva (kuvio 1 B). Tämä ilmiö voidaan selittää otto sytosoliin, joka sisältää CMFDA molekyylit yhdestä solusta toiseen. On huomionarvoista, että NK-solut ilmennyt merkkejä kerääminen loisteputki kasvain peräisin sytosoliin vaikka niillä voimakasta sytotoksista aktiivisuutta vastaan ​​L23 kasvainsoluja (kuva S2). Kuitenkin sytotoksisuus näyttää olevan järkevä selitys havaittu vaikutus. Testasimme mahdollisuutta sytotoksisuuden olevan vastuussa vaihdon sytosolin käsittelemällä PBMC kanssa strontiumkloridia (SRCL

2), reagenssilla, joka indusoi eksosytoosilla lyyttisen rakeiden [16]. Siten hoito SRCL

2 lähtee sytotoksisia soluja tehoton. Tästä huolimatta lymfosyyttien silti paljasti oton CMFDA (kuvio 1 C). Tämä selittää sekä CD4

+ ja CD8

+ T-solut, jotka on osoitus siitä, että sytotoksisuus ei ole aine vaihtoa sytosoliin. Todellakin, vaikka vain hieman havaitsimme kasvua fluoresoiva sopeutuminen jälkeen SRCL

2 hoitoa molemmissa populaatioissa T-solujen. Kuitenkin kontakti muodostuminen oli pakollista vaikutusta havaittu. T-soluja ja kasvainsoluja inkuboitiin joko yhdessä viljelemisen tai erotettu siirtoaltaat. Green loisteputki T-solut voisivat havaitaan vasta altistuu suoraan kasvainsoluihin mutta ei transwell kulttuureissa (kuvio 1 D).

Aukkoja solukalvon kasvainsolujen ja naiiveja lymfosyyttejä mahdollistaa siirron sytosolin kuten korkea molekyylipaino molekyylejä ja indusoivat T-solujen lisääntymistä

edelleen keskitettävä vuorovaikutuksesta CD4

+ T-solujen kanssa kasvainsoluja visualisoinnin kontakti muodostumista. Pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM) paljasti intensiivisempien solun koskettimet johtavat polarisaatio vuorovaikutuksessa kasvainsolun-lymfosyyttien kumppanit (kuvio 1 E i). Lisäksi siirto (TEM) osoitti, myös alhaisilla suurennuksella, virtaus elektroni tiheän sytosolin päässä T-solujen kasvaimeen solu, joka syntyi korkeimmalla suurennus on käytössä aukkoja solukalvon molempien kumppaneiden (kuvio 1E ii-iv). Nämä aukot laajennettu väliset alueet 100-200nm ja näin ollen pitäisi mahdollistaa siirron enemmän kuin vain alhaisen molekyylipainon komponentteja sytosoliin, myös ne molekyylit, joissa entsymaattinen toiminta on suuri molekyylipaino. Sen seurauksena kulkua 30 kDa proteiinin lusiferaasia arvioitiin yhdessä viljelemisen PBMCdden retroviruskäänteiskopioijaentsyy- transdusoituja lusiferaasin ilmentävien L23 soluja. Transdusoimattomia L23-solut leimattiin CMFDA ja T-solut erotettiin altistuksen jälkeen kasvainsoluihin erottaa vihreä fluoresoiva ei-fluoresoiva CD4

+ T-soluja. Puhdistetut T-solut seuraavaksi inkuboitiin lusiferiini arvioida entsyymiaktiivisuus. Todellakin, T-solujen oton CMFDA paljasti luminesenssin taas ei-fluoresoiva T-soluja olivat negatiivisia lusiferaasiaktiivisuuden (kuvio 1 F). Tämä osoitti selvästi siirto sytosolin liittyy vaihtamalla molekyylien jatkuva biologinen aktiivisuus vastaanottajan solussa. Näin ollen on kiinnostava seurata vaikutuksia kontakteja kumppaneiden jos sytosolin komponentteja säilyttää biologinen toiminto. Pohjimmiltaan teimme että hiirimallissa

in vitro

ja

in vivo

mutta löytyi tukevat tiedot myös ihmisen lymfosyyteillä ja sian syöpäsoluja.

erottaa loisteputki ja ei- fluoresoiva CD4

+ T-solujen altistamisen jälkeen CMFDA-leimattuja kasvainsoluja ja eristettyjä soluja viljeltiin ilman muita stimulaatiota väliaineessa 5 päivää. Löysimme lausutaan leviämisen näiden T-solujen kanssa sisällyttämällä Kasvaimen aiheuttamien sytosolin (kuva S3). T-solujen kasvu voidaan saada aikaan T-solureseptorin riippuvaisia ​​ja riippumattomia polkuja. On raportoitu, että T-solut sisäistää TCR altistuksen jälkeen anti-CD3 monoklonaalisen vasta-aineen (mAb), klooni OKT3 tietyissä olosuhteissa [17]. Näin ollen meidän on soveltanut protokollaa kokeissa ja tarkasti katoaminen TCR solun T-solujen pinnalla. Kuitenkin omaksumista fluoresenssi ei ole kumottu käsittelemällä. Lisäksi estää sian MHC II molekyylien kanssa mAb MSA-3 jäljellä tulosten sytosolin kuljetus lymfosyyttien ja kasvainsolujen lähes ennallaan. Viimeisenä mutta ei vähäisimpänä, sillä otto sytosolin lymfosyyttien ei tarvitse etukäteen aktivoitu. Naiivi T-solut paljasti kyky läpikäydä kontaktit kasvainsolujen vähintään samassa määrin kuin IL-2 aktivoitu tai x-kuvattiin L23 altistettu T-soluja (kaikki tiedot on esitetty kuviossa S3).

Exchange sytosolia ei rajoitu tiettyyn lajiin ja tyyppi kasvainsolujen

Siirtyminen hiirimallissa, käytimme erittäin aggressiivinen kasvainsolulinjasta BM185, eristetty BALB /c-hiirten, jotka kärsivät ALL [18], vahvistaa yleismaailmallisuuden havaittu yhteyksiä T-solujen ja kasvaimen soluihin. Laajennus hiirimallissa tarjoaa lisäksi mahdollisuuden

in vivo

todentaminen.

elektronimikroskopialla ja virtaussytometrialla analyysi vahvisti koskettimet ja siirtoa sytosolin välillä hiiren T-solujen ja BM185 soluja (kuvio 2A ja kuvio S4). Huomattavaa on, että toisin kuin ihmisen PBMC muun irtotavaran hiiren pernasolujen hyvin havaittavissa populaatio CD3

– soluja paljasti valmiudet toimia vuorovaikutuksessa kasvainsolujen johtaen sytosoliin pääsyä. Muita värjäys pernasolujen kanssa CD19 tunnistettiin väestön B-solujen portittamalla CD3

– soluja, jotka olivat lähes täysin CD19

+ (kuvio 2B), kun taas linjassa tuloksia käyttämällä ihmisen soluja, NK-solut eivät olleet mukana sytosoliin siirto (tuloksia ei ole esitetty).

(A) 2×10

6 pernasoluja inkuboitiin 2×10

6 CMFDA-leimattua BM185 solujen 4 h ja analysoitiin fluoresenssin oton T-solujen. Samoin ihmisen PBMC hiirimallissa paljasti vihreä-fluoresoiva CD4

+ ja CD8

+ T-soluja. Lisäksi hyvin havaittavissa vihreä fluoresoiva väestöstä, joka ulottuu T-solupopulaatio voitaisiin havaita pernasoluja.

(B) Värjäys pernasoluja CD3 ja CD19 altistumisen jälkeen kasvainsoluihin tunnistettu ei-T-solujen populaation kykeneviä sytosoliin ottoon B-solut.

(C) Tiivistelmä neljä itsenäistä inkubaation kokeita pernasolujen kanssa solujen eri solulinjoissa. BNL solut eivät ole kasvain johdettu taas muut linjat ovat syöpäsoluja.

(D) analyysi MHC II ilmentymisen vastaavien solulinjojen BM185, KLN-205 ja BNL CL.2. Ilmentymisen taso ei korreloinut lopputulokseen sytosolin siirron.

(E) Toisin kuin ennallaan CD4

+ T-solut (CMFDA

-), CD4

+ T-solut paljastava saantitiet kasvaimen aiheuttamien sytosolin (CMFDA

+) osoitti merkkejä mukainen aktivointi lisääntyneen ilmentymisen CD25 ja varhaisen aktivoinnin CD69 taas CD62L hieman vähentynyt. Soluja inkuboitiin kuten edellä on kuvattu (A) ja sitä seuraava värjäys CD4-T-solujen ja aktivaatiomarkkereita. Rakenteessa aktivointi oli erilainen stimulaatio 2 ug /ml ConA.

(F) leviämisen analysointi 1×10

4 puhdistettiin T-solut paljasti CMFDA otto 4 h altistuksen pernasolujen merkittyjen BM185 soluihin. Tarkastusta puhdistettuja CD4

+ T-solujen naiivi hiiret viljeltiin väliaineessa, koska se suoritettiin lajitellut T-solujen 4 päivää ja vielä 16 h

3H tymidiiniä ennen szintilization.

Tulokset esitetään edustavina scatter-g tai yhteenveto vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen keskiarvona ± SEM.

Yleisesti, hiiren T-soluja oli vähemmän selvä taipumus häiritä kasvaimen soluja verrattuna ihmisen T-soluja. Vaikka L23 solujen vain keskimäärin 10% CD4

+ T-solut tuli vihreä fluoresoiva ja tämä yhdistettynä erittäin korkea keskihajonta. Kuitenkin L23 soluista, jotka indusoitiin korkeimmat ottoa CMFDA (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi muut hiiren solulinjat mukaan lukien KLN-205 keuhkokarsinooma solut, alkion BNL CL.2 maksasoluissa, mastcytoma solut P815, J558L B-solujen myeloomasolujen, C1498 myeloidinen kasvainsoluja ja maksan kasvainsolulinjat HEPA-1C1C7 ja HEPA 1-6 testattiin. Lukuun ottamatta BNL soluja, vaihtelee, mutta hyvin havaittavissa CMFDA siirto eri kasvainsolujen havaittiin (kuvio 2C). Mielenkiintoista, vaikka pysyvästi jakamalla, BNL CL.2 soluja ei pidetä klassisen kasvainsoluissa [19]. Vastus BNL CL.2 soluja, tarjosi myös hiirimallissa mahdollisuuden vahvistaa TCR itsenäisyyden ja kasvainspesifisyys vaikutuksen. Olemme arvioineet tasoja MHC II ilme eri solulinjoissa. Kävi ilmi, että BM185 ja BNL CL.2 ilmaisi korkeatasoinen MHC II taas KLN-205-solut olivat täysin negatiivisia MHC II (kuvio 2D). Siten TCR /MHC vuorovaikutus ei näytä olevan pakollista vaihtoa sytosoliin. Tätä korostetaan myös siirtämällä sytosolin havaittu B-solujen ja kasvaimen soluihin. Lisäksi olemme suoritettiin kokeita käyttäen hemagglutiniini (HA) -transduced BM185 solujen ja verrataan tulokset sytosoliin siirron altistuksen jälkeen villityypin (wt) BALB /c ja siirtogeenisten 6,5 hiirissä. 6,5 hiiri on ominaista väestöstä noin 20% CD4-T-soluja, jotka ilmentävät HA-spesifisiä TCR. Molemmat kannat paljasti taipumus lisätä solujen frekvenssi osoittaa vaihdon sytosolin altistumisen jälkeen BM185-HA verrattuna BM185 soluihin. Kuitenkin, pernasoluja, jotka ovat peräisin 6,5-hiiret eivät osoittaneet kasvua taajuuden solujen osoittaa vaihdon sytosolin kanssa HA-siirtogeenisten BM185 soluissa (kuvio S5).

Sen jälkeen, kun altistus kasvainsolujen T-solut osoittivat ensimmäisiä merkkejä aktivoinnin. Inkubointi pernasolujen kanssa BM185 johti säätely ylöspäin aktivoinnin markkereita CD25 ja CD69 ja marginaalinen muuttaminen ilmentymisen CD62L T-soluissa paljastaen otto Kasvaimen aiheuttamien sytosolin taas T-soluja ilman mukauttamisvelvollisuus fluoresenssi osoitti ekspressiotasoja aktivaatiomarkkereiden verrattavissa keskipitkän inkuboidaan lymfosyyttejä (kuvio 2E). Havaitut tasot CD25 keskipitkän inkuboidaan ja CMFDA

– T-solujen johtui konstitutiivista CD25 ekspressiota säätelevien T-solujen siten nousivat yli Tätä taustaa oli merkkejä aktivointia. Arvioitu T-solujen aktivaation yhdistetään leviämisen lymfosyyttien kuten voitiin havaita ihmisen T-solujen kanssa vuorovaikutuksessa L23-soluja (kuvio 2F).

Tunnistettava siirtäminen sytosolin in vivo

todentaminen sytosolin siirto

in vivo

on suuresti kiinnostavista sulkea pois sitä mahdollisuutta, että sytosoliin vaihto on vain johtuu

in vitro

artefakti. Näin ollen, CMFDA-leimattuja BM185 soluja injektoitiin suonensisäisesti (i.v.) BALB /c-hiiriä ja hiiret tapettiin 6 h jälkeen. Tämän jälkeen perna, imusolmukkeet ja luuydin tarkastettiin BM185 soluja, mutta vain pernassa voi lukuisia kasvainsolujen havaitaan (tuloksia ei ole esitetty), joka yhdistettiin ulkonäkö vihreä fluoresoiva CD4

+ T-soluja (kuvio 3A) . Mukaisesti

in vitro

tuloksia, myös

in vivo

lymfosyyttien kanssa affiniteetti sytosolin oton voisi löytyä populaatioiden CD8

+ T-solut ja B-solut (kuvio 3B ).

(A) 1×10

7 CMFDA-leimattua BM185 injektoitiin suonensisäisesti. 6 h kuluttua hiiret tapettiin ja perna, imusolmukkeet ja luuydin homogenisoitiin. 5×10

7 solut värjättiin CD4 ja laskettiin virtaussytometrillä ja osuus vihreä fluoresoiva lymfosyyttien arvioitiin.

(B) arviointi fenotyypin vihreä-fluoresoiva pernasolujen 6 h kuluttua i.v. soveltaminen 1×10

7 CMFDA-leimatun BM185. Lisäksi CD4

+ ja CD8

+ T-solut, myös

vivo

B-solujen (B220

+ solut) paljasti CMFDA ottoa.

tulokset esitetään edustavina scatter-g 3 itsenäisen kokeen.

Tuumorisolut lopettavat lisääntyvissä oton jälkeen T-solun peräisin sytosoliin, joka johtaa pidentyneeseen eloonjäämiseen hiirillä

virtaus sytosolia ole yksisuuntainen tie, mutta voidaan havaita molempiin suuntiin. Siten, ei vain T-solujen tuli vihreä fluoresoiva altistumisen jälkeen CMFDA-leimattujen tuumorisolujen lisäksi myös osuus kasvainsolujen tuli vihreä fluoresoiva inkuboinnin jälkeen CMFDA-leimatun lymfosyyttien (kuvio 4A). Voit seurata siirtoa lymfosyyttien johdettujen sytosolin BM185 solut leimattiin CellVue Maroon, väriainetta, joka on sisällytetty lipidi alueilla kalvoja korostetun huomautus valmistajan minimaalista epäspesifisen kuljetus soluihin. Altistamalla CellVue-leimattuja kasvainsoluja lymfosyyttejä pystyimme havaitsemaan positiivisen fraktio CellVue indusoitu fluoresenssi CD4

+ T-solujen ilmaisee siirto osien solukalvon kasvaimen solujen lymfosyyttien pinnalla (kuvio 4B ). Tämä on vakuuttava validointi vaikutelman solukalvojen fuusiota osoituksena TEM (kuva 2 ja kuva S4).

(A) BM185 solu leimattiin CellVue erottaa väestön kasvainsolujen CMFDA-leimatun lymfosyyttejä. Kasvainsolut ja pernasoluja inkuboitiin yhtä monta 4 h ja otto CMFDA arvioitiin virtaussytometrialla. Myöhemmin, BM185 erotettiin solulaji ei-fluoresoiva ja fluoresoivien solujen.

(B) arviointi siirto kalvon komponenttien CellVue merkitty BM185 lymfosyytteihin altistuksen jälkeen solujen annos 1: 1 4 h. CellVue sisältää lipidi- alueille solukalvojen.

(C)

3H tymidiinin sisällyttämisen BM185 solujen altistetaan CMFDA-leimatun pernasoluja BALB /c- ja myöhemmin erottaa FACS solulaji kasvainsoluissa jotka vaihtoivat sytosoliin hiirellä lymfosyyttien (CMFDA

+) tai jotka pysyivät muuttumattomina (CMFDA

-). Soluja viljeltiin 3 päivää 96-kuoppalevyille ja 16 h lisäämisen jälkeen radioaktiivista tymidiiniä.

(D) Survival käyrä BALB /c-hiirillä i.v. injektio 1×10

4 BM185-soluja (5 hiirtä ryhmää kohti /koe, selviytymisen käyrä esittää kaksi erillistä koetta, jolloin n = 10) kanssa tai ilman ottoa CMFDA altistumisen jälkeen CMFDA-leimatun hiiren pernasolua. Aikana BM185 esiin leukemia on hyvin toistettavissa. Selviytymisen BM185 soluja ilman ottoa lymfosyyttien peräisin sytosolin vastaa täysin tämän tunnetun laskua viablitiy. Sitä vastoin hiirillä ruiskutetaan BM185 sisällytetty pernasolujen johdettu sytosoliin selvisivät merkitsevästi pidempi (p ≤ 0,0042).

Tulokset esitetään edustavina scatter-grammaa tai yhteenvedon 2-4 itsenäisen kokeen keskiarvo ± SEM.

erotetaan BM185 solujen fluoresoiva ja ei-fluoresoiva altistuksen jälkeen hiiren pernasoluissa . Eristetty kasvain soluja viljeltiin 4 päivän ajan jälkikäteen arvioida

3H-tymidiinin. Yllättäen on romahduttanut leviämisen BM185 solujen imeytymisen jälkeen lymfosyyttien peräisin sytosolin voitiin mitata (kuva 4C). Tämä oli vain väliaikaista keskeyttämistä solusyklin. 7 päivää viljelyn paljasti hyvin havaittavissa leviämisen jopa kasvaimen solut, jotka tehtiin siirto sytosolia (tuloksia ei ole esitetty).

tauko kasvaimen solunjakautumisen saattaa olla mahdolliset seuraukset selviytymiselle BALB /c-hiirissä. Huomattavaa on, että BM185 solut ovat erittäin pahanlaatuisten aiheuttaa aggressiivista aikana ALL. Jopa pieni annos 10

4 solut johtaa kuolemaan 20 päivän kuluessa. BM185 solut, jotka näyttivät ei-fluoresoiva altistumisen jälkeen pernasolujen paljasti erittäin toistettavan aikana kuolleisuutta. Sitä vastoin, hiiret injektoitiin BM185, joka sisälsi sytosoliin pernasoluista selviytyi merkittävästi (p ≤ 0,0042) pidempi ja 20% hiiristä (kahdella kymmenestä) jopa selviytyi kasvainsoluja (kuvio 4D).

T-soluja vaihtamaan sytosoliin nimenomaan kasvainsolujen muttei terveitä soluja

Ongelma on edelleen: Onko tämä yksinomainen vuorovaikutusta T-solujen kanssa kasvainsolujen? Ja, jos näin on vaikutus rajoittuu kasvainsolulinjoja vai primaarikasvaimen solut myös aiheuttaa tämän ilmiön? Jälkimmäinen kysymys on kiinnostava, koska sytosolin siirto primaarikasvaimen solut vahvistaa kliinistä merkitystä erityinen, kun otetaan huomioon, että immuunijärjestelmä aktivoituu solun yhteyksiä kasvainsolujen ja kasvaimen paljastaa säilöönottotilaa in solunjakautumista.

kuten suoritettiin hiiren pernasolujen, kokeet toistettiin altistamalla eri kasvainten solulinjat ihmisen PBMC. Valitsimme BM185 soluja ylimääräisenä ksenogeneeisissä kasvainlinjaan, ihmisen B-solulymfooma-solujen ja maksan kasvainten HepG2. Verrattuna L23 soluihin vaikutus oli vähäisempää kaikilla testatuilla solulinjoilla. Kuitenkin selkeä otto sytosoliin CD4

+ T-solujen jälkeen yhdessä viljelemisen kaikki kasvainsolulinjoja voitiin havaita (kuvio 5A). Mielenkiintoista, BM185 solut myös indusoituu ihmisen PBMC sovittamista fluoresenssin 5% CD4

+ T-solujen irtotavarana PBMC aivan kuten hiiren syngeneeisissä pernasolua. Siten erilliset vaihtoa sytosolin kanssa L23 soluja ei voida selittää pelkästään ksenogeenisten asetus.

(A) Altistuminen PBMC eri CMFDA-leimatun kasvainsolulinjoja myös ksenogeenisten sian L23-solujen ja hiiren BM185 solut sekä ihmisen B-solulymfooma T5.1 ja Laz, Jurkat-T-solulinja ja maksasyöpä soluja HepG2. Kaikilla testatuilla kasvainsolulinjoilla siirto sytosolin arvioitiin. Sen sijaan ihmisen PBMC altistunut terve CMFDA-leimatun PBMC samalta verenluovuttajien (syngeenisiä) tai erilaiset verenluovuttajien (allogeeninen) ei osoittanut sovitus fluoresenssin.

(B) Ensisijainen hepatosyyttien peräisin terveessä kudoksessa tai HCC ja HepG2-soluja viljeltiin 3 päivää kammiossa diat saada löysä solukerroksen. Hepatosyytit leimattiin CMFDA ja inkuboitiin 5×10

5 PBMC 4 tuntia. Solut kiinnitettiin ja ilmakuivattiin myöhempien värjäytymisen CD4 (red; ainoastaan ​​HCC ja HepG2) ja nucleus (sininen). Mikroskopia paljasti oton vihreän fluoresenssin lymfosyyttien vain, jos se altistetaan syöpäsoluja. Muihin värjäys CD4 vahvisti, että jotkut osallistuvat solut ovat CD4

+ T-soluja.

Tulokset esitetään edustavia kuvia ja scatter-g tai yhteenvedon 3 itsenäistä koetta keskiarvona ± SEM (paitsi (B ), joka tiivistää vähintään 6 koetta).

Näin kasvainsoluja aiheuttama vaihtoa sytosoliin. Valvoa, jos tämä vaikutus oli spesifinen kasvainsolujen ihmisen PBMC inkuboitiin CMFDA-leimatun allogeenisen PBMC tai autologisia PBMC peräisin terveistä verenluovuttajien. Emme löytäneet oton CMFDA vertailukelpoisia, kun kasvainsoluja käytettiin (kuvio 5A). Huomattavaa on, että splenosyytit Lewis-rotilla kasvatettu tietyissä-taudinaiheuttajista vapaat (SPF) olosuhteissa ei provosoida sopeutuminen fluoresenssin ihmisen PBMC, liian (tuloksia ei ole esitetty).

sulje pois sitä mahdollisuutta, että tämä vaikutus johtui kasvainsolulinjojen joita usein aiheuttama ja stabiloidaan virukset (kuten L23 soluja, [20]) primaarikasvaimen solut ovat peräisin ihmisen HCC viljeltiin allogeenisten PBMC. Koska olemme sulkenut pois mahdollisuuden sytosolin kuljetus allogeenisen luovuttajan solujen, havaitut vaikutukset tulkitaan liittyvän kasvaimen soluihin. Käyttäen jektiomikroskooppitekniikan voimakas otto CMFDA altistuksen jälkeen PBMC on HCC-soluissa oli nähtävissä. Kontrollina, terveen ensisijainen ihmisen hepatosyyttien inkuboitiin PBMC: t, jotka eivät indusoi siirron fluoresenssin (kuvio 5B).