Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kohdunkaulan syöpä (CC) aiheuttaa korkean riskin ihmisen papilloomaviruksen pysyvyys johtuen immunosuppressiivisten kasvain microenvironment välittämää sytokiineja. Emättimen mikrobiston määrittää läsnäolo tiettyjen sytokiinien paikallisesti. Olemme arvioineet yhteydestä kohdunkaulan mikrobiston monimuotoisuutta sekä histopatologinen diagnoosi jokaisessa vaiheessa CC, ja arvioimme mRNA kohdunkaulan ekspressiotasot IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α ja IFN-γ poikki histopatologisen diagnoosi ja tiettyjä bakteerien klustereita. Selvitimme kohdunkaulan mikrobiston korkea suoritusteho sekvensoinnilla 16S rDNA amplikonien ja luokiteltu sen yhteisössä tilassa tyypit (CST). Keskimääräinen ero analysoi välillä alfa-monimuotoisuus ja histopatologisia diagnoosi tehtiin, sekä β-monimuotoisuus analyysi sisällä histologista diagnoosia. Kohdunkaulan sytokiinien mRNA ilmentyminen analysoitiin poikki erästä ja histopatologisen diagnoosit. Löysimme merkittävä ero mikrobiston n monimuotoisuuden NCL-HPV negatiivinen naiset vs joilla levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisten leesioita (SIL) ja CC (p = 0,006, p = 0,036) .Kun β-monimuotoisuus arvioitiin, CC näytteet osoittivat korkeimmat vaihtelua ryhmät (p 0,0006) ja suurin etäisyys verrattuna NCL-HPV negatiivisia (p 0,00001). Hallitseva bakteerit naisilla, joilla oli normaali sytologia olivat

L

.

crispatuksen

ja

L

.

iners

, kun taas SIL, se oli

Sneathia spp

. ja CC,

Fusobacterium spp

. Löysimme korkeampi mediaani kohdunkaulan tasoja IL-4 ja TGF-β1 mRNA CST hallitsee

Fusobacterium spp

. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kohdunkaulan mikrobiston voi kohdistua kohdunkaulan syövän patologia. Edelleen kohortti tutkimuksia tarvitaan vahvistamaan näitä havaintoja.

Citation: Audirac-Chalifour A, Torres-Poveda K, Bahena-Román M, Téllez-Sosa J, Martínez-Barnetche J, Cortina-Ceballos B, et ai . (2016) Kohdunkaulan Microbiome ja sytokiiniprofiili eri vaiheissa kohdunkaulan syövän A Pilot Study. PLoS ONE 11 (4): e0153274. doi: 10,1371 /journal.pone.0153274

Editor: Maria Lina Tornesello, Istituto Nazionale Tumori, ITALIA

vastaanotettu: 04 joulukuu 2015; Hyväksytty 25 maaliskuuta 2016 Julkaistu: 26 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Audirac-Chalifour et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki Instituto Nacional de Salud Pública, Meksiko ja avustukset Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (MX) (CONACYT) Fondo syyskuu CB -2011-01-169552, CONACyT-Fondo E0013 apoyo COMPLEMENTARIO CATEDRAS-2014-C01-245520 ja CONACyT-FONSEC SSA /IMSS /ISSSTE-2014-C01-234149, Meksiko. Audirac-Chalifour ansiosta Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) MSc apurahan 2976418945. K Torres Poveda on CONACyT Research Fellow-Instituto Nacional de Salud Pública (INSP), Cuernavaca, Morelos, Meksiko.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä (CC) on neljänneksi yleisin syöpä naisilla ja seitsemäs yleistä maailmanlaajuisesti, arviolta 485 000 uutta tapauksia ja 236 000 kuolemantapausta vuonna 2013. CC aiheutti 6,9 miljoonaa vamma-elinvuotta (DALY) vuonna 2013 [1], ja se oli toiseksi yleisin kuolinsyy syöpä keskuudessa Mexican women vuonna 2011 (10,4%) [2 ]. CC aiheuttaa pysyvä infektio korkean riskin ihmisen papilloomaviruksen (HR-HPV). Kuitenkin HR-HPV-infektio pidetään välttämätön mutta ei riittävä syy CC kehittämiseen [3]. Mekaaninen tekijät, kuten emättimen douching tai yhdynnän, ja biologiset tekijät, kuten bakteerivaginoosi (VB) [4, 5], tai sukupuolitaudeista (sukupuolitaudeilta) [6] muuttaa emättimen microenvironment ja on tunnistettu kofaktoreita pysyvyys HPV-infektio [7].

suurin osa HR-HPV-infektion saaneiden naisten ei kehity CC koska riittävä immuunivaste kykenee ohjaamaan tartunnan ja estää sen etenemistä precancerous vaurion [8]. Tämä viittaa siihen, että lisätekijöitä toimivat yhdessä HPV vaikuttaa riskiä CC kehitystä. Tähän mennessä seuraavat determinantti keratekijöitä on liitetty ulkonäön CC: yhteiskunnallis-ympäristötekijät (kulttuurirajojen, äärimmäinen köyhyys, huono sanitaatio alueilla, ja rajoitettu pääsy terveydenhoitoon) [9], epidemiologiset tekijät (multiparity, käyttö ehkäisytablettien yli viisi vuotta, useita seksikumppaneita ja tupakointi) [10, 11], ja geneettiset tekijät liittyvät isännän (polymorfismien immuunivasteen geenejä, jotka määräävät puutteellinen immuunivaste ja paikallisen immunosuppression) [12- 14] . Siksi CC on monimutkainen monitekijäinen sairaus, ja tarvitaan lisätutkimusta jotta voidaan paremmin ymmärtää sen etiologiassa.

Se on hiljattain ehdotettu, että epänormaali emätin mikrobiston on tärkeä rooli kehitettäessä kohdunkaulan kasvainta [15] . Epidemiologinen tutkimus tunnistaa

klamydia

toisena tekijä CC kehittämiseen [16]. Myös muut tutkimukset osoittavat, että jotkut bakteerilajit näyttävät liittyvän kehittämistä muiden syöpien, kuten paksusuolen syöpä; nämä tutkimukset viittaavat myös siihen, että eri bakteerilajit valikoivasti asuttavat tuumorikohdat [17, 18].

on edelleen useita aukkoja tietämyksen yhdistyksen välillä emättimen ja kohdunkaulan microbiomes ja CC kehittämiseen [19]. Bakteerien kulttuuri-pohjainen näyttö osoittaa, että joitakin mahdollisuuksia pro-onkogeenisen taudinaiheuttajia, jotka voivat olla jäseniä pieneliöstöön, edistää kasvaimen aloittamista ja kehittämistä [20, 21].

CC on pitkäaikainen sairaus, ja siellä ovat vaiheita ennen sitä, jonka aikana ehdot kohdunkaulan ja emättimen ympäristö muutetaan, kuten emättimen happamuus ja sytokiinien kuvio, joka johtaa paikallisen immunosuppression tilassa. Läsnäolo Maitohappobakteerien, matalan emättimen pH ( 4,5) ja antimikrobiset peptidit ovat osa suojamekanismit läsnä emättimen mikroympäristössä [22]. Kun epätasapaino puolustusjärjestelmää tapahtuu, fysikaalis muutoksia syntyy ja tuottaa histologiset muutokset emättimen limakalvon ja kohdunkaulan epiteelin, jotka kaikki edellytykset selektiivinen painetta mikrobiston [23]. CC-mikroympäristön, läsnäolo immunosuppressiivisten sytokiinien (TGF-SS1, IL-10) suosii persistenceof HPV-infektion hoitoon [24, 25, 26, 27]. Useimmissa tutkimuksissa naisen sukuelimet microbiome on suoritettu emättimen tasolla ja muutamia tutkimuksia liittyy kohdunkaulan mikrobiston ja sytokiinien profiileja. Vertaileva genominen analyysi emättimen microbiome on tunnistettu muutokset mikrobiston monimuotoisuutta naisten sukupuolielinten ihmisen immuunikatovirus (HIV) infektion kanssa tai ilman bakteerivaginoosi (BV) [28] ja raskaana olevilla naisilla [29]. Lisäksi on ehdotettu, että emättimen mikrobien ekosysteemin ja sytokiiniprofiilin rooli edistämisessä kohdunkaulan dysplasia [30], sillä epänormaali emätin mikrobiston on liittynyt hankintaan HPV-infektion [31]. Kuitenkin vain harvat tutkimukset on suoritettava kohdunkaulan microbiome kuin muokkaaja HPV luonnonhistorian suhteen kehittymistä kohdunkaulan solumuutoksia ja kohdunkaulan kasvain [32].

Kun otetaan huomioon, että se on osoittanut, että tiettyjä lajeja servikovaginaalisten mikrobiston muuntaa tulehdusreaktiota immuunivastetta naisten sukuelinten terveiden musta Etelä-Afrikkalainen naiset [33], on mahdollista, että kohdunkaulan microbiome on mukana edistämään ilmentymistä immunosuppressiivisten sytokiinien [34] Meillä on arveltu, että HPV-infektio ja kehittäminen SIL ja CC liittyy muutoksiin mikrobiston monimuotoisuutta sekä sytokiiniekspressiota kuvioita kaularangan tasolla. Meidän tutkimuksessa selvitettiin yhdistyksen välillä kohdunkaulan mikrobiston monimuotoisuuden ja koostumus, erään histopatologinen diagnoosi jokaisen vaiheen Natural History CC, ja kohdunkaulan ekspressiotasot IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF -α ja IFN-γ mRNA.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimusasetelma ja väestön

poikkileikkaus tutkimus suoritettiin käyttäen näytteitä biologisesta pankin rakennettiin vuosina 2008 ja 2011 uudesta diagnosoidusta squamous intraepiteliaalisten leesioita (SIL) (n = 268 HPV-positiivista näytettä); naiset negatiivisella Papanicolaou ja normaali kolposkopia kontrolleina (n = 205, 81 HPV-negatiivinen ja 124 HPV-positiivista näytettä), rekrytoidaan naisten terveyskeskus osavaltiossa Morelos (

Centro de Atención para la Salud de la Mujer del Estado de Morelos

) Meksikossa välillä kesäkuussa 2008 ja marraskuussa 2011 ja kohdunkaulan okasolusyöpä tapauksissa (n = 171 HPV-positiivista näytettä), rekrytoidaan synnytysten Service National Cancer Institute (Inkojen) Mexico City, syys 2010 joulukuussa 2011. bioetiikan ja tutkimus komiteoiden Inkojen (viitenumero. Inkojen /CC /326 /10CB /609) ja National Institute of Public Health (

Instituto Nacional de Salud Pública

-INSP; viitenumero: CI814) hyväksyi perustason tutkimus, jonka aikana biologinen pankki on rakennettu. Lisäksi kaikki osallistujat antoivat tietoisen suostumuksensa käyttämään biologisia näytteitä edelleen tutkimuksia. Jokainen aihe haastateltiin elämäntapa, sosiodemografisiin ja lisääntymiseen liittyvien tekijöiden tiedetään liittyvän lisääntynyt riski CC [12].

Menetelmiä mukavuutta, valitsimme 32 tapausta tähän tutkimukseen, ei kohdunkaulan solumuutoksia (NCL : n = 10 HPV-negatiivinen; n = 10 HPV-positiiviset), SIL (n = 4 HPV-positiiviset) ja CC (n = 8 HPV-positiivisia). Inclusion kriteerit osaotoksessa valinnan liittyvä sairaushistoria olivat: potilaan rekrytointi samana päivänä kuukautiset (seitsemän siir- tyminen kuukautiset päivää), ei-käytön douches eikä yhdyntää edellisinä päivinä näytteenoton. Lisäksi ei ole kirjattua antibioottia tai antifungaalisen käytettäväksi viimeisten 30 päivän ennen näytteenottoa. Muita sisällyttämiskriteerit sisältyvät: molekyylitason HPV + diagnoosi; DNA: n ja RNA: n puhtaus ja eheys sopii sekvensointi ja määrällisesti mRNA qRT-PCR, ja on Meksikon Meksikon vanhempien ja isovanhempien varmistaa samanlaisia ​​syntyperä. Ainoa syrjäytyminen perustetta ei ole riittäviä lukee. ”Me pidetään 1 000 kynnyksenä, suorittamisen jälkeen bioinformatiikan sekvenssianalyysillä. Tutkittua populaatiota sosiodemograafiset ja lisääntymis–seksuaalinen ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Kaikki oppiaineista oli Meksikon naiset, joiden ikä vaihteli 22-61 vuotta. Oli merkitsevä ero ryhmien välillä koskien ehkäisymenetelmää ja positiivinen HPV-testiä. CC potilaista ei ilmoittanut ehkäisymenetelmien käyttö useammin kuin NCL potilailla. Mitä SIL tapauksissa yleisin HPV-genotyyppien olivat HR-HPV (ei-HPV16 tai 18), kun taas joukossa CC potilaiden yleisin genotyyppi oli HPV 16.

Ominaisuudet biologisten näytteiden pankki

otettiin näytteitä naisten kohdunkaulan seitsemän päivää sen jälkeen kuukautiset peruuttamisen. Biologinen Pankki käytetty tässä tutkimuksessa koostuu DNA-näytteiden ja cDNA uutetaan kohdunkaulan epiteelin kaapimalla pyyhkäisynäytteeseen naisista diagnosoitu NCL ja tuoreesta solujen koepalat naisista diagnosoitu SIL ja CC. Genominen DNA uutettiin kohdunkaulan epiteelin kaavituista ja koepaloja aiemmin digestoitiin proteinaasi K: käyttäen genomista DNA: Purification Kit (Fermentas Life Sciences, Vilna, Liettua). Kaikki mahdolliset ryhdyttiin toimenpiteisiin ristikontaminaation välttämiseksi näytteiden aikana DNA: n uuttaminen. DNA pitoisuuden ja puhtauden arvioitiin Thermo Scientific NanoDropTM 1000 spektrofotometri (260/280) ja DNA eheys määritettiin elektroforeesilla agaroosigeeleillä 1%. Kokonais-RNA eristettiin kohdunkaulan näytteistä käyttämällä Trizol-reagenssia Invitrogen. cDNA-synteesi suoritettiin, kun läsnä oli 200 U M-MLV käänteistranskriptaasia ja 2,5 ug kokonais-RNA: ta käyttäen tavanomaisia ​​olosuhteita. PCR-reaktiot suoritettiin reak- tiotilavuudessa 25 ui, joka sisälsi 1 ui cDNA: ta, 0,2 mM dNTP: itä, 15 pmol kutakin aluketta, 2,5 ui reaktiopuskuria and1U Taq DNA-polymeraasia rekombinantti. Alukkeet ihmisen taloudenhoito glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin GAPDH (450 pb) käytettiin tarkistaa cDNA eheyden.

Kohdunkaulan näytteet testattiin aiemmin HPV. Virus-DNA-fragmentit näytteistä monistettiin PCR: llä käyttämällä konsensus-alukkeita MY09 /MY11 [35], LIC1 /LIC2 [36], ja GP5 /GP6 [37], jotka reunustavat L1 alueella HPV kapsidin. PCR-monistus GAPDH (556pb) käytettiin sisäisenä kontrollina DNA laatua. Solulinjat ilmentävät HPV-16 (SiHa) ja HPV-18 (HeLa) käytettiin positiivisina verrokkeina. Deionisoidulla H

2O toimi negatiivisena kontrollina. Kaikki tuotteet analysoitiin elektroforeesilla akryyliamidigeeleillä 6%. Positiiviset näytteet visualisoitiin agaroosigeelissä 1,5%. DNA-vyöhyke, joka uutettiin ja puhdistettiin kanssa MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) ja sekvensoitiin käyttäen Sangerin menetelmää. HPV-sekvenssit analysoitiin BLAST. HPV luokiteltiin mukaan sen fylogeneettiseen malleja osaksi matalan ja korkean riskin tyyppejä: HPV16 ja HPV18. HPV asema vahvistettiin kanssa Anyplex

TM II HPV HR Detection -määritystä Seegene

®, jotka perustuvat multiplex reaaliaikaisia ​​PCR, TOCE ja DPO alukepareja tekniikka, mukaan toimittajan ohjeiden. [38]

Ethics selvitys

Tämä tutkimus suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Se hyväksyi Research, etiikka ja Biosafety komiteat INSP (CI: 1143). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta.

Analyysi kohdunkaulan sytokiinien mRNA: n ilmentymisen

qRT-PCR-monistus suoritettiin kahtena varten geenien ilmentymisen analyysin seuraavien Taqman: GAPDH (ID -Hs99999905_mL), IL-4 (ID-Hs00174122_mL), IL-6 (ID-Hs00174131_mL), IL-10 (ID-Hs00961622_mL), TGF-β1 (ID-Hs00961622_mL), TNF-α (ID-Hs00174128_mL) ja IFN -γ (ID-Hs00174143_mL). Vahvistusta seos valmistettiin lisäämällä 100 ng kutakin cDNA näytteen lopulliseen reaktioseokseen 10 ui, joka sisälsi 5 ui TaqMan PCR Master Mix ilmentämiseen, 0,5 ui koetinta ja 3,5 pl DNaasi-vapaa molekyyli- luokan vettä. Vahvistus sykliä (suoritetaan StepOnePlus ™ Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) olivat seuraavat: 94 ° C: ssa 10 minuuttia, 40 sykliä 94 ° C: ssa yhden minuutin ajan, 54 ° C yhden minuutin ajan, 72 ° C yhden minuutin ajan ja 30 sekunnin ajan, minkä jälkeen 72 ° C: ssa 15 minuuttia. GAPDH käytettiin normalisoimaan määrä IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1: n, TNF-α: n ja IFN-γ-mRNA: n, joka on läsnä näytteessä [39]. Perifeerisen veren mononukleaariset solut stimuloitiin fytohemagglutiniinilla 72 tuntia määrittämiseen käytettiin dynaamisen alueen käyrät IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1: n, TNF-α: n ja IFN-γ ilmaisu; kaikki vakio käyrät toteutuivat kolmena kappaleena. Ilmentymisen mRNA-tason kullekin cytokin estudied laskettiin käyttäen suhteellisen kvantifioinnin suhteellisten Ct (2-ACt) menetelmällä, kun GAPDH kuin endogeenisen geenin. Näytteet analysoitiin kahtena kappaleena.

Suurikapasiteettinen sekvensointi 16S rDNA amplikonien

Amplikonit on ~ 456 bp: n, joka sisältää V3-V4 vaihtelevia alueita 16S rRNA-geenit saatiin DNA kirjastot valmistamiseksi. Alukkeita 347F Forward 5′-GGAGGCAGCAGTRRGGAAT-3 ’ja 803R Reverse 5′-CTACCRGGGTATCTAATCC-3’, on kuvattu Nossa, käytettiin [40]. Ensimmäinen PCR suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 50 ng templaatti kustakin DNA-näytteestä lisättiin lopulliseen reaktioseokseen 30 ui, joka sisälsi 1 x reaktiopuskuria, 2,5 mM MgSO

4, 1 mM dNTP: tä, 0,2 U Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) ja 5 pmol /ui alukkeiden. Vahvistus ohjelma oli seuraava: 94 ° C: ssa 3 minuuttia, sitten 30 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 55 ° C 30 sekuntia, 68 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, minkä jälkeen 68 ° C: ssa 5 minuuttia. Amplikonit visualisoitiin elektroforeesilla agaroosigeelissä 1%. DNA-nauhojen saatu puhdistettiin MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Saksa).

Amplikonit oli monistettiin uudelleen ja niitä käsitellään samoja alukkeita liittyy sovitin A 454 sekvensointi protokolla, jota seuraa 6- mer multiplex tunniste ja alukkeen 347F. Käänteinen aluke oli sama kaikille reaktiot liittyvät adapteriin B 454 sekvensointi protokollaa. Reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: 0,0625 ng kutakin DNA-näytettä lopulliseen reaktioseokseen 30 ui, joka sisälsi 1 x reaktiopuskuria, 2,5 mM MgSO

4, 1 mM dNTP: tä, 0,2 U Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) ja 5 pmol /ul aluketta 347F ja 803R. Monistussykliä olivat seuraavat: 94 ° C: ssa 3 minuuttia, sitten 15 sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 55 ° C 30 sekuntia, 68 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, minkä jälkeen 68 ° C: ssa 5 minuuttia. Geelielektroforeesi suoritettiin agaroosigeelissä 1,5% visualisoida eheyden monistetut tuotteet. DNA-fragmentit puhdistettiin MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) ja myöhemmin määrittää ja arvioida. Amplikonit yhdistettiin kahdeksassa kirjastoissa ja sekoitetaan ekvimolaarinen tavalla. Tämän jälkeen kirjastot puhdistettiin Ampurebeads XP (Beckman Coulter, Inc.). Emulsio PCR titraus ja tuoton laskeminen jälkeen suoritettiin määrittämään Helmien tilavuus ladataan sekvensointi levyille. Sen jälkeen, massiivinen sekvensointi suoritettiin Genome Sequencer Titanium Roche-454 (AppliedScience) alustan.

Bioinformatics analyysi

raaka-sekvenssit V3-V4 alueen päässä 16SrRNA geenin generoidaan kullekin amplikonin prosessoitiin Roche-454 täydentävää ohjelmistoa, ja * .sff tiedostot syntyy. Korkea laatu lukee valittiin seuraavin perustein: lukee yli viisi peräkkäistä emästä pistein alle 20 annetun Qphred asteikosta 30 emästä liikkuva ikkuna heitettiin pois. Laadunvalvonta (QC) valvoi Thomas Girke n R-skripti, joka käyttää fastq Quality.R kirjasto piirtää jakelua rating kullekin pohja mukaan kantansa Qphred logaritminen [41]. Kun laatu tiedostoja ja sekvenssit saatiin erillään * .sff raaka-tiedostoja, kanavoinnin tehtiin QIIME tunnistaa sekvenssien kuuluvat kunkin näytteen niiden molekyyli- tunniste (MID) [42].

sekvenssit olivat ryhmitelty operatiivisten taxonomic yksikköä (Otus) käyttäen PyNAST algoritmia sekvenssikohdistuksen. Kaikki sekvenssit, joilla oli samankaltaisia ​​99% tai enemmän pidettiin yhtenä OTU [43]. Edustaja sekvenssi kustakin OTU valittiin myöhempää taksonomisiin tunnistamiseen. Taxa määrättiin kanssa Uclust algoritmilla [44], käyttämällä Green Genes tietokannan (99% vapautuminen toukokuu 2013) referenssinä, jotta mahdollinen edustava sekvenssi linjassa 99% samankaltaisuus viittaus sekvenssi osoitettaisiin saman lajin nimi [ ,,,0],45].

sekvenssit, jotka eivät kohdista vertailuakseliin uutettiin toiseen tiedostoon

de novo

kokoonpano ja otettava huomioon monimuotoisuus perusteet. Sen määrittämiseksi, mikrobiston koostumus kykeni klusterin näytteitä diagnoosin, valvomattoman hierarkkinen ryhmittely perustuu Bray Curtis erilaisuuden OTU runsaus kunkin näytteen (S1 taulukko) suoritettiin R paketteja ja piirretään lämpökarttana. Alfa monimuotoisuus kuvattiin käyttäen fylogeneettiseen monimuotoisuus (PD) koko puun ja Shannon diversity index (H’) laskeminen ja niiden alipaine-. Välimatka matriisi ja pääkomponenttien (PC) laskettiin UniFrac määritellä beta monimuotoisuuteen [46]. Lisäksi koordinoida analyysi (PCoA) oli piirrettiin QIIME skriptit ja visualisoida keisari [47].

luokiteltu mikrobiston koostumus mukaan yhteisön tilan tyyppi (CST), joka perustuu hallitseva taksonien löytyy näytteissä. Kohdunkaulan CST on klusterin yhteisön valtioiden (lajikoostumusta ja runsaasti kohdunkaulan yhteisö), jotka ovat samankaltaisia ​​kannalta erilaisia ​​ja suhteellinen runsaus havaitun phylotypes [48]. Klusterointi yhteisön valtioiden toteutettiin avulla hierarkkinen klusterointi perustuu Bray Curtis erilaisuuden kaikkien parien yhteisön valtioiden ja keskimääräinen sidoksen.

Tilastollinen

merkitykselliset muuttujat verrattiin toisiinsa NCL vs SIL ja NCL vs CC, käyttäen

χ

2 ja Kruskal-Wallisin testi kategorinen ja jatkuvia muuttujia, vastaavasti. T-opiskelija kokeet suoritettiin määrittämään keskiarvon ero Shannonin diversiteetti-indeksi tai fylogeneettiseen monimuotoisuutta koko puun ja histopatologinen diagnoosi. Logistinen regressio malleja käytettiin määrittämään yhdistyksen välinen histopatologinen diagnoosi ja Shannonin diversiteetti-indeksi ja histopatologinen diagnoosi (NCL riippumatta HPV- statuksesta ja SIL /CC) ja PD koko puun, säätää iän, pariteetti, ehkäisymenetelmää ja HPV-genotyyppi .

arvioitiin alfa monimuotoisuus riski kuin kerroinsuhde (OR), jossa 95%: n luottamusväli (CI). Arvioitu keskimääräinen ero bittien yksikköä (Shannon diversity index) in kohdunkaula välillä SIL tai CC ja NCL riippumatta HPV- statuksesta arvioitiin lineaarisella regressioanalyysillä säätää iän, ehkäisymenetelmää ja HPV-genotyyppi. Arvioimme vaihtelu painotettu UniFrac etäisyyksiä käyttäen Kruskal-Wallisin testi tarkista beta monimuotoisuutta kussakin histopatologinen diagnoosi ryhmässä. Wilcoxonin Mann-Whitney koe suoritettiin arvioimaan tilastollinen merkitsevyys painotetun UniFrac etäisyydet SIL /CC vs NCL-HPV negatiivinen.

Kohdunkaulan IL-4, IL-6, IL-10, TGF -β1, TNF-α: n ja IFN-γ-mRNA analysoitiin histopatologista diagnoosia varten (NCL vs SIL ja NCL vs CC) käyttäen Wilcoxonin Mann-Whitney testi. Kohdunkaulan IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1: n, TNF-α: n ja IFN-γ-mRNA analysoitiin yli CST klustereita avulla Kruskall Wallisin testiä. Lopuksi suoritetaan suora korrelaatio analysoidaan välillä Shannon monimuotoisuuden indeksi ja kohdunkaulan IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1: n, TNF-α: n ja IFN-γ-mRNA: n. Suoritimme kaikki tilastolliset analyysit käyttäen Stata tilasto-ohjelmalla, versio 13,0 (StataCorp, Collage Station, TX, USA).

Tulokset

Yleistä mallia kohdunkaulan yhteisöjen otokseen

Sen jälkeen QC oli 311863 laadukkaita lukee epätasaisesti läpi näytteitä. Tämän kysymyksen, 1000 satunnainen osanäytteisiin saatiin raakadata kunkin näytteen, ja niitä käytettiin edelleen bioinformatiikan analyysiä. Alpha monimuotoisuus alipaine- käyrät (kuvio A S1 File) osoittavat, että laskemisen jälkeen H’in yli 400 lukee, osanäyte monimuotoisuus ei lisääntynyt; Siksi, 1000 sekvenssit oli riittävät sekvensointi syvyyttä tätä tutkimusta varten. On valvomatta heatmap (kuvio 1), näytteitä NCL klusterin yhdessä ja riippumatta HPV- statuksesta, osoittivat, että HPV-negatiivinen naisilla oli suurempi osuus

Lactobacillus crispatuksen

(46%) ja pienempi yksi

Lactobacillus iners

(14,9%), kun taas HPV-positiivisten naisten oli osuudet 13,3% ja 2,1%, tässä järjestyksessä. Mielenkiintoista, nämä osuudet näyttivät vaihtaa läsnäolo HPV. Lisäksi

L

.

crispatuksen

löydettiin pienempi osuus SIL (14,4%) ja CC (1,3%), kun taas

L

.

iners

laski 2,1% SIL ja ei havaittu CC.

valvomaton heatmap n suhteellinen runsaus mikrobien taksonien löytyy kohdunkaulan mikrobiyhteisöjä 29 tervettä vapaaehtoista koehenkilöä, joka perustuu Bray Curtis erilaisuus metrinen. Lajit läsnä suhteellinen runsaus 1% vähintään yhdessä näytteessä on listattu X-akselilla. Ensimmäinen palkki vasemmalla puolella edustaa tavalla seuraavasti: punainen-HPV-negatiiviset ilman vauriota; blue-HPV-positiivisten ilman vauriota; oranssi-levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisten kohdunkaulan leesion; green-kohdunkaulan syöpä. CST on kuvattu toisessa vasemmassa barside; pink-CST III, hallitsee

Pseudomonas oleovorans

; syaani-CST II hallitsi

L

.

iners

; oranssi-CST I hallitsi

L

.

crispatuksen

; green-CST IV hallitsevat

Sneathia

; blue-CST V hallitsevat

G

.

vaginalis

; yellow-CST VIII hallitsevat

Fusobacterium spp

.; red-CST VI hallitsevat

S

.

agalactiae

, ja violetti-CST VII hallitsevat

Fusobacterium necrophorum

. Näyte nimet näkyvät oikealla puolella kaavion. Cladograms yläosassa lajien nimet osoittavat likimääräistä evoluution suhteet lajien välillä. CST: yhteisön State tyyppi. Dx: Histopatologisista diagnoosi.

Muita lajeja

Lactobacillus

,

L

.

jensenii

ja

L

.

vaginalis

havaittiin vain näytteissä naisten NCL.

Gardnerella vaginalis

löydettiin lähinnä HPV-negatiivisten naisten NCL (11,5%), ja se laski vähitellen poikki HPV-positiivinen (6,9%), SIL (8,1%) ja CC (3,3%) ryhmissä.

S

.

agalactiae

edustivat yli 90% mikrobiston koostumus kaksi näytettä.

Pseudomonas oleovorans

havaittiin suhteellisen runsaasti 19% vain joukossa HPV-positiivisten naisten kanssa NCL. Bakteerit

Fusobacteriales

jotta havaittiin vain SIL ja CC ryhmiä. Vuonna SIL ryhmässä,

Fusobacterium spp

. näytetään suhteellisen runsaasti 6,3%;

Sneathia spp

., 26,6%;

Shuttleworhia satelles

, 8,7%; ja

Megasphaera elsdenii

, 10,4%; kun taas suhteellinen runsaus samaa mikro-organismien CC ryhmässä oli seuraava: 14%, 12,9%, 0%, ja 2,2%, vastaavasti.

Fusobacterium necrophorum

havaittiin ainoastaan ​​CC ryhmässä (14,2%). Tämä viittaa siihen, että mikrobiston monimuotoisuus ja koostumus ovat erilaisia ​​eri analysoitu ryhmissä. Tämän varmistamiseksi alfa- ja beeta monimuotoisuuden analysoitiin.

Kohdunkaulan yhteisöt luokiteltiin kahdeksaan turvallisuustavoitteiden mukaan hallitseva bakteerit, kuten on esitetty taulukossa 2. CST I isdominated by

L

.

crispatuksen

(21%), CST II

L

.

iners

(17%), CST III

Pseudomonas oleovorans

(10%), CST IV

Sneathia spp

. (17%), CST V

G

.

vaginalis

(7%), CST VI

Streptococcus agalactiae

(7%), CST VII

F

.

necrophorum

(7%), ja CST VIII

Fusobacterium spp

. (14%). Paitsi CST VI, kaikki näytteet ryhmiteltiin histopatologisen diagnoosin. CST Olin koostuu pääasiassa HPV-negatiivisten naisten NCL; CST II ja III oli pääasiassa koostuu HPV-positiivisten naisten NCL; CST IV oli pääasiassa koostuu SIL tapauksissa CST V koostui pääasiassa naisten NCL riippumatta heidän HPV asemasta; CST VIII koostui pääasiassa CC tapauksissa ja CST VII mukana vain tapaukset CC (kuva 2).

Pylväsdiagrammi suhteellisen runsauden lajien ryhmää kohti.

vertailu kohdunkaulan mikrobiston moninaisuutta CC vaiheissa

Alpha monimuotoisuutta.

vaikka alipaine- käyrät Shannonin indeksi (kuvio A S1 File) oli suurempi monimuotoisuus CC ja SIL ryhmiä kuin keskuudessa HPV-negatiivisten ja positiivisten naisten NCL, huomasimme, että monimuotoisuus sinänsä, jonka osuus vain rikkauden ja suhteellinen runsaus, ei riitä määrittämään vaiheessa kehittämishanketta CC. Kuitenkin, kun se tulee indeksejä, jotka pitävät phylogenetic mittareita kuin PD koko puun, löysimme merkittävä ero koskee phylogenetic väliset erot HPV-negatiivisten NCL ja SIL välillä HPV-negatiivisten NCL ja CC (p-arvot: 0.006 ja 0,036, tässä järjestyksessä) (Taulukko 3). Toisin sanoen, koostumus kohdunkaulan mikrobiston on eri ryhmien välillä. Laatikko tontteja kuvassa 3 osoittavat jakautumista Shannonin diversiteetti-indeksi ja PD koko puun poikki histopatologinen diagnoosi ryhmissä. Shannonin diversiteetti-indeksi osoittaa lisääntyvää kehityssuuntaa, mutta se ei ole merkittävä. PD koko puun osoittaa merkittävää eroa HPV-negatiivisten NCL ja SIL välillä HPV-negatiivisten NCL ja CC. SIL ja CC ryhmät näyttää monipuolisin kohdunkaulan mikrobiston. Emme löytäneet yhdistyksen välillä histopatologinen diagnoosi ja Shannonin diversiteetti-indeksi (NCL riippumatta HPV- statuksesta ja SIL /CC) perusteella, eikä PD koko puun ja histopatologinen diagnoosi mukaan regressioanalyysimme (taulukko 4). Arvioidessaan assosiaatiota Shannon monimuotoisuuden indeksi kohdunkaulan microbiome näytteet ja histopatologinen diagnoosi keskimääräinen arvioitu ero bitin yksiköiden välillä CC ja NCL oli 1,11 (95% CI, 0,057-2,165, (p = 0,04) (taulukko 5) . Tämä vahvistaa, että mikrobiston monimuotoisuutta CC tapauksissa on suurempi kuin NCL ryhmässä.

boxplots osoittavat jakelusta H (bit yksikköä) ja PD kaikissa näytteissä.

β-monimuotoisuutta.

PCoA tulokset osoittivat johdonmukaisesti, että kohdunkaulan microbiome on huomattavan erilainen jokaisessa vaiheessa luonnollisen historian CC (kuvio 4A). kolme PC jossa piirretään 2D pareittain vertailun; PC1 osuus 33.44% varianssista näytteiden välillä, PC2 on 26,85% ja PC3 on 10,38%. läsnäolo

Fusobacterium spp

.,

Sneathia spp

. ja

Megasphaera spp

. liittyi PC1. läsnäolo

bifidobakteerien spp

. ja

Pseudomonas spp

. liittyi PC2. puuttuminen

Pseudomonas spp

.,

Fusobacterium spp

. ja läsnäolo bakteerit

Bifidobacteriaceae

perhe liittyivät PC3, lasketun tekijä lastaus matriisi (taulukko A S1 File).

. PCoA profiilia histopatologisen diagnoosin näkyy painotettuun UniFrac matkoja. Jokainen luku on yksi näyte värillistä mukaan sen histopatologinen diagnoosi. Punaiset ympyrät edustavat HPV-negatiivisten NCL näytteitä; sininen neliöt edustavat HPV-positiivisten NCL näytteitä; oranssi kolmiot edustavat SIL ja vihreä kolmiot edustavat CC. A1. Pääasiallinen komponentti (PC) -1 osuus 33,44%: n vaihtelua koostumus mikrobiston läsnäolon takia on

Sneathia spp

. ja

Fusobacterium spp

. A2. PC-2 osuus 26,85%: n vaihtelu inthe koostumus mikrobiston läsnäolon takia on

bifidobakteerien spp

. ja

Pseudomonas spp

. A3. PC-3 osuus 10,38%: n vaihtelua koostumus mikrobiston läsnäolon takia on

Lactobacillus spp

. ja

Streptococcus spp

. B. B1. Vaihtelu painotettu UniFrac etäisyydet kunkin histologisen diagnoosi ryhmässä. B2.