Krooninen sairaus

tiivistelmä

Decorin, monitoiminen pieni leusiinirikkaita soluväliaineen proteoglykaanien, on osoitettu olevan voimakas kasvaimen vastainen aktiivisuutta. On kuitenkin jonkin verran epävarmuutta siitä, onko eri syöpäsoluja ilmentävät dekoriini lisäksi hyvänlaatuisen stroomasoluissa. Tässä tutkimuksessa selvitimme dekoriini ilmentymistä ihmisen virtsarakon syövän solujen sekä

in vivo

ja

in vitro

. Lisäksi vaikutus adenovirus-välitteisen dekoriini ilmentyminen ihmisen virtsarakon syövän solujen

in vitro

tutkittiin. Ensin osoittaa käyttäen julkisesti saatavilla GeneSapiens tietopankki että dekoriini geenien ilmentymisen on läsnä sekä normaaleissa ja pahanlaatuiset ihmisen virtsarakon kudoksissa. Kuitenkin, kun käytetään in situ -hybridisaatio digoksigeniini-leimatun RNA-koettimien Decorin ihmisen virtsarakon karsinooma kudosnäytteitä johdettu suuri radikaali kystektomia potilaan kohortin (n = 199), olemme yksiselitteisesti osoitettu, että invasiivisia ja ei-invasiivisia virtsarakon karsinooma solujen puuttuu kokonaan dekoriinin mRNA. Syöpäsolut olivat myös negatiivisia dekoriini immunoreaktiivisuus. Sen sijaan dekoriini ilmentyminen lokalisoitu ainoastaan ​​alkuperäiseen hyvänlaatuisen strooman alueilla virtsarakkokudos. Mukaisesti edellä mainittujen tulosten, ihmisen virtsarakon syöpäsoluja

in vitro

olivat myös negatiivisia dekoriini ilmaisun kuten on esitetty RT-qPCR analysoi. Puute dekoriini ilmentymisen virtsarakon syövän solujen osoitettu olevan johtuen metylaation proksimaalisen promoottorialueen dekoriinia geenin. Kun virtsarakon syövän solut transfektoitiin dekoriini adenovirusvektori, niiden leviäminen väheni huomattavasti. Yhteenvetona olemme osoittaneet, että ihmisen virtsarakon syövän solut ovat täysin vailla dekoriini ilmaisua. Olemme myös osoittaneet, että adenovirus-välitteistä dekoriini geenin transduktio ihmisen virtsarakon syövän solulinjat merkittävästi estää niiden leviäminen. Siten dekoriini geenikuljettimia tarjoaa uusia mahdollisuuksia hoitomenetelmien sisään urothelial syöpäsairauksia.

Citation: Sainio A, Nyman M, Lund R, Vuorikoski S, Boström P, Laato M, et al. (2013) puuttuminen Decorin Expression Human virtsarakon syövän solut Tarjoaa New Tools Therapy of urothelial Maligniteetit. PLoS ONE 8 (10): e76190. doi: 10,1371 /journal.pone.0076190

Editor: Yves St-Pierre, INRS, Kanada

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 23 elokuu 2013; Julkaistu: 11 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Sainio et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellisesti tämä tutkimuksen tukivat Medical Research Fund (EVO) Turun yliopistollisen sairaalan, Cancer Foundations of-Suomessa, säätiö Ida Montin, Oskar Öflunds Stiftelse, Suomen Kulttuurirahasto /Varsinais-Suomi aluekehitysrahasto, Biokeskus Suomi, Suomen Akatemia, ja Turun yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tänään ymmärtää, että solunulkoisen matriisin (ECM) makromolekyylit eivät ole ainoastaan ​​muodostaa inertin tilan täyttö mikroympäristön solujen ympärillä, mutta toimii dynaamisen rakenteen tuottavan signaaleja ohjaamaan solun käyttäytymistä [1]. Todellakin, ECM ja sen komponentit, mukaan lukien pienen leusiinirikkaita proteoglykaani dekoriini [2], [3] ovat nyt tiedossa olevan keskeinen rooli erilaisissa fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa kautta niiden kyky säädellä keskeisten solutapahtumiin kuten tartunta, muuttoliike, lisääntymistä ja apoptoosin [4].

Pieni leusiinirikkaita proteoglykaanien (SLRPs) muodostavat geeni perheen viisi alaluokkien koostuu 18 jäsentä, mukaan lukien dekoriini, prototyyppi perheenjäsen, ja sen lähisukulainen, biglykaania [5] – [6]. Mitä dekoriini useita silmukointimuunnokset (A1, A2, B-E) on tunnistettu mRNA-tasolla [7]. Dekoriinin koostuu yleensä ytimestä glykoproteiini, jonka molekyylipaino on noin 42 kDa: n ja yhden chondroitin /dermataanisulfaatti sivuketju. Sen ytimessä glykoproteiini on 10 leusiinirikkaita toistoja (LRR), kukin toista koostuu 24 aminohaposta ja sisältää α-heliksin ja β-käännöksen [2], [8]. Decorińs rakenteelliset ominaisuudet, jotta se voi olla vuorovaikutuksessa useiden muiden ECM-proteiinien, sytokiinien, kasvutekijöiden ja niiden reseptorien, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), MET (mesenkymaalisten-epiteelin siirtymistä) -reseptorin, eli reseptorin hepatosyyttikasvutekijä, insuliinin kaltaisen kasvutekijän reseptori I: n (IGF-IR) ja jäsenet ErbB-reseptoriperheen [8] – [10]. Via nämä vuorovaikutukset dekoriini on monipuolinen toimet sekä terveyden ja sairauden.

rooli dekoriini syövän etenemiseen ja sen terapeuttista potentiaalia kasvain tukahduttaa haarapesäkkeiden aine on ollut painopiste lukuisia tutkimuksia [10] – [11] . Aluksi dekoriini liittyi syöpään, kun huomattiin, että dekoriini /p53 kaksinkertainen hiirten kehittyi kasvaimia nopeammin kuin valvonnan [10]. Tulokset osoittivat, että häiriöitä dekoriini geenin ei johda spontaaneja kasvaimia, mutta puute dekoriini on salliva tuumorigeneesiä [10]. Myöhemmissä tutkimuksissa ilmentymisen dekoriini on havaittu pienentyneen useita syöpien, kuten paksusuolen [12], eturauhassyöpä [13], ja munasarjojen syöpien [14]. Lisäksi rintasyöpä alhainen ilmentyminen dekoriini on osoitettu liittyvän lyhyempi aika taudin etenemiseen ja huonompi selviytymisen [15]. Toisaalta, toimitus dekoriini geenin tai proteiinin on osoitettu johtavan kasvun hidastumista eri syöpiä [16] – [18] kautta eri vaikutusmekanismeja, kuten sitoutumalla kasvutekijäreseptoreita edellä mainitut ja moduloivan niiden toimintaa [11 ]. Äskettäin olemme osoittaneet, että eri ihmisen rinta- syöpäsolujen täysin puuttuu dekoriini mRNA [19]. Olemme myös osoittaneet, että tarttumista, proliferaatiota ja apoptoosia ihmisen MCF-7 rintasyöpäsolujen voidaan vaikuttaa Decorin transduktiolla [19].

virtsarakon syöpä, joka on 9

th yleisin syöpä diagnoosi maailmanlaajuisesti [20], ilmentyminen dekoriini on aiemmin osoitettu olevan vähentynyt [21] – [24]. Kuten dekoriini toimii luonnollisena antagonisti IGF-IR kasvaimissa, sen vähentynyt ilmentyminen voi osaltaan lisätä IGF-IR: toiminta, mikä johtaa etenemisen IGF-IR-riippuvaisten syöpien tehostamalla solujen liikkuvuutta ja invaasiota [23] – [24 ]. On myös mahdollista, että kasvaimen vastainen vaikutus dekoriini virtsarakon syöpä välittyy dekoriini liittyvä kasvainsuppressorigeenin mitostatin, jonka toiminta on vähentynyt pitkälle virtsarakon syövän lievittämiseen kasvua ja leviämistä neoplastisten solujen [25].

Vaikka useissa tutkimuksissa on tutkittu dekoriini ilmentymistä erilaisissa syövissä kuten virtsarakon syöpä, on jonkin verran epävarmuutta siitä, onko eri syöpäsoluja ilmaista sitä tai ei. Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus dekoriini ihmisen virtsarakon syövän solujen sekä

in vivo

ja

in vitro

. Tutkimme myös vaikutusta dekoriini geenitransduktion proliferaatioon ihmisen virtsarakon syövän solujen

in vitro

.

Materiaalit ja menetelmät

GeneSapiens tietokannan

käytetyt GeneSapiens tietokanta arvioimiseksi aiemmin julkaistu tulokset koskien dekoriini ilmentymistä normaaleissa ja pahanlaatuisten ihmiskudoksia [26]. Tämä tietokanta (https://www.genesapiens.org/) kattaa suhteellinen geeniekspressiomalleja 17 330 geenien kaikissa 9783 selityksin normaalin ja patologisen ihmisen kudosnäytteitä julkisesti saatavilla Affymetrix microarray kokeiluja. Vuonna GeneSapiens tietokannassa on tietoa 35 eri epiteelin karsinoomien

in vivo

. Tässä tutkimuksessa käytimme dekoriini ilmaus 174 näytettä, jotka edustavat ihmisen virtsarakon syövän ja verrataan saatujen tietojen 20 normaalin ihmisen virtsarakon kudosnäytteitä.

Kasvainten näytteitä

Eettinen hyväksynnän käyttää kliinisen Tutkimusaineisto antoivat eettisen komitean sairaanhoitopiiri Varsinais-Suomen. Eettinen komitea luopua tarvetta kirjallinen suostumus. Virtsarakon syöpä kudosnäytteet peräisin 199 radikaalien cystectomy potilasta toimi 1985-2005 Turun yliopistollisen sairaalan, Turku, Suomi. Patologinen potilaiden ominaisuuksiin on esitetty taulukossa 1. kudossiruina (TMA) rakennettiin hankkimalla 3 edustaja ydintä luovuttajasta radikaali cystectomy lohkoja. Käytimme 5 um peräkkäistä leikettä päässä TMA lohkoissa hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäys, in situ -hybridisaatio (ISH) ja immunohistokemia (IHC). Käyttö näytteissä hyväksyntää paikallisen eettisen komitean.

Decorin in situ

Suoritimme dekoriini ISH kaikille TMA jaksoihin luotaa näytteitä ihmisen dekoriini antisense ja yksijuosteisesta RNA ribokoettimia, kuten on aiemmin kuvattu yksityiskohtaisesti [27].

immunohistokemia

IHC analyysit tehtiin Decorin kanin polyklonaalisella vasta-aineella (H-80, Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, laimennus 1:400) ja biglykaania vuohen polyklonaalisella vasta-aineella (L-15, Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, laimennus 1:200) kaikissa TMA aikaisemmin selostetulla tavalla [27]. Immuunivärjäytyminen Ki-67 tehtiin kuten jäljempänä kohdassa Adenovirusvälitteisellä dekoriini transduktio.

RT-qPCR varten dekoriini

kolme ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa RT-4, 5637, ja T24 ostettiin American Type Culture Collection (ATCC). Nämä solulinjat käytettiin RT-qPCR analyysi dekoriinia. Kaikki solulinjat pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle (DMEM, Gibco, Paisley, Skotlanti), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Biochrom AG, Berliini, Saksa), penisilliiniä (100 IU /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml) (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA), ja kasvatettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2. Solut trypsinoitiin, yhdistettiin, ja RNA uutettiin käyttäen NucleoSpin RNA II -Kit (Macherey-Nagel, Düren, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

RNA pitoisuudet syöpä-solulinjasta uutteet määritettiin käyttämällä NanoDrop spektrofotometrillä (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) ja koskemattomuuden RNA varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Yksi ug RNA: ta DNaasi käsiteltiin RQ1 RNase-free DNase (Promega, Madison, WI, USA) ja käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen M-MLV käänteistranskriptaasia ja oligo (dT) 15-aluketta (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan ohjeiden. RT-qPCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19].

DNA metylaatiostatuksen dekoriini promoottorin

Yhteensä DNA uutettiin virtsarakosta syöpäsolulinjasta (RT-4, 5637 ja T24) käyttäen QIAamp® genomista DNA kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Saksa) noudattaen valmistajan protokollan. Metyloitua DNA: ta rikastettua kahdella eri määrityksiä, ensin automatisoitu MethylCap ja sitten automatisoitu MeDIP määrityksessä käyttämällä epigeneettisiä näytteen valmistus robotti SX-8G IP-Star® (Diagenode). Lyhyesti, genominen DNA ensimmäisen fragmentoitu Covaris S2 sonikaattoria. Metyloidut DNA-fragmentit rikastettiin metyyli sitova proteiini Domain (MBD) affiniteettiin perustuva MethylCap määrityksessä tai 5-metyylisytosiini-vasta-ainetta, joka perustuu MeDIP immuunisaostustesti kuten valmistaja on kuvannut (Diagenode). Jotta voidaan tutkia metylaatiostatuksen Decorin-geenin promoottori, metyloitua DNA-fragmentit puhdistettiin (MinElute PCR-puhdistuskittiä, Qiagen) ja altistettiin kvantitatiivista PCR: ää (SybrGreenER qPCR Supermix Universal, Invitrogen) käyttämällä 7900HT Nopea RT-PCR -järjestelmää (Applied Biosystems ). Kukin näyte ajettiin neljä rinnakkaista ja kolme promoottorialueet, jotka kattavat eri dekoriini isoformeja (A1, A2, B-E) tutkittiin. QPCR oligot käytetään RT-PCR-analyysi oli: DCN_A1_F 5′-CAG GTG TGG AAA GGA GGA GG -3 ’; DCN_A1_R 5’- GTG TCA GCC GGA TTG TGT TC -3 ’; DCN_A2_F 5’- AGT CCT CAC CTG AAC CCT GA -3 ’; DCN_A2_R 5’- GAA AGC AGC ATC TTG CCT GG -3 ’; DCN_B-E _F 5’- CTG CAT CCC ACT CAC CCA AA -3 ’; DCN_B-e_r 5’TTC CTG ATG ACC GCG ACT TC -3 ’. Ohjaus loci liittyy GAPDH ja TSH2B geenin promoottorit (Diagenode) käytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina DNA: n metylaatio, vastaavasti. Elpyminen%: a metyloitua DNA kaavalla: toipuminen% input = 2? ((Ct tulo-log input laimennus) – CtMeDIP) * 100.

Adenovirusvälitteinen dekoriini transduktio

transduktion kokeissa rekombinanttia replikaatiovialliset adenovirusvektori DCN-pxc1c-1 oli käytetty, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Tämä vektori suhtautuu ihmisen dekoriini (DCN) cDNA valvonnassa sytomegalovirus (CMV) promoottori. Valmistamiseksi vektorin, ihmisen täyspitkän dekoriini cDNA [28] pGEM plasmidit kloonattiin ja liitettiin shuttle plasmidiin pxcJL-1. Virukset valmistettiin transfektoimalla HEK293-solut takaisin luun plasmidilla pBHG10. Kontrollina vektori RAdlacZ, joka suhtautuu E. coli β-galaktosidaasigeenin (lacZ) valvonnassa CMV IE-promoottoria on käytetty. Tämä vektori hankittiin Virus Vector Facility, Biotekniikan keskus, Turun yliopisto, Turku, Suomi. Ihmisen virtsarakon syövän solulinjat RT4 ja T24 käytettiin transduktion protokollan mukaisesti, kuten aiemmin on kuvattu [19] pienin muutoksin. Lyhyesti, syövän solut ylläpidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä (100 IU /ml), ja streptomysiinillä (100 ug /ml) ja kasvatettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Solut maljattiin 8-Kaivokammio slide (Thermo Scientific, Rochester, NY, USA), 30 000 solua kuoppaa kohti. Seuraavana päivänä solut transdusoitiin 10, 100 ja 1000 pfu /solu DCN-pxc1c-1 tai RAdlacZ DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää. 24 tuntia transduktion jälkeen alusta poistet- tiin ja korvattiin tuoreella. Soluja kasvatettiin sitten seuraavaan päivään asti, minkä jälkeen ne kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Lopuksi leviämisen indeksi dekoriini Transdusoitujen solulinjojen määritettiin Ki-67 kanin monoklonaalinen vasta-aine (30-9, Ventana Medical Systems /Roche Diagnostics, Tucson, Arizona, laimennus 1:200) [19]. Ki-67 positiiviset solut laskettiin kymmenestä näkökenttien eroihin (suurennus 10 x) in dekoriini ja lacZ transfektoitu soluviljelmissä sekä käsittelemätön kontrolliviljelmiin. Lisäksi määrä Ki-67-positiivisia soluja /100 solua per kenttä kymmenessä eri alojen luettiin pois mahdollisuutta, että muuttuneen solujen määrän eri kulttuureissa olisi aiheuttanut vääristymiä leviämisen tuloksiin. Vaikutus dekoriini transduktion solujen määrä mitattiin myös käyttäen hemosytometriä. Lyhyesti, solut maljattiin 12-kuoppalevylle (Thermo Scientific, Rochester, NY, USA), 170 000 solua per kuoppa. Transfektio suoritettiin edellä kuvatulla tavalla ja solut laskettiin 24 tunnin kuluttua korvaamalla väliaineessa tuoreella. Solujen määrä kussakin hoidossa (Ad-DCN, Ad-LacZ ohjaus ja negatiivinen kontrolli) laskettiin kuten kolme toistoa.

Tilastollinen

Parittomia Opiskelijan

t

testi käytettiin tilastollisia analyysejä.

p

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Suhteellinen dekoriini geenin ilmentymistä ihmisen virtsarakon syövän perustuu GeneSapiens in silico transkriptomiikka data

GeneSapiens tietokannan paljasti, että dekoriini ilmentyy merkittävästi tasoilla lähes kaikissa eri ihmisen epiteelikarsinooma kudosnäytteiden

in vivo

(tuloksia ei ole esitetty) [26]. Tämä päti myös ihmisen virtsarakon syövän, vaikka pahanlaatuinen virtsarakkokudoksessa dekoriini ilmentyminen väheni verrattuna normaaliin virtsarakon kudokseen (kuvio 1).

Box käyräanalyysillä suhteellisen dekoriini geeni-ilmentymisen kudosnäytteistä normaalien ja pahanlaatuisten ihmis- virtsarakon käyttämällä GeneSapiens

in silico

tietokantaan (https://www.genesapiens.org/). Jatkuva rivit rasiakuvaajan kuvat edustavat mediaani ekspressiotason dekoriini virtsarakon kudoksissa. Huomaa, että suhteellinen dekoriini ilmentyminen on merkitty sekä normaalissa että pahanlaatuisia virtsarakon kudosnäytteistä ja että suhteellinen ekspressio dekoriini on vähentynyt virtsarakon syöpä verrattuna normaaliin virtsarakon kudokseen. Rajattu palkit laatikossa blot kuvat osoittavat keskihajonnan tulokset sisältyvät tietokantaan.

lokalisaatio dekoriini mRNA ja immuunivaste pahanlaatuinen ihmisen virtsarakon kudosnäytteiden

ISH analyysit DIG leimattua RNA-koettimia dekoriini osoitti selvästi, että invasiivinen virtsarakon karsinooma solut olivat täysin vailla Decorin mRNA kaikissa virtsarakon syövän kudosnäytteistä (kuvio 2). Sama toteamus päti myös näytteet, jotka edustavat ei-invasiivisia in situ ihmisen virtsarakon syöpä (kuva 3). Invasiivisissa ja in situ virtsarakkokarsinoomat, kaikki havaitut dekoriini mRNA havaittiin lokalisoitu ainoastaan ​​alkuperäiseen ei-pahanlaatuisten strooman alueilla (kuvio 2 ja 3). IHC analysoi näytteiden tarkistanut, että dekoriini immunoreaktiivisuus asunut samassa alueilla dekoriini mRNA (kuva 2 ja 3). Sen sijaan, IHC-analyysi näytteistä toinen pieni leusiinirikkaita proteoglykaanin, eli biglykaania, paljasti, että dekoriini negatiiviset alueet invasiivisia virtsarakon syövän kudosta oli positiivinen biglykaania immunoreaktiivisuus (kuvio 4). Tämä havainto oli totta in situ virtsarakon syövän kudosnäytteet sekä (tuloksia ei ole esitetty).

Analyysit tehtiin koko tutkittavan ja edustavia kuvia näytetään. Tähdet osoittavat asuttuna yksinomaan virtsarakon syöpäsoluja. Paneelit A, D, G ovat edustavat kuvat leikesarjojen saman kudoksen näyte, joka edustaa invasiivisen ihmisen virtsarakon syövän. A. HE värjäys. D. ISH varten dekoriini. Positiivinen DIG reaktio ISH osoittaa lokalisoinnin dekoriini mRNA voidaan nähdä violetti. G. IHC varten dekoriini. Ruskea väri osoittaa dekoriini positiivinen pahanlaatuisten stroomasolulinja alueilla. Osat normaalin (B, E, H) ja pahanlaatuinen (C, F, I) virtsarakkokudos alueet (tähdellä) esitetään suurennettu alla. Huomaa, että invasiivinen ihmisen rakkosyöpä- solut ovat täysin vailla Sekä dekoriini mRNA ja dekoriini immunoreaktiivisuus ja että dekoriini ilmaisun asuu ainoastaan ​​aloilla alkuperäisen, hyvänlaatuisen strooman kudosta. Kuvissa A, D ja G, Mittakaavapalkki 50 pm, ja B, C, E, F, H ja I, Mittakaavapalkki 20 pm.

Analyysit tehtiin koko tutkimuksen väestö ja edustavia kuvia näytetään. Tähdet osoittavat asuttuna yksinomaan virtsarakon syöpäsoluja. Paneelit A, D, G ovat edustavia kuvia leikesarjojen saman kudosnäytteen edustavat in situ ihmisen virtsarakon syöpä. Nuolet rajojen in situ karsinooma ja Tähdet osoittavat asuttuna virtsarakon syövän solut vain. A. HE värjäys. D. ISH varten dekoriini. Positiivinen DIG reaktio ISH osoittaa lokalisoinnin dekoriini mRNA voidaan nähdä violetti. G. IHC varten dekoriini. Ruskea väri osoittaa dekoriini positiivinen pahanlaatuisten stroomasolulinja alueilla. Osat normaalin (B, E, H) ja pahanlaatuinen (C, F, I) virtsarakkokudos alueet (tähdellä) esitetään suurennettu alla. Huomaa, että in situ ihmisen rakkosyöpä- solut ovat täysin vailla Sekä dekoriini mRNA ja dekoriini immunoreaktiivisuus ja että dekoriini ilmaisun asuu ainoastaan ​​aloilla alkuperäisen, hyvänlaatuisen strooman kudosta. Kuvissa A, D ja G, Mittakaavapalkki 50 pm, ja B, C, E, F, H ja I, Mittakaavapalkki 20 pm.

Nuolet osoittavat esimerkkejä pahanlaatuisia virtsarakon solujen . A. Edustavia kuva HE värjäys invasiivisen virtsarakon syövän kudosta. IHC for dekoriini (B) ja biglykaania (C), että samasta näytteestä kuin A. Mittakaava A-C, 20 um.

Decorin ilmentymistä ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa

vuonna vitro

edellä

in vivo

tulokset osoittivat, että pahanlaatuisia soluja sekä invasiivisia ja ei-invasiivisia ihmisen virtsarakon syöpä kudosnäytteiden eivät ilmaise dekoriini. Siksi käyttämällä RT-qPCR me seuraavaksi tutkittava, onko solulinjoissa, jotka edustavat eri laatuja ihmisen virtsarakon syövän express dekoriini. Tulokset osoittivat, että yksikään virtsarakon syöpä solulinjoja, kuten RT-4 (alunperin luokka I uroteelisyöpä), 5637 (luokka II), ja T24 (luokka III) ilmaisi dekoriini. Selventämiseksi, onko puute dekoriini ilmaisun johtui DNA metylaatio dekoriini-geenin promoottori, käytimme kahta eri määrityksiä, MeDIP ja MethylCap, jota seuraa kvantitatiivinen RT-PCR tutkia metylaatiostatuksen eri dekoriinia geenin promoottorin isoformien uutetaan syöpäsolun linjat. Perustuen näihin määrityksiin emme pystyneet havaitsemaan DNA metylaatio dekoriini geenin promoottorin tahansa virtsarakon syövän solulinjat tutkittiin (kuvio 5). Ohjaus promoottori TSH2B geeni metyloitu ja GAPDH ei metyloitu odotetusti.

puute dekoriini ilmentymistä ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa ei johdu DNA: n metylaatio on dekoriini-geenin promoottorin. Metylaatiostatuksen Decorin isoformien (DCN A1, A2, B-E), virtsarakon syöpä solulinjoissa tutkittiin kahden eri automaattisen määrityksissä MethylCap ja MeDIP. Kuvassa ovat kvantitatiivinen RT-PCR tulokset MethylCap määritystä osoittavat% DNA metylaatio rikastamiseen vs. Input DNA. Lisäksi dekoriini geenin promoottorit, tulokset näkyvät positiivisen kontrollin TSH2B ja negatiivisen kontrollin GAPDH.

vaikutus adenovirusvälitteisellä dekoriini transduktio proliferaatioon ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa

in vitro

sekä ISH tuloksia ja RT-qPCR määritykset osoittivat selvästi, että ihmisen virtsarakon syöpäsolut eivät pysty ilmaisemaan dekoriini joko

in vivo

tai

in vitro

. Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus kohdennettujen dekoriini transduktion proliferaatioon ihmisen virtsarakon syövän solujen

in vitro

. Käytimme ihmisen virtsarakon syövän solulinjat RT4 ja T24 ja dekoriinin adenovirusvektori tätä tarkoitusta varten. Solut transdusoitiin tiitteri on 10-1000 pfu /solu adenovirusvektori ja viruksen pitoisuus 1000 pfu /solu valittiin lisäkokeita. Tulokset osoittivat, että adenoviruksen välittämä dekoriini transduktio laski leviämisen indeksi syöpäsolujen kanssa tilastollista merkitystä (kuva 6). Myös solumäärä jälkeen dekoriini transduktio oli merkittävästi vähentynyt (tuloksia ei ole esitetty).

Decorin geenin transduktio vähentää leviämisen indeksi T24 virtsarakon syövän soluissa. A. Virtsarakon syöpäsolut transdusoitiin dekoriini adenovirusvektorilla (Ad-DCN). B. transduktio solut LacZ vektorin (Ad-LacZ Control). C. Transdusoimattomia syöpäsolujen (negatiivinen kontrolli). Ruskea väri osoittaa Ki-67-positiivisia soluja (esimerkit merkitty nuolilla). Mittakaava A-C, 50 pm. Rajattu palkit päälle sarakkeita D osoittavat keskihajonnat. *** P 0,001, Opiskelijan

t

testiä.

Keskustelu

Vaikka decorińs rooli tuumorin kasvun tunnustetaan nykyään [18], alkuperä dekoriini ilmentyminen syövissä on säilynyt osittain ratkaisematta [12], [13], [23], [29]. Varsinkin, on jonkin verran epävarmuutta siitä, onko eri syöpäsoluja ilmentävät dekoriini lisäksi hyvänlaatuisen stroomasoluissa. Viime aikoina olemme osoittaneet, että eri muodoissa ihmisen rintasyöpään, dekoriini ei ilmaistaan ​​syöpäsolut [19]. Mitä tulee virtsarakon kudoksessa, ilmentymisen dekoriini on osoitettu olevan merkittävä, että epiteelinalaisella kerrokset hiiren virtsarakossa [30]. On myös esitetty IHC analyysi, joka dekoriini immunoreaktiivisuus on huomattavasti pienempi kasvain strooman sekä matalan ja korkean asteen rakkokasvaimista [23]. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet dekoriini ilmentymistä ihmisen virtsarakon syövän solujen sekä

in vivo

ja

in vitro

. Ensin arvioitiin edellisen koskevat tiedot dekoriini geenin ilmentymistä erilaisissa syövissä viitaten erityisesti virtsarakon syöpä hyödyntäen yleisesti saatavilla GeneSapiens tietopankin [26]. Samoin kuin aikaisemmissa tutkimuksissa [21] – [22], dekoriinia ilmentyminen havaittiin olevan vähentynyt pahanlaatuinen ihmisen virtsarakon kudosnäytteitä verrattuna normaaliin virtsarakon kudoksissa. Seuraavaksi paikallinen dekoriini mRNA ja dekoriini immunoreaktiivisuus omissa laaja radikaali cystectomy potilaan kohortin ihmisen virtsarakon syövän kudosnäytteitä käyttämällä ISH DIG-leimatun dekoriini antureista ja polyklonaalista dekoriini vasta-, vastaavasti. Kuten olemme osoittaneet ihmisen rintasyövän [19], nämä analyysit osoittivat selkeästi, että myös ihmisen virtsarakon syövän kaikilla alueilla ja saarekkeiden asuu pahanlaatuisia soluja olivat täysin vailla dekoriini mRNA ja immunoreaktiivisuus. Sen sijaan ilmaus dekoriini asui ainoastaan ​​aloilla alkuperäisen, hyvänlaatuisen virtsarakon strooman. Siten GeneSapiens tulokset koskien dekoriini ilmentymistä ihmisen virtsarakkosyöpänäytteiden vastaa laatua alkuperäisen kudosnäytteiden sisältyy tietokantaan, eli lisäksi syöpäsolujen näytteet sisältävät eri määriä strooman kudosta.

in vivo

tulokset osoittivat, että ihmisen virtsarakon syöpä solut eivät ilmaista dekoriini. Tämä sama havainto osoitettiin olevan totta myös ihmisen virtsarakon syövän solulinjat. Koska metylaatio dekoriini geenin on aiemmin osoitettu säätelevän dekoriini ilmentymisen paksusuolen syöpä [29], päätimme tutkia, onko tämä epigeneettiset mekanismi vaikuttaa dekoriini ilmentymistä ihmisen virtsarakon syövän solujen samoin. Kuitenkin meidän tulokset kiistatta osoitettu, että metylaatio dekoriini geenin promoottori ei ole merkitystä ihmisen virtsarakon syöpä. Siten mekanismit esto dekoriini ilmentymistä ihmisen virtsarakon syövän soluja vielä selvittämättä.

Tutkimukset hyödyntäen dekoriini transduktio aiemmin tehty esim. rinta- syöpäsolujen ja tulokset ovat osoittaneet sekä vähentää primaarisen kasvaimen kasvua ja ehkäisyyn etäpesäkkeiden [17], [31]. Lisäksi systeemistä kuljettamista dekoriini proteiinin ytimen rintojen ksenografteja on raportoitu ilmentymisen moduloimiseksi useita satoja strooman geenien luominen epäedullinen kasvaimen mikroympäris- kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden [32]. Lisäksi, tukahduttaminen tumourigenicity käyttäen dekoriini transduktio on osoitettu myös paksusuolen ja levyepiteelikarsinooma kohdunkaulan tuumoriksenografteja [16]. Äskettäin olemme osoittaneet, että adenovirus-välitteisen transduktion dekoriinia ja Decorin rintasyöpäsolujen (MCF-7) vähentynyt proliferaatio ja lisääntynyt apoptoosia solujen [19]. Tässä tutkimuksessa ihmisen virtsarakon syöpäsolulinjoista RT4 (gradus I) ja T24 (gradus III) on transdusoitu dekoriini adenovirusvektori, joka johti samanlainen väheneminen solujen lisääntymisen, identtinen MCF-7-soluissa. Edellä mainitut tulokset yhdessä havaitun puutteen dekoriini ilmentymisen syöpäsolujen kiehtova mahdollisuus tutkia vaikutusta dekoriini virtsarakon syöpäsolujen käyttäytymistä terapeuttisena välineenä. Tämä voitaisiin tehdä

in vivo

esim jossa rakkoon hoito, jossa syöpä rakon ontelon huuhdellaan dekoriini adenoviruksen sisältävä nestettä [33] – [34].

Parhaan tietomme mukaan esillä oleva tutkimus on ensimmäinen, täsmälleen paikallistaa dekoriini mRNA on solutasolla ihmisen virtsarakon syövän

in vivo

. Kuten olemme seulotaan näytteistä immunoreaktiivisuus toisen, hyvin samankaltainen SLRP on dekoriini, nimittäin biglykaania, huomasimme, että kasvain alueet negatiivinen dekoriini oli positiivinen biglykaania immunoreaktiivisuus. Tämä osoittaa, että vaikka dekoriini ja biglykaania edustavat hyvin samankaltaisia ​​molekyylejä, jotka ovat samantapaisia ​​toimintoja kuten niiden kyky sitoa TGF-β [35] niiden ilmentymistä kudoksissa ei ole identtinen. Aiemmin ero dekoriini ja biglykaania ilmaisun patters on todettu esim. kehittämisessä luuston ja luustoon kudoksissa [36], aikana sarveiskalvon kehitys [37] ja patologisten tilanteiden kuten fibroosia osittainen virtsarakon pistorasiaan tukkeuma [38]. Lisäksi biglykaania on myös vähitellen osoittautunut toimimaan avainmolekyyli sääntelyn immuunijärjestelmän [38]. Tutkimustulosten perusteella, biglykaania ilmentymistä havaitaan ihmisen virtsarakon syövän solut, joista puuttuu dekoriini ilme. Lopullinen rooli biglykaania ilmaisun etenemisessä tai rajoittamista tuumorigeneesiä vaatii lisätutkimuksia.

Johtopäätökset

Johtopäätöksenä tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että ihmisen virtsarakon syöpä solut eivät ilmaista dekoriini myöskään

in vivo

tai

in vitro

, ja että dekoriini ilmentymistä pahanlaatuinen ihmisen virtsarakon kudosten asuu vain aloilla alkuperäisen, hyvänlaatuisen strooman. Olemme myös osoittaneet, että puute dekoriini ilmentymisen ihmisen virtsarakon syövän soluissa ei johdu metylointi proksimaalisen promoottorin alueet dekoriinia geenin. Lisäksi olemme osoittaneet, että transduktio ihmisen viljellyissä virtsarakon syövän solut dekoriini adenovirusvektori aiheuttaa merkittävän inhibition solujen proliferaation

in vitro

. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että puute dekoriini ilmentymisen virtsarakon syövän solut tarjoaa mahdollisuuden käyttää dekoriini hoitomuodot ihmisen urothelial syöpäsairauksia.

Kiitokset

Kiitämme Bogata Fezazi ja Suomi Microarray ja sekvensointi keskuksen Turun biotekniikan, Turku, Suomi teknistä tukea. Asiantuntija teknistä apua Sinikka Kollanus kiittävät. Kirjoittajat kiittävät myös Jaakko Liippo varten auttamassa valokuvaamalla.