Krooninen sairaus

tiivistelmä

Neljän jumiin G-Nelivaiheinen DNA sekundäärirakenteiden on hiljattain visualisoida ytimet ihmisen viljeltyjen solujen. Tässä osoitamme, että BG4, G-Nelivaiheinen-spesifistä vasta-ainetta, voidaan käyttää värjäämään DNA G-Nelivaiheinen rakenteiden potilaasta peräisin kudoksia käyttäen immunohistokemia. Havaitsemme merkittävästi kohonnut määrä G-Nelivaiheinen-positiivisia ytimet ihmisen syövissä maksan ja mahan verrattuna tausta ei-kasvainkudoksessa. Tuloksemme viittaavat siihen, että G-Nelivaiheinen muodostuminen voidaan havaita ja mitata potilaan johdetun materiaalin, ja että kohonnut G-Nelivaiheinen muodostuminen voi olla ominaista joidenkin syöpien.

Citation: Biffi G, Tannahill D, Miller J, Howat WJ, Balasubramanian S (2014) kohonneet G-Nelivaiheinen Formation in Human Vatsa ja Maksasyöpä kudokset. PLoS ONE 9 (7): e102711. doi: 10,1371 /journal.pone.0102711

Editor: Mark Isalan, Imperial College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: toukokuu 28, 2014; Hyväksytty: 23 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 17 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Biffi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tekijät Kiitokset Cancer Research UK ohjelman avustus (C9681 /A11961) ja keskeisiä institutionaalisia rahoitusta Balasubramanian lab, ja PhD stipendi varten GB (https://www.cancerresearchuk.org). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kaanonisoimaton G-Nelivaiheinen DNA toissijaisia ​​rakenteita voidaan muodostaa guaniini-rikas DNA-sekvenssit tyypin G

3 + N

L1 G

3 + N

L2 G

3 + N

L3 G

3+ (N = mikä tahansa emäs ja L = loop) ja tällaiset jaksoryhmittymät ovat yleisiä kaikkialla ihmisen genomin [1], [2]. G-kvadrupleksien ovat neljän jumiin rakenteita, jotka koostuvat kasana tetrads muodostetaan Hoogsteenin vetysidoksia neljä guaniinit koordinoi keskeinen yksiarvoinen kationi [3]. Oligonukleotidit taitetaan G-Nelivaiheinen rakenne

in vitro

on suuri termodynaaminen stabiilisuus lähes fysiologisissa olosuhteissa, sopusoinnussa niiden muodostumista soluissa [4]. Ennustettu sijainti G-Nelivaiheinen sekvenssimotiivit säätelyalueita genomin, kuten promoottoreita ja telomeerit, viittaa siihen, että G-Nelivaiheinen rakenteet voivat olla tärkeitä rooleja genomin toiminto [5] – [7]. Useat helikaasit että ratkaista G-kvadrupleksien on tunnistettu ja ne arveltu edistää normaalia genomin toimintoja, kuten replikaatio, transkriptio ja ylläpito genomin vakautta [8]. DNA: n visualisoimiseksi G-Nelivaiheinen rakenteet ihmisen soluissa on tukenut olemassaolon G-kvadrupleksejä genomissa [9]. Näissä kokeissa, erittäin selektiivinen G-Nelivaiheinen-spesifistä vasta-ainetta (BG4) muodostettiin faagi-display ja käyttää visualisoida erillisiä pesäkkeitä G-Nelivaiheinen rakenteiden ytimet ihmisen kudosviljelmäsolulinjoissa. Tämä vasta-aine on antanut mahdollisuuden koetin solujen roolin G-kvadrupleksien ja niiden potentiaali osallistumisesta tauti.

G-Nelivaiheinen rakenteita on ehdotettu liittyvän solun toimintoja, kuten replikaatio ja transkriptio. Esimerkiksi G-Nelivaiheinen vakauttaminen pieni molekyyli voi tukahduttaa transkriptio tiettyjen onkogeenien ja /tai aiheuttaa DNA-vaurioita klo telomeres ja oncogenes johtavat replikaatioin- vikoja ja solukuolemaa [10] – [17]. G-Nelivaiheinen rakenteita voidaan myös liittää genomiin epävakautta ja G-Nelivaiheinen jaksoryhmittymät on todettu proksimaalisesti DNA raja-arvot ja sivustoja somaattisten kopioluvun muutokset nähdään useita syöpiä [18], [19]. Helikaaseilla että ratkaista G-kvadrupleksien myös löydetty paikallisia paikoissa genomin epävakautta [20] – [22], ja sairauksia, kuten Bloom ja Werner oireyhtymät, jotka osoittavat kohonneita genomin epävakautta ja syöpäalttius, ovat osaltaan mutaatiot G -quadruplex-ratkaisemiseen helikaasit [23].

Koska mahdollisia suhdetta G-Nelivaiheinen rakenteet ja ihmisten sairauksien, se on tärkeä tavoite käsitellä onko G-kvadrupleksien on mitattavissa ihmisen kudoksissa. Siksi tutkittiin DNA: n ilmaisemiseksi G-kvadrupleksejä potilaasta peräisin kudoksia ja onko olemassa eroja G-Nelivaiheinen tasojen ei-neoplastisia ja syöpäkudoksissa. Käyttämällä G-Nelivaiheinen-spesifistä vasta-ainetta, BG4, immunohistokemiassa formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kudos microarray kohdat, olemme havainneet laajalti DNA G-Nelivaiheinen muodostuminen ytimet ihmisen kudoksissa. Kvantifiointi BG4-positiivisten soluytimet paljasti laajempi muodostumisen G-Nelivaiheinen rakenteiden mahassa ja maksassa syövät verrattuna vastaavaan tausta ei-neoplastisia kudoksia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että käsittely G-Nelivaiheinen rakenteisiin on väärin säännelty joissakin ihmisen syövissä.

Tulokset ja keskustelu

Lähdimme osoittaa läsnäolo G-kvadrupleksejä ytimet ihmisen kudoksia ja tutkimaan, ovatko mahdolliset erot ovat helposti nähtävissä potilaasta johdettujen syöpä kudoksia. Meidän lähestymistapamme perustui havaitsemiseen ydinaseiden G-kvadrupleksien immunohistokemiallisesti (IHC) kanssa G-Nelivaiheinen-spesifistä vasta-ainetta, BG4, Ei-neoplastisia ja syövän kudossiruina (TMA). Spesifisyys ja selektiivisyys BG4 G-Nelivaiheinen rakenteita ja soveltaminen BG4 immunofluoresenssi- (IF) mikroskopialla ihmisen soluissa on kuvattu aiemmin [9]. Määrittämään soveltuvuus BG4 IHC, ensin testannut tämän vasta-mallissa, jossa käytetään osastoja FFPE solupelleteistä MDA-MB-231 rintasyövän soluja, jotka olivat aiemmin havaittu näyttämään ydinaseiden G-Nelivaiheinen pesäkkeitä IF mikroskoopilla [9] . Kuten epitooppi haku, joko lämmön-välitteinen (sitraatti- perustuu pH 6,0 tai Tris /EDTA: han perustuvalla pH 9,0 puskurit) tai entsymaattinen (proteinaasi K), on usein tarpeen altistaa antigeenisten ennen vasta-aineen sitoutumisen, vertasimme nämä kolme standardia epitoopin haku pre-hoitoja. Jälkeen BG4 Inkuboinnin värjäys suoritettiin inkuboimalla toissijainen anti-FLAG-vasta-ainetta, joka tunnistaa FLAG-tag-epitoopin läsnä BG4 vasta-aineen, jonka jälkeen Leica piparjuuriperoksidaasi polymeeriin perustuva tunnistus käyttäen Bond IHC värjäys alustalla. Tämän protokollan, voimakas tumavärjäystä havaittiin BG4 vasta epitoopin hakuun (kuvio 1 B ja S1). Ei värjäytymistä havaittiin ilman esikäsittelyä (kuvio 1A) ja tarkastukset suoritetaan ilman BG4 osoittivat, että epitooppi haku sitraatti-pohjainen puskuri antoi vähemmän tausta kuin Tris /EDTA (kuvio 1 C ja S1), kun taas pre HOIDON proteinaasi K: lla johti epäspesifistä tumavärjäystä jopa ilman BG4 (kuva S1). Lisäksi, kun epitooppi hakua sitraatti tai Tris /EDTA-puskureita, DNaasi I käsittely ennen BG4 värjäystä johti voimakkaaseen vähenemiseen BG4 ydin- signaalin intensiteetin (kuvio 1D ja S1), joka edelleen varmistaa DNA: n ilmaisemiseksi G-kvadrupleksien. Ydin- BG4 signaali nähdään IHC on yhdenmukainen aiempien havaitsemiseen BG4 pesäkkeitä ytimet kudosviljelysolut [9].

. Ihmisen MDA-MB-231 rinnan adenokarsinooma solupelletit, parafiiniin upotettuja ja käsitellään IHC käyttäen G-Nelivaiheinen-spesifistä vasta-ainetta BG4. Mitään värjäytymistä ei havaittu ilman epitoopin haku. Asteikkoviiva vastaa 20 um. Ytimet vastavärjätään hematoksyliinillä (sininen). B. Voimakas BG4 värjäytymistä (ruskea) käy selvästi ilmi solutumissa antigeenieks- haku sitraatti-pohjainen pH 6,0. C. ei värjäytymistä havaitaan puuttuessa BG4 primaarisen vasta-aineen. D. Ei värjäytymistä nähdään seuraavat DNaasikäsittely ennen BG4 värjäystä. Nämä tulokset osoittavat, että BG4 voidaan käyttää DNA G-Nelivaiheinen havaitsemista IHC värjäystä.

Kun laatinut IHC protokolla BG4, ensin vahvistanut, että koepalana otetulle ei-neoplastisia ihmisen kudosnäytteitä voidaan värjätä käyttämällä BG4. Yleensä huomasimme monipuolinen BG4 värjäyskuviot poikki monissa kudoksissa viittaa siihen, erot muodostumiseen G-kvadrupleksien kudosten välillä ja myös solujen välillä samassa kudoksessa (kuvio S2). Nämä tulokset osoittavat, että yleinen muodostumista DNA G-kvadrupleksejä kompleksi ihmisen kudoksissa voidaan arvioida BG4 vuonna IHC, pidentäen visualisointi G-Nelivaiheinen rakenteiden ulkopuolella IF mikroskopialla kudosviljelysoluissa. Väliaikaiseen kyselyn BG4 värjäytymisen syövän kudoksissa verrattuna taustalla ei-kasvainkudoksessa erot BG4 värjäytymisen intensiteetti tai jakeluun esiintyi enimmäkseen tuloksettomia (tuloksia ei esitetty), ja monissa tapauksissa tiukka määrällinen ollut mahdollista johtuen merkittävistä eroista morfologia ja läsnäolo useiden solutyyppien pahanlaatuinen vs. ei-kasvainkudoksessa. Sen sijaan, maksan ja mahan, meidän väliaikainen tutkimus ehdotti, että nämä kudokset oli helposti mitattavissa vuoksi yhtenäisemmän näköisiä ja keskenään neoplastisia ja syöpä kudoksiin. Siksi käytetään Aperio Imagescope Nuclear (v9) kuva-analyysi-ohjelmisto määrittää prosenttiosuuden BG4-positiivisten ytimien läsnä TMA. Erillinen kuva-analyysi luokittelija kehitettiin kullekin kudostyypin täsmällisesti ja erillinen koskettava objekteja, jossa pahanlaatuinen ja ei-neoplastisia näytteiden pisteytetty samat parametrit sekä tarkkaa vertailua. Silmiinpistävän, yhdeksässä tapauksessa josta meillä oli kahtena maksasyövän TMA ytimet vastaavan sovitetun tausta ei-kasvainkudoksessa otettu samasta potilaasta, havaitsimme paljon suurempi määrä BG4-positiivisten tumien syövän (keskiarvo 60,3 ± 5,4%) vs. ei-neoplastisia (keskiarvo 18,3 ± 2,12%) kudoksen ytimet (kuvio 2). Kun yksittäinen syöpä fenotyypit tutkittiin, huomasimme, että molemmat maksasolusyövän (HCC) ja maksansisäisten kolangiokarsinooma (ICC) verrokkeja useammin ydin- BG4 värjäytyminen verrattuna ei-kasvainkudoksessa (kuva 2A-D ja G). Vaikka HCC ja ICC on eri solujen alkuperä, kehittää hepatosyyteista tai sappitiehyen kolangiosyytit vastaavasti, molemmat osoittivat suuremman määrän ja intensiteetin BG4-positiivisten ytimien verrattuna ei-neoplastisia maksakudosta. Lisäksi etäpesäkkeitä (eristetty suuri solu erilaistumaton keuhkosyöpä sivustot) lisääntyminen BG4-positiivista värjäytymistä oli myös huomattava (kuvio 2E-G). Havaitsimme selviä eroja ei-neoplastisten ja kasvainkudoksen useita eri potilaan tapauksessa. Itse asiassa laajempi analyysi syövän ja tausta ei-neoplastisia TMA ytimien lukien verraton tapaukset jälleen osoitti kasvua BG4-positiivisten ytimien poikki HCC, ICC ja metastasoitunut (kuvio 3A). Kun kaikissa tapauksissa pidettiin yhdessä, ~2.4-kertainen määrä BG4-positiivisten tumien nähtiin maksasyövän verrattuna ei-kasvainkudoksessa (P 0,001, kuvio 3B).

Taustaa ei- neoplastisia ja syöpä maksakudoksissa värjättiin IHC käyttämällä G-Nelivaiheinen-spesifistä vasta-ainetta BG4. A. ytimet ei-neoplastisten maksan kudoksesta maksasyövän potilaan ovat enimmäkseen BG4-negatiivinen, hematoksyliinillä counterstaining (sininen) ilmeinen. Asteikkoviiva vastaa 50 um. Huomaa, että sytoplasman rakeet ovat vaihtelevia ja todennäköisesti Hemi-pohjainen artefakteja joskus havaittu maksassa IHC. B. kasvainkudoksessa samasta potilaasta A esitetään laaja läsnäolo BG4-positiivisten ytimet (ruskea). C. ytimet ei-neoplastisten maksakudosta varten intrahepaattinen kolangiokarsinooma potilas ovat enimmäkseen BG4-negatiivinen. D. kasvainkudoksessa samasta potilaasta C näyttää monissa BG4-positiivisia ytimeksi. E. ytimet ei-neoplastisten maksakudosta etäispesäkkeellisestä suuri solu erilaistumaton keuhkosyöpä potilaan ovat enimmäkseen BG4-negatiivinen. F. Metastasoitunut maksakudosta eristetty samalta potilaalta E näyttää monissa BG4-positiivisia ytimeksi. G. kvantifiointi määrä BG4-positiivisten tumien maksasyövän ja vastaavan sovitettu ei-neoplastiset kudokset yhdeksästä potilaista. Virhe palkit edustavat standardin keskivirhe (s.e.m.) laskettuna, kun päällekkäisiä TMA ytimiä oli saatavilla. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että on olemassa suurempi määrä G-Nelivaiheinen rakenteiden maksasyövän verrattuna tausta ei-kasvainkudoksessa samasta yksilöstä.

. Kvantifiointi määrä BG4-positiivisten tumien yksittäisissä maksan kudoksissa, kuten verraton TMA ydintä. Ei-neoplastisia maksa näyttää vähemmän BG4-positiiviset ytimet verrattuna maksasyövän tai intrahepaattista kolangiokarsinooma. Kukin sarake vastaa yhtä kudosnäyte ja virhepalkit edustavat s.e.m. laskettu kun kahtena kudosnäytteet käytettävissä. B. Yleisesti määrällisesti määrä BG4-positiivisten tumien kaikki ei-neoplastisia ja syövän maksan kudoksissa. Virhe palkit edustavat s.e.m. ** P 0,001, n = 19 ja 32 ei-neoplastisia ja syövän ydintä, vastaavasti. Nämä tulokset vahvistavat yleisyyttä laajempi G-Nelivaiheinen muodostumista maksassa syövät verrattuna ei-neoplastisia kudoksia.

Samanlainen nousu G-Nelivaiheinen ilmaantuvuus maksasyövän kudoksen, joka on suurempi kuin 3 kertainen lisääntyminen on BG4-positiivisten tumien havaittiin mahan adenokarsinooma ja sinettisormus karsinooma verrattuna taustalla ei-kasvainkudoksessa otettu samasta yksilöstä (kuva 4). Laajempi kattava analyysi mahasyöpä ja ei-neoplastisia kudoksia mukaan lukien verraton tapaukset vahvistivat kasvu määrän BG4-positiivisten tumien nähdään mahasyöpä verrattuna ei-kasvainkudoksessa (kuva 5). Todellakin, yksittäisissä mahasyöpä alatyyppejä, adenokarsinoomat (peräisin rauhas epiteeli), sinettisormus solukarsinoomat (adenokarsinooman ominaista musiinituoton laskeuman) ja ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet (GIST, KIT ilmentäviä sarkoomat mesenkymaaliset), kaikki osoittivat suuremman määrän BG4-positiiviset ytimet verrattuna ei-neoplastisia mahan kudoksessa (kuvio 5A). Kun kaikissa tapauksissa tarkasteltiin yhdessä, ~3.1 kertaa enemmän BG4-positiivisia tumat löydettiin syöpä vs. ei-neoplastisten kudosten (kuvio 5B, P 0,001). On huomattava, että useat mahatuumori alatyyppejä, joilla on erilaiset etiologies ja etenemiseen, on ominaista lisääntyminen BG4 värjäystä. Nämä tulokset ovat siis hyvin vaikuttava yleinen yhteys lisääntynyt läsnäolo G-Nelivaiheinen rakenteita ja mahasyöpä kehittämiseen.

Mahalaukun adenokarsinooma ja sinettisormus karsinooma ja sovitetun tausta ei-neoplastiset kudokset otettu samasta potilaasta oli värjätään G-Nelivaiheinen-spesifistä vasta-ainetta BG4 IHC. A. ytimet ei-neoplastisten vatsan kudosta mahalaukun adenokarsinooman potilaan ovat enimmäkseen BG4-negatiivinen, hematoksyliinillä counterstaining (sininen) ilmeisiä. Asteikkoviiva vastaa 50 um. B. Adenokarsinooma kudosta samalta potilaalta A osoittaa laaja määrä BG4-positiivisten ytimet (ruskea). C. ytimet ei-neoplastisten mahaan kudosta sinettisormus karsinooma potilas ovat enimmäkseen BG4-negatiivinen. D. sinettisormus cell carcinoma kudosta samalta potilaalta C näyttää monissa BG4-positiivisia ytimeksi. E. kvantifiointi määrä BG4-positiivisten tumien sovitetussa mahasyöpä ja tausta ei-neoplastiset kudokset kahdesta eri potilailla. Virhe palkit edustavat s.e.m. laskettu kun kahtena TMA ytimiä oli saatavilla. Nämä tulokset osoittavat, että on olemassa enemmän G-Nelivaiheinen rakenteiden ytimet mahasyövän kudoksen kuin ei-kasvainkudoksessa samasta yksilöstä.

Vahvistus lisääntyneestä läsnäolosta BG4-positiivisten ytimien valikoima mahasyöpä kudosten verrattuna tausta ei-neoplastisia kudoksia mukaan lukien verraton tapaukset. A. ytimet ei-neoplastisten mahan kudoksissa ovat suurelta osin BG4-negatiivinen. Solujen tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä (sininen). Asteikkoviiva vastaa 50 um. B. Mahalaukun adenokarsinooma kudos osoittaa laaja läsnäolo BG4-positiivisten ytimet (ruskea). C. sinettisormus karsinooma näyttää monet BG4-positiivisia ytimeksi. D. ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet (GIST) ovat pääosin BG4-positiivisia (selvityksen laatimiseksi mahasyöpä vain verraton GIST kudokset olivat saatavilla). E. kvantifiointi määrä BG4-positiivisten tumien yksittäisissä vatsassa kudoksissa, kuten verraton TMA ydintä. Ei-neoplastisia vatsa kudos näyttää vähemmän BG4-positiiviset ytimet verrattuna adenokarsinooma, sinettisormus syöpä tai GIST. Kukin sarake vastaa yhtä kudosnäyte ja virhepalkit edustavat s.e.m. laskettu kun kahtena kudosnäytteet käytettävissä. F. Kaiken määrällisesti määrä BG4-positiivisten tumien kaikki ei-neoplastisia ja vatsa maksakudoksissa. Virhe palkit edustavat s.e.m. ** P 0,001, n = 10 ja 34 ei-neoplastisia ja syövän ydintä, vastaavasti. Nämä tulokset vahvistavat yleisyyttä laajempi G-Nelivaiheinen muodostumista mahasyöpä verrattuna ei-neoplastisia kudoksia.

maksassa ja vatsassa TMA, jotkut syöpäkudoksessa ytimien ilmeni vähän tai ei lainkaan mitattavissa BG4 värjäystä heijastaen ehkä kysymys epitoopin vakauden kirurgisissa koepala kerääminen tai vaihtoehtoisesti osoittaa todellista vaihtelua G-Nelivaiheinen muodostuminen näissä tietyissä kudoksissa. On kuitenkin huomattava, että missään tapauksessa ollut mitään epäneoplastisis- maksa- tai vatsan kudosta laajasti BG4-positiivisia. Tämä jälkimmäinen havainto edelleen vahvistaa, että kasvu määrän BG4-positiivisten solujen nähdään syövän TMA ytimet heijastaa todellista eroa G-Nelivaiheinen läsnäolo välillä epäneoplastisis- ja pahanlaatuiset tilat. Analyysi G-Nelivaiheinen värjäytymisen muiden syöpien vuoksi on mahdollista ja meidän alustavan analyysin haiman kudos viittaa siihen, että vaikka BG4 värjäys ei-neoplastisten haima on yleistä, on -1,6-kertainen BG4 tumavärjäystä in adenokarsinooma kudoksissa ( P 0,01, kuva S3).

Kaiken tuloksemme osoittavat, että G-kvadrupleksien voidaan visualisoida IHC ei-neoplastisia ja syövän ihmisen kudosten laajentaa aiemmin toteamukset paljasti G-Nelivaiheinen rakenteiden ytimet kulttuurin solulinjojen [9]. On huomionarvoista, että havaitsimme kasvu määrä G-Nelivaiheinen-positiivisten solujen jonkin syövän kudoksissa verrattuna ei-neoplastisia tapauksissa. Tiedot että esitämme ei itsessään selitä miksi enemmän G-kvadrupleksien ovat ilmeisiä tapauksissa mahan ja maksan syövät. On kuitenkin olemassa useita rivejä todisteita kirjallisuudessa, että ehdottaa mahdollisia yhteyksiä tai aiheuttajaa yhteyden G-kvadrupleksien ja mekanismeja, jotka auttavat syövän kehitystä tai etenemistä. Esimerkiksi G-Nelivaiheinen rakenteet, jos niitä ei ratkaista aikana DNA: n replikaation, voivat edustaa haurasta sivustoja, jotka edistävät genomin epävakaus, joka on tunnettu tunnusmerkki syöpä [24]. Todellakin, G-Nelivaiheinen jaksoryhmittymät löytyvät DNA breakpoints jotka johtavat toiselle siirtäminen sisällä BCL2 geenin lymfoomat ja sisällä HOX11 geenin T-solujen leukemiat [25], [26]. Laskennallinen analyysit ovat myös ehdottaneet mahdollisia yhdistysten G-kvadrupleksien ja keskeytyskohta alueiden erilaisten syöpien [19].

Hypoteesimme että kasvu genomista G-kvadrupleksejä syöpä voi johtua mutaatioista entsyymejä, jotka käsittelevät G-kvadrupleksien ja /tai perimän epävakaisuuden G-Nelivaiheinen sivustoja. Esimerkiksi Fanconin anemia, Bloomin ja Wernerin oireyhtymät, kaikki näytön genomin epävakautta, joilla on alttius syöpään [27] – [29] ja tuloksena mutaatioista DNA helikaasin entsyymejä, jotka ovat G-Nelivaiheinen-ratkaisemiseen toimintaa [30] – [32] . Viimeaikaiset genominlaajuisten tutkimukset ovat myös korostaneet tunnustamista G-Nelivaiheinen sekvenssit ylimääräisillä ratkaisemiseen helikaasit kuten ATRX, PIF1 ja XPB /D [20] – [22]. Lisäksi PIF1 on ehdotettu tukahduttaa genomin epästabiilisuuden G-kvadrupleksien [22], kun taas ATRX menetys liittyy kromosomi-epävakautta haiman neuroendocrine kasvaimissa [33], ja XPD mutaatiot häiritä nukleotidin poisto DNA: n korjaukseen, joka johtaa syövän altis sairauksien, kuten Xeroderma pigmentosumin [34].

näyttää siltä, ​​että maksan ja mahasyöpä ovat hyvin erilaisia ​​ja ei ominaista yhteinen geneettinen allekirjoitusta tai erittäin edustaa ajo mutaatio, joka voi yksinkertaisesti selittää havaitun nousu G-Nelivaiheinen rakenteet . Vaikka monet maksasyöpien liittyy hepatiitti B tai C-hepatiitti, patologiset saatujen tietojen kanssa TMA osoittaa, että ei ole korrelaatiota BG4 värjäystä. Osana tulevaa työtä, se on arvokasta analysoida ei-neoplastisia ja pahanlaatuinen kasvain näytteet silloin, kun koko-Genomikartoituksen on käytetty selvittämään geneettisen taustan kasvain /ei-neoplastisia paria, jotta voidaan luoda suhdetta välillä genotyypin ja G-Nelivaiheinen muodostumisen syöpää.

Yhteenvetona, me raportoimme käyttö G-Nelivaiheinen-spesifistä vasta-ainetta, BG4, in IHC värjäys kokeissa ihmisen ei-neoplastisia ja syöpäkudoksissa. Tämä tutkimus on auttanut meitä tunnistamaan huomattavasti suurempi läsnäolo DNA G-Nelivaiheinen rakenteiden ytimet mahalaukun ja maksan syöpäsoluja verrattuna vastaaviin ei-neoplastisia kudoksia. Oletamme, että nämä erot saattavat olla riippuvaisia ​​muutoksista solun prosesseja, jotka säätelevät genomin vakautta tai muutoksia chromatin tilassa G-Nelivaiheinen sivustoja syövän kudoksissa. Tuloksemme tukevat mahdollisuutta, että syöpäsolut voivat tarjota ikkuna valikoivuus, joka tekisi niistä herkempiä kuin ei-neoplastisten solujen kohti pienimolekyylinen G-Nelivaiheinen-kohdistusstrategia.

Materiaalit ja menetelmät

Fixation, upottamisen, leikkaus- ja värjäys solupellettien suoritettiin histopatologisen ydin palvelua Cancer Research UK Cambridge Institute. Immunohistokemiallinen (IHC) suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä automatisoidulla Leica Bond alustan vähäisin muutoksin. Lyhyesti, fiksoitiin 24 tuntia huoneenlämmössä (RT) 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin ja käsitellään käyttämällä Leica ASP300 kudostenkäsittelijä kanssa de-nesteytys kautta porrastettu etanolia sarja, clearing ksyleenissä ja tunkeutumisen sulan parafiinivahaa. Upottaminen suoritettiin Leica EG1160 upottaminen asemalta ja leikattiin 3 um mikrotomilla, kellui vesihauteessa asetettu ~45-50 ° C: ssa, kunnes sileä ja tasainen, ennen kokoelma objektilasille ja kuivaus 60 ° C: ssa 1 h. De-vahaus ja uudelleen nesteytyksestä suoritettiin käyttämällä automaattista Leica ST5020 Multistainer. MDA-MB-231 ihmisen rinta-adenokarsinooma-solut saatiin ATCC LGC Standards. MDA-MB-231 solujen pelletit, epitooppi haku suoritettiin 100 ° C: ssa 20 min Bond epitoopin haku Ratkaisu 1 (sitraatti-pohjainen, pH 6,0) tai Bond epitooppi haku liuosta 2 (Tris /EDTA-pohjainen, pH 9,0) tai 37 ° C: ssa 10 min Bond entsyymin esikäsittelyyn kit (100 ug /ml proteinaasi K: Tris-puskuroitu suolaliuos, pinta-aktiivista ainetta ja 0,35% ProClin 950) löytää paras edellytys. Kaupallisesti saatavissa ihmisen kudossiruina asianmukaiset eettisten hyväksyntää lähtömaassa ostettiin Insight Bio UK (USA Biomax- Inc. paneelit) ja BIOCAT, Saksa tai Stretton Scientific, UK (for Accumax, Isu Abxis taulukot). Epitooppi haku suoritettiin 100 ° C: ssa 20 minuutin ajan sitraattipuskurilla. BG4 värjäys suoritettiin huoneenlämpötilassa automatisoidulla Leica Bond välinettä, jossa on kanin polymeerin kit (Leica) jälkeen 15 min inkubaation BG4 ja 8 min inkubaatio anti-FLAG kanin polyklonaalista vasta-ainetta (Cell Signaling Technology). Jälkeen objektilasit vastavärjättiin 5 minuutin ajan 0,02% hematoksyliinillä visualisoida solutumien. De-nesteytys ja clearing tehtiin automatisoidulla Leica ST5020 Multistainer, ja asennus suoritettiin automatisoidulla lasi coverslipper Leica CV5030. Objektilasit skannattiin kanssa Aperio XT120 dian skannaus järjestelmä (Leica) ja kuvien analysoitiin käyttämällä Aperio Imagescope Nuclear v9 ohjelmisto. Tilastolliset analyysit ja P-arvot laskettiin käyttäen Studentin t-testiä. Taajuus-kuvaajat piirrettiin käyttämällä GraphPad Prism (GraphPad Software).

tukeminen Information

Kuva S1.

BG4 värjäytymisen parafinoidut MDA-MB-231 solupelletit. A. Ihmisen MDA-MB-231 rintasyöpä solupelletit, parafiiniin upotettuja ja käsitellään IHC käyttäen G-Nelivaiheinen-spesifistä vasta-ainetta BG4. Vahva BG4 värjäys (ruskea) ilmenee solutumissa seuraavissa epitooppi haku Tris /EDTA-pohjainen pH 9,0. Asteikkoviiva vastaa 20 um. Ytimet vastavärjätään hematoksyliinillä (sininen). B. Voimakas BG4 värjäytymistä (ruskea) ilmenee solutumissa seuraavissa epitooppi haun proteinaasi K C. Ei tumavärjäystä havaitaan puuttuessa BG4 vasta-jälkeen Tris /EDTA-epitoopin haku. D. Ei tumavärjäystä nähdään seuraavat DNaasikäsittely ennen BG4 värjäystä jälkeen epitooppi hakua EDTA. E. Korkea epäspesifisen värjäytymisen puuttuessa BG4 jälkeen epitoopin haku proteinaasi K.

doi: 10,1371 /journal.pone.0102711.s001

(TIF)

Kuva S2.

Non-neoplastisia ihmisen kudokset osoittavat muuttuja BG4 värjäytymistä. Ei-neoplastisia kudoksia värjättiin IHC käyttämällä G-Nelivaiheinen-spesifistä vasta-ainetta BG4. A. BG4 värjäys (ruskea) munuaisissa cortex näyttää erilaisia ​​ydin- värjäytymisvoimakkuuksia keräsiin ja niihin liittyvien rakenteiden. Solujen tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä (sininen). Asteikkoviiva vastaa 50 pm B. heikosti positiivinen BG4 värjäytymistä nähdään kokoojaputken ytimet munuaisten ydin. C. Iho näyttää erilaisia ​​BG4 intensiteettien orvaskeden kanssa positiiviset ja negatiiviset ytimet hajallaan, kun taas dermis on enimmäkseen myönteisiä. D. Useimmat ytimet paksusuolen ovat BG4-positiivisia. E. kohdun runko, kerrostunut levyepiteeli on pitkälti BG4-negatiivinen taas positiivista värjäytymistä nähdään enemmän pinnallisesti. F. Koko rinnan duktaalinen lobules, sekä myoepithelial ja onteloerityssolut osoittavat yleisesti vahva BG4 värjäytyminen vain satunnaisesti negatiivisia soluja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0102711.s002

(TIF) B Kuva S3.

Kohonnut läsnäolo G-Nelivaiheinen rakenteiden ihmisen haimasyöpä kudoksiin. Ei-neoplastisia ja syövän haiman kudoksista värjättiin IHC käyttäen G-Nelivaiheinen-spesifinen vasta-aine BG4, ja määrä BG4-positiivisten tumien oli pisteytetty Aperio Imagescope ohjelmistoa. A. ytimet ei-neoplastisten haima kudos kohtalaisesti BG4 värjäytymistä (ruskea) monia unstained ytimien myös läsnä. Solujen tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä (sininen). Asteikkoviiva vastaa 50 um. B. BG4 värjäystä haiman adenokarsinooma kudos on laajempi syvällisemmin. C. Kaiken määrällisesti määrä BG4-positiivisten ytimien kaikissa ei-neoplastisia ja haimasyöpä kudoksiin. Virhe palkit edustavat s.e.m. * P 0,01, n = 6 ja 12 ei-neoplastisia ja syövän ydintä, vastaavasti.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0102711.s003

(TIF)